JP2015073457A - Method for detecting staphylococcus aureus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、従来知られていなかった遺伝子変異を有する黄色ブドウ球菌を検出するための試薬に関する。 The present invention relates to a reagent for detecting Staphylococcus aureus having a genetic mutation that has not been conventionally known.
黄色ブドウ球菌は、常在菌であり、かつ血流感染、肺炎、髄膜炎など様々な感染症の原因菌である。特に血流感染の場合は様々な合併症を引き起こしうるため、早期にかつ正確に診断する方法が必要不可欠である。 Staphylococcus aureus is a resident bacterium and causes various infections such as bloodstream infection, pneumonia and meningitis. Especially in the case of bloodstream infection, since various complications can be caused, an early and accurate diagnosis method is indispensable.
通常、黄色ブドウ球菌の検査はグラム染色およびコアグラーゼ試験によって行われることが多い。これは、人から通常検出され、かつコアグラーゼ陽性であるブドウ球菌は黄色ブドウ球菌のみであるという知見に基づく。該方法は広く知られる検査法であるが、分離培養を行って得られたコロニーに対して行われるため、検査を行うにはまず菌の培養を行わなければならない。 Usually, Staphylococcus aureus tests are often performed by Gram staining and coagulase testing. This is based on the finding that the only staphylococci that are normally detected in humans and are coagulase positive are S. aureus. Although this method is a well-known test method, since it is performed on colonies obtained by performing isolation culture, in order to perform the test, it is necessary to first culture the bacteria.
これに対してＰＣＲなどの核酸増幅による検査では、培養した黄色ブドウ球菌以外にも、鼻腔スワブや膿などの臨床サンプル中に存在する黄色ブドウ球菌を検出することが可能である（非特許文献１）。核酸増幅検査では、例えば黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子（熱安定性ヌクレアーゼをコードしている遺伝子）をＰＣＲによって増幅し検出する方法が知られている（非特許文献２）。 On the other hand, in the examination by nucleic acid amplification such as PCR, it is possible to detect Staphylococcus aureus present in clinical samples such as nasal swabs and pus in addition to cultured Staphylococcus aureus (Non-patent Document 1). ). In the nucleic acid amplification test, for example, a method of amplifying and detecting a nuc gene (gene encoding a thermostable nuclease) specific to S. aureus by PCR (Non-patent Document 2) is known.
核酸増幅を用いた方法では核酸増幅産物をどのようにして検出するかが問題となる。最も古典的な検出方法としてはアガロースゲル電気泳動よって増幅産物を視認する方法がある。しかしこの方法では増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。 In the method using nucleic acid amplification, how to detect the nucleic acid amplification product becomes a problem. As the most classic detection method, there is a method of visually confirming an amplification product by agarose gel electrophoresis. However, this method may cause contamination due to carryover of amplification products.
この問題を解決する方法として、標的核酸と結合すると消光する特徴を有する蛍光色素標識プローブＱＰｒｏｂｅを用いて正確性に優れた黄色ブドウ球菌の遺伝子検出方法が提案されている（特許文献１）。特許文献１に記載の検出方法では核酸増幅と核酸検出を連続して行えるため、核酸増幅後に反応系を開放する必要がなく、キャリーオーバーコンタミネーションを防ぐことができる。 As a method for solving this problem, a highly accurate S. aureus gene detection method using a fluorescent dye-labeled probe QProbe that has a characteristic of quenching when bound to a target nucleic acid has been proposed (Patent Document 1). In the detection method described in Patent Document 1, since nucleic acid amplification and nucleic acid detection can be performed continuously, it is not necessary to open the reaction system after nucleic acid amplification, and carry-over contamination can be prevented.
特許文献１ではｎｕｃ遺伝子を標的として検出する方法が提示されている。しかし、該方法はｎｕｃ遺伝子の塩基配列に変異が生じた場合、プライマーまたはプローブのミスマッチが生じてｎｕｃ遺伝子を検出できなくなる可能性があった。そして現実に、本発明者らは、特許文献１に記載の方法で検出できないタイプの黄色ブドウ球菌を発見した。 Patent Document 1 proposes a method for detecting a nuc gene as a target. However, in this method, when a mutation occurs in the base sequence of the nuc gene, there is a possibility that a primer or probe mismatch occurs and the nuc gene cannot be detected. In reality, the present inventors have discovered a type of Staphylococcus aureus that cannot be detected by the method described in Patent Document 1.
本発明が解決しようとする課題は、新たに発見された変異したｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌を、通常の黄色ブドウ球菌と同様に検出するための方法および該方法を実施するための検出試薬に関する。 The problem to be solved by the present invention relates to a method for detecting a newly discovered staphylococcus aureus having a mutated nuc gene in the same manner as normal S. aureus, and a detection reagent for carrying out the method. .
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ｎｕｃ遺伝子の一部領域を特異的に増幅するための核酸プライマーおよび該核酸プライマーを用いた核酸増幅反応によって得られた増幅核酸を検出するための核酸プローブを含んだ冷蔵で保存が可能な試薬組成を見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下のような構成からなる。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors detect a nucleic acid primer for specifically amplifying a partial region of a nuc gene and an amplified nucleic acid obtained by a nucleic acid amplification reaction using the nucleic acid primer. The present invention has been completed by finding a reagent composition containing a nucleic acid probe for refrigerated storage. That is, the present invention has the following configuration.
[項１]
黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出する方法であって、該方法は以下の工程（１）〜（３）からなる方法であり、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが（Ａ）および（Ｂ）の特徴を有し、核酸プローブが（Ｃ）および（Ｄ）の特徴を有する方法。
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
（Ａ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｂ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｃ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
［項２］
項１に記載の方法であって、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが（Ａ´）および（Ｂ´）の特徴を有し、（２）の工程で用いられる核酸プローブが（Ｃ´）および（Ｄ´）の特徴を有する、方法。
（Ａ´）配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｂ´）配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｃ´）配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ´）配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
[項３]
前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される項１または項２に記載の方法。
[項４]
前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、項１〜３のいずれかに記載の方法。
[項５]
１対の核酸プライマーからなる核酸プライマーセットであって、フォワードプライマーが以下の（Ｅ）の特徴を有し、リバースプライマーが以下の（Ｆ）の特徴を有する、核酸プライマーセット。
（Ｅ）配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３´末端とし、該配列の５４番目〜６５番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号３で示される塩基配列の５９番目を３´末端とし、該配列の３１〜４１番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
[項６]
フォワードプライマーが配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーであり、リバースプライマーが塩基配列９〜１１のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーである、項５に記載の核酸プライマーセット。
[項７]
ｎｕｃ遺伝子の一部領域を検出するための核酸プローブであって、配列番号３で示される塩基配列の１３７番目を３´末端とし、該配列の１１８番目〜１２３番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プローブ。
[項８]
前記核酸プローブが、配列番号１２または１３で示される塩基配列を有する、項７に記載の核酸プローブ
[項９]
前記核酸プライマーセットが項５または項６に記載の核酸プライマーセットであり、前記核酸プローブが項７または項８に記載の核酸プローブである、項１〜４のいずれかに記載の方法。
[項１０]
項１〜４および項９のうちいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、項５または項６のいずれかに記載の核酸プライマーセットと、項７または項８のいずれかに記載の核酸プローブとを含む組成物。
[項１１]
項１〜４および項９のうちいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、項５または項６のいずれかに記載の核酸プライマーセットと項７または項８のいずれかに記載の核酸プローブ、または、項１０に記載の組成物を含むキット。
[Section 1]
A method for detecting the nuc gene of Staphylococcus aureus, the method comprising the following steps (1) to (3), wherein the nucleic acid primer set used in step (1) of the method is (A ) And (B), and the nucleic acid probe has the characteristics (C) and (D).
(1) Amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing a pair of nucleic acid primer sets (2) Forming a complex with the nucleic acid amplification product obtained by (1) and part or all of the nucleic acid amplification product A step of detecting a complex obtained in (3) and (2) by hybridizing with a possible nucleic acid probe to form a complex (A) a base sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 1 Nucleic acid primer set (B) that can amplify a part or all of a certain oligonucleotide (B) Nucleic acid primer set (C) that can amplify a part or all of an oligonucleotide that is a base sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 2 Can form a complex with the region amplified by the nucleic acid primer set among oligonucleotides having a nucleotide sequence of 95% identity or more with No. 1 Of the oligonucleotide is a nucleotide sequence having an acid probe (D) SEQ ID NO: 2 95% identity, nucleic acids capable of forming a complex with the amplified region by the nucleic acid primer set probe [claim 2]
Item 2. The method according to Item 1, wherein the nucleic acid primer set used in the step (1) of the method has the characteristics (A ′) and (B ′), and the nucleic acid probe used in the step (2) Having the features of (C ′) and (D ′).
(A ′) Nucleic acid primer set capable of amplifying a part or all of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (B ′) Part or all of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 Nucleic acid primer set (C ′) that can amplify nucleic acid probe (D ′) that can form a complex with the region amplified by the nucleic acid primer set, among oligonucleotides that are base sequences represented by SEQ ID NO: 1 Nucleic acid probe capable of forming a complex with the region amplified by the nucleic acid primer set in the oligonucleotide having the base sequence shown
[Section 3]
The sample is selected from whole blood, blood culture medium, pus, cerebrospinal fluid, pleural effusion, nasal wipe, pharyngeal wipe, sputum, catheter washing solution, tissue section, and those diluted with an appropriate solution. Item 3. The method according to Item 1 or Item 2.
[Section 4]
Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein at least one end of the nucleic acid probe is fluorescently labeled and the base of the nucleic acid probe labeled nucleic acid is cytosine.
[Section 5]
A nucleic acid primer set comprising a pair of nucleic acid primers, wherein the forward primer has the following characteristics (E) and the reverse primer has the following characteristics (F).
(E) a nucleic acid primer (F) sequence having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 having the 3rd end at the 83rd or 84th base sequence and the 5 'end at any of the 54th to 65th bases of the sequence Nucleic acid primer having a nucleotide sequence having the 3rd end as the 59th nucleotide sequence of the nucleotide sequence indicated by No. 3 and the 5 'end as the 31st to 41st arbitrary bases in the sequence
[Section 6]
Item 6. The nucleic acid according to Item 5, wherein the forward primer is a nucleic acid primer having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 to 8, and the reverse primer is a nucleic acid primer having a base sequence represented by any of base sequences 9 to 11. Primer set.
[Section 7]
A nucleic acid probe for detecting a partial region of a nuc gene, wherein the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is at the 137th position as the 3 'end, and the arbitrary base from the 118th to 123rd position of the sequence is at the 5' end A nucleic acid probe having a base sequence of
[Section 8]
Item 8. The nucleic acid probe according to Item 7, wherein the nucleic acid probe has a base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13.
[Section 9]
Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the nucleic acid primer set is the nucleic acid primer set according to Item 5 or 6, and the nucleic acid probe is the nucleic acid probe according to Item 7 or Item 8.
[Section 10]
Item 10. A composition for carrying out the method according to any one of Items 1 to 4 and Item 9, wherein the nucleic acid primer set according to any one of Items 5 or 6, and any one of Items 7 or 8 A composition comprising the nucleic acid probe according to 1.
[Section 11]
Item 9. A kit for carrying out the method according to any one of Items 1 to 4 and Item 9, wherein the nucleic acid primer set according to any one of Items 5 or 6 and Item 7 or Item 8 are used. Or a kit comprising the composition according to item 10.
本発明によれば、通常の黄色ブドウ球菌の検出と、従来報告されていなかったｎｕｃ遺伝子変異を有する黄色ブドウ球菌の検出とを区別することなく、迅速、確実かつ簡便に行うことが可能となる。 According to the present invention, it is possible to carry out promptly, reliably and simply without distinguishing between detection of normal S. aureus and detection of S. aureus having a nuc gene mutation that has not been reported so far. .
本発明は、通常のｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌と、変異したｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌の両方を検出するための核酸プライマー（プライマー）、核酸プローブ（プローブ）、ならびにこれらを用いて黄色ブドウ球菌を検出するための方法、および該方法を実施するためのキット等に関する。 The present invention relates to a nucleic acid primer (primer), a nucleic acid probe (probe) for detecting both S. aureus having a normal nuc gene and S. aureus having a mutated nuc gene, and yellow grapes using these. The present invention relates to a method for detecting cocci, a kit for carrying out the method, and the like.
本発明における通常のｎｕｃ遺伝子とは、ＮＣＢＩのアクセションＮｏ．ＢＸ５７１８５６のＲｅｇｉｏｎ８９５６６１〜８９６３４７に掲載された塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子を指す。該遺伝子の３０３位〜５４２位を示したものが配列番号１である。また、本発明における「変異したｎｕｃ遺伝子」とは、３０３位〜５４２位が配列番号２で示される塩基配列であるｎｕｃ遺伝子を指す。配列番号２の部分配列を有するｎｕｃ遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌はこれまで報告がなく、今回初めて発見された塩基配列である。
また、配列番号３は配列番号１の相補的配列であり、配列番号４は配列番号２の相補的配列である。配列番号５はデータベースに登録されているｎｕｃ遺伝子全体の塩基配列である。
The normal nuc gene in the present invention is NCBI accession no. It refers to the nuc gene having the base sequence listed in Region 895661-896347 of BX571856. SEQ ID NO: 1 shows positions 303 to 542 of the gene. In addition, the “mutated nuc gene” in the present invention refers to a nuc gene whose positions 303 to 542 are the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. S. aureus having the nuc gene having the partial sequence of SEQ ID NO: 2 has not been reported so far, and is the first base sequence discovered this time.
SEQ ID NO: 3 is a complementary sequence of SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 4 is a complementary sequence of SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 5 is the base sequence of the entire nuc gene registered in the database.
核酸プライマーセット
本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法において、黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子の領域を特異的に増幅する核酸プライマーセットは、１対の核酸プライマーからなり、かつ以下の（Ａ）および（Ｂ）の両方の特徴を有する。
（Ａ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を核酸増幅することが可能な核酸プライマーセットである。
（Ｂ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を核酸増幅することが可能な核酸プライマーセットである。
上記の（Ａ）において、配列番号１との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１そのもの）である。同様に、上記の（Ｂ）において、配列番号２との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号２そのもの）である。
Nucleic acid primer set In the method for detecting Staphylococcus aureus of the present invention, the nucleic acid primer set that specifically amplifies a region of the nuc gene specific to S. aureus comprises a pair of nucleic acid primers, and the following (A) And (B).
(A) A nucleic acid primer set capable of nucleic acid amplification of part or all of an oligonucleotide having a base sequence represented by a base sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 1.
(B) A nucleic acid primer set capable of nucleic acid amplification of part or all of an oligonucleotide having a base sequence represented by a base sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 2.
In the above (A), the identity with SEQ ID NO: 1 is preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and further preferably 100% (ie SEQ ID NO: 1 itself). Similarly, in (B) above, the identity with SEQ ID NO: 2 is preferably 96% or higher, more preferably 97% or higher, more preferably 98% or higher, more preferably 99% or higher, and more preferably 100%. % (Ie, SEQ ID NO: 2 itself).
本明細書における「１対の核酸プライマーセット」は、１種類（１配列）のフォワードプライマーと１種類（１配列）のリバースプライマーとで構成される。 In this specification, “one pair of nucleic acid primer sets” is composed of one type (one sequence) of forward primers and one type (one sequence) of reverse primers.
［核酸配列の相同性］
本願明細書において、核酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。
ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売されているＧＥＮＥＴＹＸ ＷＩＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用できる。
[Nucleic acid sequence homology]
In the present specification, the identity of a nucleic acid sequence means a value compared with GENETYX software.
As the GENETYX software, for example, the GENETYX WIN Version 6.1 software sold by GENETYX CORPORATION can be used.
上記の核酸プライマーセットは、（Ａ）および（Ｂ）の両方の特徴を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはフォワードプライマーが以下の（Ｅ）からなり、リバースプライマーが以下の（Ｆ）からなる。
（Ｅ）配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３´末端とし、該配列の５４番目〜６５番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号３で示される塩基配列の５９番目を３´末端とし、該配列の３１〜４１番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
The nucleic acid primer set is not particularly limited as long as it has both the features (A) and (B). Preferably, the forward primer comprises the following (E), and the reverse primer comprises the following (F) Consists of.
(E) a nucleic acid primer (F) sequence having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 having the 3rd end at the 83rd or 84th base sequence and the 5 'end at any of the 54th to 65th bases of the sequence Nucleic acid primer having a nucleotide sequence having the 3rd end as the 59th nucleotide sequence of the nucleotide sequence indicated by No. 3 and the 5 'end as the 31st to 41st arbitrary bases in the sequence
前記（Ｅ）の核酸プライマーの塩基配列は３´末端が配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目のいずれかの塩基であるならば、５´末端は配列番号１の５４番目〜６５番目の中の任意の塩基にしてよい。好ましくは５´末端が配列番号１の５６番目〜６２番目であり、より好ましくは５８番目〜６１番目である。
また、前記（Ｆ）の核酸プライマーの塩基配列は３´末端が配列番号３で示される塩基配列の５９番目の塩基であるならば、５´末端は配列番号３の３１番目〜４１番目の中の任意の塩基にしてよい。好ましくは５´末端が配列番号３の３２〜４０番目であり、より好ましくは３４〜３８番目である。
The base sequence of the nucleic acid primer (E) is such that the 3 'end is either the 83rd or 84th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the 5' end is the 54th to the start of SEQ ID NO: 1. It may be any base in the 65th position. Preferably, the 5 ′ end is the 56th to 62nd position of SEQ ID NO: 1, and more preferably the 58th to 61st position.
If the nucleotide sequence of the nucleic acid primer (F) is the 59th base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 at the 3 ′ end, the 5 ′ end is the 31st to 41st of SEQ ID NO: 3. Any base may be used. Preferably, the 5 'end is the 32nd to 40th positions of SEQ ID NO: 3, more preferably the 34th to 38th positions.
前記核酸プライマーセットを構成するそれぞれの核酸プライマーは、少なくとも３´末端から５番目までの核酸が配列番号１および配列番号２の両方と一致するように設計されている。従って、該核酸プライマーセットは配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部、および配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部の両方を核酸増幅することが可能になっている。 Each of the nucleic acid primers constituting the nucleic acid primer set is designed so that at least the 5th nucleic acid from the 3 ′ end matches both SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Accordingly, the nucleic acid primer set can nucleic acid amplify both a part of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a part of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. ing.
このような核酸プライマーセットとして、特に、フォワードプライマーとして配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列、および、リバースプライマーとして配列番号９〜１１のいずれかで示される塩基配列、の組合せが例示できる。 Examples of such a nucleic acid primer set include a combination of a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 to 8 as a forward primer and a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 9 to 11 as a reverse primer. it can.
核酸プローブ
本発明で用いられる核酸プローブは、上記核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部とハイブリダイズして複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
Nucleic acid probe The nucleic acid probe used in the present invention is not particularly limited as long as it can hybridize with a part or all of the nucleic acid amplification product amplified by the nucleic acid primer set to form a complex. More preferably, it is a nucleic acid probe that specifically forms a complex only with the nucleic acid amplification product and does not form a complex with a nucleic acid having other base sequence, more preferably a part of the nucleic acid amplification product or A nucleic acid probe having the same or complementary base sequence as the entire base sequence.
そのような核酸プローブとして好ましくは（Ｃ）および（Ｄ）の両方の特徴を備えた核酸プローブが挙げられる。
（Ｃ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、前記核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、前記核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
上記の（Ｃ）において、配列番号１との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１そのもの）である。同様に、上記の（Ｄ）において、配列番号２との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号２そのもの）である。
Such a nucleic acid probe is preferably a nucleic acid probe having both the features (C) and (D).
(C) Nucleic acid probe capable of forming a complex with the region amplified by the nucleic acid primer set among oligonucleotides having a nucleotide sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 1 (D) SEQ ID NO: 2 and 95% Among the oligonucleotides having the base sequences having the above identity, the nucleic acid probe capable of forming a complex with the region amplified by the nucleic acid primer set In the above (C), the identity with SEQ ID NO: 1 is preferably It is 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and further preferably 100% (that is, SEQ ID NO: 1 itself). Similarly, in the above (D), the identity with SEQ ID NO: 2 is preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, more preferably 100%. % (Ie, SEQ ID NO: 2 itself).
前記核酸プローブの塩基配列は、前記（Ｃ）（Ｄ）を満たすものであれば特に制限されないが、好ましくは配列番号３で示される塩基配列の１３７番目を３´末端とし、該配列の１１８番目〜１２３番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プローブである。前記塩基配列の核酸プローブは、配列番号１および２の共通配列の一部と同じ配列を有しており、１と２のいずれの配列番号で示される塩基配列を含む核酸増幅産物とも複合体を形成することができる。 The base sequence of the nucleic acid probe is not particularly limited as long as it satisfies the above (C) and (D), but preferably the 137th base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is the 3 'end, and the 118th base of the sequence A nucleic acid probe having a nucleotide sequence having the 5 ′ end at the ˜123rd arbitrary base. The nucleic acid probe of the base sequence has the same sequence as a part of the common sequence of SEQ ID NOS: 1 and 2, and is complexed with a nucleic acid amplification product containing the base sequence represented by any of the sequence numbers 1 and 2. Can be formed.
このような核酸プローブとして、配列番号１２、１３の塩基配列で示される核酸プローブが例示できる。 As such a nucleic acid probe, the nucleic acid probe shown by the base sequence of sequence number 12, 13 can be illustrated.
上記核酸プローブは核酸が標識されていてもいなくてもよい。標識されている場合は、標識される核酸の位置および数に制限はないが、好ましくは核酸プローブ末端の核酸が標識されることであり、より好ましくはいずれか片方の末端が標識されることである。さらに好ましくは、標識される末端の核酸の塩基がシトシンであることである。 The nucleic acid probe may or may not be labeled with a nucleic acid. In the case of labeling, the position and number of the nucleic acid to be labeled are not limited, but preferably the nucleic acid at the end of the nucleic acid probe is labeled, and more preferably, one of the ends is labeled. is there. More preferably, the base of the terminal nucleic acid to be labeled is cytosine.
標識物質は特に制限されないが、好ましくは蛍光物質であり、より好ましくは単独では蛍光を示し、標的核酸とハイブリッドを形成した場合には消光する性質を有する蛍光物質である。前記蛍光物質は、制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）等が例示できる。
本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法
本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法は、試料中の黄色ブドウ球菌を検出する方法であって、ある特定の工程により試料中の黄色ブドウ球菌由来の核酸を検出する方法、を含むことを特徴とする。
The labeling substance is not particularly limited, but is preferably a fluorescent substance, more preferably a fluorescent substance that exhibits fluorescence alone and quenches when it forms a hybrid with the target nucleic acid. Examples of the fluorescent substance include, but are not limited to, fluorescein, phosphor, rhodamine, polymethine dye derivatives, and the like. Examples of commercially available fluorescent dyes include BODIPY FL (trademark, manufactured by Molecular Probes), FluorePrime (trademark, Amersham). Pharmacia), Fluoredite (trademark, manufactured by Millipore), FAM (ABI), Cy3 and Cy5 (Amersham Pharmacia), TAMRA (Molecular Probes), carboxyrhodamine 6G (CR6G), and the like.
Method for detecting Staphylococcus aureus of the present invention The method for detecting Staphylococcus aureus of the present invention is a method for detecting Staphylococcus aureus in a sample, and detecting nucleic acid derived from Staphylococcus aureus in a sample by a specific process. Including a method of performing.
該方法の一つの様態として、以下の（１）〜（３）の工程を含む黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出する方法が挙げられる。
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
該方法で用いられる核酸プライマーセットおよび核酸プローブとしては前記のものが使用できる。
One embodiment of the method includes a method for detecting the nuc gene of Staphylococcus aureus comprising the following steps (1) to (3).
(1) Amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing a pair of nucleic acid primer sets (2) Forming a complex with the nucleic acid amplification product obtained by (1) and part or all of the nucleic acid amplification product A step of hybridizing with a possible nucleic acid probe to form a complex (3) a step of detecting the complex obtained in (2) The above-described nucleic acid primer sets and nucleic acid probes used in the method are used it can.
本発明のｎｕｃ遺伝子検出方法は、上記工程が含まれること以外は特に制限されない。ｎｕｃ遺伝子の検出が可能ならば上記工程に新たな工程を追加してもよい。 The nuc gene detection method of the present invention is not particularly limited except that the above steps are included. If the nuc gene can be detected, a new process may be added to the above process.
該方法で用いられるｎｕｃ遺伝子を増幅し検出するための核酸プライマーセットおよび核酸プローブは、それぞれ前記したものを用いることができる。さらに、例えばｎｕｃ遺伝子とは異なる遺伝子を増幅し検出する目的で、前記の核酸プライマーセットおよび核酸プローブとは異なる核酸プライマーや核酸プローブを追加することも特に制限されない。 As the nucleic acid primer set and the nucleic acid probe for amplifying and detecting the nuc gene used in the method, those described above can be used. Furthermore, for example, for the purpose of amplifying and detecting a gene different from the nuc gene, addition of a nucleic acid primer or nucleic acid probe different from the nucleic acid primer set and the nucleic acid probe is not particularly limited.
被検核酸の増幅
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
Amplification of test nucleic acid The test nucleic acid in the present invention may be, for example, single-stranded or double-stranded. In the case of a double strand, for example, it is preferable to include a step of dissociating the double strand into a single strand by heating in order to hybridize a test nucleic acid and a probe to form a hybrid.
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、黄色ブドウ球菌の血液培養試料、カテーテル洗浄液、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。これらの試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる The type of the test nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include DNA, RNA such as total RNA and mRNA, and the like. Examples of the test nucleic acid include nucleic acids contained in samples such as a blood culture sample of S. aureus, a catheter washing solution, and a biological sample. These samples may be used as they are, or those diluted with an appropriate solution may be used. Suitable solutions include water, saline, buffer solution, alkaline aqueous solution, acidic aqueous solution, nucleic acid extraction reagent, surfactant, organic solvent and the like.
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、組織切片、血液（全血）などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
Although it does not restrict | limit especially as said biological sample, For example, pus, cerebrospinal fluid, pleural effusion, nasal wiping liquid, pharyngeal wiping liquid, sputum, tissue section, blood (whole blood) etc. are mentioned.
A method for collecting a sample, a method for preparing a nucleic acid such as DNA or RNA, and the like are not limited, and conventionally known methods can be employed.
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の核酸プライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。 Subsequently, the isolated genomic DNA is used as a template to amplify a sequence containing a base site to be detected by a nucleic acid amplification method such as PCR using the above-described nucleic acid primer set. The specific nucleic acid amplification method is not particularly limited, and a known method can be used as appropriate. For example, PCR (Polymerase Chain Reaction) method, NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, TMA (Transscription-mediated amplification (LMP) method, SDA (Strand Displacement Amplification method), SDA (Strand Displacement Amplification method). It is preferable to use the PCR method. In each of these methods, the conditions for the amplification reaction are not particularly limited, and can be performed by a conventionally known method.
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。 When the PCR method is used for nucleic acid amplification, the DNA polymerase to be used is not particularly limited, but α-type DNA polymerase is preferably used. The reason will be described below.
本発明プローブが含まれる反応系でｎｕｃ遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のｎｕｃ遺伝子またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にｎｕｃ遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。 When a nuc gene is amplified in a reaction system containing the probe of the present invention, the nucleic acid probe can bind to a sample nuc gene or an amplification product thereof during the nucleic acid amplification step. The nucleic acid probe bound to the nuc gene during the nucleic acid amplification step inhibits the nucleic acid amplification reaction by the nucleic acid primer and DNA polymerase.
Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’− ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるｎｕｃ遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。 PolI type DNA polymerases such as Taq DNA Polymerase are known to have 5'-3 'exonuclease activity. Because of this activity, if there is a nucleic acid bound to the nuc gene as a template during the nucleic acid amplification reaction, the bound nucleic acid is degraded by exonuclease activity. For this reason, the nucleic acid probe in the reaction system may be reduced, causing a problem in the nucleic acid detection process. Therefore, it is not preferable to carry out the present invention using PolI type DNA polymerase.
他方、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。 On the other hand, α-type DNA polymerases such as KOD DNA Polymerase (derived from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1) do not have 5'-3 'exonuclease activity but have 3'-5' exonuclease activity. Therefore, the use of α-type DNA polymerase not only solves the above problem, but also exhibits high accuracy in the nucleic acid amplification step due to the 3′-5 ′ exonuclease activity.
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。 Usually, α-type DNA polymerase has a 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity, and therefore the nucleic acid amplification rate tends to be lower than that of PolI-type enzyme. However, although KOD DNA Polymerase is an α-type DNA polymerase, it has high DNA synthesis activity, has a DNA synthesis rate of 100 bases / second or more, and has excellent elongation efficiency. Therefore, it is preferable to use KOD DNA Polymerase (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) among the α-type DNA polymerases for carrying out the present invention.
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−が望ましい。
In addition, a mutant type in which α-type DNA polymerase is mutated to achieve a deoxyribonucleic acid synthesis rate of 100 bases / second or more, or a DNA polymerase composition in which the performance is achieved by a combination of wild type and / or mutant type Can be used as a DNA polymerase suitable for the practice of the present invention.
For example, as a DNA polymerase having a deoxyribonucleic acid synthesis rate of 100 bases / second or more in addition to the above KOD DNA Polymerase, “KOD FX (Toyobo, Trademark)”, “KOD-Plus- (Toyobo, Trademark)”, “KOD” Dash (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.), PrimeSTAR HS DNA polymerase (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.) and the like can also be used.
Among these, KOD-Plus- having both high accuracy and DNA synthesis activity is desirable.
ＤＮＡ合成活性
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
DNA synthesis activity In the present invention, DNA synthesis activity refers to deoxyribonucleic acid by covalently binding α-phosphate of deoxyribonucleoside 5′-triphosphate to 3′-hydroxyl group of oligonucleotide or polynucleotide annealed to template DNA. Refers to the activity of catalyzing the reaction of introducing deoxyribonucleoside 5′-monophosphate in a template-dependent manner.
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μｌ キャリアーＤＮＡ
When the enzyme activity is high, the activity is measured by diluting the sample with a storage buffer. In the present invention, 25 μl of the following A solution, 5 μl of each of B solution and C solution, and 10 μl of sterilized water are added to an Eppendorf tube and mixed with stirring. Then, 5 μl of the enzyme solution is added and reacted at 75 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture is ice-cooled, and 50 μl of E solution and 100 μl of D solution are added. This solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter), thoroughly washed with solution D and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard) to incorporate nucleotides into the template DNA. taking measurement. One unit of enzyme activity is the amount of enzyme that incorporates 10 nmol nucleotides per 30 minutes into the acid-insoluble fraction under these conditions.
A: 40 mM Tris-HCl (pH 7.5)
16 mM magnesium chloride 15 mM dithiothreitol 100 μg / ml BSA
B: 2 μg / μl activated calf thymus DNA
C: 1.5 mM dNTP (250 cpm / pmol [3H] dTTP)
D: 20% trichloroacetic acid (2 mM sodium pyrophosphate)
E: 1 μg / μl carrier DNA
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
3'-5 'exonuclease activity In the present invention, the 3'-5' exonuclease activity refers to an activity of excising the 3 'terminal region of DNA and releasing 5'-mononucleotide.
The activity was measured using 50 μl of a reaction solution (120 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 μg tritium-labeled E. coli DNA) is dispensed into a 1.5 ml Eppendorf tube and DNA polymerase is added. After reacting at 75 ° C. for 10 minutes, the reaction was stopped by cooling with ice, and then 50 μl of 0.1% BSA was added as a carrier, and then 100 μl of 10% trichloroacetic acid and 2% sodium pyrophosphate solution were added and mixed. To do. After leaving on ice for 15 minutes, the precipitate is separated by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. The radioactivity of 100 μl of the supernatant is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard), and the amount of nucleotide released in the acid-soluble fraction is measured.
核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
本発明のｎｕｃ遺伝子検出方法においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
Complex formation of nucleic acid amplification product and probe The nuc gene detection method of the present invention is designed to form a complex with the nucleic acid amplification product obtained in step (1) and a part of the nucleic acid amplification product. The nucleic acid probe is hybridized to form a complex.
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
The timing of adding a nucleic acid probe to a sample containing a nucleic acid amplification product is not particularly limited. For example, it may be added to the reaction system of the amplification reaction before, during or after the nucleic acid amplification reaction. May be.
Especially, since an amplification reaction and a detection reaction described later can be performed continuously, it is preferable to add them before the amplification reaction. Thus, when the probe is added before the nucleic acid amplification reaction, for example, as described later, it is preferable to add a fluorescent dye or a phosphate group to the 3 ′ end.
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。 The probe may be added to a liquid sample containing a nucleic acid amplification product, or may be mixed with a nucleic acid amplification product in a solvent. The solvent is not particularly limited, and examples thereof include conventionally known solvents such as a buffer solution such as Tris-HCl, a solvent containing KCl, MgCl 2 , MgSO 4 , glycerol and the like, and a PCR reaction solution.
核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
前記方法の（３）で示される工程において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
Detection of Complex of Nucleic Acid Amplification Product and Probe In the step shown in (3) of the above method, the method for detecting the complex obtained is not particularly limited. For example, a method by melting curve analysis can be mentioned.
融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
In the case of melting curve analysis, for example, the following is performed.
When a solution containing double-stranded DNA is heated, the absorbance at 260 nm increases. This is because hydrogen bonds between both strands in double-stranded DNA are unwound by heating and dissociated into single-stranded DNA (DNA melting). When all the double-stranded DNAs are dissociated into single-stranded DNA, the absorbance is about 1.5 times the absorbance at the start of heating (absorbance of only double-stranded DNA), thereby melting. Can be determined to be completed.
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のｎｕｃ遺伝子の検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。 In the present invention, the measurement of the signal fluctuation accompanying the temperature change for performing the melting curve analysis can be performed by measuring the absorbance at 260 nm based on the principle as described above, but the signal of the label added to the probe of the present invention is measured. It is preferable to measure. For this reason, it is preferable to use a labeled probe as a probe used in the nuc gene detection method of the present invention.
標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。 Examples of the labeled probe include a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization, or a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization. In the former probe, no signal is shown when a hybrid (double strand) is formed with the detection target sequence, and a signal is shown when the probe is released by heating. In the case of the latter probe, a signal is shown by forming a hybrid (double strand) with the sequence to be detected, and the signal decreases (disappears) when the probe is released by heating. Therefore, by detecting the signal from the label under signal-specific conditions (absorbance and the like), the progress of melting can be grasped in the same manner as the absorbance measurement at 260 nm.
標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。 As a specific example of the labeled probe, for example, a probe that is labeled with a fluorescent dye, exhibits fluorescence alone, and fluorescence decreases (for example, quenches) by hybridization is preferable. Such a phenomenon is generally called a fluorescence quenching phenomenon. As a probe using this fluorescence quenching phenomenon, a probe generally called a guanine quenching probe is preferable. Such a probe is known as a so-called QProbe (registered trademark). A guanine quenching probe is, for example, a fluorescent dye designed so that the base at the 3 ′ end or 5 ′ end of an oligonucleotide becomes cytosine, and light emission becomes weaker when the base cytosine at the end approaches a complementary base guanine. It is a probe labeled at the end. In the probe of the present invention, for example, a fluorescent dye exhibiting a fluorescence quenching phenomenon may be bound to cytosine at the 3 ′ end of the oligonucleotide, or the 5 ′ end of the oligonucleotide is designed to be cytosine. It may be combined.
本発明のｎｕｃ遺伝子の検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。 In the probe used in the nuc gene detection method of the present invention, for example, a phosphate group may be added to the 3 'end. As will be described later, a test nucleic acid (target nucleic acid) for detecting the presence or absence of a gene can be prepared by a nucleic acid amplification method such as PCR. In this case, the probe of the present invention is allowed to coexist in the reaction system of the nucleic acid amplification reaction. be able to. In such a case, if a phosphate group is added to the 3 'end of the probe, the probe itself can be sufficiently prevented from extending due to the nucleic acid amplification reaction. The same effect can be obtained by adding a labeling substance as described above to the 3 'end.
得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。 Dissociation of the obtained PCR amplification product and hybridization between the single-stranded DNA obtained by the dissociation and the labeled probe can be performed, for example, by changing the temperature of the reaction solution.
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。 The heating temperature in the dissociation step is not particularly limited as long as the amplification product can be dissociated, and is, for example, 85 to 98 ° C. The heating time is not particularly limited, but is usually 1 second to 10 minutes, preferably 1 second to 5 minutes.
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。 The dissociated single-stranded DNA and the labeled probe can be hybridized, for example, by lowering the heating temperature in the dissociation step after the dissociation step. As temperature conditions, it is 35-50 degreeC, for example.
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。 The volume and concentration of each composition in the reaction system (reaction system) of the hybridization process are not particularly limited. As a specific example, in the reaction system, the concentration of DNA is, for example, 0.01-100 μmol / L, preferably 0.1-10 μmol / L, and the concentration of the labeled probe is, for example, relative to the DNA A range satisfying the addition ratio is preferable, for example, 0.01 to 100 μmol / L, and preferably 0.01 to 10 μmol / L.
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。 Then, the temperature of the reaction solution is changed, and a signal value indicating the melting state of the hybrid formed of the amplification product and the labeled probe is measured. Specifically, for example, the reaction solution (hybridized body of the single-stranded DNA and the labeled probe) is heated, and a change in signal value accompanying a temperature rise is measured. As described above, when a probe labeled with a terminal C base (guanine quenching probe) is used, fluorescence is reduced (or quenched) in a hybridized state with single-stranded DNA, and in a dissociated state, Fluoresce. Therefore, for example, the hybrid formed body in which the fluorescence is decreased (or quenched) may be gradually heated, and the increase in the fluorescence intensity accompanying the temperature increase may be measured.
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。 The temperature range for measuring the fluctuation of the fluorescence intensity is not particularly limited. For example, the start temperature is room temperature to 85 ° C, preferably 25 to 70 ° C, and the end temperature is 40 to 105 ° C, for example. is there. Moreover, the rate of temperature rise is not particularly limited, but is, for example, 0.05 to 20 ° C./second, and preferably 0.08 to 5 ° C./second.
被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。 The presence / absence of the test nucleic acid can be determined, for example, by measuring signal fluctuations during hybridization. That is, when a hybrid is formed by lowering the temperature of the reaction solution containing the probe, the signal fluctuation accompanying the temperature drop is measured.
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。 As a specific example, when a labeled probe (for example, a guanine quenching probe) that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization, it emits fluorescence when the single-stranded DNA and the probe are dissociated. However, when a hybrid is formed due to a decrease in temperature, the fluorescence is reduced (or quenched). Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually decreased to measure the decrease in fluorescence intensity accompanying the temperature decrease. On the other hand, when a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization, it does not emit fluorescence when the single-stranded DNA and the probe are dissociated, but the hybrid is not released due to a decrease in temperature. Once formed, it will fluoresce. Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered and the increase in fluorescence intensity accompanying the temperature drop may be measured.
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。 In the present invention, in order to determine the genotype at the target base site, the signal variation may be analyzed and determined as a Tm (melting temperature) value.
ｎｕｃ遺伝子検出キット
本発明のｎｕｃ遺伝子検出キットは、前記核酸プライマーセットを含み、前記ｎｕｃ遺伝子検出方法に用いることが出来る。該キットは、さらに前記核酸プローブを含み、そのほかに、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。
nuc Gene Detection Kit The nuc gene detection kit of the present invention includes the nucleic acid primer set and can be used in the nuc gene detection method. It is preferable that the kit further includes the nucleic acid probe and, in addition to that, a reagent necessary for a nucleic acid amplification reaction and / or a nucleic acid amplification product detection reaction as appropriate.
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
〔実施例１：ｎｕｃ遺伝子のシークエンス解析〕
（１）試料の調製
ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ （ｍｅｃＡ＋） ＤＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００００（コピー／μｌ）に調製したＤＮＡ希釈液、および分離培養された黄色ブドウ球菌のコロニーを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁したコロニー液を試料とした。前者を試料１、後者を試料２とした。
（２）核酸増幅およびシークエンス
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりｎｕｃ遺伝子をＰＣＲによって核酸増幅した。この核酸増幅産物をＰＣＲで使用した核酸プライマーを用いてシークエンス解析し、塩基配列を解読した。
[Example 1: Sequence analysis of nuc gene]
(1) Preparation of sample STAPHYLOCOCUS AUREUS (mecA +) DNA CONTROL (manufactured by Vircell) prepared with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) to 10000 (copy / μl), and isolated and cultured yellow grape A colony solution in which a cocci colony was suspended in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) was used as a sample. The former was sample 1 and the latter was sample 2.
(2) Nucleic acid amplification and sequencing The following reagents were added to the above samples, respectively, and the nuc gene was nucleic acid amplified by PCR under the following conditions. The nucleic acid amplification product was subjected to sequence analysis using nucleic acid primers used in PCR, and the base sequence was decoded.
核酸増幅用試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１４）１．０μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１５）１．０μｌ
１０×ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｖｅｒ．２（東洋紡）２．５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ １．５μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ０．５μｌ
試料 ２μｌ
精製水 １４μｌ
A solution containing the following reagents for nucleic acid amplification was prepared.
1.0 μl of 10 μM nucleic acid primer (SEQ ID NO: 14)
1.0 μl of 10 μM nucleic acid primer (SEQ ID NO: 15)
10 × KOD Plus Buffer Ver. 2 (Toyobo) 2.5μl
25 mM MgSO 4 1.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
KOD -Plus- 0.5 μl
Sample 2 μl
14 μl of purified water
核酸増幅
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９８℃・１０秒
６０℃・３０秒
６８℃・２０秒
（以上３５サイクル）
６８℃・１分
（以上１サイクル）
Nucleic acid amplification 94 ° C, 2 minutes (1 cycle or more)
98 ° C · 10 seconds 60 ° C · 30 seconds 68 ° C · 20 seconds (more than 35 cycles)
68 ℃, 1 minute (more than one cycle)
結果
シークエンス解析の結果、試料１からは配列番号１の塩基配列が、試料２からは配列番号２の塩基配列が得られ、両者でｎｕｃ遺伝子の塩基配列が大きく異なることが明らかになった。
As a result of sequence analysis, it was revealed that the base sequence of SEQ ID NO: 1 was obtained from sample 1 and the base sequence of SEQ ID NO: 2 was obtained from sample 2, and the base sequence of the nuc gene was greatly different between the two.
〔実施例２：本発明プライマー・プローブによるｎｕｃ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ （ｍｅｃＡ＋） ＤＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５０（コピー／μｌ）に調製したＤＮＡ希釈液、および分離培養された黄色ブドウ球菌のコロニーを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し、それをＴｒｉｓ前記緩衝液で１０倍希釈したコロニー希釈液を試料とした。前者を試料３、後者を試料４とした。試料３は配列番号１からなる塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有しており、試料４は配列番号２からなる塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有している。また、陰性コントロール（ＮＣ）として精製水を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりメチシリン耐性遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
[Example 2: Detection of nuc gene by primer / probe of the present invention]
(1) Preparation of sample STAPHYLOCOCCUS AUREUS (mecA +) DNA CONTROL (manufactured by Vircell) prepared with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) to 50 (copy / μl), and separated and cultured yellow grape A colony dilution obtained by suspending a cocci colony in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and diluting it 10 times with the above Tris buffer was used as a sample. The former was sample 3 and the latter was sample 4. Sample 3 has a nuc gene containing a base sequence consisting of SEQ ID NO: 1, and sample 4 has a nuc gene containing a base sequence consisting of SEQ ID NO: 2. Further, purified water was used as a sample as a negative control (NC).
(2) Nucleic acid amplification and melting curve analysis The following reagents were added to the above samples, respectively, and methicillin resistance genes were detected under the following conditions. GENECUBE (registered trademark) manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used for nucleic acid amplification and melting curve analysis.
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号６、７、８のいずれか一つ）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１０）０．３μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号１２、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料 試料３、試料４、精製水のいずれか一つ（１μｌ）
精製水２．２５μｌ
A solution containing the following reagents was prepared.
100 μM nucleic acid primer (any one of SEQ ID NOS: 6, 7, and 8) 0.15 μl
0.3 μl of 10 μM nucleic acid primer (SEQ ID NO: 10)
0.3 μl of 10 μM nucleic acid probe (SEQ ID NO: 12, 3 ′ end labeled with BODIPY-FL)
KOD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 μl
PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 μl
Sample One of sample 3, sample 4 and purified water (1 μl)
2.25 μl of purified water
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Nucleic acid amplification and melting curve analysis 94 ° C, 2 minutes (1 cycle or more)
97 ° C, 1 second 58 ° C, 3 seconds 63 ° C, 5 seconds (over 50 cycles)
94 ° C, 30 seconds, 39 ° C, 30 seconds, 39 ° C to 75 ° C (temperature rises at 0.09 ° C / second)
結果
図１は、フォワードプライマーが配列番号６、リバースプライマーが配列番号１０、核酸プローブが配列番号１２からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図１より明らかなように、試料３（Ｆ６,試料３）と試料４（Ｆ６,試料４）の両方からｎｕｃ遺伝子が検出されている。また、図２、図３は、フォワードプライマーとしてそれぞれ配列番号７、８の塩基配列からなる核酸プライマーを用い、リバースプライマーと核酸プローブは上記と同じものを用いて、同様の実験を行った結果である。いずれの組み合わせでも，試料３と試料４の両方が検出されていることが明らかである。
以上から、本発明の核酸プライマーは配列番号１および配列番号２のいずれの一部領域も核酸増幅可能であり、本発明の核酸プローブは配列番号１および配列番号２由来の核酸増幅産物の両方を検出できることが示され、また、本発明の方法は、配列番号１を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子および配列番号２を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子の両方を検出できる方法であることが示された。
Results FIG. 1 shows that the nucleic acid amplification was performed using the nucleic acid primer / probe combination consisting of SEQ ID NO: 6 for the forward primer, SEQ ID NO: 10 for the reverse primer, and SEQ ID NO: 12 for the nucleic acid probe. FIG. 6 is a graph showing the analysis results of the change in the graph with the horizontal axis of the graph representing the temperature and the vertical axis representing the differential value of the fluorescence signal. As is clear from FIG. 1, the nuc gene is detected from both sample 3 (F6, sample 3) and sample 4 (F6, sample 4). FIGS. 2 and 3 show the results of similar experiments using nucleic acid primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 as forward primers, and using the same reverse primers and nucleic acid probes as described above. is there. In any combination, it is clear that both sample 3 and sample 4 are detected.
As described above, the nucleic acid primer of the present invention can amplify a partial region of either SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and the nucleic acid probe of the present invention can detect both nucleic acid amplification products derived from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. It was shown that detection is possible, and the method of the present invention was shown to be a method that can detect both a nuc gene having a base sequence including SEQ ID NO: 1 and a nuc gene having a base sequence including SEQ ID NO: 2. .
〔比較例１：異なる核酸プライマーおよび核酸プローブを用いたｎｕｃ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
実施例２と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
[Comparative Example 1: Detection of nuc gene using different nucleic acid primers and nucleic acid probes]
(1) Sample preparation Same as Example 2.
(2) Nucleic acid amplification and melting curve analysis Same as Example 2.
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。なお、核酸プライマーの組み合わせについては表３に記載した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号１６）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１７）０．３μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号１８、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料 試料３、試料４、精製水のいずれか一つ（１μｌ）
精製水２．２５μｌ
結果
図４は上記試薬組成で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図４から、試料３からはｎｕｃ遺伝子を検出できているが（比較 試料３）、試料４はＮＣと同様の結果が得られており（比較 試料４、比較 ＮＣ）、試料４からのｎｕｃ遺伝子検出はできていないことが明らかである。
従って、異なる核酸プライマーおよび核酸プローブを用いると、本発明の検出方法と同様の方法を用いても、本発明のように配列番号１を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子および配列番号２を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子の両方を検出できる方法には成りえないことが示された。以上から、本発明で規定した特徴を有する核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いて、本発明の検出方法を実施することが重要であることが示された。
A solution containing the following reagents was prepared. The combinations of nucleic acid primers are shown in Table 3.
100 μM nucleic acid primer (SEQ ID NO: 16) 0.15 μl
0.3 μl of 10 μM nucleic acid primer (SEQ ID NO: 17)
0.3 μl of 10 μM nucleic acid probe (SEQ ID NO: 18, 3 ′ end labeled with BODIPY-FL)
KOD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 μl
PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 μl
Sample One of sample 3, sample 4 and purified water (1 μl)
2.25 μl of purified water
Results FIG. 4 is a graph showing the results of analysis of changes in fluorescence intensity with subsequent increase in temperature with the above reagent composition, with the horizontal axis of the graph representing temperature and the vertical axis representing the differential value of the fluorescence signal. From FIG. 4, the nuc gene was detected from sample 3 (comparative sample 3), but sample 4 obtained the same results as NC (comparative sample 4, comparative NC), and the nuc gene from sample 4 was obtained. It is clear that no detection has been made.
Therefore, when different nucleic acid primers and nucleic acid probes are used, even if the same method as the detection method of the present invention is used, the nucleotide sequence including the nuc gene having the nucleotide sequence including SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence including SEQ ID NO: 2 as in the present invention It has been shown that it cannot be a method capable of detecting both of the nuc genes having. From the above, it was shown that it is important to carry out the detection method of the present invention using a nucleic acid primer set and a nucleic acid probe having the characteristics defined in the present invention.
本発明を黄色ブドウ球菌の遺伝子検査に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れ、なおかつ高感度に黄色ブドウ球菌を検出することができる。さらに、配列番号１と９５％以上相同な塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌と、配列番号２と９５％以上相同な塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌の両方を検出できる検出方法、検出試薬を提供できる。 By utilizing the present invention for genetic testing of Staphylococcus aureus, it is possible to detect Staphylococcus aureus with both high speed and accuracy and high sensitivity. Furthermore, detection capable of detecting both Staphylococcus aureus having a nuc gene containing a nucleotide sequence 95% or more homologous to SEQ ID NO: 1 and Staphylococcus aureus having a nuc gene containing a nucleotide sequence 95% or more homologous to SEQ ID NO: 2. Methods and detection reagents can be provided.
Claims (11)
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
（Ａ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｂ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｃ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ A method for detecting the nuc gene of Staphylococcus aureus, the method comprising the following steps (1) to (3), wherein the nucleic acid primer set used in step (1) of the method is (A ) And (B), and the nucleic acid probe has the characteristics (C) and (D).
(1) Amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing a pair of nucleic acid primer sets (2) Forming a complex with the nucleic acid amplification product obtained by (1) and part or all of the nucleic acid amplification product A step of detecting a complex obtained in (3) and (2) by hybridizing with a possible nucleic acid probe to form a complex (A) a base sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 1 Nucleic acid primer set (B) that can amplify a part or all of a certain oligonucleotide (B) Nucleic acid primer set (C) that can amplify a part or all of an oligonucleotide that is a base sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 2 Can form a complex with the region amplified by the nucleic acid primer set among oligonucleotides having a nucleotide sequence of 95% identity or more with No. 1 Of the oligonucleotide is a nucleotide sequence having an acid probe (D) SEQ ID NO: 2 95% identity, nucleic acids capable of forming a complex with the amplified region by the nucleic acid primer set probe
（Ａ´）配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｂ´）配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｃ´）配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ´）配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ The method according to claim 1, wherein the nucleic acid primer set used in the step (1) of the method has the characteristics (A ') and (B'), and is used in the step (2). A method wherein the probe has the characteristics of (C ′) and (D ′).
(A ′) Nucleic acid primer set capable of amplifying a part or all of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (B ′) Part or all of the oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 Nucleic acid primer set (C ′) that can amplify nucleic acid probe (D ′) that can form a complex with the region amplified by the nucleic acid primer set, among oligonucleotides that are base sequences represented by SEQ ID NO: 1 Nucleic acid probe capable of forming a complex with the region amplified by the nucleic acid primer set in the oligonucleotide having the base sequence shown
（Ｅ）配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３´末端とし、該配列の５４番目〜６５番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号３で示される塩基配列の５９番目を３´末端とし、該配列の３１〜４１番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー A nucleic acid primer set comprising a pair of nucleic acid primers, wherein the forward primer has the following characteristics (E) and the reverse primer has the following characteristics (F).
(E) a nucleic acid primer (F) sequence having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 having the 3rd end at the 83rd or 84th base sequence and the 5 'end at any of the 54th to 65th bases of the sequence Nucleic acid primer having a nucleotide sequence having the 3rd end as the 59th nucleotide sequence of the nucleotide sequence indicated by No. 3 and the 5 'end as the 31st to 41st arbitrary bases in the sequence
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