JP2015050941A - Model animal showing disease state similar to human pulmonary hypertension, and creation method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト肺高血圧症の病態モデル動物及びその作製方法に関する。 The present invention relates to a disease model animal for human pulmonary hypertension and a method for producing the same.
ヒト肺（動脈）高血圧症は肺動脈圧の上昇を認める病態の総称であり、肺の血管に異常が生じるため、心臓への多大な負担と全身への酸素供給が障害される。
その発症には肺の血管障害に加え、遺伝的背景、肺動脈の物理的閉塞など、様々な要因があるが原因は特定されていない。
難治性であり、国の指定する特定疾患である。
治療としては、抗凝固薬投与、利尿薬投与、酸素療法などが行われる。
ヒトにおいて病理的解析が行われているが、その検体は肺高血圧症の末期の状態であるため、病態の初期段階の検体の入手は難しく、病態進行の過程を検討することは極めて困難である。
また、ほとんどの検体はすでに治療を受けた状態であるため、治療薬の影響を排除できない。
これらの問題点が肺高血圧症の発症メカニズムの解明を妨げている。
したがって、ヒト肺高血圧症に類似した動物モデルの構築は、発症メカニズムの解明に加えて治療の観点からも切望されている。
Human pulmonary (arterial) hypertension is a general term for pathological conditions in which an increase in pulmonary arterial pressure is observed, and abnormalities occur in the blood vessels of the lung, which impairs a great burden on the heart and oxygen supply to the whole body.
In addition to pulmonary vascular disorders, there are various factors such as genetic background and physical occlusion of the pulmonary artery, but the cause has not been identified.
It is refractory and is a specific disease designated by the country.
Treatment includes anticoagulant administration, diuretic administration, oxygen therapy, and the like.
Although pathological analysis has been performed in humans, it is difficult to obtain a specimen at the initial stage of the pathology because the specimen is in the end stage of pulmonary hypertension, and it is extremely difficult to examine the process of pathological progression .
In addition, since most specimens are already treated, the influence of the therapeutic agent cannot be excluded.
These problems hinder the elucidation of the onset mechanism of pulmonary hypertension.
Therefore, construction of an animal model similar to human pulmonary hypertension is eagerly desired from the viewpoint of treatment in addition to elucidation of the onset mechanism.
現在、ヒト肺高血圧症の動物モデルとして主に以下の３つのモデルが報告されている。
・モノクロタリン誘発性肺高血圧症モデル（非特許文献１）
ラットにモノクロタリンを６０ｍｇ／ｋｇを１回皮下投与し、３週間後に肺高血圧症を発症させるモデルである。
・低酸素誘発性肺高血圧症モデル（非特許文献２）
マウスやラットを２〜３週間１０％程度の低酸素状態で飼育し、肺高血圧症を発症させるモデルである。
・低酸素とVascular Endothelial Growth Factor（ＶＥＧＦ）受容体拮抗薬による肺高血圧症モデル（非特許文献３）
ラットに血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体拮抗薬を一回皮下注射し、１０％の低濃度チャンバーで三週間飼育、次いで、常酸素に戻し１０週間飼育し、肺高血圧症を発症させるモデルである。
一方、肺高血圧症が原因である肺性心のモデル動物として、インターロイキン６を投与することで、肺に類線維素形成及び血栓形成を起こし右心室肥大を引き起こし、肺性心を発症するラットが知られている（特許文献１）
Currently, the following three models are mainly reported as animal models of human pulmonary hypertension.
Monocrotaline-induced pulmonary hypertension model (Non-patent Document 1)
This is a model in which monocrotaline 60mg / kg is subcutaneously administered to rats once and pulmonary hypertension develops after 3 weeks.
・ Hypoxia-induced pulmonary hypertension model (Non-patent Document 2)
This is a model in which mice and rats are kept in hypoxia of about 10% for 2 to 3 weeks to develop pulmonary hypertension.
・ Pulmonary hypertension model with hypoxia and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) receptor antagonist (Non-patent Document 3)
A model in which rats are injected subcutaneously with a vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor antagonist once, reared in a 10% low concentration chamber for 3 weeks, then returned to normoxia for 10 weeks to develop pulmonary hypertension It is.
On the other hand, as a model animal of pulmonary heart caused by pulmonary hypertension, rats that develop pulmonary heart due to administration of interleukin 6 cause fibrinogenesis and thrombus formation in the lung, causing right ventricular hypertrophy Is known (Patent Document 1)
インターロイキン３３（ＩＬ−３３）は、宿主防御や免疫調節、神経性の損傷や炎症において重要な役割を担っているＩＬ−１ファミリーに属し、炎症誘発性のサイトカインと転写制御機能を有する核内因子の両方の機能を有するタンパク質である。
そして、肺高血圧症の患者の末梢血液の研究からＩＬ−３３の関与が指摘されている（非特許文献４）ものの、ＩＬ−３３が肺高血圧症の原因となっているかは不明である。
Interleukin 33 (IL-33) belongs to the IL-1 family, which plays an important role in host defense, immune regulation, neurological damage and inflammation, and has a pro-inflammatory cytokine and a transcriptional regulatory function in the nucleus. It is a protein that functions as both factors.
And although the involvement of IL-33 has been pointed out from studies of peripheral blood of patients with pulmonary hypertension (Non-patent Document 4), it is unclear whether IL-33 is a cause of pulmonary hypertension.
非特許文献１及び２のモデルでは、軽度〜中程度の肺高血圧の症状が観察されるが、いずれのモデルにおいてもヒトの末期の肺高血圧症の病態を呈していない。
また、非特許文献１のモデルは多臓器障害を引き起こし、適切なモデルではないとされる。
非特許文献３のモデルは非特許文献１及び２のモデルに比べて、ヒトの末期の肺高血圧症の病態に類似したモデルである。
このモデルに用いられるＶＥＧＦ受容体拮抗薬は本来血管新生を阻害する働きがあるが、低酸素状態では逆に特定の血管内皮細胞を増殖させ、その結果、肺高血圧症の病態が誘導されるものである。
しかしながら、ヒトの肺高血圧症の発症メカニズムがこのような作用機序によって誘導されているかは検討が必要である。
特許文献１におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）を利用したラットにおいて動脈血栓の形成が観察されたことが記載されているものの、組織学的には軽度の症状であり、最終的に症状が緩和・改善するモデルであるため、ヒトの肺高血圧症の動物モデルとしては不十分である。
例えば、ヒトＩＬ−６がラットＩＬ−６レセプターに結合した上で、正常なシグナルが伝達されているか定かでない。
また、抗ＩＬ−６ＩｇＧ抗体が検出されていることから、ラットにとって異物であるヒトＩＬ−６に対する免疫応答が起きているが、この反応が肺高血圧症の発症とどの程度関係しているか不明である。
In the models of Non-Patent Documents 1 and 2, mild to moderate symptoms of pulmonary hypertension are observed, but none of the models exhibits human pathological conditions of end-stage pulmonary hypertension.
In addition, the model of Non-Patent Document 1 causes multi-organ damage and is not an appropriate model.
Compared with the models of Non-Patent Documents 1 and 2, the model of Non-Patent Document 3 is a model similar to the pathological condition of human pulmonary hypertension at the end stage.
The VEGF receptor antagonist used in this model has the function of inhibiting angiogenesis originally, but in the hypoxia state, it proliferates specific vascular endothelial cells, and as a result, induces the pathology of pulmonary hypertension It is.
However, it is necessary to investigate whether the onset mechanism of human pulmonary hypertension is induced by such a mechanism of action.
Although it is described in Patent Document 1 that the formation of arterial thrombus was observed in rats using interleukin 6 (IL-6), it was mild histologically and finally alleviated. -Since this is an improved model, it is not sufficient as an animal model for human pulmonary hypertension.
For example, it is not clear whether normal signals are transmitted after human IL-6 binds to the rat IL-6 receptor.
Moreover, since anti-IL-6 IgG antibody has been detected, an immune response to human IL-6, which is a foreign body for rats, has occurred, but it is unclear how much this response is related to the development of pulmonary hypertension. is there.
ヒト肺高血圧症の発症要因は様々であり、上記の動物モデルの解析だけでは治療法の開発には不十分である。
また、ヒトの日常生活の中で肺高血圧症の発症要因である可能性が高い処置を用いた動物モデルが求められている。
The onset factors of human pulmonary hypertension vary, and analysis of the above animal model alone is insufficient for the development of therapeutic methods.
There is also a need for an animal model that uses treatments that are likely to be a causative factor of pulmonary hypertension in human daily life.
本発明者らは、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）をマウスに比較的長期間投与することによって、中膜肥厚、血管閉塞を伴う血管内膜の顕著な肥厚、血管周囲への炎症細胞の集積など、ヒトの肺高血圧症の中期〜後期の段階の再現が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
以下に本発明を詳細に説明する。
The present inventors administer interleukin 33 (IL-33) to mice for a relatively long period of time, thereby increasing medial thickness, markedly thickening of the intima with vascular occlusion, and accumulation of inflammatory cells around the blood vessels. The present inventors have found that it is possible to reproduce the middle to late stages of human pulmonary hypertension.
The present invention is described in detail below.
本発明に係るモデル動物は、げっ歯類にインターロイキン３３（ＩＬ−３３）を投与することで得られるヒト肺高血圧症に類似した病態を示す。
本発明に使用されるＩＬ−３３は、特に限定されることはなく、天然物由来であってもよいが、遺伝子組換法によって作製されたもの（リコンビナントＩＬ−３３）であってもよい。好ましくは、リコンビナントＩＬ−３３が挙げられる。
遺伝子組換法による作製方法は、自体公知の方法によることができる。
The model animal according to the present invention exhibits a pathological condition similar to human pulmonary hypertension obtained by administering interleukin 33 (IL-33) to rodents.
IL-33 used in the present invention is not particularly limited and may be derived from a natural product, but may be one produced by a genetic recombination method (recombinant IL-33). Preferably, recombinant IL-33 is mentioned.
The production method by the gene recombination method can be a method known per se.
本発明に使用されるげっ歯類としてはマウスが好ましい。 The rodent used in the present invention is preferably a mouse.
ＩＬ−３３をげっ歯類に投与する方法として、静脈投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与などが挙げられるが、好ましいものとして腹腔内投与が挙げられる。 Examples of the method for administering IL-33 to rodents include intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intranasal administration, and the like, and preferred is intraperitoneal administration.
ＩＬ−３３をげっ歯類に投与する量としては、１回につき体重１ｇ当たり０．００５〜０．１μg、好ましくは、０．０１〜０．０５μｇの範囲で選ばれる。
前記の投与量は、実験条件によっても異なり、これらの値に限定されるものでない。
投与回数としては１週１回ないし２回、好ましくは１週１回であるが、これに限定されるものではない。
通常、上記投与を１〜４週間続けることにより、ヒト肺高血圧症に類似した病態を発症させることができる。
肺高血圧症の確認は、最終投与の一週間後に肺組織を採取し、中膜肥厚、血管閉塞を伴う血管内膜の顕著な肥厚、血管周囲への炎症細胞の集積などを組織学的に解析すればよい。
このようなモデル動物を使用すると、肺高血圧症の治療薬のスクリーニングに有用である。
The amount of IL-33 administered to rodents is selected in the range of 0.005 to 0.1 μg, preferably 0.01 to 0.05 μg, per gram of body weight per time.
The dose varies depending on the experimental conditions and is not limited to these values.
The frequency of administration is once or twice a week, preferably once a week, but is not limited thereto.
Usually, by continuing the above administration for 1 to 4 weeks, a pathological condition similar to human pulmonary hypertension can be developed.
For confirmation of pulmonary hypertension, lung tissue is collected one week after the final administration, and histological analysis of media thickening, marked thickening of the intima with vascular occlusion, accumulation of inflammatory cells around the blood vessels, etc. do it.
Use of such a model animal is useful for screening a therapeutic drug for pulmonary hypertension.
本発明は、これまでの動物モデルと比べて以下の点で優れている。
（１）ヒトの肺高血圧症の引き金となっている可能性の高い処置を施すことにより、実際の病態進行に近いモデルである。
（２）ヒトの肺高血圧症の末期の状態に近い病態（Heath-Edwards分類法のGrade3）も再現している。
（３）投与方法に特に制限がないものの腹腔内投与等の直接投与のみでも実施することができ、動物飼育用の低酸素チャンバーなどの専用機器が不要ある。
The present invention is superior to the conventional animal models in the following points.
(1) It is a model close to the actual progression of the disease state by performing a treatment that is likely to trigger human pulmonary hypertension.
(2) The condition close to the end stage of human pulmonary hypertension (Grade 3 of Heath-Edwards classification) is also reproduced.
(3) Although there is no particular limitation on the administration method, it can be carried out only by direct administration such as intraperitoneal administration, and a dedicated device such as a hypoxic chamber for animal breeding is unnecessary.
以下、本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention, this invention is not limited to these.
マウス成獣（Ｃ５７ＢＬ／６系統、７〜１０週令）に４００ｎｇのリコンビナントマウスＩＬ−３３（ｒｍＩＬ−３３），［Ｒ＆Ｄ社より購入、４μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解］を、１週間に１回、１週間，３週間，５週間，７週間、腹腔内投与した。
最終投与の１週間後に肺組織を採取し、組織学的に解析した。
野生型マウスにｒｍＩＬ−３３もしくはＰＢＳを投与後、パラフィン包埋し作成した肺組織切片をＨ＆Ｅ染色で解析した結果を図１に示す。
血管病態の重症度はＨｅａｔｈ−Ｅｄｗａｒｄｓ分類法（Heath D, Edwards JE., Circulation 1958;18:533-547）に従った。
ｒｍＩＬ−３３投与後１週間ではＰＢＳ投与に比べ、ごく稀にＧｒａｄｅ１の症状が観察されはしたが、ほとんど影響は認められなかった。
３週間の投与では、Ｇｒａｄｅ３の求心性の内膜肥大が観察された。
５週間の投与では、３週間と比べ顕著な変化はなかったが、７週間では管腔内の内膜が肥大した箇所に毛細血管が確認され始め、Ｇｒａｄｅ４に近い病態が観察された。
この結果から本発明に係る動物モデルは、中膜肥厚，血管閉塞を伴う血管内膜の顕著な肥厚，血管周囲への炎症細胞の集積が認められ、ヒトの肺高血圧症の中期〜後期の段階に類似する病態が再現されていることが明らかになった。
400 ng recombinant mouse IL-33 (rmIL-33), [purchased from R & D, PBS (phosphate buffered saline) at a concentration of 4 μg / ml] for adult mice (C57BL / 6 strain, 7-10 weeks old) Dissolution] was administered intraperitoneally once a week for 1, 3, 5 and 7 weeks.
One week after the final administration, lung tissue was collected and analyzed histologically.
FIG. 1 shows the results of H & E staining of lung tissue sections prepared by administering rmIL-33 or PBS to wild-type mice and then embedding them in paraffin.
The severity of the vascular pathology followed the Heath-Edwards classification (Heath D, Edwards JE., Circulation 1958; 18: 533-547).
One week after rmIL-33 administration, Grade 1 symptoms were observed very rarely compared with PBS administration, but almost no effect was observed.
Grade 3 afferent intimal hypertrophy was observed after 3 weeks of administration.
When administered for 5 weeks, there was no significant change compared to 3 weeks, but at 7 weeks, capillaries began to be observed at the site where the intima in the lumen was enlarged, and a condition close to Grade 4 was observed.
From these results, in the animal model according to the present invention, medial thickening, marked thickening of the intima with vascular occlusion, and accumulation of inflammatory cells around the blood vessels were observed. It became clear that the pathological condition similar to was reproduced.
近年、炎症が肺高血圧症の引き金であることを示唆する事例が多々報告されており、ＩＬ−３３も炎症を惹起する因子である。
ＩＬ−３３はアレルギー性の炎症を誘導することが知られており、比較的研究が盛んに行われている分子である。
特に気管支に異物が侵入すると分泌される分子であり、肺高血圧症の原因の一つである可能性が極めて高い。
その生産細胞や標的細胞も明らかとなっており、病態の解析がスムーズに行える。
In recent years, there have been many reports suggesting that inflammation is a trigger for pulmonary hypertension, and IL-33 is also a factor that causes inflammation.
IL-33 is known to induce allergic inflammation, and is a molecule that has been actively studied.
In particular, it is a molecule that is secreted when a foreign body enters the bronchus, and is very likely to be one of the causes of pulmonary hypertension.
The production cells and target cells have also been clarified, and pathological analysis can be performed smoothly.
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| US10479836B2 (en) | 2015-06-01 | 2019-11-19 | National University Corporation University Of Toyama | Method for treating pulmonary hypertension with interleukin-5 receptor antibody |
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2013
- 2013-09-05 JP JP2013183870A patent/JP2015050941A/en active Pending
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| CN112300265A (en) * | 2019-07-29 | 2021-02-02 | 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 | Construction method and application of IL33 gene humanized non-human animal |
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