JP2015027283A

JP2015027283A - Multiplex dna typing method of crab-eating macaque mhc gene, and primer set

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Publication number: JP2015027283A
Application number: JP2013158501A
Authority: JP
Inventors: 隆椎名; Takashi Shiina; 幸穂山田; Yukiho Yamada; 一誠小笠原; Kazumasa Ogasawara; 正穗太田; Masao Ota
Original assignee: Tokai University; Shinshu University NUC; Shiga University of Medical Science NUC; Ina Research Inc
Current assignee: Tokai University; Shinshu University NUC; Shiga University of Medical Science NUC; Ina Research Inc
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2015-02-12

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a DNA typing method capable of quickly and simply selecting an individual crab-eating macaque having a specific Mafa gene type.SOLUTION: A DNA typing method of crab-eating macaque Mafa gene includes the following steps: (1) a step of preparing a primer set for performing PCR amplification from an exon 2 region to an exon 4 region of Mafa-A and Mafa-B gene in a crab-eating macaque cDNA base sequence and from an exon 1 region to an exon 3 region of Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPA1 gene in the same PCR conditions; (2) a step of amplifying by using primer sets of Mafa-A, Mafa-B, Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1 through performing PCR in one or three containers in the same PCR conditions using cDNA synthesized from a test sample (RNA) as a template (herein, in the case of amplifying in one container, all primer sets are used in one container. Further, in the case of amplifying in three container, the primer sets of Mafa-A and Mafa-B are used in a first container, the primer set of Mafa-DRB is used in a second container, and the primer sets of Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1 are used in a third container); (3) a step of determining a base sequence of a PCR product; and (4) a step of executing homology search with database arbitrarily.

Description

本発明は、ハイスループットＤＮＡシークエンサーを用いたカニクイザルＭＨＣ遺伝子のマルチプレックスＤＮＡタイピング方法、及びそれに用いるプライマーセットに関する。さらに本発明は、上記したマルチプレックスＤＮＡタイピング方法を用いて特定のＭａｆａ遺伝子（カニクイザルのＭＨＣ遺伝子）を有するカニクイザルを選別する方法に関する。 The present invention relates to a method for multiplex DNA typing of cynomolgus monkey MHC gene using a high-throughput DNA sequencer, and a primer set used therefor. Furthermore, the present invention relates to a method for selecting a cynomolgus monkey having a specific Mafa gene (cynomolgus monkey MHC gene) using the multiplex DNA typing method described above.

主要組織適合遺伝子複合体（ＭａｊｏｒＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっている。カニクイザルのＭＨＣであるＭａｆａ（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）では、主なものとして５種類の抗原が知られている。ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ抗原（Ｍａｆａ−Ａ，Ｍａｆａ−Ｂ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ抗原（Ｍａｆａ−ＤＲ，Ｍａｆａ−ＤＱ，Ｍａｆａ−ＤＰ）である。 Major histocompatibility complex (MHC) is deeply involved in the induction of immune response by presenting foreign protein-derived peptides such as pathogens and self-protein-derived peptides to T cells. In an MHC cynomolgus Mafa (Ma caca fa scicularis), and five types of antigens as mainly is known. Class I antigens (Mafa-A, Mafa-B) expressed in almost all cells, and class II antigens (Mafa-DR, Mafa-DQ, Mafa-DP) expressed mainly in cells of the immune system is there.

ＭＨＣクラスＩ抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ２−ミクログロブリンからなり、ＭＨＣクラスＩＩ抗原は高度な多型が存在するβ鎖と比較的多型性が少ないα鎖から成る（図１参照）。クラスＩ分子のα鎖はＭａｆａ−Ａ，Ｍａｆａ−Ｂの各遺伝子にコードされ、クラスＩＩ抗原のβ鎖はＭａｆａ−ＤＲＢ，Ｍａｆａ−ＤＱＢ１，Ｍａｆａ−ＤＰＢ１、α鎖はＭａｆａ−ＤＲＡ１，Ｍａｆａ−ＤＱＡ１，Ｍａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子にコードされている（図２参照）。 MHC class I antigen is composed of α-chain showing high polymorphism and β2-microglobulin with almost no polymorphism, and MHC class II antigen is relatively low in polymorphism with β-chain having high polymorphism. It consists of an α chain (see Fig. 1). The α chain of the class I molecule is encoded by Mafa-A and Mafa-B genes, the β chain of the class II antigen is Mafa-DRB, Mafa-DQB1, Mafa-DPB1, and the α chain is Mafa-DRA1, Mafa-DQA1 , Encoded by the Mafa-DPA1 gene (see FIG. 2).

遺伝子レベルでは、ＭａｆａクラスＩ抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン２とエクソン３が高度な多型性を示し、ＭａｆａクラスＩＩ抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン２が高度な多型性を示す。 At the gene level, exon 2 and exon 3 of the gene encoding the α chain show high polymorphism in the Mafa class I antigen, and exon 2 of the gene encoding the β chain in the Mafa class II antigen shows high polymorphism. Show polymorphism.

Ｍａｆａをコードしている遺伝子領域の染色体位置は不明であるが、ヒトのＭＨＣ領域であるヒト白血球抗原（ＨｕｍａｎＬｅｕｋｏｃｙｔｅＡｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）遺伝子領域を参照した場合、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（Ｍａｆａ−Ａ，Ｍａｆａ−Ｂ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（Ｍａｆａ−ＤＲＡ，Ｍａｆａ−ＤＲＢ，Ｍａｆａ−ＤＱＡ１，Ｍａｆａ−ＤＱＢ１，Ｍａｆａ−ＤＰＡ１，Ｍａｆａ−ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされている（図３と図４参照）。クラスＩＩＩ領域にはＭＨＣ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。 The chromosome position of the gene region encoding Mafa is unknown, but when referring to the human leukocyte antigen (HLA) gene region which is a human MHC region, the class is directed from the telomere side toward the centromere side. I region (Mafa-A, Mafa-B, etc.), Class III region, Class II region (Mafa-DRA, Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1, Mafa-DPB1, etc.) Many genes are encoded at very high density (see FIGS. 3 and 4). There is no MHC gene in the class III region, and genes such as complement components and tumor necrosis factor (TNF) are present.

Ｍａｆａ−Ａ抗原のα鎖をコードするＭａｆａ−Ａ遺伝子座位には、少なくとも５種類の構造多型が確認されている（図５参照）。Ｍａｆａ−ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＭａｆａ−ＤＲＢ遺伝子座位には、少なくとも２０種類の構造多型が確認されている（図６参照）。一方、Ｍａｆａ−Ｂ抗原のα鎖をコードするＭａｆａ−Ｂ遺伝子座位にも、数多くの構造多型が確認されている（非特許文献１）。 At least five structural polymorphisms have been confirmed at the Mafa-A locus encoding the α chain of the Mafa-A antigen (see FIG. 5). At least 20 types of structural polymorphisms have been confirmed in the Mafa-DRB locus encoding the β chain of the Mafa-DR antigen (see FIG. 6). On the other hand, many structural polymorphisms have also been confirmed at the Mafa-B gene locus encoding the α chain of the Mafa-B antigen (Non-patent Document 1).

各ＭＨＣ遺伝子のエクソンには複数の多型性に富む領域（多型領域）が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のＭＨＣ対立遺伝子（ＭＨＣアリル）に共通であることも多い。すなわちＭＨＣアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＭＨＣクラスＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が複数のアリルに共通であることもある。 Each exon of each MHC gene has a plurality of polymorphic regions (polymorphic regions), and the base sequence (amino acid sequence) of a certain polymorphic region is common to a plurality of MHC alleles (MHC alleles). There are many things. That is, MHC allele is defined by a combination of a plurality of polymorphic regions. In the MHC class I antigen, exon 2 or exon 3 having the same base sequence may be common to a plurality of alleles as well as the polymorphic region in the exon.

ＭＨＣには高度な多型が存在するためＭＨＣアリルの種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、ＭＨＣ型の系統を判別する第１区域、同一系統内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第２区域、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第３区域、及びＭＨＣ分子をコードする遺伝子領域外（イントロン）での塩基置換を伴うアリルを判別する第４区域である（図７参照）。
この分類法に基づいた場合、１２６９種類のＭａｆａアリルがこれまでに登録されている（図４参照）。 It is known that MHC alleles are very many because there are advanced polymorphisms in MHC, and their notation is also determined. That is, a first zone for discriminating MHC type strains, a second zone for discriminating alleles with amino acid substitutions in the same strain, a third zone for discriminating alleles with base substitutions without amino acid mutations, and MHC molecules This is the fourth zone for discriminating alleles with base substitution outside the gene region (intron) encoding (see FIG. 7).
Based on this classification method, 1269 types of Mafa alleles have been registered so far (see FIG. 4).

ヒトの場合、移植の際のドナーとレシピエントとの間のＨＬＡ型を一致させることは拒絶反応回避のために重要な要素となっている。また、特定のＨＬＡ型が自己免疫疾患、アレルギー性疾患、がん、造血幹細胞移植に伴う移植片対宿主（ｇｒａｆｔｖｅｒｓｕｓｈｏｓｔ；ＧＶＨ）病、ウイルス感染症における防御と重症化、さらには薬剤副作用に関連するなど数多くの医学的に重要な知見が報告されている。よって、Ｍａｆａ型の多型情報を知ることは、カニクイザルを用いた再生医療研究、細胞や組織移植研究、がん治療薬開発およびワクチン開発研究における基礎研究を臨床研究に結び付けるための重要な要素になる。従って、ＭＨＣタイピングを正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。 In humans, matching the HLA type between the donor and recipient at the time of transplantation is an important factor for avoiding rejection. In addition, certain HLA types may be used for autoimmune diseases, allergic diseases, cancer, graft-versus-host (GVH) disease associated with hematopoietic stem cell transplantation, defense and aggravation in viral infections, and drug side effects. Numerous medically important findings have been reported. Therefore, knowing the polymorphism information of Mafa type is an important element for linking basic research in regenerative medicine research using cynomolgus monkeys, cell and tissue transplantation research, cancer drug development research and vaccine development research to clinical research. Become. Therefore, it is extremely important clinically to perform MHC typing accurately and with high accuracy.

他方、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の樹立が報告されて以来、ｉＰＳ細胞の臨床応用研究がさかんに行われている。ｉＰＳ細胞の臨床応用研究においては、ｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞を生体に移植する研究が必須である。ｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞の生体への移植研究においては、ヒトへの移植に先立ってカニクイザルへの移植実験を行うことが一般的である。ｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞をカニクイザルに移植する際には、拒絶反応を回避するためには、移植細胞と同じＭＨＣ遺伝子型を有するカニクイザルを予め選別しておき、このカニクイザルに細胞を移植することが必要である。移植が成功することによって、はじめて移植ｉＰＳ細胞の有効性や副作用を明らかにすることができる。 On the other hand, since the establishment of induced pluripotent stem cells (iPS cells) was reported, clinical application studies of iPS cells have been conducted extensively. In clinical application research of iPS cells, it is essential to transplant cells derived from iPS cells into living bodies. In transplantation research into cells of cells induced to differentiate from iPS cells, it is common to conduct transplantation experiments into cynomolgus monkeys prior to transplantation into humans. When transplanting cells induced to differentiate from iPS cells into cynomolgus monkeys, in order to avoid rejection, a cynomolgus monkey having the same MHC genotype as that of the transplanted cells is selected in advance, and the cells are transplanted into this cynomolgus monkey. is necessary. Only after successful transplantation can the effectiveness and side effects of transplanted iPS cells be revealed.

従来、Ｍａｆａ遺伝子におけるＤＮＡタイピング法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）に基づくＳＢＴ（ＳｅｑｕｅｎｃｅＢａｓｅｄＴｙｐｉｎｇ）法やＰＣＲ産物のサブクローニングにより得られるクローンの塩基配列を決定すること（サブクローニング法）により進められてきた。非特許文献１では、１３５個体の血縁関係のある個体のＭａｆａ−Ｂ遺伝子座位の多型解析を行い、数多くの新規アリルを同定したこと、そしてＭａｆａ−Ｂ遺伝子座位に構造多型を同定したことが記載されている。従来のＳＢＴ法では、多型領域の染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じ、高精度なＤＮＡタイピングが難しい場合があった。とりわけＭａｆａ−Ａ，Ｍａｆａ−Ｂ及びＭａｆａ−ＤＲＢ遺伝子座位では構造多型が観察されるため、この方法の使用は不可能であった。また、カニクイザルのＭＨＣ領域には、発現しているＭａｆａ遺伝子の他に多数の偽遺伝子が位置することから、ＤＮＡを使用したＤＮＡタイピングも困難であった。さらにサブクローニング法では、多数のサンプルを迅速にタイピングできないという短所もあった。従って、従来のＤＮＡタイピング法では、アリルの検出を見逃す可能性があった。 Conventionally, the DNA typing method in the Mafa gene includes determining the base sequence of clones obtained by SBT (Sequence Based Typping) method based on polymerase chain reaction (PCR) or subcloning of PCR products (subcloning method). Has been promoted by. In Non-Patent Document 1, polymorphism analysis of the Mafa-B gene locus of 135 related individuals was performed, a number of novel alleles were identified, and structural polymorphism was identified at the Mafa-B gene locus Is described. In the conventional SBT method, the positional relationship between cis and trans on the chromosome of the polymorphic region may not be determined accurately, resulting in phase ambiguity, and high-precision DNA typing is difficult. There was a case. In particular, this method could not be used because structural polymorphisms were observed at the Mafa-A, Mafa-B and Mafa-DRB loci. In addition, since many pseudogenes are located in the MHC region of cynomolgus monkeys in addition to the expressed Mafa gene, DNA typing using DNA was difficult. Furthermore, the subcloning method has a disadvantage that it cannot type a large number of samples quickly. Therefore, the conventional DNA typing method may miss allele detection.

特許文献１には、ヒトＭＨＣであるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子のＤＮＡタイピング方法及びキットが記載されている。具体的には、特許文献１には、（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ，ＨＬＡ−ＤＱＡ１，ＨＬＡ−ＤＱＢ１，ＨＬＡ−ＤＰＡ１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１の各遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１のエクソン２及び３’側の非翻訳領域に特異的にアニールするプライマーセットを準備するステップ；（２）前記プライマーセットを用いて被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲ増幅するステップ；（３）ＰＣＲ増幅された産物の塩基配列を決定するステップ；及び（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法が記載されている。特許文献１に記載の発明は、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供することを課題とするものであり、長いＰＣＲ産物をシークエンシングする手法を採用している。 Patent Document 1 describes a DNA typing method and kit for a human leukocyte antigen (HLA) gene, which is a human MHC. Specifically, Patent Document 1 describes (1) the upstream of each gene of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, and HLA-DPB1 in the human genome base sequence. Preparing a primer set that specifically anneals to each of the region and the downstream region and a primer set that specifically anneals to the untranslated regions on exons 2 and 3 ′ of HLA-DRB1; (2) using the primer set A step of PCR amplification of a test sample (DNA); (3) a step of determining a base sequence of the PCR amplified product; and (4) optionally performing a homology search with a database, The HLA DNA typing method is described. The invention described in Patent Document 1 is to provide a highly accurate DNA typing method and kit that eliminates ambiguity derived from phase ambiguity, and a method for sequencing a long PCR product Is adopted.

国際公開ＷＯ２０１３／０１１７３４Ａ１International Publication WO2013 / 011734A1

ＯｔｔｉｎｇＮ．等、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，第６１巻、７４５−７５３頁、２００９Hotting N. Et al., Immunogenetics, Vol. 61, pp. 745-753, 2009. ＷｉｓｅｍａｎＲ．Ｗ．等、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、第１５巻、１３２２−１３２７頁（２００９年）Wiseman R.M. W. Et al., Nature Medicine, Vol. 15, p. 1322-1327 (2009).

本発明は、各Ｍａｆａ遺伝子におけるプライマーの設計、各Ｍａｆａ遺伝子のＰＣＲ条件（アニーリング温度）を設定すること、その条件に基づいたＭａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のマルチプレックスＰＣＲ法を開発することにより、特定のＭａｆａ遺伝子タイプを有するカニクイザル個体を迅速かつ簡便に選抜することを可能とするＤＮＡタイピング方法を提供することを課題とする。 In the present invention, primer design in each Mafa gene, setting of PCR conditions (annealing temperature) for each Mafa gene, Mafa-A, Mafa-B, Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa- based on the conditions are set. PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a DNA typing method capable of selecting cynomolgus monkey individuals having a specific Mafa gene type quickly and easily by developing a multiplex PCR method of DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1 And

本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、ＭａｆａクラスＩ抗原であるＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ、ＭａｆａクラスＩ抗原であるＭａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１について、それらのＭａｆａ遺伝子を特異的に、かつ同一のアニーリング温度で増幅しうるＰＣＲプライマーを設計すること、１台のＰＣＲ装置で１度に上記のＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピングを可能とする好適なＰＣＲ条件を設定すること、その条件に基づいて３本の容器（（容器１：Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ）、（容器２：Ｍａｆａ−ＤＲＢ）、（容器３：Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１））のみでＰＣＲできるマルチプレックスＰＣＲ法を開発すること、並びにハイスループットシークエンシング技術を駆使することにより、本発明を完成するに至った。 As a result of repeated studies to solve the above problems, the present inventors have made Mafa-A and Mafa-B, which are Mafa class I antigens, Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa class I antigens, For Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1, design PCR primers that can amplify the Mafa genes specifically and at the same annealing temperature; DNA typing of the Mafa genes at once with one PCR device Based on the conditions, three containers ((Container 1: Mafa-A and Mafa-B), (Container 2: Mafa-DRB), (Container 3: Mafa) are set. PCR can be performed only with DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1)) To develop Ruchi plex PCR method, and by making full use of the high-throughput sequencing technology, and we have completed the present invention.

即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］以下のステップを含むカニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング方法。
（１）カニクイザルｃＤＮＡ塩基配列におけるＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子のエクソン２領域からエクソン４領域、Ｍａｆａ−ＤＲＢ，Ｍａｆａ−ＤＱＡ１，Ｍａｆａ−ＤＱＢ１，Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子のエクソン１領域からエクソン３領域を同一のＰＣＲ条件にてＰＣＲ増幅させるためのプライマーセットを準備するステップ；
（２）Ｍａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットを用いて、被検試料（ＲＮＡ）から合成したｃＤＮＡを鋳型として、１本あるいは３本の容器内で同一のＰＣＲ条件にてＰＣＲを行うことにより増幅するステップ（ここで、１本の容器で行う場合は、１つの容器内で全てのプライマーセットを用いる。また、３本の容器で行う場合は、第１の容器ではＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂのプライマーセットを用い、第２の容器ではＭａｆａ−ＤＲＢのプライマーセットを用い、第３の容器ではＭａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットを用いる）；
（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。 That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
[1] A method for DNA typing of a cynomolgus monkey Mafa gene, comprising the following steps.
(1) From the exon 2 region to the exon 4 region of the Mafa-A and Mafa-B genes in the cynomolgus monkey cDNA nucleotide sequence, from the exon 1 region of the Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPA1 genes Preparing a primer set for PCR amplification of the exon 3 region under the same PCR conditions;
(2) Mafa-A, Mafa-B, Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1, and Mafa-DPB1 primer sets, and cDNA synthesized from a test sample (RNA) as a template Amplifying by carrying out PCR under the same PCR conditions in one or three containers (where all primer sets are used in one container when performing in one container. When using three containers, Mafa-A and Mafa-B primer sets are used in the first container, Mafa-DRB primer sets are used in the second container, and Mafa-DQA1 is used in the third container. , Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1 primer sets);
(3) determining the base sequence of the PCR product; and (4) optionally performing a homology search with the database.

［２］Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂのプライマーセットが配列番号１及び２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＲＢのプライマーセットが配列番号３及び４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１のプライマーセットが配列番号５及び６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１のプライマーセットが配列番号７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１のプライマーセットが配列番号９及び１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｍａｆａ−ＤＰＢ１のプライマーセットが配列番号１１及び１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、［１］に記載の方法。
［３］ＰＣＲ条件が、９５〜９８℃で１０〜２０秒間、５５〜６５℃で３０〜６０秒間、６５〜７２℃で３０〜６０秒間の３ステップを１工程として、これを３０〜４０回繰り返す条件である、［１］又は［２］に記載の方法。 [2] The Mafa-A and Mafa-B primer sets are oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, and the Mafa-DRB primer set is an oligonucleotide having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4. The Mafa-DQA1 primer set is an oligonucleotide having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6, the Mafa-DQB1 primer set is the oligonucleotide having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8, and the Mafa-DPA1 primer The method according to [1], wherein the set is an oligonucleotide having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10, and the Mafa-DPB1 primer set is an oligonucleotide having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 and 12.
[3] The PCR conditions are 95 to 98 ° C. for 10 to 20 seconds, 55 to 65 ° C. for 30 to 60 seconds, and 65 to 72 ° C. for 30 to 60 seconds. The method according to [1] or [2], which is a repeated condition.

［４］配列番号１及び２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
［５］配列番号：３及び４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＲＢ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
［６］配列番号５及び６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。 [4] A primer set for DNA typing of Mafa-A and Mafa-B genes, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2.
[5] A primer set for DNA typing of the Mafa-DRB gene, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4.
[6] A primer set for DNA typing of the Mafa-DQA1 gene, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6.

［７］配列番号７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
［８］配列番号９及び１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
［９］配列番号１１及び１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、Ｍａｆａ−ＤＰＢ１遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。 [7] A primer set for DNA typing of the Mafa-DQB1 gene, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8.
[8] A primer set for DNA typing of the Mafa-DPA1 gene, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10.
[9] A primer set for DNA typing of the Mafa-DPB1 gene, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 11 and 12.

［１０］配列番号１から１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる、Ｍａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
［１１］［１０］に記載のプライマーセット、及びＤＮＡポリメラーゼを含む、Ｍａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング用キット。
［１２］［１］から［３］の何れかに記載の方法により、被検試料に含まれるカニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡをタイピングし、その結果に基づいて特定のＭａｆａ遺伝子を有するカニクイザルを選別する方法。 [10] A primer set for DNA typing of the Mafa gene, comprising an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 12.
[11] A kit for DNA typing of the Mafa gene, comprising the primer set according to [10] and a DNA polymerase.
[12] A method for typing cynomolgus monkey Mafa gene DNA contained in a test sample by the method according to any one of [1] to [3] and selecting a cynomolgus monkey having a specific Mafa gene based on the result .

本発明の方法は１分子からのＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、アリルの検出を見逃す可能性を軽減させ、且つシス・トランスの位置関係不明なフェーズ・アンビギュイティの認められないＤＮＡタイピング法であり、例えば、移植の際のドナーとレシピエントとの間における高精度なＭａｆａ型の一致が実現される。本発明では、１台のＰＣＲ増幅装置で１度にすべてのＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピングを可能とする好適なＰＣＲ条件を設定することから、操作上の迅速化及び簡便化が実現される。さらに本発明では、Ｍａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のマルチプレックスＰＣＲ法を提供することから、ドナーとレシピエントとの間のＭａｆａ型の高精度かつ迅速なＤＮＡタイピングが実現される。 The method of the present invention provides the entire base sequence necessary for DNA typing of the Mafa gene from a single molecule, thus reducing the possibility of missing allele detection and phase ambiguity with unknown cis-trans positional relationship. The DNA typing method is not recognized, and for example, high-precision Mafa-type matching between the donor and the recipient at the time of transplantation is realized. In the present invention, since a suitable PCR condition that enables DNA typing of all Mafa genes at one time is set with one PCR amplification apparatus, speeding up and simplification of operation are realized. Furthermore, the present invention provides a multiplex PCR method of Mafa-A, Mafa-B, Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1, and therefore, between a donor and a recipient. Mafa type high-precision and rapid DNA typing is realized.

Ｍａｆａ遺伝子領域を示す図である。ＷａｔａｎａｂｅＡ．等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、８９巻、４０２−４１２頁、２００７年から引用した。It is a figure which shows a Mafa gene area | region. Watanabe A.M. Et al., Genomics, 89, 402-412, 2007. ＭＨＣクラスＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第３５頁から引用した。It is a figure which shows the relationship between MHC class I gene structure and molecular structure. Supervised by Hidetoshi Isogo, Takehiko Suzuki, Takeo Kuro, “Transplantation / Transfusion Testing”, Kodansha Scientific, 2004, p.35. ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４６頁〜第４７頁から引用した。It is a figure which shows the relationship between MHC class II gene structure and molecular structure. Supervised by Hidetoshi Isogo, Takehiko Suzuki, Takeo Kuro, “Transplantation and Blood Transfusion Laboratory”, Kodansha Scientific, 2004, pp. 46-47. 代表的なMHC遺伝子のゲノム構成と多型性を示す図である。代表的なヒトとカニクイザルにおけるMHC遺伝子の種類とMHC領域における大まかな位置を記した。括弧はそれぞれの遺伝子に同定されているアリル数を示す。ヒトのアリル情報は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)、カニクイザルのアリル情報は、ＩＰＤ−ＭＨＣＤａｔａｂａｓｅのＶｅｒｓｉｏｎ１．７．０ (http://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/nhp/nomen_mafa.html) をそれぞれ参照した。It is a figure which shows the genome structure and polymorphism of a typical MHC gene. The types of MHC genes in representative humans and cynomolgus monkeys and their approximate positions in the MHC region are noted. The parentheses indicate the number of alleles identified for each gene. Human allele information is IMGT / HLA Database Release (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/), Cynomolgus monkey allele information is IPD-MHC Database Version 1.7.0 (http (http://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/nhp/nomen_mafa.html). Ｍａｆａ−Ａ遺伝子座位における構造多型を示す図である。ＯｔｔｉｎｇＮ．等、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５９巻、３６７−３７５頁、２００７年から引用した。It is a figure which shows the structural polymorphism in Mafa-A gene locus. Hotting N. Et al., Immunogenetics, 59, 367-375, 2007. Ｍａｆａ−ＤＲＢ遺伝子座位における構造多型を示す図である。ＢｌａｎｃｈｅｒＡ．等、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、６４巻、６０５−６１４頁、２０１２年から引用した。It is a figure which shows the structural polymorphism in Mafa-DRB gene locus. Blancher A. Et al., Immunogenetics, 64, 605-614, 2012. Ｍａｆａアリルの分類法を示す図である。ＩＰＤ−ＭＨＣＤａｔａｂａｓｅのＶｅｒｓｉｏｎ１．７．０ (http://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/nhp/nomen_mafa.html)から引用した。It is a figure which shows the classification method of Mafa allyl. Quoted from IPD-MHC Database Version 1.7.0 (http://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/nhp/nomen_mafa.html). 実施例１で増幅したＭａｆａ遺伝子のＰＣＲ増幅状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。It is a figure which shows the agarose gel electrophoresis image which shows the PCR amplification condition of the Mafa gene amplified in Example 1. 実施例１で得られたリード数とＤＮＡ断片の長さとの関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the read number obtained in Example 1, and the length of a DNA fragment. 実施例２にて実施したリード配列のホモロジー検索自動化のフローチャートを示す図である。ステップ１（自動化）：次世代シークエンサーから出力された塩基配列データ（リード配列）とカニクイザルの既知MHCアリル配列とのBLAT解析を行うことにより、以後の解析に使用できるリード配列を選択する。ステップ２（自動化）：使用できるリード配列をForward側からのリード配列群とReverse側からのリード配列群に分け、それぞれについてカニクイザルの既知MHCアリル配列とのBLAT解析を行い、アリル候補を抽出する。ステップ３（自動化）：Forward側とReverse側から抽出したアリル候補のうち、共通に有するものを最終アリル候補とする。ステップ４（マニュアル）：最終アリル候補に対して、個別に GS Reference Mapper ソフトウェアでマッピングし、アルゴリズムの異なる方法でも最終アリル候補を確認した後、その個体の持つアリルを確定する。FIG. 10 is a diagram showing a flowchart of read sequence homology search automation performed in Example 2; Step 1 (automation): By performing a BLAT analysis of the base sequence data (read sequence) output from the next-generation sequencer and the known MHC allele sequence of cynomolgus monkey, a read sequence that can be used for the subsequent analysis is selected. Step 2 (Automation): The read sequences that can be used are divided into a read sequence group from the Forward side and a read sequence group from the Reverse side, and BLAT analysis is performed on each of the known MHC allele sequences of cynomolgus monkeys to extract allele candidates. Step 3 (Automation): Among allyl candidates extracted from the Forward side and the Reverse side, the allele candidate that is shared is set as the final allyl candidate. Step 4 (manual): The final allele candidate is individually mapped with the GS Reference Mapper software, and after confirming the final allele candidate by a method with a different algorithm, the allele of the individual is determined. 実施例２にて判定されたＭａｆａ−Ａアリルを示す図である。ＮＤは既知情報では観察されているが、本実施例では観察されなかったアリルを示す。5 is a diagram showing Mafa-A allyl determined in Example 2. FIG. ND indicates allyl that was observed in the known information but was not observed in this example. 実施例２にて判定されたＭａｆａ−Ｂアリルを示す図である。ＮＤは既知情報では観察されているが、本実施例では観察されなかったアリルを示す。5 is a diagram showing Mafa-B allyl determined in Example 2. FIG. ND indicates allyl that was observed in the known information but was not observed in this example. 実施例２にて判定されたＭａｆａ−ＤＲＢアリルを示す図である。5 is a diagram showing Mafa-DRB allyl determined in Example 2. FIG. 実施例２にて判定されたＭａｆａ−ＤＱＡ１及びＭａｆａ−ＤＱＢ１アリルを示す図である。It is a figure which shows the Mafa-DQA1 and Mafa-DQB1 allyl which were determined in Example 2. 実施例２にて判定されたＭａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１アリルを示す図である。It is a figure which shows the Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1 allyl which were determined in Example 2.

以下、本発明のＤＮＡタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
（１）プライマーセット準備ステップ
本発明のＤＮＡタイピング方法においては、まず、Ｍａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１の各遺伝子のエクソン内に各々特異的にアニールするプライマーセットを準備する。 Hereinafter, the DNA typing method of the present invention will be described in detail step by step.
(1) Primer set preparation step In the DNA typing method of the present invention, first, exons of each gene of Mafa-A, Mafa-B, Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1, and Mafa-DPB1 A primer set for specifically annealing each is prepared.

Ｍａｆａ遺伝子が存在する領域を含む部分的なゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物（ＭＨＣ抗原）の構造との関連も知られている（図２と図３参照）。
即ち、古典的ＭＨＣクラスＩ抗原を規定するＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子は８個のエクソンを含む（図２参照）。エクソン２、３及び４において多型領域が多数存在することも知られている。また、古典的ＭＨＣクラスＩＩ抗原を規定するＭａｆａ−ＤＲ，Ｍａｆａ−ＤＱ及びＭａｆａ−ＤＰはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は５個又は６個のエクソンを含む（図３参照）。エクソン２及び３において多型領域が多数存在することも知られている。 The partial genomic base sequence including the region where the Mafa gene is present has already been elucidated, and the relationship between the gene structure and the structure of the expression product (MHC antigen) is also known (see FIGS. 2 and 3).
That is, the Mafa-A and Mafa-B genes that define classical MHC class I antigens contain 8 exons (see FIG. 2). It is also known that there are many polymorphic regions in exons 2, 3 and 4. In addition, Mafa-DR, Mafa-DQ and Mafa-DP that define classical MHC class II antigens are composed of an α chain and a β chain, and each gene contains 5 or 6 exons (see FIG. 3). . It is also known that there are many polymorphic regions in exons 2 and 3.

本発明では、これら古典的クラスＩ抗原（Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ）ならびに古典的クラスＩＩ抗原（Ｍａｆａ−ＤＲＢ１、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ-ＤＰＢ１）におけるエクソンの多型領域を挟み込むようにしてＰＣＲ増幅できるプライマーセットを調製し、それを用いてＰＣＲ増幅したＰＣＲ産物を後述するハイスループットシークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、正確にアリルを検知することができる。 In the present invention, a large number of exons in these classical class I antigens (Mafa-A and Mafa-B) and classical class II antigens (Mafa-DRB1, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1) Prepare a primer set that can be PCR-amplified by sandwiching the mold region, and use the PCR product amplified by PCR for high-throughput sequencing described later, so you can eliminate uncertainties such as phase ambiguity, Allyl can be detected accurately.

本発明では、各Ｍａｆａ遺伝子のＰＣＲの際のアニーリング温度を同一にすることにより、１台のＰＣＲ装置で同時にＰＣＲを行うことができる。
本発明では、マルチプレックスＰＣＲ法によりＭａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ、Ｍａｆａ−ＤＲＢ、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のＰＣＲを３本の容器内で反応させることができる。 In the present invention, PCR can be performed simultaneously with one PCR device by making the annealing temperature in PCR of each Mafa gene the same.
In the present invention, Mafa-A, Mafa-B, Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1, and Mafa-DPB1 can be reacted in three containers by the multiplex PCR method. .

具体的には、下記表１に掲げるＰＣＲプライマーセットを調製する。
表１における配列番号１及び２は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＭａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルの伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−Ａ１＊０５２：０２やＭａｆａ−Ｂ＊０９５：０１の塩基配列）において、Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ遺伝子のエクソン２〜エクソン４領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 Specifically, PCR primer sets listed in Table 1 below are prepared.
SEQ ID NOs: 1 and 2 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify Mafa-A and Mafa-B genes that are MHC class I α chains. These primer sets are derived from cynomolgus monkey messenger RNA (mRNA) base sequences (for example, the base sequences of Mafa-A1 * 052: 02 and Mafa-B * 095: 01) of the Mafa-A and Mafa-B genes. It is a base sequence present at a position sandwiching the exon 2 to exon 4 region from the upstream side and the downstream side.

配列番号１は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−Ａ１＊０５２：０２の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３３６１）における第１７１番目から第１９１番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号２は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−Ａ１＊０５２：０１の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３３６１）における第６６５番目から第６８５番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５１５塩基（ｂｐ）である。 SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence corresponding to positions 171 to 191 in a base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, base sequence of Mafa-A1 * 052: 02, GenBank / EMBL / DDBJ accession number: AM943611) Has an array.
SEQ ID NO: 2 is a nucleotide sequence corresponding to the 665th to 685th positions in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (eg, the base sequence of Mafa-A1 * 052: 01, the accession number of GenBank / EMBL / DDBJ: AM94361) It has a base sequence complementary to the sequence.
The expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 515 bases (bp).

表１における配列番号３と４は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＭａｆａ−ＤＲＢ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＲＢ１＊１０：０７の塩基配列）において、Ｍａｆａ−ＤＲＢ遺伝子のエクソン１〜エクソン３領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 Sequence numbers 3 and 4 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the Mafa-DRB gene, which is an MHC class II β chain. These primer sets are located in positions where the exon 1 to exon 3 region of the Mafa-DRB gene is sandwiched from the upstream side and the downstream side in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, the base sequence of Mafa-DRB1 * 10: 07). It is an existing base sequence.

配列番号３は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＲＢ１＊１０：０７の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＤＱ３８１７４３）における第１７１番目から第１９１番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号４は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＲＢ１＊１０：０７の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＤＱ３８１７４３）における第１５番目から第４３４番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは４２０ｂｐである。 SEQ ID NO: 3 is the base corresponding to positions 171 to 191 in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, base sequence of Mafa-DRB1 * 10: 07, GenBank / EMBL / DDBJ accession number: DQ381743) Has an array.
SEQ ID NO: 4 is a nucleotide sequence corresponding to positions 15 to 434 in a base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, base sequence of Mafa-DRB1 * 10: 07, GenBank / EMBL / DDBJ accession number: DQ381743). It has a base sequence complementary to the sequence.
The expected length of the PCR product obtained using these primer sets is 420 bp.

表１における配列番号５と６は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＭａｆａ−ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＡ１＊０１：０７：０１の塩基配列）において、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１遺伝子のエクソン１〜エクソン３領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 Sequence numbers 5 and 6 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the Mafa-DQA1 gene, which is an MHC class II α chain. These primer sets sandwich the exon 1 to exon 3 region of the Mafa-DQA1 gene from the upstream side and the downstream side in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, the base sequence of Mafa-DQA1 * 01: 07: 01). It is the base sequence present at the position.

配列番号５は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＡ１＊０１：０７：０１の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＨＭ５７９９８９３）における第５番目から第２２番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号６は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＡ１＊０１：０７：０１の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＨＭ５７９９８９３）における第４２２番目から第４３９番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは４３５ｂｐである。 SEQ ID NO: 5 corresponds to the 5th to 22nd positions in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (eg, Mafa-DQA1 * 01: 07: 01 base sequence, GenBank / EMBL / DDBJ accession number: HM5799893) It has a base sequence to do.
SEQ ID NO: 6 corresponds to the 422th to 439th positions in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, Mafa-DQA1 * 01: 07: 01 base sequence, GenBank / EMBL / DDBJ accession number: HM5799893) The base sequence is complementary to the base sequence to be processed.
The expected length of the PCR product obtained using these primer sets is 435 bp.

表１における配列番号７と８は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＭａｆａ−ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＢ１＊０６：０８の塩基配列）において、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１遺伝子のエクソン１〜エクソン３領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 SEQ ID NOs: 7 and 8 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the Mafa-DQB1 gene, which is an MHC class II β chain. These primer sets are located at positions that sandwich the exon 1 to exon 3 region of the Mafa-DQB1 gene from the upstream side and the downstream side in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, the base sequence of Mafa-DQB1 * 06: 08). It is an existing base sequence.

配列番号７は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＢ１＊０６：０８の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＥＦ２０８８２２）における第５５番目から第７２番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号８は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＱＢ１＊０６：０８の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＥＦ２０８８２２）における第４３３番目から第４５０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは３９６ｂｐである。 SEQ ID NO: 7 is the base corresponding to the 55th to 72nd bases in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, the base sequence of Mafa-DQB1 * 06: 08, the accession number of GenBank / EMBL / DDBJ: EF208822) Has an array.
SEQ ID NO: 8 is a nucleotide sequence corresponding to positions 433 to 450 in a base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, base sequence of Mafa-DQB1 * 06: 08, accession number of GenBank / EMBL / DDBJ: EF208822) It has a base sequence complementary to the sequence.
The expected length of the PCR product obtained using these primer sets is 396 bp.

表１における配列番号９と１０は、はＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＭａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＡ１＊０２：０５の塩基配列）において、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１遺伝子のエクソン１〜エクソン３領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 SEQ ID NOs: 9 and 10 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the Mafa-DPA1 gene, which is an MHC class II α chain. These primer sets are located at positions that sandwich the exon 1 to exon 3 region of the Mafa-DPA1 gene from the upstream side and the downstream side in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, the base sequence of Mafa-DPA1 * 02: 05). It is an existing base sequence.

配列番号９は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＡ１＊０２：０５の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３６３３）における第１９番目から第３６番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号１０は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＡ１＊０２：０５の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３６３３）における第４０８番目から第４２５番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは４０７ｂｐである。 SEQ ID NO: 9 is the base corresponding to the 19th to 36th bases in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, base sequence of Mafa-DPA1 * 02: 05, accession number of GenBank / EMBL / DDBJ: AM943633) Has an array.
SEQ ID NO: 10 is a nucleotide sequence corresponding to positions 408 to 425 in a base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, base sequence of Mafa-DPA1 * 02: 05, accession number of GenBank / EMBL / DDBJ: AM943633) It has a base sequence complementary to the sequence.
The expected length of the PCR product obtained using these primer sets is 407 bp.

表１における配列番号１１と１２は、はＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＭａｆａ−ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＢ１＊１５：０４の塩基配列）において、Ｍａｆａ−ＤＰＢ１遺伝子のエクソン１〜エクソン３領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。 SEQ ID NOs: 11 and 12 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the Mafa-DPB1 gene, which is an MHC class II β chain. These primer sets are located at positions that sandwich the exon 1 to exon 3 region of the Mafa-DPB1 gene from the upstream side and the downstream side in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, the base sequence of Mafa-DPB1 * 15: 04). It is an existing base sequence.

配列番号１１は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＢ１＊１５：０４の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３６３４）における第１０３番目から第１２０番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号１２は、カニクイザルのｍＲＮＡ由来の塩基配列（例としてＭａｆａ−ＤＰＢ１＊１５：０４の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪのアクセッション番号：ＡＭ９４３６３４）における第４２４番目から第４４１番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは３３９ｂｐである。 SEQ ID NO: 11 is the base corresponding to the 103rd to 120th bases in the base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, the base sequence of Mafa-DPB1 * 15: 04, the accession number of GenBank / EMBL / DDBJ: AM943634) Has an array.
SEQ ID NO: 12 is a nucleotide sequence corresponding to positions 424 to 441 in a base sequence derived from cynomolgus monkey mRNA (for example, the base sequence of Mafa-DPB1 * 15: 04, the accession number of GenBank / EMBL / DDBJ: AM943634) It has a base sequence complementary to the sequence.
The expected length of the PCR product obtained using these primer sets is 339 bp.

表１に記載のプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表１に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、Ｍａｆａの多型領域を上流側及び下流側から挟み込む位置にアニーリング可能なセンス（Ｓｅｎｓｅ）側プライマーとアンチセンス（Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）側プライマーとのセットであれば同様に使用することができる。 The primers listed in Table 1 can be prepared by a technique commonly used in the field. In addition, the primer set described in Table 1 shows the most preferable example. In the method of the present invention, the sense (Sense) side that can be annealed at a position sandwiching the polymorphic region of Mafa from the upstream side and the downstream side. If it is a set of a primer and an antisense (anti-sense) side primer, it can be used similarly.

（２）ＰＣＲ増幅ステップ
本発明の方法では、前記ステップ（１）で準備したプライマーの５‘側に、４０ｍｅｒからなるハイスループットシークエンシング用アダプターをコードする塩基配列と１０ｍｅｒからなるバーコードをコードする塩基配列を付加させたアンプリコンシークエンシング用のプライマーを設計し、それらを用いて、被検試料（伝令ＲＮＡ；ｍＲＮＡ）のＰＣＲを実施する。
バーコード配列をプライマーに組み込むことにより、１回のハイスループットシークエンシングにて数十サンプルの処理ができる。
ＰＣＲ増幅反応は、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。 (2) PCR amplification step In the method of the present invention, a base sequence encoding a 40-mer high-throughput sequencing adapter and a 10-mer barcode are provided on the 5 ′ side of the primer prepared in step (1). Primers for amplicon sequencing to which a base sequence to be encoded is added are designed, and PCR of a test sample (messenger RNA; mRNA) is performed using them.
By incorporating the barcode sequence into the primer, several tens of samples can be processed in one high-throughput sequencing.
The PCR amplification reaction is performed according to a normal protocol. Specifically, it is as follows.

１．被検試料の形態に応じて、当該試料からｍＲＮＡを抽出する。
２．抽出したｍＲＮＡを定量し、逆転写反応により相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ；ｃＤＮＡ）を調製する。
３．適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
４．反応条件を設定してＰＣＲを実施する。反応条件は、例えば、熱変性ステップ（通常は９２〜９８℃）、アニーリングステップ（通常は５０〜７０℃）、及び伸長ステップ（通常は６５〜７８℃）とすることができる。
５．得られたＰＣＲ産物を精製し、（３）の塩基配列決定ステップに供する。 1. Depending on the form of the test sample, mRNA is extracted from the sample.
2. The extracted mRNA is quantified, and complementary DNA (cDNA) is prepared by reverse transcription reaction.
3. Prepare a reaction solution by appropriately setting the primer concentration.
4). Set the reaction conditions and perform PCR. The reaction conditions can be, for example, a heat denaturation step (usually 92 to 98 ° C.), an annealing step (usually 50 to 70 ° C.), and an extension step (usually 65 to 78 ° C.).
5. The obtained PCR product is purified and subjected to the base sequence determination step of (3).

本発明の方法では、前記アニーリングステップの温度を約５５〜６０℃とするのが好ましい。約５５〜６０℃でアニーリングさせることにより、Ｍａｆａアリルを等比率で（均一に）生成させることができる。 In the method of the present invention, the temperature of the annealing step is preferably about 55 to 60 ° C. By annealing at about 55 to 60 ° C., Mafa allyl can be produced in an equal ratio (uniformly).

上記した条件に基づいて３本の容器（（容器１：Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ）、（容器２：Ｍａｆａ−ＤＲＢ）、（容器３：Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１））のみでＰＣＲできるマルチプレックスＰＣＲを実施する。このステップは、１台のＰＣＲ装置で同時にＰＣＲすることができる。 Based on the above conditions, three containers ((container 1: Mafa-A and Mafa-B), (container 2: Mafa-DRB), (container 3: Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa) -Perform multiplex PCR that can be PCR only with DPB1)). This step can be performed simultaneously with one PCR device.

（３）塩基配列決定ステップ。
次に、前記ステップ（２）で生成されたＰＣＲ産物（増幅ＤＮＡ）の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆるハイスループットシークエンシング（あるいは超高速シークエンシング、大量並列シークエンシング）と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。ハイスループットシークエンシングに関しては、例えば、「実験医学」第２７巻、第１号、２００９年（羊土社）等を参照できる。
本明細書では、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）の４５４ＧＳシステムに基づいて配列決定する方法を以下に記載する。なお、ライフテクノロジーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のゲノムシークエンサーＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＰＧＭシステム及びイルミナ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）のＭｉＳｅｑシステムも同様に塩基配列決定が可能である。 (3) A base sequence determination step.
Next, the base sequence of the PCR product (amplified DNA) generated in step (2) is determined. This step is preferably performed using a technique called so-called high-throughput sequencing (or ultra-high speed sequencing, mass parallel sequencing). Regarding high-throughput sequencing, for example, “Experimental Medicine” Vol. 27, No. 1, 2009 (Yodosha) can be referred to.
Described herein is a method for sequencing based on the Roche 454 GS system. The base sequences can also be determined in the same way for Life Technologies' genome sequencer Ion Torrent PGM system and Illumina's MiSeq system.

１．増幅ＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片にした後、アダプターを介してビーズに結合させる。得られたビーズを油中水型エマルジョンに包み込む（１ビーズに１つのＤＮＡ断片が結合したマイクロリアクター環境が形成される）。
２．エマルジョンＰＣＲ反応を実施し、各ビーズ上に各ＤＮＡ断片のコピーを形成させる（各ＤＮＡ断片は各々のマイクロリアクター内でクローナルに増幅されるので、他の配列との競合もなく、多数の断片の増幅が同時に並列的に実施できる）。ついで、エマルジョンを破壊して増幅されたＤＮＡ断片を有するビーズを回収する。
３．ビーズを濃縮し、ピコタイターウェルにローディングする（１ウェルに１個のビーズが入るサイズである）。
４．各々のビーズについて、ポリメラーゼが酵素反応するときに生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光の強度とパターンからＤＮＡの塩基配列を決定する。４種類の核酸（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を一定の順序で加える、添加した核酸に応じた化学発光パターンを記録し、そのシグナル強度と位置情報との組み合わせにより塩基配列を決定する。 1. The amplified DNA fragment is converted into a single-stranded DNA fragment and then bound to the beads via an adapter. The resulting beads are wrapped in a water-in-oil emulsion (a microreactor environment is formed with one DNA fragment bound to one bead).
2. An emulsion PCR reaction is performed to form a copy of each DNA fragment on each bead (each DNA fragment is clonally amplified in each microreactor, so there is no competition with other sequences and multiple fragments Amplification can be performed simultaneously in parallel). The emulsion is then broken to recover the beads with amplified DNA fragments.
3. Concentrate the beads and load into pico titer wells (sized to contain one bead per well).
4). For each bead, pyrophosphate generated when the polymerase reacts with the enzyme is detected by a fluorescence reaction with luciferase, and the DNA base sequence is determined from the intensity and pattern of luminescence. Four types of nucleic acids (A, C, G, T) are added in a certain order, a chemiluminescence pattern corresponding to the added nucleic acid is recorded, and a base sequence is determined by a combination of the signal intensity and position information.

（４）データベースとのホモロジー検索を実施するステップ
次いで、前記ステップ（３）で得られるｓｆｆｆｉｌｅをバーコード毎に分類した後、既知のＭａｆａアリルの塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたｍＲＮＡの第３区域レベルのＭａｆａアリルが決定される。 (4) Step of performing homology search with database Next, after classifying the sff file obtained in step (3) for each barcode, it is compared with the data of the base sequence database of known Mafa allele, The Mafa allele at the third zone level of the mRNA contained in the test sample is determined.

本発明の方法は、前記表１に記載したプライマーセットを代表例とする。ＭａｆａクラスＩ及びＭａｆａクラスＩＩの各遺伝子全領域を挟み込む位置にプライマーを設定し、ほぼ全領域に渡って増幅したＤＮＡの配列決定をすることに特徴を有し、それによってアンビギュイティを排除することができる。 In the method of the present invention, the primer set described in Table 1 is used as a representative example. It is characterized in that primers are set at positions sandwiching the entire region of each gene of Mafa class I and Mafa class II, and the amplified DNA is sequenced over almost the entire region, thereby eliminating ambiguity. be able to.

さらに、本発明によれば、上記した本発明によるニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピング方法により、被検試料に含まれるカニクイザルＭａｆａ遺伝子のＤＮＡをタイピングし、その結果に基づいて特定のＭａｆａ遺伝子を有するカニクイザルを選別する方法が提供される。例えば、ｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞をカニクイザルに移植する際には、拒絶反応を回避するために、本発明のＤＮＡタイピング方法により移植細胞と同じＭＨＣ遺伝子型を有するカニクイザルを予め選別しておき、このカニクイザルに細胞を移植することができる。 Furthermore, according to the present invention, the cynomolgus mafa gene DNA contained in the test sample is typed by the above-described cynomolgus mafa gene DNA typing method according to the present invention, and a cynomolgus monkey having a specific Mafa gene is obtained based on the result. A method of sorting is provided. For example, when cells differentiated from iPS cells are transplanted into cynomolgus monkeys, in order to avoid rejection, cynomolgus monkeys having the same MHC genotype as the transplanted cells are selected in advance by the DNA typing method of the present invention, Cells can be transplanted into this cynomolgus monkey.

以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with specific examples, but the present invention is not limited to these examples.

（実施例１）
［実験目的］
本発明にて設定したマルチプレックス法にてＰＣＲ産物の増幅状況を確認するために、複数のｃＤＮＡサンプルを用いてＰＣＲ産物の塩基配列決定を行うことを目的にした。 Example 1
[Purpose of experiment]
In order to confirm the amplification status of the PCR product by the multiplex method set in the present invention, it was aimed to determine the base sequence of the PCR product using a plurality of cDNA samples.

［実験方法］
Ｍａｆａアリルの不明な２０個体の末梢白血球から抽出したｍＲＮＡサンプルを用いた。このｍＲＮＡを鋳型として、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、本発明にて設定したＰＣＲ条件にて、各Ｍａｆａ遺伝子を３本の容器（（容器１：Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ）、（容器２：Ｍａｆａ−ＤＲＢ）、（容器３：Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１））に分けてＰＣＲを実施した。 [experimental method]
MRNA samples extracted from peripheral leukocytes of 20 individuals with unknown Mafa allyl were used. Using this mRNA as a template, cDNA was prepared by a reverse transcription reaction. Under the PCR conditions set in the present invention, each Mafa gene was divided into three containers ((container 1: Mafa-A and Mafa-B), (container). 2: Mafa-DRB) and (container 3: Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1))).

（１）ＰＣＲにはＫＯＤＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）酵素を用いた。すなわち、１μＬのｃＤＮＡ溶液に、反応液全体に対しての終濃度を０．１２５〜０．３７５ｐｍｏｌ／μＬに調整した量のＰＣＲプライマー（表１に記載したプライマー（配列番号１から１２）を使用した）、各酵素のプロトコールに準じたＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ及びＰＣＲ用酵素を加え、反応液の全量を滅菌水にて２０ μＬに調整した。 (1) KOD FX (TOYOBO) enzyme was used for PCR. That is, 1 μL of cDNA primer was used with the amount of PCR primer (primer described in Table 1 (SEQ ID NOs: 1 to 12)) adjusted to a final concentration of 0.125 to 0.375 pmol / μL with respect to the entire reaction solution. PCR Buffer, dNTP and PCR enzyme according to the protocol of each enzyme were added, and the total amount of the reaction solution was adjusted to 20 μL with sterilized water.

（２）これを９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、５８度で４５秒間、６８度で３０秒間の３ステップを１工程として、これを３５回繰り返した。なお、このＰＣＲ増幅にはＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。一部のサンプルにおける泳動像を図８に示した。 (2) After keeping the temperature at 94 ° C. for 2 minutes, this was repeated 35 times with 3 steps of 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 45 seconds, and 68 ° C. for 30 seconds as one step. In this PCR amplification, GeneAmp PCR System 9700 (Life Technologies) was used. After PCR, the amplification status of the PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis. The electrophoretic image in some samples is shown in FIG.

（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
１．ＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡＭｐｕｒｅＸＰの標準プロトコールにしたがって精製した。
２．ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
３．精製したＰＣＲ産物をそれぞれ容器１は５．００Ｅ＋０７ｍｏｌ／μＬ、容器２は１．００Ｅ＋０７ｍｏｌ／μＬ、容器３は２．８０Ｅ＋０７ｍｏｌ／μＬの分子量に調整し、ＤＮＡ断片を等量の割合で混合した。
４．混合したＤＮＡ断片を鋳型として、ＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）の標準プロトコールにしたがって、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、塩基配列を得た。
５．出力された塩基配列データをＭａｆａリファレンスに対して、ｍｉｎｉｍｕｍｓｃｏｒｅ１００，ｍｉｎｉｍｕｍｉｄｅｎｔｉｔｙ９８％の条件にて相同性検索（Ｂｌａｔ解析）を行い、短いリード等や使用できないようなリードを除いた。その後、各Ｍａｆａ遺伝子由来のＤＮＡ断片長とリード数とを示す図を作成した（図９）。 (3) The base sequence of the PCR product was determined. Specifically, it was performed as follows.
1. The PCR product was purified according to the standard protocol of Agencourt AMpure XP.
2. Concentrations were measured according to the standard protocol of the PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen).
3. The purified PCR products were adjusted to a molecular weight of 5.00E + 07 mol / μL in container 1, 1.00E + 07 mol / μL in container 2, and 2.80E + 07 mol / μL in container 3, and the DNA fragments were mixed in equal proportions. did.
4). Using the mixed DNA fragment as a template, emulsion PCR and sequencing were performed according to the standard protocol of Genome Sequencer (GS) Junior (Roche) to obtain a base sequence.
5. The output base sequence data was subjected to homology search (Blat analysis) with respect to the Mafa reference under the conditions of minimum score 100, minimum identity 98%, and short reads and unusable reads were removed. Then, the figure which shows the DNA fragment length and read number derived from each Mafa gene was created (FIG. 9).

［結果及び考察］
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、（１）Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ、（２）Ｍａｆａ−ＤＲＢ、（３）Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のいずれのＰＣＲ産物においても目的の分子量の位置に増幅産物が得られた（図８）。さらに、３本の容器内のＰＣＲ産物を混合し、ＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）によりＰＣＲ産物の塩基配列を決定した結果、計１３０，２３５（１７２−１９１）の塩基配列が得られ、各Ｍａｆａ遺伝子由来のリード配列が目的の分子量の位置に観察された（図９）。この際、Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１のリード数は全リードの８〜１０％、Ｍａｆａ−ＤＲＢは１０〜１５％、Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂは５０〜５５％であったことから、３本の容器からのＤＮＡ断片の混合比は最適であると考えられ、構造多型の観察されるＭａｆａ−Ａ、Ｍａｆａ−Ｂ及びＭａｆａ−ＤＲＢでも十分にＤＮＡタイピングが可能であるリード数であると考えられた。 [Results and discussion]
From the agarose gel electrophoresis of the PCR product, any one of (1) Mafa-A and Mafa-B, (2) Mafa-DRB, (3) Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1 In FIG. 8, an amplification product was obtained at the target molecular weight (FIG. 8). Furthermore, as a result of mixing the PCR products in the three containers and determining the base sequences of the PCR products by Genome Sequencer (GS) Junior (Roche), a total of 130,235 (172-191) base sequences were obtained, A lead sequence derived from each Mafa gene was observed at the target molecular weight (FIG. 9). At this time, the number of leads of Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1 is 8 to 10% of all leads, Mafa-DRB is 10 to 15%, and Mafa-A and Mafa-B are 50 to 55. %, The mixing ratio of the DNA fragments from the three containers is considered to be optimal, and DNA typing is sufficiently performed even with Mafa-A, Mafa-B and Mafa-DRB in which structural polymorphisms are observed. The number of leads considered possible.

（実施例２）
［実験目的］
本発明にて設定したマルチプレックス法がＭａｆａ遺伝子のＤＮＡタイピングに好適であることを裏付けるために、複数のｃＤＮＡサンプルを用いてＰＣＲ産物の塩基配列決定を行うことを目的にした。 (Example 2)
[Purpose of experiment]
In order to confirm that the multiplex method set in the present invention is suitable for DNA typing of the Mafa gene, the purpose was to determine the base sequence of the PCR product using a plurality of cDNA samples.

［実験方法］
従来のＳＢＴ法やサブクローニング法にてＭａｆａアリルが明確な２０個体の末梢白血球から抽出したｍＲＮＡサンプルを用いた。このｍＲＮＡを鋳型として、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、本発明にて設定したＰＣＲ条件ならびに３本のチューブ（（容器１：Ｍａｆａ−Ａ及びＭａｆａ−Ｂ）、（容器２：Ｍａｆａ−ＤＲＢ）、（容器３：Ｍａｆａ−ＤＱＡ１、Ｍａｆａ−ＤＱＢ１、Ｍａｆａ−ＤＰＡ１及びＭａｆａ−ＤＰＢ１））に分けてＰＣＲを実施した。 [experimental method]
MRNA samples extracted from peripheral leukocytes of 20 individuals with clear Mafa allyl by conventional SBT method or subcloning method were used. Using this mRNA as a template, cDNA was prepared by reverse transcription reaction, PCR conditions set in the present invention and three tubes ((container 1: Mafa-A and Mafa-B), (container 2: Mafa-DRB) (Vessel 3: Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1)).

（１）ＰＣＲにはＫＯＤＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）酵素を用いた。すなわち、１ μＬのｃＤＮＡ溶液に、反応液全体に対しての終濃度を０．１２５〜０．３７５ｐｍｏｌ／μＬに調整した量のＰＣＲプライマー（表１に記載したプライマー（配列番号１から１２）を使用した）、各酵素のプロトコールに準じたＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ及びＰＣＲ用酵素を加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。 (1) KOD FX (TOYOBO) enzyme was used for PCR. That is, in a 1 μL cDNA solution, PCR primers (primers described in Table 1 (SEQ ID NOS: 1 to 12)) in an amount adjusted to a final concentration of 0.125 to 0.375 pmol / μL with respect to the entire reaction solution. PCR buffer, dNTP and PCR enzyme according to the protocol of each enzyme were added, and the total amount of the reaction solution was adjusted to 20 μL with sterilized water.

（２）これを９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、５８度で４５秒間、６８度で３０秒間の３ステップを１工程として、これを３５回繰り返した。なお、このＰＣＲ増幅にはＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ライフテクノロジーズ）を用いた。 (2) After keeping the temperature at 94 ° C. for 2 minutes, this was repeated 35 times with 3 steps of 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 45 seconds, and 68 ° C. for 30 seconds as one step. In this PCR amplification, GeneAmp PCR System 9700 (Life Technologies) was used.

（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
１．ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の標準プロトコールにしたがって精製した。
２．ＰｉｃｏＧｒｅｅｎｄｓＤＮＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
３．精製したＰＣＲ産物をそれぞれ容器１は５．００Ｅ＋０７ｍｏｌ／μＬ、容器２は１．００Ｅ＋０７ｍｏｌ／μＬ、容器３は２．８０Ｅ＋０７ｍｏｌ／μＬの分子量に調整し、ＤＮＡ断片を等量の割合で混合した。
４．混合したＤＮＡ断片を鋳型として、ＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）の標準プロトコールにしたがって、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、塩基配列を得た。
５．出力された塩基配列データをＭａｆａリファレンスに対して、ｍｉｎｉｍｕｍｓｃｏｒｅ１００，ｍｉｎｉｍｕｍｉｄｅｎｔｉｔｙ９８％の条件にて相同性検索（Ｂｌａｔ解析）を行い、短いリード等や使用できないようなリードを除いた。
６．５．にて抽出されたリードについて５‘末端側からのリードと３’末端側からのリードに分け、それぞれのリードについてＢｌａｔ解析を実施し、アリル候補を抽出する。これらで選択されたアリル候補のうち、５‘末端側と３‘末端側の両末端で共通に選択されたアリルを最終アリル候補とした。５〜６の過程についてはスクリプトを作成し、これを用いて自動化を図った（図１０）。
７．最終アリル候補に対して、個別にＧＳＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｐｐｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）でマッピングし、マッピング状況を確認してアリルを確定した。 (3) The base sequence of the PCR product was determined. Specifically, it was performed as follows.
1. The PCR product was purified according to the standard protocol of the QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN).
2. Concentrations were measured according to the standard protocol of the PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen).
3. The purified PCR products were adjusted to a molecular weight of 5.00E + 07 mol / μL in container 1, 1.00E + 07 mol / μL in container 2, and 2.80E + 07 mol / μL in container 3, and the DNA fragments were mixed in equal proportions. did.
4). Using the mixed DNA fragment as a template, emulsion PCR and sequencing were performed according to the standard protocol of Genome Sequencer (GS) Junior (Roche) to obtain a base sequence.
5. The output base sequence data was subjected to homology search (Blat analysis) with respect to the Mafa reference under the conditions of minimum score 100, minimum identity 98%, and short reads and unusable reads were removed.
6.5. The lead extracted in step 1 is divided into a lead from the 5 ′ end side and a lead from the 3 ′ end side, and a Blat analysis is performed on each lead to extract allyl candidates. Among these allyl candidates selected, the allyl selected in common at both the 5 ′ end side and the 3 ′ end side was used as the final allyl candidate. A script was created for steps 5-6, and automation was performed using this script (FIG. 10).
7). The final allele candidate was individually mapped with GS Reference Mapper (Roche), and the mapping status was confirmed to determine the allele.

［結果及び考察］
ＰＣＲ産物を等量ずつ混合し、ＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）によりＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、Ｍａｆａタイピングをおこなった。その結果、数アリルにおいては極めて遺伝子発現量が低いことが原因で本実施例では観察されなかったが、それら以外は既知情報と矛盾なくＭａｆａアリルが判定された（図１１〜図１５）。これらのアリル情報からハプロタイプにおいても既知情報と矛盾が無かった（表２）。したがって、本発明のＰＣＲ法とマルチプレックス法は、フェーズ・アンビギュイティのないＤＮＡタイピングを可能とするとともに、ＰＣＲの煩雑な操作の簡素化や迅速化に役立つ優れたツールであると考えられた。 [Results and discussion]
Equal amounts of the PCR product were mixed, the base sequence of the PCR product was determined by Genome Sequencer (GS) Junior (Roche), and Mafa typing was performed. As a result, although several gene alleles were not observed in the present example due to the extremely low gene expression level, Mafa allele was determined without any contradiction to known information other than those (FIGS. 11 to 15). From these allele information, haplotypes were consistent with known information (Table 2). Therefore, the PCR method and the multiplex method of the present invention are considered to be excellent tools that enable DNA typing without phase ambiguity and that simplify and speed up complicated PCR operations. .

Claims

A method for DNA typing of a cynomolgus monkey Mafa gene comprising the following steps:
(1) From the exon 2 region to the exon 4 region of the Mafa-A and Mafa-B genes in the cynomolgus monkey cDNA nucleotide sequence, from the exon 1 region of the Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPA1 genes Preparing a primer set for PCR amplification of the exon 3 region under the same PCR conditions;
(2) Mafa-A, Mafa-B, Mafa-DRB, Mafa-DQA1, Mafa-DQB1, Mafa-DPA1, and Mafa-DPB1 primer sets, and cDNA synthesized from a test sample (RNA) as a template Amplifying by carrying out PCR under the same PCR conditions in one or three containers (where all primer sets are used in one container when performing in one container. When using three containers, Mafa-A and Mafa-B primer sets are used in the first container, Mafa-DRB primer sets are used in the second container, and Mafa-DQA1 is used in the third container. , Mafa-DQB1, Mafa-DPA1 and Mafa-DPB1 primer sets);
(3) determining the base sequence of the PCR product; and (4) optionally performing a homology search with the database.

The Mafa-A and Mafa-B primer sets are oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, the Mafa-DRB primer set is the oligonucleotide having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, and Mafa- The primer set of DQA1 is an oligonucleotide having the base sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6, the primer set of Mafa-DQB1 is an oligonucleotide having the base sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8, and the primer set of Mafa-DPA1 is a sequence The method according to claim 1, wherein the oligonucleotides have the nucleotide sequences of Nos. 9 and 10, and the Mafa-DPB1 primer set is an oligonucleotide having the nucleotide sequences of SEQ ID Nos. 11 and 12.

PCR conditions are as follows: 3 steps of 95 to 98 ° C. for 10 to 20 seconds, 55 to 65 ° C. for 30 to 60 seconds, and 65 to 72 ° C. for 30 to 60 seconds, and this is repeated 30 to 40 times. The method according to claim 1 or 2, wherein:

A primer set for DNA typing of Mafa-A and Mafa-B genes, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2.

A primer set for DNA typing of Mafa-DRB gene, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4.

A primer set for DNA typing of Mafa-DQA1 gene, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6.

A primer set for DNA typing of Mafa-DQB1 gene, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8.

A primer set for DNA typing of Mafa-DPA1 gene, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 and 10.

A primer set for DNA typing of Mafa-DPB1 gene, comprising a sense primer and an antisense primer selected from oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 11 and 12.

A primer set for DNA typing of Mafa gene, comprising an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 12.

A kit for DNA typing of the Mafa gene, comprising the primer set according to claim 10 and a DNA polymerase.

A method for typing cynomolgus monkey Mafa gene DNA contained in a test sample by the method according to any one of claims 1 to 3 and selecting a cynomolgus monkey having a specific Mafa gene based on the result.