JP2015010874A - Liquid chromatograph, elution time deriving device and program for deriving elution time - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、液体クロマトグラフ、溶出時間導出装置及び溶出時間導出用プログラムに関する。 The present invention relates to a liquid chromatograph, an elution time deriving device, and an elution time deriving program.
液体クロマトグラフにおいては、固定相が充填されたカラムに、複数の成分を有する試料、及び、溶離液が流される。そして溶離液とともにカラムに流入した試料は、カラムに充填された固定相に吸着しつつ溶離液の流下に伴って移動し、所定時間後にカラムから排出される。ここで、試料に含まれた各成分が排出されるのに要する時間は、溶離液との親和性及びカラムの固定相と各成分との相互作用などに依存し、成分ごとに異なる。つまり、溶離液との親和性が弱いもの及び固定相との相互作用が強いものは、カラム内に長く留まる。また、逆に、溶離液との親和性が強いもの及び固定相との相互作用が弱いものは、早く排出される。これによって、カラムを通過する試料が成分ごとに分離されて溶出する。 In a liquid chromatograph, a sample having a plurality of components and an eluent flow through a column packed with a stationary phase. The sample flowing into the column together with the eluent moves along with the flow of the eluent while adsorbing to the stationary phase packed in the column, and is discharged from the column after a predetermined time. Here, the time required for each component contained in the sample to be discharged depends on the affinity with the eluent, the interaction between the stationary phase of the column and each component, and the like. That is, those having a weak affinity with the eluent and those having a strong interaction with the stationary phase remain in the column for a long time. Conversely, those having a strong affinity with the eluent and those having a weak interaction with the stationary phase are quickly discharged. As a result, the sample passing through the column is separated for each component and eluted.
このような液体クロマトグラフの使用に当たっては、溶離液として使用する溶媒が溶出時間に与える影響が非常に大きい。したがって、最適な分離条件を得るために、複数種の溶媒を組み合わせて使用することも一般的に行われている。更に、複数種の溶媒を組み合わせる場合に、一定の混合比の溶離液を使用するのではなく、その混合比を徐々に変化させること（これをグラジエントという）によって、試料の固定相との相互作用を調整し、より精密な分離を図ることも行われている。 In using such a liquid chromatograph, the influence of the solvent used as the eluent on the elution time is very large. Therefore, in order to obtain optimum separation conditions, it is generally performed to use a combination of plural kinds of solvents. Furthermore, when combining multiple types of solvents, instead of using an eluent with a fixed mixing ratio, the mixing ratio is gradually changed (this is called a gradient), thereby allowing the sample to interact with the stationary phase. In order to achieve a more precise separation, adjustments are also made.
本発明者は、液体クロマトグラフにおいて、プログラム等を使用して各成分の溶出時間を予測することについて検討を行ってきた。上述したようなグラジエントを行った場合における溶出時間の予測を行う方法として、本発明者は特許文献１を完成した。特許文献１は、下記式（２） The present inventor has studied about predicting the elution time of each component using a program or the like in a liquid chromatograph. The present inventor has completed Patent Document 1 as a method for predicting the elution time when performing the gradient as described above. Patent Document 1 discloses the following formula (2)
によって、グラジエントを行った場合の溶出時間を予測する方法である。しかしながら、その後の検討によって、実際の溶出時間は上記式（２）によって算出された溶出時間との間にずれを生じる場合があることが明らかとなった。（２）の式は、カラム入口にかかる移動度の積分であるため、実際のサンプルに与えられる移動度ではない。そこで、この点を補正するための発明として特許文献２を完成した。 This is a method for predicting the elution time when gradient is performed. However, subsequent studies have revealed that the actual elution time may deviate from the elution time calculated by the above equation (2). Since the equation (2) is an integral of the mobility applied to the column inlet, it is not the mobility given to the actual sample. Therefore, Patent Document 2 has been completed as an invention for correcting this point.
特許文献２においては、直線的に複数種の溶媒の混合比を変化させる液体クロマトグラフにおいて、特許文献１において示した計算式を補正し、下記式（２），（４）によって、カラム入口の移動度ではなく、カラム内を移動しているサンプルに与えられる移動度を算出することにより、きわめて正確に溶出時間を算出できることを見出し、このような機能を備えた液体クロマトグラフ装置を提供することに成功した。 In Patent Document 2, in the liquid chromatograph that linearly changes the mixing ratio of plural kinds of solvents, the calculation formula shown in Patent Document 1 is corrected, and the following equation (2) and (4) Finding that the elution time can be calculated very accurately by calculating the mobility given to the sample moving in the column, not the mobility, and providing a liquid chromatograph with this function succeeded in.
しかしながら、特許文献２における発明は、直線的に複数種の溶媒の混合比を変化させる液体クロマトグラフにおいてのみ適用できる方法であり、非直線的に複数の溶媒の混合比を変化させる場合には適用できなかった。他方では、近年、より精密な分離を行うために、非直線的なグラジエントを行うことによるクロマトグラフが提案されている（特許文献３）。したがって、非直線的なグラジエントを行った場合においても正確に溶出時間を算出することができ、また、溶媒の適切なグラジエント方法を判定することができるようなクロマトグラフが要求されている。 However, the invention in Patent Document 2 is a method that can be applied only in a liquid chromatograph that linearly changes the mixing ratio of a plurality of solvents, and is applied when the mixing ratio of a plurality of solvents is changed nonlinearly. could not. On the other hand, in recent years, a chromatograph using a non-linear gradient has been proposed in order to perform more precise separation (Patent Document 3). Therefore, there is a need for a chromatograph that can accurately calculate the elution time even when a non-linear gradient is performed, and that can determine an appropriate gradient method for the solvent.
本発明の目的は、任意のグラジエントを行った液体クロマトグラフにおいて、試料に含まれる各成分の溶出時間をより高精度に導出できる液体クロマトグラフを提供することである。 An object of the present invention is to provide a liquid chromatograph capable of deriving the elution time of each component contained in a sample with higher accuracy in a liquid chromatograph subjected to an arbitrary gradient.
本発明の別の目的は、液体クロマトグラフにおいて試料に含まれる成分を所定の溶出時間で溶出させるための２つの溶媒の混合比の変化をより高精度に導出できる液体クロマトグラフを提供することである。 Another object of the present invention is to provide a liquid chromatograph capable of deriving a change in the mixing ratio of two solvents for eluting components contained in a sample in a predetermined elution time in a liquid chromatograph with higher accuracy. is there.
本発明は、溶媒の混合比を変化させて行う液体カラムクロマトグラフに使用できる液体クロマトグラフ装置であって、カラムに導入する溶媒の混合比の変化関係式を成分ｃの移動度Ｒｆの（ｔ／ｔ０）の関数として表現した下記式（１） The present invention is a liquid chromatograph apparatus that can be used in a liquid column chromatograph performed by changing the mixing ratio of the solvent, and the change relational expression of the mixing ratio of the solvent introduced into the column is expressed by the mobility R f of the component c ( The following formula (1) expressed as a function of t / t 0 )
を記憶する混合比変化式記憶手段と、
前記混合比変化関係式記憶手段が記憶した前記変化関係式に従って前記２つの溶媒の混合比が連続的に変化する溶離液を生成する混合手段と、
前記混合手段によって得られた溶離液を連続的にカラムに導入するポンプと、
前記試料が前記カラムに流入し始めてから成分ｃが前記カラムから溶出するまでの溶出時間ｔｒ ｃを導出する溶出時間導出手段とを備えており、
前記溶出時間導出手段は、式（２）（５）によって表された移動度Ｒｆ ｃ（ｔ／ｔ０）の式によってｔｒ ｃを算出することによって溶出時間を算出するものであることを特徴とする液体クロマトグラフである。
Mixing ratio change type storage means for storing
Mixing means for generating an eluent in which the mixing ratio of the two solvents continuously changes in accordance with the change relational expression stored in the mixture ratio change relational expression storage means;
A pump for continuously introducing the eluent obtained by the mixing means into the column;
And a dissolution time derivation means the sample derives the elution time t r c from the beginning to flow into the column until the components c elutes from the column,
Said elution time deriving means is for calculating the elution time by calculating the t r c by the expression of equation (2) mobility represented by (5) R f c (t / t 0) It is the liquid chromatograph characterized.
本発明は、溶媒の混合比を変化させて行う液体カラムクロマトグラフにおいて使用される溶出時間導出手段を有する溶出時間導出装置であって、
試料が前記カラムに流入し始めてから前記試料に含まれる成分ｃが前記カラムから溶出するまでの溶出時間ｔｒ ｃを導出する溶出時間導出装置であり、
カラムに導入する溶媒の混合比の変化関係式を成分ｃの移動度Ｒｆの（ｔ／ｔ０）の関数として下記式（１）
The present invention is an elution time deriving device having elution time deriving means used in a liquid column chromatograph performed by changing the mixing ratio of solvents,
Sample is the elution time derivation device component c contained in the sample from the beginning to flow into the column derives the elution time t r c to elute from the column,
As a function of (t / t 0 ) of the mobility R f of the component c, the change relational expression of the solvent mixing ratio introduced into the column is expressed by the following formula (1)
で表した場合に、
前記溶出時間導出手段は、式（２）（５）によって表された式によってｔｒ ｃを算出することによってサンプルの溶出時間を算出するものであることを特徴とする溶出時間導出装置でもある。
When expressed in
The elution time derivation means is also the elution time derivation apparatus, characterized in that to calculate the elution time of the sample by calculating the t r c by formula represented by formula (2) (5).
本発明は、溶媒の混合比の変化関係式
前記試料が前記カラムに流入し始めてから前記成分ｃが前記カラムから溶出するまでの溶出時間ｔｒ ｃを導出する溶出時間導出手段とを備えており、
前記溶出時間導出手段は、下記式（２）（５）によってｔｒ ｃを算出することによって溶出時間を算出するものであることを特徴とする溶出時間導出用プログラムでもある。
The present invention is a change relational expression of the mixing ratio of the solvent.
And a dissolution time derivation means the sample derives the elution time t r c from the beginning to flow into the column until the component c are eluted from the column,
The elution time derivation means is also the elution time derivation program characterized in that to calculate the elution time by calculating the t r c by the following formula (2) (5).
本発明は、溶媒の混合比を変化させて行う液体カラムクロマトグラフに使用できる液体クロマトグラフ装置であって、
サンプルに与えられる溶媒のグラジュエントパターンを表す式（６）
The present invention is a liquid chromatograph apparatus that can be used in a liquid column chromatograph performed by changing the mixing ratio of solvents,
Equation (6) representing the gradient pattern of the solvent applied to the sample
を入力するグラジエントパターン入力手段と、
前記グラジエントパターン入力手段によって入力されたグラジエントパターンを表す式を式（７）
Gradient pattern input means for inputting
Expression (7) expressing the gradient pattern input by the gradient pattern input means
に基づいてカラムに導入する溶媒の混合比の変化関係式に変換する数式変換手段と、
前記溶媒の混合比の変化関係式に従って前記２つの溶媒の混合比が変化する溶離液を生成する混合手段と、
前記混合手段によって得られた溶離液を連続的にカラムに導入するポンプと
を備える特徴とすることを特徴とする液体クロマトグラフでもある。
Formula conversion means for converting into a change relational expression of the mixing ratio of the solvent introduced into the column based on
A mixing means for generating an eluent in which the mixing ratio of the two solvents changes according to the change relational expression of the mixing ratio of the solvent;
It is also a liquid chromatograph characterized by comprising a pump for continuously introducing the eluent obtained by the mixing means into the column.
本発明によると、任意のグラジエントを行ったクロマトグラフにおいて、試料中に含まれる各成分の溶出時間を事前に高精度に予測できるため、複数の成分の分離の程度を測定者が容易に事前に把握することが可能となり、混合比の変化関係式を評価することができる。 According to the present invention, in a chromatograph with an arbitrary gradient, the elution time of each component contained in a sample can be predicted with high accuracy in advance, so that the measurer can easily determine the degree of separation of a plurality of components in advance. It becomes possible to grasp, and the change relational expression of the mixing ratio can be evaluated.
また、本発明によると、所望溶出時間に対する成分に係る移動度を高精度に導出することができるので、成分の分離に十分な溶出時間が確保された、短い溶出時間での液体クロマトグラフが可能となる。 In addition, according to the present invention, the mobility related to the component with respect to the desired elution time can be derived with high accuracy, so that a liquid chromatograph with a short elution time can be secured with sufficient elution time ensured for component separation. It becomes.
更に、事前に各成分の溶出時間を知ることができるため、種々のグラジエント条件について比較検討を行い、もっとも効率よく各成分を分離できるグラジエント条件がどのようなものであるかを実験前に予測することができる。これによって、液体クロマトグラフによる分離の効率化を図ることができる。 In addition, since it is possible to know the elution time of each component in advance, a comparative study is performed on various gradient conditions, and the gradient conditions that can separate each component most efficiently are predicted before the experiment. be able to. Thereby, the efficiency of separation by a liquid chromatograph can be improved.
更に、液体クロマトフラフを行うサンプルにおける各成分の性質から予測される最適なグラジエント式に基づく液体クロマトグラフを行おうとする場合、当該グラジエント式に適応した最適な溶媒の混合比の変化式をえることができ、正確なグラジエントを行うことができる。このため、理論に基づいた正確な液体クロマトグラフを行うことができる。 In addition, when performing a liquid chromatograph based on the optimal gradient equation predicted from the properties of each component in the sample to be subjected to liquid chromatography, obtain an optimal solvent mixing ratio change equation suitable for the gradient equation. And an accurate gradient can be performed. For this reason, the exact liquid chromatograph based on a theory can be performed.
上述したように、グラジエントを行った場合は溶媒の混合比が変化することに対応してサンプル中の成分のＲｆ値が変化する。このＲｆ値の変化に基づいて理論的に溶出時間を算出する場合、特許文献１に記載されたような理論に基づいて溶出時間を算出すると、実際の溶出時間との間に差を生じる場合がある。よって、特許文献１の算出式に対して補正を行う必要がある。 As described above, when the gradient is performed, the Rf value of the component in the sample changes corresponding to the change in the mixing ratio of the solvent. When the elution time is theoretically calculated based on the change in the Rf value, when the elution time is calculated based on the theory as described in Patent Document 1, there is a difference from the actual elution time. There is. Therefore, it is necessary to correct the calculation formula of Patent Document 1.
本発明においては、このような関係式について検討を行い、より正確に溶離液として使用する溶媒の混合率の変化式と溶出時間との関係を明らかにすることができ、これによって、精密な液体クロマトグラフを行える方法、および、これに使用する液体クロマトグラフを提供するものである。 In the present invention, such a relational expression is examined, and the relation between the change expression of the mixing ratio of the solvent used as the eluent and the elution time can be clarified more accurately. A method capable of performing chromatography and a liquid chromatograph used for the method are provided.
引用文献１の方法で完全に正確な予測ができない場合が生じる原因は、溶媒の混合比を変化させた場合、式（２）におけるＲｆ Ｃ値として、カラムに注入された溶媒の混合比に対応した値を採用している点にある。現実には、成分ｃのＲｆ ｃ値は、その時点で成分ｃが存在する位置にある溶媒に対応したＲｆ ｃ値であり、ここに一定のずれが生じてしまう。よって、この時間のずれを反映させた計算式に修正することで、このような問題は解決される。本発明においては、このような点を考慮して、溶出時間を算出したものである。 The reason why a completely accurate prediction cannot be made by the method of Cited Document 1 is that when the mixing ratio of the solvent is changed, the R f C value in Equation (2) is used as the mixing ratio of the solvent injected into the column. The corresponding value is adopted. In reality, R f c value of component c is R f c values corresponding to the solvent which is positioned to present component c at that point, here it occurs a certain deviation. Therefore, such a problem is solved by correcting the calculation formula to reflect this time lag. In the present invention, the elution time is calculated in consideration of such points.
本発明は、より具体的には、溶媒の混合比の変化式を決定した後に溶出時間を決定する態様（以下、これを第１の本発明と記す）と、溶出時間から逆算して得られたグラジエント方法を数式化した後、この数式に対応した溶媒の混合比の変化式を決定する態様（以下、これを第２の本発明）とが考えられる。本明細書においては以下、これらを順次説明し、そののちに、具体的な液体クロマトグラフ装置について説明する。 More specifically, the present invention is obtained by calculating back the elution time after determining an equation for changing the mixing ratio of the solvent (hereinafter referred to as the first present invention) and the elution time. It is conceivable that the gradient method is formulated into a formula, and then the change formula of the solvent mixing ratio corresponding to this formula is determined (hereinafter referred to as the second invention). In the present specification, these will be sequentially described below, and then a specific liquid chromatograph apparatus will be described.
［第１の本発明について］
第１の本発明においては、溶離液の溶媒の混合比の変化関係式と、別途得られたサンプル中の成分についてのＲｆと溶媒の混合比との関係に基づいてサンプルの溶出時間を計算し、これによって最適な液体クロマトグラフを行うための条件を選定するものである。これによって、各成分の溶出時間が明らかな状態で液体クロマトグラフを行うことができるため、液体クロマトグラフの操作も便利なものとなる。
[About the first invention]
In the first aspect of the present invention, the elution time of the sample is calculated based on the change relational expression of the mixing ratio of the solvent in the eluent and the relationship between the Rf and the mixing ratio of the solvent for the components obtained separately. Thus, the conditions for performing the optimum liquid chromatograph are selected. Thereby, since the liquid chromatograph can be performed in a state where the elution time of each component is clear, the operation of the liquid chromatograph becomes convenient.
第１の本発明において、溶出時間を明らかにするためには、
（１）溶媒混合比の時間変化
（２）使用する混合溶媒において、溶媒混合比とサンプル中に含まれる成分のＲｆ値の関係を示す関係式
が必要である。（１）は、液体クロマトグラフを行う作業者が設定して、入力するものである。（２）は、各成分について混合溶媒の混合比とカラム充填剤の種類に応じて決まる固有値であり、実際に液体クロマトグラフ又は薄層クロマトグラフを行うことによって測定を行うことができる。
In the first invention, in order to clarify the elution time,
(1) Time variation of solvent mixing ratio (2) In the mixed solvent to be used, a relational expression showing the relationship between the solvent mixing ratio and the R f value of the component contained in the sample is required. (1) is set and input by an operator who performs a liquid chromatograph. (2) is an eigenvalue determined according to the mixing ratio of the mixed solvent and the type of column filler for each component, and can be measured by actually performing a liquid chromatograph or a thin layer chromatograph.
＜薄層クロマトグラフ＞
以下は、薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ：thin layer chromatography）に係る説明である。本発明において、薄層クロマトグラフは、液体クロマトグラフにおける試料の各成分の移動度と溶媒の混合比との関係式を導出するために行われる。すなわち、薄層クロマトグラフ等によって各成分の移動度と溶媒の配合比との関係を明らかにして、この関係式を各成分の溶出時間を予想において利用する。
<Thin layer chromatograph>
The following is an explanation relating to thin layer chromatography (TLC). In the present invention, the thin layer chromatograph is performed in order to derive a relational expression between the mobility of each component of the sample and the mixing ratio of the solvent in the liquid chromatograph. That is, the relationship between the mobility of each component and the compounding ratio of the solvent is clarified by a thin layer chromatograph or the like, and the elution time of each component is used in the prediction.
図２は、薄層クロマトグラフに用いられるＴＬＣ装置３０の概略図である。
ＴＬＣ装置３０は、薄層板３１及び容器３２を有している。容器３２には、液体クロマトグラフ１１によるクロマトグラフに用いられる溶媒と同様の溶媒を所定の混合比で混合した、溶離液３３が貯留される。本実施形態においては、上記のように、溶離液３３として溶媒Ａ及びＢが用いられる。また、薄層板３１は、液体クロマトグラフ１１に用いられる固定相と同様の材料からなり、本実施形態ではシリカゲルが用いられている。薄層板３１には、液体クロマトグラフ１１によるクロマトグラフの試料と同じ成分を有する試料３が設置される。試料３が設置された薄層板３１は、図２に示されるように、容器３２に貯留された溶離液３３に浸される。
FIG. 2 is a schematic diagram of a TLC device 30 used in a thin layer chromatograph.
The TLC device 30 includes a thin layer plate 31 and a container 32. The container 32 stores an eluent 33 in which a solvent similar to the solvent used in the chromatograph by the liquid chromatograph 11 is mixed at a predetermined mixing ratio. In the present embodiment, the solvents A and B are used as the eluent 33 as described above. The thin layer plate 31 is made of the same material as the stationary phase used in the liquid chromatograph 11, and silica gel is used in the present embodiment. The thin layer plate 31 is provided with a sample 3 having the same components as the chromatographic sample by the liquid chromatograph 11. As shown in FIG. 2, the thin layer plate 31 on which the sample 3 is installed is immersed in the eluent 33 stored in the container 32.
薄層板３１が溶離液３３に浸されると、毛管作用により溶離液３３が薄層板３１に吸い上げられていく。薄層板３１に設置された試料３に含まれる成分ｃは、溶離液３３の移動に伴って、徐々に上方に移動する。そして、薄層板３１が溶離液３３に浸されてから、薄層板３１に浸透した溶離液３３の上端部分が薄層板３１の上端に達するまでに要する時間に基づいて、成分ｃに係る移動度Ｒｆ ｃが求められる。図３は、このときの薄層板３１の様子を示している。薄層板３１における試料３の初期位置Ｓを基準位置とし、基準位置から薄層板３１の上端までの長さを基準長さ１．０としたとき、移動度Ｒｆ ｃは基準長さに対する基準位置からの成分ｃの移動距離（０≦Ｒｆ ｃ≦１．０）として求められる。 When the thin layer plate 31 is immersed in the eluent 33, the eluent 33 is sucked up by the thin layer plate 31 by capillary action. The component c contained in the sample 3 placed on the thin layer plate 31 gradually moves upward as the eluent 33 moves. Then, based on the time required for the upper end portion of the eluent 33 that has penetrated the thin layer plate 31 to reach the upper end of the thin layer plate 31 after the thin layer plate 31 is immersed in the eluent 33, the component c mobility R f c is determined. FIG. 3 shows a state of the thin layer plate 31 at this time. The initial position S of the sample 3 in the thin-layer plate 31 as a reference position, when the reference position to the upper end of the thin layer plate 31 a length as a reference length 1.0, the mobility R f c is the reference length The movement distance of the component c from the reference position (0 ≦ R f c ≦ 1.0) is obtained.
上記のような薄層クロマトグラフにより、混合比と移動度との関係が求められる。なお、一般に、混合溶媒中での成分ｃの移動度は、２種の溶媒の混合比に対する関数で表される。よって、１つの成分について、少なくとも２種類の混合比の混合溶媒に対してＲｆ値を測定すれば、これによってＲｆ値と混合溶媒の混合比との関係を関数としてあらわすことができる。 The relationship between the mixing ratio and the mobility is determined by the thin layer chromatograph as described above. In general, the mobility of component c in the mixed solvent is expressed as a function with respect to the mixing ratio of the two solvents. Therefore, if the R f value is measured for one component with respect to a mixed solvent having at least two types of mixing ratios, the relationship between the R f value and the mixing ratio of the mixed solvent can be expressed as a function.
図４は、薄層クロマトグラフから得られた混合比の変化と移動度の変化との関係の一例を示している。この例は、２つの溶媒の混合比がｒに設定されて行われた薄層クロマトグラフによって、ある成分の移動度がＲと求められた場合を示している。したがって、混合比と移動度との関係は、横軸が混合比、縦軸が移動度を示す平面において、点（ｒ，Ｒ）を通る直線４１によって表される。 FIG. 4 shows an example of the relationship between the change in the mixing ratio and the change in mobility obtained from the thin-layer chromatograph. This example shows a case where the mobility of a certain component is determined as R by thin layer chromatography performed with the mixing ratio of the two solvents set to r. Therefore, the relationship between the mixing ratio and the mobility is represented by a straight line 41 passing through the point (r, R) on the plane in which the horizontal axis indicates the mixing ratio and the vertical axis indicates the mobility.
＜液体クロマトグラフによるＲｆ値の測定方法＞
溶媒組成を変化させることのない液体カラムクロマトグラフにおいては、特定の成分ｃが溶出する時間をｔｒ ｃ０、溶離液が前記カラムに流入し始めてから前記溶離液が前記カラムから流出し始めるまでの時間をｔ０とすると、Ｒｆとｔｒ ｃ０、ｔ０とは、
Ｒｆ ｃ０＝ｔ０／ｔｒ ｃ０
の関係となる。したがって、溶媒の混合比を変化させない液体カラムクロマトグラフを溶媒組成の異なる２点について行って、ｔｒ ｃ０を測定することによっても、Ｒｆ ｃと溶媒の混合比との関係を明らかにすることができる。
<Measurement method of Rf value by liquid chromatograph>
In the liquid column chromatography without changing the solvent composition, since the time that a particular component c elutes t r c0, the eluate begins to flow into the column until the eluate begins to flow out from the column When the time is referred to as t 0, and R f and t r c0, t 0 is,
R f c0 = t 0 / t r c0
It becomes the relationship. Thus, the liquid column chromatograph does not change the mixing ratio of the solvent performed in two different points solvent composition, by measuring the t r c0, to clarify the relationship between the R f c and the mixing ratio of the solvent Can do.
＜溶媒混合比の変化式＞
本発明においては、溶媒の組成を変化させながら液体カラムクロマトグラフを行うものである。
この関係は、時間ｔにおける溶媒Ａの含有割合ｘ％とすると、
ｘ＝ｆ（ｔ）
として、ｘを任意の時間の関数とすることで表現することができる。
<Change formula of solvent mixing ratio>
In the present invention, liquid column chromatography is performed while changing the composition of the solvent.
If this relationship is the content ratio x% of the solvent A at time t,
x = f (t)
X can be expressed as a function of an arbitrary time.
一方、図４において上述したように、特定の成分ｃに着目して考えれば、溶媒Ａの含有割合がｘ０％という特定の値となる場合、その特定の混合比に対応した成分ｃのＲｆ（ｘ０）値が特定の値として存在する。これは上述した方法で明らかにしたＲｆ ｃと溶媒の混合比との関係から容易に導き出すことができる。
したがって、溶媒の混合比は、溶媒Ａの含有割合ではなく、特定の成分ｃのＲｆ値であるＲｆ ｃの時間変化の関数としてあらわすことができる。更に、当該関係において、時間ｔではなく、（ｔ／ｔ０）（式中、ｔ０は溶離液がカラムに流入し始めてから溶離液がカラムから流出し始めるまでの時間）によってあらわすこともできる。
以上の観点から、溶媒組成の変化式は、サンプル中の成分ｃの移動度に着目して、
On the other hand, as described above with reference to FIG. 4, when considering the specific component c, when the content ratio of the solvent A is a specific value of x 0 %, the R of the component c corresponding to the specific mixing ratio The f (x 0 ) value exists as a specific value. This can be easily derived from the relationship between R f c and the solvent mixing ratio clarified by the above-described method.
Therefore, the mixing ratio of the solvent can be expressed not as a content ratio of the solvent A but as a function of the time change of R f c which is the R f value of the specific component c. Furthermore, in this relationship, instead of the time t, (t / t 0 ) (where t 0 is the time from when the eluent starts to flow into the column to when the eluent starts to flow out) can be expressed. .
From the above viewpoint, the change formula of the solvent composition focuses on the mobility of the component c in the sample,
なお、複数の成分を含有するサンプルの分離において液体カラムクロマトグラフを使用する場合は、それぞれの成分について、溶媒の混合比の変化式を上記式（１）の形で表すことができる。成分ごとに溶出時間を算出する必要がある場合は、上記式（１）を成分毎に作成する必要がある。 In the case of using a liquid column chromatograph in the separation of a sample containing a plurality of components, the change formula of the solvent mixing ratio can be expressed in the form of the above formula (1) for each component. When it is necessary to calculate the elution time for each component, the above formula (1) needs to be created for each component.
＜溶出時間の算出＞
一方、特許文献１における知見において、特定成分ｃの溶出時間ｔｒ ｃ
<Calculation of elution time>
On the other hand, in finding in Patent Document 1, the elution time of a specific component c t r c
で求められることが知られている。
しかしながら、上述した式（１）で示されたＲｆ ｃを式（２）に適用しても、実際の溶出時間に対応したｔｒ ｃが算出できない場合があった。
It is known that it is required in
However, even by applying the R f c shown in equation (1) described above in equation (2), there is a case that corresponds to the actual elution time t r c can not be calculated.
本発明においては、以下の式（５） In the present invention, the following formula (5)
という関係式を式（２）に導入することでより正確な溶出時間の算出時間が算出できることを見出したものである。 It has been found that a more accurate calculation time of elution time can be calculated by introducing the relational expression:
なお、式中、定数ｂは、液体クロマトグラフに導入する最初の溶媒に対する成分ｃのＲｆ値を表す初期移動度Ｒｆ０から導くことができる定数である。具体的には、ｂ＝ｌｎ（１−Ｒｆ０）である。ｂは薄層クロマトグラィ（ＴＬＣ）又はカラムを用いた液体クロマトグラフでＲｆ０を測定することによって得られる。 In the formula, the constant b is a constant that can be derived from the initial mobility R f0 that represents the R f value of the component c with respect to the first solvent introduced into the liquid chromatograph. Specifically, b = ln (1-R f0 ). b is obtained by measuring R f0 by thin layer chromatography (TLC) or liquid chromatography using a column.
式（３）を式（２）に適用することで、ｔｒ ｃを正確に算出することができ、これによって成分ｃの溶出時間を算出することができる。このような方法で算出されたｔｒ ｃは、実際の実験結果との対応関係も良好である。 By applying equation (3) into equation (2), it is possible to accurately calculate the t r c, whereby it is possible to calculate the elution time of component c. The tr c calculated by such a method has a good correspondence with the actual experimental results.
また、試料中の複数成分のそれぞれについて上記操作を行うことによって、複数の成分に対してｔｒ ｃを得ることもできる。これによって、各成分の溶出時間を知ることができるから、これによって良好な分離が行われるかどうかの予測を事前に行うこともできる。すなわち、各成分のｔｒ ｃが非常に近い値となる場合は、グラジエント条件が不適切と判断されるため、新たなグラジエント条件を設定したり、より長いカラムを使用したりして、良好な分離が行われるように条件を変更することが好ましい。また、特定成分の溶出時間が過剰に長くなると予測される場合には、一般式（１）を変化させることによって、最適な条件の検討を行うこともできる。 Further, by performing the above operation for each of the plurality of components in a sample, it can be obtained t r c for a plurality of components. As a result, it is possible to know the elution time of each component, so that it is possible to predict in advance whether or not good separation will be performed. That is, when tr c of each component is very close, it is determined that the gradient condition is inappropriate. Therefore, a new gradient condition is set or a longer column is used. It is preferable to change the conditions so that the separation takes place. In addition, when it is predicted that the elution time of the specific component will be excessively long, the optimum condition can be examined by changing the general formula (1).
以下、具体的な例に基づいて上記式による算出を行う。
図５、６には、ｔ／ｔ０に対する移動度Ｒｆ ｃ（ｔ／ｔ０）の各種の変化の様子を表したグラフを示した。
Hereinafter, calculation by the above formula is performed based on a specific example.
Figure 5 and 6, showed various graph showing the manner of change in mobility R f c (t / t 0 ) for t / t 0.
図５においては、特定の成分ｃに対して、
の関係となるようにカラムに導入する溶媒の混合比を変化させるグラジエントをかけたものである。
この場合、当該式を上記式（５）に適用することによって、
In FIG. 5, for a specific component c,
A gradient that changes the mixing ratio of the solvent introduced into the column is applied so as to satisfy the following relationship.
In this case, by applying the equation to the above equation (5),
の関係が導き出せる。このような関係を図５に示す。
このようにして得られたＲｆの値を式（２）に適用して積分を行うことによって、成分ｃの溶出時間を算出することができる。
Can be derived. Such a relationship is shown in FIG.
The elution time of component c can be calculated by applying the value of R f thus obtained to Equation (2) and performing integration.
同様に、図６においては、 Similarly, in FIG.
の関係となるようにカラムに導入する溶媒の混合比を変化させるグラジエントをかけたものである。
この場合、当該式を上記式（５）に適用することによって、
A gradient that changes the mixing ratio of the solvent introduced into the column is applied so as to satisfy the following relationship.
In this case, by applying the equation to the above equation (5),
このようにして得られたＲｆの値を式（２）に適用して積分を行うことによって、成分ｃの溶出時間を算出することができる。
The elution time of component c can be calculated by applying the value of R f thus obtained to Equation (2) and performing integration.
このように、本発明の液体クロマトグラフを使用することによって、任意のグラジエントを行った場合の正確な溶出時間を導くことができるものである。 Thus, the use of the liquid chromatograph of the present invention can lead to an accurate elution time when an arbitrary gradient is performed.
［第２の本発明について］
第２の本発明においては、溶出時間を先に設定して、適切な溶出時間を得るための溶媒の混合比の変化関係式を導き出し、このようにして導かれた溶媒の混合比の変化関係式に応じた液体クロマトグラフを行うものである。すなわち、サンプル中に存在する各成分のＲｆ値と溶媒の混合割合の関係を上述した方法によって明らかにすれば、式（２）
[About the Second Invention]
In the second aspect of the present invention, the elution time is set in advance, a change relational expression of the solvent mixing ratio for obtaining an appropriate elution time is derived, and the change relation of the solvent mixing ratio thus derived is derived. A liquid chromatograph according to the equation is performed. That is, if the relationship between the R f value of each component present in the sample and the mixing ratio of the solvent is clarified by the method described above, the formula (2)
のｔｒ ｃを目的の溶出時間として、複数種の成分ｃに対してそれぞれ目的の溶出時間を設定することで、最適な液体クロマトグラフのグラジエント条件をＲｆ ｃの時間変化の関係式としてあらわすことができる。
The t r c as the elution time of the target, respectively for a plurality of types of component c by setting the elution time of interest, represents the optimal gradient conditions of the liquid chromatograph as a relationship of a temporal change in the R f c be able to.
このようにして表されたＲｆ ｃの時間を変数とする関係式は、 The relational expression with the time of R f c expressed in this way as a variable is
とすることができる。
なお、このような関係式は、作業者が所定の測定値に基づいて設定して作成し、入力するものであってもよいし、条件に応じて関係式作成プログラムによって作成するものであってもよい。
It can be.
Such a relational expression may be created and input by an operator based on a predetermined measurement value, or may be created by a relational expression creation program depending on conditions. Also good.
そして、溶出時間に基づいて決定された式（６）に基づく、移動度と時間との関係による正確な液体クロマトグラフを行うためには、上述したようなカラム入口部分と各成分との溶媒比の相違を反映させて、溶媒の混合比の変化関係式を導き出す必要がある。より適切な溶媒の混合比の変化関係式を得るには、上述した第１の本発明の計算方法を逆に行うことが必要である。このようにして、良好なグラジュエントを得るための溶媒の混合比の変化関係式を設定することが第２の本発明の特徴である。 In order to perform an accurate liquid chromatograph based on the relationship between mobility and time based on the equation (6) determined based on the elution time, the solvent ratio between the column inlet portion and each component as described above is used. It is necessary to derive a change relational expression of the mixing ratio of the solvent in order to reflect the difference. In order to obtain a more appropriate change relational expression of the solvent mixing ratio, it is necessary to reverse the calculation method of the first aspect of the present invention described above. Thus, it is a feature of the second aspect of the present invention to set the change relational expression of the mixing ratio of the solvent for obtaining a good gradient.
第２の本発明においては、まず、サンプル中に存在する各成分について、既に詳述した薄層クロマトグラフにより、混合比と移動度との関係を明らかにする。そして、この関係から、サンプルに対してどのようなグラジエントがかかれば、良好な分離を行うことができるか、という点について予測を行う。成分毎に混合比と移動度が分かれば、ある程度直線的な変化によってグラジエントをかけたほうがよいか、あるいは上に凸となるような曲線的な変化を行うことが好ましいか、下に凸となるような曲線的な変化を行うことが好ましいか、等のおおよその見当をつけることができる。また、このような混合比と移動度との関係式の作成をプログラムによって自動的に行ってもよい。 In the second aspect of the present invention, the relationship between the mixing ratio and the mobility is first clarified by the thin layer chromatograph described in detail for each component present in the sample. Based on this relationship, a prediction is made as to what kind of gradient is applied to the sample and good separation can be performed. If the mixing ratio and mobility are known for each component, it is better to apply the gradient by a linear change to some extent, or it is preferable to perform a curvilinear change that is convex upward, or it is convex downward It is possible to make an approximate registration such as whether it is preferable to make such a curvilinear change. In addition, such a relational expression between the mixture ratio and mobility may be automatically created by a program.
そして、各成分が所定の溶出時間となるように予測される式（６）を決定することができる。すなわち、 Then, the formula (6) that is predicted so that each component has a predetermined elution time can be determined. That is,
として、最適な溶出時間を有するような条件として各成分の時間ｔにおけるＲｆ値を表す式を得ることができる。 As a condition for having an optimal elution time, an equation representing the R f value of each component at time t can be obtained.
なお、当該式（６）を上記式（２）に適用すれば、各成分のｔｒ ｃは容易に算出できるから、これによって、適切な溶出時間が得られる関係式であるか否かの確認ができる。 Incidentally, by applying the equation (6) into the equation (2), confirmed from t r c of the components can be easily calculated, in this way, whether the relational expression suitable elution time is obtained Can do.
第２の本発明においては、このような関係式（６）に基づくＲｆ変化をカラム内に存在する各成分に適用させるために、カラムに導入する溶媒の混合比変化式を得るものである。このようにして得られた、溶媒の混合比変化式にもとづいて溶媒の混合比を変化させて液体クロマトグラフに導入することによって、理論によって導いたとおりの溶出時間を有する液体クロマトグラフを行うものである。 In the second aspect of the present invention, in order to apply the R f change based on the relational expression (6) to each component existing in the column, a formula for changing the mixing ratio of the solvent introduced into the column is obtained. . A liquid chromatograph having an elution time as theoretically derived by changing the solvent mixing ratio based on the solvent mixing ratio change formula and introducing it into the liquid chromatograph. It is.
上記（６）の関係式からカラムに導入する溶媒の混合比の変化式を求める方法は、上述した第１の本発明の計算式と完全に逆の計算を行えばよい。
すなわち、上記数式（５）（６）を組み合わせることによって、
The method for obtaining the change formula of the mixing ratio of the solvent introduced into the column from the relational expression (6) may be a calculation that is completely opposite to the calculation formula of the first invention described above.
That is, by combining the above formulas (5) and (6),
の関係が導かれる。
なお、上記式（８）中のｂｘは、初期移動度に対する定数であり、上述したｂと同様に実測によって測定することができる。
これを整理することで、
The relationship is guided.
Note that b x in the above formula (8) is a constant for the initial mobility, and can be measured by actual measurement in the same manner as b described above.
By organizing this,
の関係式を導くことができる。これによって、理論的に算出された所定の時間における成分ｃに対するＲｆ値の式に基づいてカラムに導入する溶媒の混合比の変化式を得ることができる。 The following relational expression can be derived. As a result, an equation for changing the mixing ratio of the solvent to be introduced into the column can be obtained based on the formula of the R f value for the component c at a theoretically calculated predetermined time.
以下に、具体的な例によって更に説明する。
例えば、式（２）使用した検討によって、各成分について所定の溶出時間を得るためのＲｆ値の時間変化の最適な式が、
This will be further described below with specific examples.
For example, the optimal expression for the time change of the R f value for obtaining a predetermined elution time for each component by the study using Expression (2) is as follows:
であることが明らかになった場合を例に説明する。 The case where it becomes clear will be described as an example.
上記（６）式にこれを代入することで、 By substituting this into equation (6) above,
の式を導くことができる。
これを図７に示す。
このような式によってあらわされた溶媒の混合比の変化式に従って、カラムに導入する溶媒の混合比を変化させることによって、当初設定した条件で予測された溶出時間で各成分を取り出すことができ、精密な分離を容易に行うことができる。
The following formula can be derived.
This is shown in FIG.
By changing the mixing ratio of the solvent to be introduced into the column in accordance with the changing formula of the mixing ratio of the solvent expressed by such an expression, each component can be taken out with the elution time predicted under the initially set conditions. Precise separation can be easily performed.
［液体クロマトグラフ装置］
本発明は、上述したような溶媒の混合比の変化関係式と溶出時間との関係を用いて制御する液体クロマトフラフ装置に関するものである。
上述した第１の本発明を行う場合も、第２の本発明を行う場合も使用する装置は本質的に同一であり、いずれの場合も、混合比変化式記憶手段と、前記混合比変化関係式記憶手段が記憶した前記変化関係式に従って前記２つの溶媒の混合比が連続的に変化する溶離液を生成する混合手段と、前記混合手段によって得られた溶離液を連続的にカラムに導入するポンプと、前記試料が前記カラムに流入し始めてから成分ｃが前記カラムから溶出するまでの溶出時間ｔｒ ｃを導出する溶出時間導出手段を備えた液体クロマトグラフ装置によって発明を実施することができる。
[Liquid chromatograph]
The present invention relates to a liquid chromatographic apparatus that is controlled using the relationship between the change relational expression of the solvent mixing ratio and the elution time as described above.
The apparatus used is the same for both the first invention and the second invention described above. In either case, the mixture ratio change type storage means and the mixture ratio change relationship are used. A mixing means for generating an eluent in which the mixing ratio of the two solvents continuously changes in accordance with the change relational expression stored in the equation storage means, and an eluent obtained by the mixing means is continuously introduced into the column. a pump, may be the sample out the invention by a liquid chromatographic apparatus having a dissolution time derivation means for deriving the elution time t r c until flowed started by the component c to the column are eluted from the column .
なお、第２の本発明の場合、上記構成を備えた装置に、上記（６）で示される関係式を入力し、これから混合比変化関係式を得て、これに基づいて混合手段を制御することによって使用するものであるから、使用方法は異なる。しかしながら、計算は逆算によって行うものであるから、使用態様が異なるのみであり、使用する装置は実質的に同一のものとすることができる。 In the case of the second aspect of the present invention, the relational expression shown in (6) above is input to the apparatus having the above-described configuration, and the mixing ratio change relational expression is obtained therefrom, and the mixing means is controlled based on this. The method of use is different. However, since the calculation is performed by back calculation, only the usage mode is different, and the devices used can be substantially the same.
したがって、第２の本発明においては、グラジエントパターン入力手段と、前記グラジエントパターン入力手段によって入力されたグラジエントパターンを表す式を式（７）に基づいて溶媒の混合比の変化関係式に変換する数式変換手段と、前記溶媒の混合比の変化関係式に従って前記２つの溶媒の混合比が変化する溶離液を生成する混合手段と、前記混合手段によって得られた溶離液を連続的にカラムに導入するポンプを有する液体クロマトグラフとして表現されているが、（Ａ）上記溶出時間導出手段に対してグラジエントパターンを入力する入力手段を備え、（Ｂ）上記溶出時間導出手段で逆算することによって混合比変化関係式を導き出している、と考えれば、これらは実質的に同一の手段である。 Therefore, in the second aspect of the present invention, the gradient pattern input means and the mathematical expression for converting the expression representing the gradient pattern input by the gradient pattern input means into a change relational expression of the solvent mixing ratio based on the expression (7) A conversion unit; a mixing unit that generates an eluent in which the mixing ratio of the two solvents changes according to a change relational expression of the mixing ratio of the solvent; and an eluent obtained by the mixing unit is continuously introduced into the column. Although expressed as a liquid chromatograph having a pump, (A) provided with an input means for inputting a gradient pattern to the elution time deriving means, and (B) a change in the mixing ratio by performing reverse calculation with the elution time deriving means If we consider that we have derived the relational expression, these are substantially the same means.
したがって、本発明の液体クロマトグラフは、本発明１及び本発明２の両方の態様に対応できる液体クロマトグラフとすることができる。
以下にこれを具体的に説明する。
Therefore, the liquid chromatograph of the present invention can be a liquid chromatograph that can correspond to both aspects of the present invention 1 and the present invention 2.
This will be specifically described below.
＜液体クロマトグラフの概略構成＞
液体クロマトグラフ１１は、溶媒Ａ及びＢをそれぞれ貯留した容器１２及び１３、電磁弁１４、ポンプＰ１、並びに、容器１５（以上、混合手段）を有している。容器１２及び１３が貯留した溶媒Ａ及びＢは、ポンプＰ１によって汲み上げられ、いったん容器１５に貯留される。このとき、汲み上げられる溶媒Ａ及びＢのそれぞれの量は、電磁弁１４によって調節されている。これによって、電磁弁１４によって調節された混合比で溶媒Ａ及びＢが混合され、容器１５において移動相となる溶離液１０が形成される。
<Schematic configuration of liquid chromatograph>
The liquid chromatograph 11 includes containers 12 and 13 that store the solvents A and B, an electromagnetic valve 14, a pump P1, and a container 15 (hereinafter, mixing means). The solvents A and B stored in the containers 12 and 13 are pumped up by the pump P1 and temporarily stored in the container 15. At this time, the respective amounts of the solvents A and B pumped up are adjusted by the electromagnetic valve 14. As a result, the solvents A and B are mixed at the mixing ratio adjusted by the electromagnetic valve 14, and the eluent 10 serving as the mobile phase is formed in the container 15.
溶離液として用いられる溶媒は２種類に限定されず、使用状態・目的に応じてその数が増やされる。一般に、溶媒Ａ及びＢには、非極性分子及び極性分子が用いられる。 The number of solvents used as the eluent is not limited to two, and the number is increased according to the state of use and purpose. In general, non-polar molecules and polar molecules are used for the solvents A and B.
液体クロマトグラフ１１は、さらに、ポンプＰ２、インジェクター１７、及び、カラム１８を有している。ポンプＰ２は、容器１５に貯留された溶離液１０を汲み上げて、インジェクター１７へと流し出す。インジェクター１７には、複数の成分を含んでいる試料が設置されている。インジェクター１７に設置された試料は、ポンプＰ２によって汲み上げられた溶離液とともに、カラム１８へと流し出される。 The liquid chromatograph 11 further includes a pump P2, an injector 17, and a column 18. The pump P <b> 2 pumps up the eluent 10 stored in the container 15 and flows it out to the injector 17. The injector 17 is provided with a sample containing a plurality of components. The sample installed in the injector 17 is flowed out to the column 18 together with the eluent pumped up by the pump P2.
カラム１８には、固定相が充填されている。本実施形態においては、固定相には通常、シリカゲルが用いられている。但し、特殊な分離が必要とされる場合は、それ以外の固定相が使用されるものであってもよい。移動相である溶離液１０とともにカラム１８に流入した試料は、カラム１８の固定相に吸着しつつ溶離液１０の流下に従って移動し、所定時間後にカラムから排出される。ここで、試料に含まれた各成分が排出されるのに要する時間は、溶離液との親和性やカラムの固定相と各成分との相互作用などに依存し、成分ごとに異なる。つまり、溶離液との親和性が弱いもの、及び、固定相との相互作用が強いものは、カラム内に長く留まる。また、逆に、溶離液との親和性が強いもの、及び、固定相との相互作用が弱いものは、早く排出される。これによって、カラムに設置された試料が成分ごとに分離されて溶出する。 Column 18 is packed with a stationary phase. In this embodiment, silica gel is usually used for the stationary phase. However, when special separation is required, other stationary phases may be used. The sample that has flowed into the column 18 together with the eluent 10 as the mobile phase moves along the flow of the eluent 10 while adsorbing to the stationary phase of the column 18 and is discharged from the column after a predetermined time. Here, the time required for discharging each component contained in the sample depends on the affinity with the eluent, the interaction between the stationary phase of the column and each component, etc., and differs for each component. That is, those having weak affinity with the eluent and those having strong interaction with the stationary phase stay in the column for a long time. Conversely, those having a strong affinity with the eluent and those having a weak interaction with the stationary phase are quickly discharged. As a result, the sample placed on the column is separated for each component and eluted.
液体クロマトグラフ１１は、さらに、検知器１９及びフラクションコレクター２０を有している。検知器１９は、カラム１８から溶出される試料の各成分を検知する。フラクションコレクター２０は、検知器１９の検知結果に基づいて、試料に含まれる各成分をそれぞれ異なる試験管に収容する。 The liquid chromatograph 11 further includes a detector 19 and a fraction collector 20. The detector 19 detects each component of the sample eluted from the column 18. The fraction collector 20 accommodates each component contained in the sample in a different test tube based on the detection result of the detector 19.
液体クロマトグラフ１１は、さらに、液体クロマトグラフ制御装置２１を有している。液体クロマトグラフ制御装置２１は電磁弁１４に電気的に接続されている。そして、液体クロマトグラフ制御装置２１は、後述のように、電磁弁１４を制御して、溶媒Ａ及びＢの混合比を調節する。また、液体クロマトグラフ制御装置２１は、図示されないポンプＰ１及びＰ２の駆動モータに電気的に接続されており、ポンプＰ１及びＰ２の駆動を制御する。 The liquid chromatograph 11 further includes a liquid chromatograph control device 21. The liquid chromatograph control device 21 is electrically connected to the electromagnetic valve 14. Then, the liquid chromatograph control device 21 controls the electromagnetic valve 14 to adjust the mixing ratio of the solvents A and B as will be described later. The liquid chromatograph control device 21 is electrically connected to drive motors of pumps P1 and P2 (not shown), and controls driving of the pumps P1 and P2.
＜液体クロマトグラフの概略＞
上記のような構成を有する液体クロマトグラフ１１によって、液体クロマトグラフが以下のように行われる。
<Outline of liquid chromatograph>
By the liquid chromatograph 11 having the above configuration, the liquid chromatograph is performed as follows.
まず、容器１２及び１３に溶媒Ａ及びＢが貯留される。そして、インジェクター１７に試料が設置される。 First, the solvents A and B are stored in the containers 12 and 13. Then, a sample is placed on the injector 17.
次に、液体クロマトグラフ制御装置２１が、電磁弁１４を制御して混合比を調節しつつ、ポンプＰ１の駆動を制御して、ポンプＰ１に溶媒Ａ及びＢを汲み上げさせる。このとき、液体クロマトグラフ制御装置２１は、設定された混合比の変化反応式に従って混合比を調節する。汲み上げられた溶媒Ａ及びＢは、調節された混合比で混合され、溶離液１０として、いったん容器１５に貯留される。 Next, the liquid chromatograph control device 21 controls the solenoid valve 14 to adjust the mixing ratio, and controls the driving of the pump P1 to cause the pump P1 to pump up the solvents A and B. At this time, the liquid chromatograph control device 21 adjusts the mixing ratio according to the set mixing ratio changing reaction formula. The pumped solvents A and B are mixed at a controlled mixing ratio and temporarily stored in the container 15 as the eluent 10.
次に、液体クロマトグラフ制御装置２１が、ポンプＰ２の駆動を制御して、ポンプＰ２に容器１５に貯留された溶離液１０を汲み上げさせる。汲み上げられた溶離液１０は、インジェクター１７に設置された試料とともに、カラム１８に流入する。カラム１８に流入した試料に含まれる各成分は、成分ごとに分離され、所定時間経過後にカラム１８から溶出する。その際、各成分の溶出時間が算出されているから、これを液体クロマトグラフ装置に表示させることが好ましい。また、各フラクションの取得を算出された溶出時間に応じて適宜行うサンプル取得手段を備えたものであってもよい。 Next, the liquid chromatograph control device 21 controls the drive of the pump P2, and causes the pump P2 to pump up the eluent 10 stored in the container 15. The eluent 10 pumped up flows into the column 18 together with the sample installed in the injector 17. Each component contained in the sample flowing into the column 18 is separated for each component and eluted from the column 18 after a predetermined time has elapsed. In that case, since the elution time of each component is calculated, it is preferable to display it on the liquid chromatograph apparatus. Moreover, it may be provided with a sample acquisition means for appropriately acquiring each fraction according to the calculated elution time.
なお、本明細書において、「試料中の成分がカラムから溶出する時」とは、カラム１８から溶出される試料中の成分の単位時間当たりの量が最大となる時にほぼ相当するものである。 In the present specification, “when the component in the sample is eluted from the column” substantially corresponds to the time when the amount of the component in the sample eluted from the column 18 is maximum.
＜液体クロマトグラフ制御装置＞
以下は、液体クロマトグラフ制御装置２１についての説明である。
<Liquid chromatograph control device>
The following is a description of the liquid chromatograph control device 21.
液体クロマトグラフ制御装置２１の機能は、汎用のコンピュータ及び所定のプログラムによって実現されている。このコンピュータには、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスク、ＦＤやＣＤの駆動装置などのハードウェアが収納されており、ハードディスクには、このコンピュータを液体クロマトグラフ制御装置として機能させるためのプログラム（このプログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ、ＦＤ、ＭＯなどのリムーバブル型記録媒体に記録しておくことにより、任意のコンピュータにインストールすることが可能である）を含む各種のソフトウェアが記憶されている。そして、これらのハードウェア及びソフトウェアが組み合わされることによって、記憶部及び制御処理部が構築されている。 The function of the liquid chromatograph control device 21 is realized by a general-purpose computer and a predetermined program. The computer stores hardware such as a CPU, ROM, RAM, hard disk, FD and CD drive device, and the hard disk includes a program (this program for causing the computer to function as a liquid chromatograph control device). Are stored in a removable recording medium such as a CD-ROM, FD, or MO, and can be installed in any computer. A storage unit and a control processing unit are constructed by combining these hardware and software.
本発明の液体クロマトグラフ制御装置は入力手段も備えており、ＴＬＣ等によって導かれる図４に示したような関係、溶媒の混合比の変化関係式等の、本発明の目的を達成する上で必要とされる各種情報を作業者が入力する手段を有するものである。 The liquid chromatograph control apparatus of the present invention is also provided with input means, and in order to achieve the object of the present invention, such as the relationship shown in FIG. It has means for an operator to input various necessary information.
当該制御装置においては、上述した本発明の目的を達成する上で必要とされる各種関係式がすべて記憶されており、それぞれ目的に応じて呼び出されて、入力されたデータに基づいて必要な演算を行い、更に、入力された溶媒の混合比の変化関係式、又は、算出された溶媒の混合比の変化関係式に基づいて、溶離液における溶媒の混合比を制御する。更に、算出された各成分の溶出時間数値又はグラフとして表示手段上に表示し、作業者に情報を提供するものである。 In the control device, all the various relational expressions necessary for achieving the above-described object of the present invention are stored, and each of them is called according to the purpose and necessary calculation based on the input data. Further, the mixing ratio of the solvent in the eluent is controlled based on the input change relational expression of the solvent mixing ratio or the calculated changing relational expression of the solvent mixing ratio. Further, the calculated elution time value or graph of each component is displayed on the display means to provide information to the operator.
すなわち、これによって、第一の本発明においては、使用者が入力又は選択した混合比変化式を制御装置中の混合比変化式記憶手段に記憶させ、これを利用して溶離液の組成を変化させ、更に、溶出時間導出手段を用いて、溶出時間を予測するものである。
更に、第二の本発明においては、使用者が入力、選択又はプログラムによって推奨されたグラジエントパターンをあらわす式をグラジエント入力手段から入力し、これを数式変換手段によって、溶媒の混合比の変化関係式に変換し、これに基づいて溶媒の混合比を変化させ、カラムクロマトグラフを行うものである。第二の本発明においても、グラジエントパターンをあらわす式に基づいて溶出時間を予測することができる。
That is, according to this, in the first aspect of the present invention, the mixing ratio change expression input or selected by the user is stored in the mixing ratio change expression storing means in the control device, and the composition of the eluent is changed using this. Furthermore, the elution time is predicted using elution time deriving means.
Further, in the second aspect of the present invention, a formula representing a gradient pattern recommended by the user, input, selection, or program is input from the gradient input means, and this is expressed by the formula conversion means as a change relational expression of the solvent mixing ratio. Column chromatography is performed by changing the solvent mixing ratio based on this. Also in the second aspect of the present invention, the elution time can be predicted based on an equation representing a gradient pattern.
本発明の液体クロマトグラフは、研究室等における実験に際して、精密な分離を簡便に行うために使用することができる。 The liquid chromatograph of the present invention can be used to easily perform precise separation in experiments in laboratories and the like.
１０ 溶離液
１１ 液体クロマトグラフ
１８ カラム
２１ 液体クロマトグラフ制御装置
３０ 薄層クロマトグラフ
３１ 薄層板
３３ 溶離液
５１ 溶媒の混合比の変化を表すグラフ
５２ 特定の成分についての実際のＲｆを表すグラフ
５３ 特定の成分に期待されるＲｆを表すグラフ
５４ ５３の関係式に対応した溶媒の混合比の変化を表すグラフ
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Eluent 11 Liquid chromatograph 18 Column 21 Liquid chromatograph control apparatus 30 Thin layer chromatograph 31 Thin layer plate 33 Eluent 51 The graph 52 which shows the change of the mixing ratio of a solvent 52 The graph 53 which shows actual Rf about a specific component Graph representing change in solvent mixing ratio corresponding to the relational expression of graph 5453 representing Rf expected for a specific component
Claims (4)
カラムに導入する溶媒の混合比の変化関係式を成分ｃの移動度Ｒｆの（ｔ／ｔ０）の関数として表現した下記式（１）
を記憶する混合比変化式記憶手段と、
前記混合比変化関係式記憶手段が記憶した前記変化関係式に従って前記２つの溶媒の混合比が連続的に変化する溶離液を生成する混合手段と、
前記混合手段によって得られた溶離液を連続的にカラムに導入するポンプと、
前記試料が前記カラムに流入し始めてから成分ｃが前記カラムから溶出するまでの溶出時間ｔｒ ｃを導出する溶出時間導出手段とを備えており、
前記溶出時間導出手段は、式（２）（５）によって表された移動度Ｒｆ ｃ（ｔ／ｔ０）の式によってｔｒ ｃを算出することによって溶出時間を算出するものであることを特徴とする液体クロマトグラフ。
The following relational expression (1) in which the change relational expression of the mixing ratio of the solvent introduced into the column is expressed as a function of (t / t 0 ) of the mobility R f of the component c
Mixing ratio change type storage means for storing
Mixing means for generating an eluent in which the mixing ratio of the two solvents continuously changes in accordance with the change relational expression stored in the mixture ratio change relational expression storage means;
A pump for continuously introducing the eluent obtained by the mixing means into the column;
And a dissolution time derivation means the sample derives the elution time t r c from the beginning to flow into the column until the components c elutes from the column,
Said elution time deriving means is for calculating the elution time by calculating the t r c by the expression of equation (2) mobility represented by (5) R f c (t / t 0) Characteristic liquid chromatograph.
試料が前記カラムに流入し始めてから前記試料に含まれる成分ｃが前記カラムから溶出するまでの溶出時間ｔｒ ｃを導出する溶出時間導出装置であり、
カラムに導入する溶媒の混合比の変化関係式を成分ｃの移動度Ｒｆの（ｔ／ｔ０）の関数として下記式（１）
で表した場合に、
前記溶出時間導出手段は、式（２）（５）によって表された式によってｔｒ ｃを算出することによって溶出時間を算出するものであることを特徴とする溶出時間導出装置。
Sample is the elution time derivation device component c contained in the sample from the beginning to flow into the column derives the elution time t r c to elute from the column,
As a function of (t / t 0 ) of the mobility R f of the component c, the change relational expression of the solvent mixing ratio introduced into the column is expressed by the following formula (1)
When expressed in
The elution time deriving unit of the formula (2) (5) elution time derivation apparatus, characterized in that to calculate the elution time by calculating the t r c by the represented expression by.
を記憶する混合比変化式記憶手段と、
前記試料が前記カラムに流入し始めてから前記成分ｃが前記カラムから溶出するまでの溶出時間ｔｒ ｃを導出する溶出時間導出手段とを備えており、
前記溶出時間導出手段は、下記式（２）（５）によってｔｒ ｃを算出することによって溶出時間を算出するものであることを特徴とする溶出時間導出用プログラム。
Mixing ratio change type storage means for storing
And a dissolution time derivation means the sample derives the elution time t r c from the beginning to flow into the column until the component c are eluted from the column,
The elution time deriving unit represented by the following formula (2) (5) by elution time derivation program characterized in that to calculate the elution time by calculating the t r c.
サンプルに与えられる溶媒のグラジエントパターンを表す式（６）
を入力するグラジエントパターン入力手段と、
前記グラジエントパターン入力手段によって入力されたグラジエントパターンを表す式を式（７）
前記溶媒の混合比の変化関係式に従って前記２つの溶媒の混合比が変化する溶離液を生成する混合手段と、
前記混合手段によって得られた溶離液を連続的にカラムに導入するポンプと
を備える特徴とすることを特徴とする液体クロマトグラフ。
A liquid chromatograph apparatus that can be used in a liquid column chromatograph performed by changing a mixing ratio of solvents,
Equation (6) representing the gradient pattern of the solvent applied to the sample
Gradient pattern input means for inputting
Expression (7) expressing the gradient pattern input by the gradient pattern input means
A mixing means for generating an eluent in which the mixing ratio of the two solvents changes according to the change relational expression of the mixing ratio of the solvent;
A liquid chromatograph comprising a pump for continuously introducing the eluent obtained by the mixing means into the column.
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