JP2015006178A - ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌から銅ナノ粒子を得る方法、ならびに廃水のバイオレメディエーションおよび銅ナノ粒子の生産におけるヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌の使用 - Google Patents
ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌から銅ナノ粒子を得る方法、ならびに廃水のバイオレメディエーションおよび銅ナノ粒子の生産におけるヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌の使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
a.ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌を単離する工程、
b.工程aの単離真菌の銅耐性を決定する工程、
c.銅ストック溶液を調製する工程、
d.前記単離真菌を、培養培地サブロー液体培地に添加して、生菌バイオマスを生じさせる工程、
e.生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、
f.生菌バイオマスを乾燥して、乾燥バイオマスを生じさせる工程、および
g.該生菌バイオマス、乾燥バイオマス、および死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、
を含んでなる方法に関する。
初期金属濃度、pH、温度、撹拌、および種菌量の関数として、真菌の死菌バイオマス、乾燥バイオマス、および生菌バイオマスへの銅の生物吸着の平衡および動態試験を行った。
1.生物の培養および維持
ヒポクレア・リキシイは、カナラン・ドス・カラジャース(Cana dos Carajas)、パラ(Para)、ブラジルアマゾン地域(南緯06°26’および西経50°4’)に位置するソッセゴ(Sossego)鉱山の銅廃棄物の溜め池から採集した水から単離した。ヒポクレア・リキシイを、サブローデキストロース寒天培地(SDA)(オクソイド、イングランド)で維持および活性化した[Kumar BN, Seshadri N, Ramana DKV, Seshaiah K, Reddy AVR (2011) Equilibrium, Thermodynamic and Kinetic studies on Trichoderma viride biomass as biosorbent for the removal of Cu (II) from water. Separ Sci Technol 46: 997-1004]。
単離した真菌の銅耐性を、スポットプレート法(spot plate method)によって最小発育阻止濃度(MIC)として決定した[Ahmad I, Ansari MI, Aqil F (2006) Biosorption of Ni, Cr and Cd by metal tolerante Aspergillus niger and Penicillium sp using single and multi-metal solution. Indian J Exp Biol 44: 73-76]。さまざまな濃度の銅(50〜2000mg L−1)を含有するSDAプレートを調製し、試験真菌の種菌を金属および対照プレート(金属を含まないプレート)上にスポットした。プレートを、25℃で少なくとも5日間インキュベーションした。MICは、目に見える単離菌の成長を阻害する金属の最低濃度として定義する。
3.1.吸着質溶液の調製
本試験で使用した化学薬品はすべて、分析グレードであり、さらに精製することなく使用した。希釈液はすべて、2回脱イオン水(ミリポアミリQ、伝導率18.2Ωcm−1)で調製した。銅ストック溶液を、CuCl22H20(Carlo Erba、イタリア)を2回脱イオン水に溶解することによって調製した。このストック溶液を希釈することによって、作業溶液を調製した。
真菌のバイオマスを、サブロー液体培地(Sb)(オクソイド、イングランド)で調製し、25℃で5日間、150rpmでインキュベーションした。インキュベーションした後、沈渣を採取し、2回脱イオン水で洗浄し、これを生菌バイオマスとした。死菌バイオマスの調製は、適当量の生菌バイオマスをオートクレーブした。乾燥バイオマスは、真菌マットを50℃でパリパリになるまで乾燥することを通して得た。乾燥したマットを粉砕して、均一なサイズの粒子を得た[Salvadori MR, Lepre LF, Ando RA, do Nascimento CAO, Correa B (2013) Biosynthesis and uptake of copper nanoparticles by dead biomass of Hypocrea lixii isolated from the metal mine in the Brazilian Amazon region. Plos One 8: 1-8].
銅の除去について、pH(2〜6)、温度(20〜60℃)、接触時間(5〜360分)、初期銅濃度(50〜500mg L−1)、および攪拌速度(50〜250rpm)を解析した。そのような実験を、プラスチックフラスコ中で、100mg L−1のCu(II)テスト試験溶液を45mL用いて所望のpH、温度、金属濃度、接触時間、攪拌速度、および生物吸着剤投与量(0.15〜1.0g)に最適化した。
R=(Ci−Ce)/Ci.100
(式中、CiおよびCeはそれぞれ、初期および平衡金属濃度である。)
金属取り込み能、qe、を以下の方程式を用いて算出した。
qe=V(Ci−Ce)/M
(式中、qe(mg・g−1)は任意の時間における生物吸着剤の生物吸着能、M(g)はバイオマス投与量、およびV(L)は溶液の量である。)
生物吸着は、次の吸着剤濃度、50〜500mg L−1を用いてバッチ平衡法により分析した。フロイントリッヒおよびラングミュア等温式モデルを用いて、平衡データを当てはめた[Volesky B (2003) Biosorption process simulation tools. Hydrometallurgy 71: 179-190]。線形化ラングミュア等温式モデルは、
Ce/qe=1/(qm.b)+Ce/qm
であり、式中、qmは吸着剤の単分子層吸着能(mg・g−1)、bはラングミュア吸着定数(L・mg−1)である。線形化フロイントリッヒ等温式モデルは、
lnqe=lnKF+1/n.lnCe
であり、式中、KFは生物吸着能に関連する定数、1/nは吸着剤の吸着強度に関する。
Cu(II)生物吸着の速度動態の結果を、擬1次モデルおよび擬2次モデルを用いて解析した。線形擬1次モデル[Lagergren S (1898) About the theory of so called adsorption of soluble substances. Kung Sven Veten Hand 24: 1-39]は、以下の方程式によって表わすことができる。
log(qe−qt)=logqe−K1/2.303.t
(式中、qe(mg・g−1)およびqt(mg・g−1)はそれぞれ、平衡時間および任意の時間tおける吸着剤に吸着される金属の量であり、K1(分−1)は擬1次吸着プロセスの速度定数である。)
線形擬2次モデル[Ho YS, Mckay G (1999) Pseudo-second-order model for sorption process. Process Biochem 34: 451-465]は、以下の方程式によって表わすことができる。
t/qt=1/K2.qe 2+t/qe
(式中、K2(g・mg−1・分−1)は、擬2次の平衡速度定数である。)
生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスと比較して、高い銅金属イオン吸着能を示したヒポクレア・リキシイの死菌バイオマスのみを、この試験では使用した。銅(II)溶液が100mg・L−1の濃度における平衡モデルデータを使用して、ヒポクレア・リキシイの死菌バイオマスによる銅ナノ粒子の生合成を調べた。
サイズ、形状、および生物吸着剤上の銅ナノ粒子を位置を決定するために、透過電子顕微鏡法(TEM)による解析を用い、検体の超薄切片を透過型電子顕微鏡(JEOL−1010)で観察した。
銅ナノ粒子の形成前後の生体材料小さい断片の分析をピンスタブ上で行ない、次いで真空下で金でコーティングし、エネルギー分散型分光計(EDS)を備えたJEOL 6460 LVでSEMによって試験した。
赤外振動分光法(FTIR)を使用して、バイオマスに存在する官能基を同定し、銅ナノ粒子の存在によって引き起こされるスペクトル変動を評価した。赤外吸収スペクトルを、ブルカーモデルALPHA干渉分光計で得た。試料を、単一反射の全反射測定法アクセサリー(白金−結晶ダイヤモンドを用いたATR)を使用して、試料コンパートメントに直接置いた。4cm−1のスペクトル分解能を用いて、試料各々について80スペクトルを蓄積した。
本試験は、バイオマス投与量、pH、温度、接触時間、撹拌速度、および金属イオン濃度などの物理化学的因子もよって、ヒポクレア・リキシイバイオマスによる銅除去が影響されることを示した。生物吸着剤投与量は、金属の所与の初期濃度に対する生物吸着剤の容量・能力を決定するため、重要なパラメーターである。
ラングミュアおよびフロイントリッヒ等温式モデルを使用して、生物吸着データを当てはめ、生物吸着能を決定した。3種類のヒポクレア・リキシイバイオマスから得られたCu(II)生物吸着に関するラングミュア等温式を図2A、図2B、および図2Cに示す。等温式定数、ラングミュアおよびフロイントリッヒモデルによって推定される最大積載能力、回帰係数を、表1に示す。ラングミュアモデルは、フロイントリッヒモデルと比べて、より良くCu(II)生物吸着等温式を説明した。
生物学的な系によるナノ粒子の形成の複雑な機序を研究することは、さらにより信頼でき、再現可能なその生合成の方法を決定するために重要である。真菌のバイオマスでのナノ粒子の形成の理解に向けて、一部分の死菌バイオマスをTEMによって調査した。ヒポクレア・リキシイにおけるナノ粒子の位置を調べると、電子顕微鏡像から、ナノ粒子は細胞壁に見られるが細胞質および細胞膜には見られず、対照ではナノ粒子が存在しないことが明らかになり、対照およびオートクレーブプロセスにより銅が浸潤したバイオマスでは、細胞質材料の萎縮などの超微細構造変化が観察された(図3Aおよび図3B)。細胞外に位置することは、生産プロセスにおける、より迅速で、大量にナノ粒子の獲得、容易な除去、バイオマスの再使用の可能性という有利な点を提供する。ナノ粒子の形状およびサイズは、ナノスケール材料の物理的、化学的、光学的、および電子的性質を制御する最も重要な特徴のうちの2つである(Alivisatos AP (1996) Perspectives on the physical chemistry of semiconductor nanocrystals. J Phys Chem 100: 13226-13239; Aizpurua J, Hanarp P, Sutherland DS, KaII M, Bryant GW, et al. (2003) Optical properties of gold nanorings. Phys Rev Lett 90: 57401-57404)。
1.生物の培養および維持
トリコデルマ・コニンギオプシスは、カナラン・ドス・カラジャース(Canaa dos Carajas)、パラ(Para)、ブラジルアマゾン地域(南緯06°26’および西経50°4’)に位置するソッセゴ(Sossego)鉱山の銅廃棄物の溜め池から採集した沈殿物から単離した。トリコデルマ・コニンギオプシスを、サブローデキストロース寒天培地(SDA)(オクソイド、イングランド)で維持および活性化した(Kumar BN, Seshadri N, Ramana DKV, Seshaiah K, Reddy AVR (2011) Equilibrium, Thermodynamic and Kinetic studies on Trichoderma viride biomass as biosorbent for the removal of Cu (II) from water. Separ Sci Technol 46: 997-1004)。
単離した真菌の銅耐性を、スポットプレート法(spot plate method)によって最小発育阻止濃度(MIC)として決定した(Ahmad I, Ansari MI, Aqil F (2006) Biosorption of Ni, Cr and Cd by metal tolerante Aspergillus niger and Penicillium sp using single and multi-metal solution. Indian J Exp Biol 44: 73-76)。さまざまな濃度の銅(50〜2000mg・L−1)を含有するSDAプレートを調製し、試験する真菌の種菌を金属および対照プレート(金属を含まないプレート)上にスポットした。プレートを、25℃で少なくとも5日間インキュベーションした。MICは、目に見える単離菌の成長を阻害する金属の最低濃度として定義する。
3.1.吸着質溶液の調製
本試験で使用した化学薬品はすべて、分析グレードであり、さらに精製することなく使用した。希釈液はすべて、2回脱イオン水(ミリポアミリQ、伝導率18.2Ωcm−1)で調製した。銅ストック溶液を、CuCl22H20(Carlo Erba、イタリア)を2回脱イオン水に溶解することによって調製した。このストック溶液を希釈することによって、作業溶液を調製した。
真菌のバイオマスを、サブロー液体培地(Sb)(オクソイド、イングランド)で調製し、25℃で5日間、150rpmでインキュベーションした。インキュベーションした後、沈渣を採取し、2回脱イオン水で洗浄し、これを生菌バイオマスとした。死菌バイオマスの調製は、適当量の生菌バイオマスをオートクレーブした。乾燥バイオマスは、真菌マットを50℃でパリパリになるまで乾燥することを通して得た。乾燥したマットを粉砕して、均一なサイズの粒子を得た(Salvadori MR, Lepre LF, Ando RA, do Nascimento CAO, Correa B (2013) Biosynthesis and uptake of copper nanoparticles by dead biomass of Hypocrea lixii isolated from the metal mine in the Brazilian Amazon region. Plos One 8: 1-8)。
銅の除去について、pH(2〜6)、温度(20〜60℃)、接触時間(5〜360分)、初期銅濃度(50〜500mg・L−1)、および攪拌速度(50〜250rpm)を解析した。そのような実験を、プラスチックフラスコ中で、100mg L−1のCu(II)テスト試験溶液を45mL用いて所望のpH、温度、金属濃度、接触時間、攪拌速度、および生物吸着剤投与量(0.15〜1.0g)に最適化した。
R=(Ci−Ce)/Ci.100
(式中、CiおよびCeはそれぞれ、初期および平衡金属濃度である。)
金属取り込み能、qeを以下の方程式を用いて算出した。
qe=V(Ci−Ce)/M
(式中、qe(mg・g−1)は任意の時間における生物吸着剤の生物吸着能、M(g)はバイオマス投与量、およびV(L)は溶液の量である。)
生物吸着は、次の吸着剤濃度、50〜500mg L−1を用いてバッチ平衡法により分析した。フロイントリッヒおよびラングミュア等温式モデルを用いて、平衡データを当てはめた(Volesky B (2003) Biosorption process simulation tools. Hydrometallurgy 71: 179-190)。線形化ラングミュア等温式モデルは、
Ce/qe=1/(qm・b)+Ce/qm
であり、式中、qmは吸着剤の単分子層吸着能(mg・g−1)、bはラングミュア吸着定数(L・mg−1)である。線形化フロイントリッヒ等温式モデルは、
lnqe=lnKF+1/n.lnCe
であり、式中、KFは生物吸着能に関連する定数、1/nは吸着剤の吸着強度に関する。
Cu(II)生物吸着の速度動態の結果を、擬1次モデルおよび擬2次モデルを用いて解析した。線形擬1次モデル(Lagergren S (1898) About the theory of so called adsorption of soluble substances. Kung Sven Veten Hand 24: 1-39)は、以下の方程式によって表わすことができる。
log(qe−qt)=logqe−K1/2.303.t
(式中、qe(mg・g−1)およびqt(mg・g−1)はそれぞれ、平衡時間および任意の時間tおける吸着剤に吸着される金属の量であり、K1(分−1)は擬1次吸着プロセスの速度定数である。)
線形擬2次モデル(Ho YS, Mckay G (1999) Pseudo-second-order model for sorption process. Process Biochem 34: 451-465)は、以下の方程式によって表わすことができる。
t/qt=1/K2.qe 2+t/qe
(式中、K2(g・mg−1・分−1)は、擬2次の平衡速度定数である。)
生菌バイオマスおよび乾燥バイオマスと比較して、高い銅金属イオン吸着能を示したトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスのみを、この試験では使用した。銅(II)溶液が100mg・L−1の濃度における平衡モデルデータを使用して、トリコデルマ・コニンギオプシスの死菌バイオマスによる銅ナノ粒子の生合成を調べた。
サイズ、形状、および生物吸着剤上の銅ナノ粒子を位置を決定するために、透過電子顕微鏡法(TEM)による解析を用い、検体の超薄切片を透過型電子顕微鏡(JEOL−1010)で観察した。
銅ナノ粒子の形成前後の生体材料小さい断片の分析をピンスタブ上で行ない、次いで真空下において金でコーティングし、エネルギー分散型分光計(EDS)を備えたJEOL 6460 LVでSEMによって試験した。
赤外振動分光法(FTIR)を使用して、バイオマスに存在する官能基を同定し、銅ナノ粒子の存在によって引き起こされるスペクトル変動を評価した。赤外吸収スペクトルを、ブルカーモデルALPHA干渉分光計で得た。試料を、単一反射の全反射測定法アクセサリー(白金−結晶ダイヤモンドを用いたATR)を使用して、試料コンパートメントに直接置いた。4cm−1のスペクトル分解能を用いて、試料各々について80スペクトルを蓄積した。
本試験は、バイオマス投与量、pH、温度、接触時間、撹拌速度、および金属イオン濃度などの物理化学的因子もよって、トリコデルマ・コニンギオプシスによる銅除去が影響されることを示した。
4.5.吸着等温式および動態モデル
emoval of Cu (II) from water. Separ Sci Technol 46: 997-1004; Yilmazer P, Saracoglu N (2009) Bioaccumulation and biosorption of copper (II) and chromium (III) from aqueous solutions by Pichia stiptis yeast. J Chem Technol Biot 84: 604-610; Yahaya YA, Matdom M, Bhatia S (2008) Biosorption of copper (II) onto immobilized cells of Pycnoporus sanguineus from aqueous solution: Equilibrium and Kinetic studies. Hazard Mater 161: 189-195)。
生物学的な系によるナノ粒子の形成の複雑な機序を研究することは、さらにより信頼でき、再現可能なその生合成の方法を決定するために重要である。真菌のバイオマスでのナノ粒子の形成の理解に向けて、一部分の死菌バイオマスをTEMによって調査した。トリコデルマ・コニンギオプシスにおけるナノ粒子に位置を調べると、電子顕微鏡像から、ナノ粒子は細胞壁に見られるが細胞質および細胞膜には見られず、対照ではナノ粒子が存在しないことが明らかになり、対照およびオートクレーブプロセスにより銅が浸潤したバイオマスでは、細胞質材料の萎縮などの超微細構造変化が観察された(図9Aおよび図9B)。細胞外に位置することは、生産プロセスにおける、より迅速で、大量にナノ粒子の獲得、容易な除去、バイオマスの再使用の可能性という有利な点を提供する。ナノ粒子の形状およびサイズは、ナノスケール材料の物理的、化学的、光学的、および電子的性質を制御する最も重要な特徴のうちの2つである(Alivisatos AP (1996) Perspectives on the physical chemistry of semiconductor nanocrystals. J Phys Chem 100: 13226-13239; Aizpurua J, Hanarp P, Sutherland DS, KaII M, Bryant GW, et al. (2003) Optical properties of gold nanorings. Phys Rev Lett 90: 57401-57404)。
Claims (6)
- ヒポクレア・リキシイ(Hypocrea lixii)およびトリコデルマ・コニンギオプシス(Trichoderma koningiopsis)から選択される真菌から銅ナノ粒子を得る方法であって、
a.ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌を単離する工程、
b.工程aの単離真菌の銅耐性を決定する工程、
c.銅ストック溶液を調製する工程、
d.前記単離真菌を、培養培地サブロー液体培地に添加して、生菌バイオマスを生じさせる工程、
e.生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、
f.生菌バイオマスを乾燥して、乾燥バイオマスを生じさせる工程、および
g.該生菌バイオマス、乾燥バイオマス、および死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、
を含んでなる方法。 - 廃水のバイオレメディエーションの実施のための、ヒポクレア・リキシイ抽出物およびトリコデルマ・コニンギオプシス抽出物から選択される真菌の使用。
- ヒポクレア・リキシイ抽出物がヒポクレア・リキシイの死菌体(dead mass)である、請求項2に記載の使用。
- トリコデルマ・コニンギオプシス抽出物がトリコデルマ・コニンギオプシスの死菌体である、請求項2に記載の使用。
- 銅ナノ粒子の生産用である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- ヒポクレア・リキシイおよびトリコデルマ・コニンギオプシスから選択される真菌から、廃水のバイオレメディエーションを利用して生産される銅ナノ粒子。
Applications Claiming Priority (2)
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US201361831362P | 2013-06-05 | 2013-06-05 | |
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