JP2015002723A - Hbv-specific artificial dna nuclease - Google Patents

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Michinori Obara
道法 小原
石田　雄二
Yuji Ishida
雄二 石田
知世 向谷
Tomoyo Mukoya
知世 向谷
島田　卓
Taku Shimada
卓 島田
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide novel treatment means for the complete cure of HBV infection.SOLUTION: HBV-specific artificial DNA nuclease comprises: TALE (Transcription Activator-Like Effectors) derived from Xanthomonas bacteria modified to specifically bind to HBV DNA; and sequence-independent endonuclease.

Description

本発明は、HBV DNAと特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALEと、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとを含んでなる、HBV特異的人工DNAヌクレアーゼ及びそれを用いたHBV 感染の治療及び予防方法に関する。   The present invention relates to an HBV-specific artificial DNA nuclease comprising TALE derived from a genus Xanthomonas modified so as to specifically bind to HBV DNA, and a sequence-independent endonuclease, and HBV using the same. The present invention relates to a method for treating and preventing infection.

B型肝炎ウイルス（以下、「HBV」と記載する。）は、ヘパドナウイルス族に属するウイルスであり、外被（envelope）と不完全環状二本鎖DNAとDNAポリメラーゼ、逆転写酵素などを含む、直径27nmの芯（core）からなる、球状（直径約42nm）のDNAウイルスである。   Hepatitis B virus (hereinafter referred to as “HBV”) is a virus belonging to the hepadnavirus family, and includes an envelope, incomplete circular double-stranded DNA, DNA polymerase, reverse transcriptase and the like. A spherical (about 42 nm diameter) DNA virus consisting of a 27 nm diameter core.

現在、全世界で350〜400万人もの人々がHBVに感染していると考えられ、そのうちの多くの人が将来的に非代償性肝硬変や肝細胞癌を発症するリスクを有する。   Currently, 3.5 to 4 million people worldwide are thought to be infected with HBV, many of whom are at risk of developing decompensated cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the future.

HBVは肝細胞に侵入すると、ウイルス遺伝子が肝細胞の核内に移動し、不完全環状二本鎖DNAは完全閉鎖二本鎖DNA（covalenty closed circular DNA）(以下、「cccDNA」と記載する。)に転換される。cccDNAは核内にて転写・翻訳され、ウイルス粒子を形成する。   When HBV enters a hepatocyte, the viral gene moves into the nucleus of the hepatocyte, and the incomplete circular double-stranded DNA is described as “covalently closed circular DNA” (hereinafter “cccDNA”). ). cccDNA is transcribed and translated in the nucleus to form virus particles.

現在、HBV感染の治療においては抗ウイルス剤や逆転写酵素阻害剤が使用されている。これら治療剤の投与によりウイルス粒子の形成が阻害されるために、肝細胞より血中に分泌、放出されるウイルス粒子の量を顕著に減少させることができる。しかしながら、当該治療剤の投与によっても、cccDNAは核内にて減少されることなく維持される。これにより、たとえウイルス粒子の血中レベルが検出感度未満になったとしても、治療剤投与の中止により、cccDNAからのウイルス粒子形成が再燃する（非特許文献１）。すなわち、今日の治療法においては、肝細胞中のcccDNA量を減少・消失させることができないことから、HBV感染の根治は不可能であるといえる。故に、当該分野においてはHBV感染に対する新たな治療手段が切望されている。   Currently, antiviral agents and reverse transcriptase inhibitors are used in the treatment of HBV infection. Since the formation of virus particles is inhibited by administration of these therapeutic agents, the amount of virus particles secreted and released into the blood from hepatocytes can be significantly reduced. However, administration of the therapeutic agent also maintains cccDNA without being reduced in the nucleus. Thereby, even if the blood level of virus particles becomes less than the detection sensitivity, virus particle formation from cccDNA is reignited by discontinuation of treatment agent administration (Non-patent Document 1). In other words, it cannot be said that the cure of HBV infection is impossible because the amount of cccDNA in hepatocytes cannot be reduced or eliminated by current treatment methods. Therefore, there is an urgent need in the art for new treatments for HBV infection.

今日、遺伝子組換えの手段としてTALEN(登録商標)（Transcription activator-like effector nuclease）とよばれる人工DNAヌクレアーゼが利用されている。TALEN(登録商標)は、DNA結合ドメインである植物病原性Xanthomonas属細菌のTALE（Transcription activator-like effector）とDNA切断ドメインであるFokIが融合されてなるサブセットを2つ含むヘテロ二量体の人工DNAヌクレアーゼである。各TALEは高度に保存された33〜35アミノ酸残基からなるユニットのリピート構造を有しており、各ユニットがそれぞれの塩基を特異的に認識し結合する。TALEN(登録商標)においてはTALE部分がDNA上の標的配列に特異的に結合するように改変されている。これによりTALEN(登録商標)の2つのサブセットはそれぞれDNA上の特定の配列に特異的に結合し、当該結合部位の近傍にて各サブセットに由来するFokIが二量体を構成し、2本鎖DNAを切断する。2本鎖DNAの切断によって誘導される非相同末端再結合 (Non Homologous End Joining：NHEJ)によって塩基の欠損や置換が誘発され、これにより遺伝子のノックアウトを容易に行うことができる。また、2本鎖DNAの切断の際に、ドナーを同時にトランスフェクションしておけば、相同組換え(Homologous Recombination: HR)を利用して切断部に遺伝子のノックインを容易に行うことができる。その特異性と容易性から、TALEN(登録商標)は、DNAの点変異、欠損、挿入、逆位、重複、転移などの様々な遺伝子操作において利用されている（非特許文献２）。   Today, an artificial DNA nuclease called TALEN (registered trademark) (Transcription activator-like effector nuclease) is used as a means of gene recombination. TALEN (registered trademark) is an artificial heterodimer containing two subsets of the fusion of Talscription activator-like effector (TALE) of the phytopathogenic Xanthomonas bacterium, which is a DNA-binding domain, and FokI, a DNA-cleaving domain DNA nuclease. Each TALE has a highly conserved unit repeat structure consisting of 33 to 35 amino acid residues, and each unit specifically recognizes and binds to each base. In TALEN (registered trademark), the TALE moiety is modified so as to specifically bind to a target sequence on DNA. As a result, each of the two subsets of TALEN (registered trademark) specifically binds to a specific sequence on DNA, and FokI derived from each subset forms a dimer in the vicinity of the binding site. Cleave DNA. Non-homologous end rejoining (NHEJ) induced by the cleavage of double-stranded DNA induces base deletions and substitutions, which facilitates gene knockout. Further, if a donor is transfected at the same time when double-strand DNA is cleaved, gene knock-in can be easily performed at the cleaved portion using homologous recombination (HR). Due to its specificity and ease, TALEN (registered trademark) is used in various gene manipulations such as DNA point mutation, deletion, insertion, inversion, duplication, and metastasis (Non-patent Document 2).

田中靖人ら、モダンメディア、2008年、54巻、12号、347−352頁Tanaka Hayato et al., Modern Media, 2008, 54, 12, 347-352 Joung JK et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2013 Jan;14(1):49-55.Joung JK et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2013 Jan; 14 (1): 49-55.

本発明は、HBV感染の根治を目的とする新たな治療手段を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a new therapeutic means aiming at the cure of HBV infection.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、HBV DNA（より詳細にはHBV cccDNA）を標的とする人工DNAヌクレアーゼを、HBV感染の危険にある肝細胞に導入することによって、感染後のHBV DNA（より詳細にはHBV cccDNA）増加を抑制又は阻害できることを見出した。また、当該、人工DNAヌクレアーゼを、HBV感染した肝細胞に導入することによって、HBV DNA（より詳細にはHBV cccDNA）量を減少又は消失させることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have introduced an artificial DNA nuclease that targets HBV DNA (more specifically, HBV cccDNA) into hepatocytes at risk of HBV infection. The present inventors have found that an increase in HBV DNA (more specifically, HBV cccDNA) after infection can be suppressed or inhibited. Further, the present inventors have found that the amount of HBV DNA (more specifically, HBV cccDNA) can be reduced or eliminated by introducing the artificial DNA nuclease into HBV-infected hepatocytes. The present invention is based on these findings.

すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。   That is, the present invention has the following features.

［１］ B型肝炎ウイルス（HBV）DNAのセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALE (Transcription Activator-Like Effectors)と、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとが連結されてなる第１の融合タンパク質；ならびに
HBV DNAのアンチセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALEと、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとが連結されてなる第２の融合タンパク質、
を含む人工DNAヌクレアーゼであって、
該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質が配列番号２〜４のいずれかで示される塩基配列を有するセンス鎖及びそのアンチセンス鎖より選択される15〜30個の連続した塩基からなる領域に対してそれぞれ結合し、該第１の融合タンパク質が結合するセンス鎖上の領域と第２の融合タンパク質が結合するアンチセンス鎖上の領域は相補的でなく、かつ、両領域によって挟まれる領域にて該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質に連結するエンドヌクレアーゼがHBV DNAを切断し、かつ、該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質が核移行シグナルペプチドを含む、上記人工DNAヌクレアーゼ。
［２］ 第１の融合タンパク質が配列番号５で示される塩基配列からなる領域と特異的に結合し、かつ第２の融合タンパク質が配列番号６で示される塩基配列からなる領域と特異的に結合する、［１］の人工DNAヌクレアーゼ。
［３］ 配列非依存性のエンドヌクレアーゼが、DNA認識機能ドメインが除去されたFokIエンドヌクレアーゼである、［１］又は［２］の人工DNAヌクレアーゼ。
［４］ 第１の融合タンパク質が配列番号７で示されるアミノ酸配列からなり、かつ第２の融合タンパク質が配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる、［１］又は［２］の人工DNAヌクレアーゼ。
［５］ ［１］〜［４］のいずれかの人工DNAヌクレアーゼをコードするDNAであって、第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む、上記人工DNAヌクレアーゼをコードするDNA。
［６］ ［５］の人工DNAヌクレアーゼをコードするDNAを含む発現ベクターであって、第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAが同一のベクター中に含まれるか、または別々のベクター中に含まれる、上記発現ベクター。
［７］ ［６］の発現ベクターを含む、HBV DNAを切断するための医薬組成物。
［８］ HBV DNAがHBV cccDNAである、［７］の医薬組成物。
［９］ HBV感染を治療又は予防するための、［７］又は［８］の医薬組成物。 [1] TALE (Transcription Activator-Like Effectors) derived from the genus Xanthomonas modified to specifically bind to a specific region on the sense strand of hepatitis B virus (HBV) DNA, and sequence-independent A first fusion protein linked to an endonuclease; and
A second fusion protein comprising TALE derived from a genus Xanthomonas modified so as to specifically bind to a specific region on the antisense strand of HBV DNA and a sequence-independent endonuclease;
An artificial DNA nuclease comprising
The first fusion protein and the second fusion protein are composed of a sense strand having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 4 and 15 to 30 consecutive bases selected from the antisense strand. The region on the sense strand that binds to each region, to which the first fusion protein binds, and the region on the antisense strand to which the second fusion protein binds are not complementary and are sandwiched by both regions An endonuclease linked to the first fusion protein and the second fusion protein in a region cleaves HBV DNA, and the first fusion protein and the second fusion protein comprise a nuclear translocation signal peptide , The above artificial DNA nuclease.
[2] The first fusion protein specifically binds to the region consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 5, and the second fusion protein specifically binds to the region consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 6 The artificial DNA nuclease according to [1].
[3] The artificial DNA nuclease according to [1] or [2], wherein the sequence-independent endonuclease is a FokI endonuclease from which a DNA recognition function domain has been removed.
[4] The artificial DNA nuclease according to [1] or [2], wherein the first fusion protein consists of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 and the second fusion protein consists of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8.
[5] The artificial DNA comprising the DNA encoding the artificial DNA nuclease according to any one of [1] to [4], the DNA encoding the first fusion protein and the DNA encoding the second fusion protein. DNA encoding a nuclease.
[6] Is the expression vector comprising DNA encoding the artificial DNA nuclease of [5], wherein the DNA encoding the first fusion protein and the DNA encoding the second fusion protein are contained in the same vector? Or the expression vector, contained in a separate vector.
[7] A pharmaceutical composition for cleaving HBV DNA, comprising the expression vector according to [6].
[8] The pharmaceutical composition of [7], wherein the HBV DNA is HBV cccDNA.
[9] The pharmaceutical composition according to [7] or [8] for treating or preventing HBV infection.

本発明によれば、HBV感染の根治を可能とする新たな治療手段を提供することができる。   ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the new treatment means which enables radical cure of HBV infection can be provided.

図１（A）は、HBVの17クローンの遺伝子配列のホモロジー検索の結果得られた、保存性の高いHBVポリメラーゼ遺伝子領域の塩基配列を示す。（a）及び(c)は、HBV特異的ヌクレアーゼの第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質が結合する標的配列の領域を示し、(b)は各サブセットのエンドヌクレアーゼ（FokI）によって切断される部位を含む領域を示す。図１（B）は、HBV DNAの模式的な構造図を示す。(d)は図１（A）に示す（a）−(c)を含む領域を示す。FIG. 1 (A) shows the nucleotide sequence of the highly conserved HBV polymerase gene region obtained as a result of homology search of the gene sequence of 17 HBV clones. (A) and (c) show the region of the target sequence to which the first and second fusion proteins of the HBV-specific nuclease bind, and (b) is cleaved by each subset of endonucleases (FokI). Indicates a region including a region. FIG. 1 (B) shows a schematic structural diagram of HBV DNA. (d) shows a region including (a)-(c) shown in FIG. 図２はHBV特異的ヌクレアーゼの各サブセットの発現ベクターの模式図を示す。（A）pTAL.CMV.T7.HBV-L；（B）pTAL.CMV.T7. HBV-R。FIG. 2 shows a schematic diagram of expression vectors for each subset of HBV-specific nucleases. (A) pTAL.CMV.T7.HBV-L; (B) pTAL.CMV.T7.HBV-R. 図３（A）はヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞におけるHBV感染実験の実験プロトコルを示す。図３（B）は、HBV感染させたヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞の培養上清におけるHBV DNA(遺伝子型A及びC)の定量結果を示す。図３（C）は、HBV感染後22日目における、ヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞の細胞内HBV DNA(遺伝子型A及びC)の定量結果を示す。図３（D）は、間接免疫蛍光分析による、HBV感染後22日目におけるヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞におけるHB抗原の検出結果を示す写真図である。FIG. 3 (A) shows an experimental protocol for HBV infection experiments in primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice. FIG. 3 (B) shows the results of quantification of HBV DNA (genotypes A and C) in the culture supernatant of primary hepatocytes derived from HBV-infected humanized chimeric mice. FIG. 3 (C) shows the quantitative results of intracellular HBV DNA (genotypes A and C) in primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice on day 22 after HBV infection. FIG. 3 (D) is a photograph showing the detection results of HB antigen in primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice on day 22 after HBV infection by indirect immunofluorescence analysis. 図４（A）は、HBV特異的ヌクレアーゼによるHBV感染阻害実験の実験プロトコルを示す。図４（B）は、HBV感染後27日目における、ヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞の細胞内HBV cccDNA(遺伝子型C)の定量結果を示す。FIG. 4 (A) shows an experimental protocol of an HBV infection inhibition experiment using an HBV-specific nuclease. FIG. 4 (B) shows the quantification results of intracellular HBV cccDNA (genotype C) in primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice on the 27th day after HBV infection. 図５（A）は、HBV持続感染に対するHBV特異的ヌクレアーゼの効果を確認するための実験プロトコルを示す。図５（B）は、HBV特異的ヌクレアーゼで処置した、持続的にHBV感染したヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞の細胞内HBV cccDNA(遺伝子型C)の定量結果を示す。FIG. 5 (A) shows an experimental protocol for confirming the effect of HBV-specific nuclease on persistent HBV infection. FIG. 5 (B) shows the results of quantification of intracellular HBV cccDNA (genotype C) in primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice continuously infected with HBV treated with HBV-specific nuclease.

１．TALE (Transcription Activator-Like Effector)
TALEは植物病原性Xanthomonas属細菌に由来し、特定の塩基を認識することが可能なユニットが15〜30個連結してなり、これにより特定の塩基配列を有するDNAを認識し、特異的に結合することができる。各ユニットは33〜35個のアミノ酸からなり、12番目及び13番目のアミノ酸残基（可変残基）を除き、同一又は非常に高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。本発明においてユニットは、以下のアミノ酸配列によって表わすことができる（各アミノ酸は一文字表記にて示す）。 1. TALE (Transcription Activator-Like Effector)
TALE is derived from a phytopathogenic Xanthomonas genus bacterium and consists of 15 to 30 units capable of recognizing a specific base, thereby recognizing and binding specifically to DNA having a specific base sequence. can do. Each unit consists of 33 to 35 amino acids, and consists of amino acid sequences having identical or very high sequence identity except for the 12th and 13th amino acid residues (variable residues). In the present invention, a unit can be represented by the following amino acid sequence (each amino acid is represented by a single letter).

Figure 2015002723
Figure 2015002723

配列中「X」にて示される12番目及び13番目のアミノ酸残基が、N及びIである場合アデニンを、H及びDである場合シトシンを、N及びGである場合チミンを、N及びNである場合グアニンを、N及びKである場合グアニンを、各ユニットが認識することができる。   The 12th and 13th amino acid residues represented by “X” in the sequence are adenine when N and I, cytosine when H and D, thymine when N and G, N and N Each unit can recognize guanine when N is, and guanine when N and K.

本発明におけるユニットには、各ユニットが目的の塩基を認識することができる限り、上記配列番号１のアミノ酸配列の12番目及び13番目のアミノ酸残基を除く部分において一又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで「複数個」とは1〜5個、好ましくは1〜4個である。   In the unit of the present invention, as long as each unit can recognize the target base, one or more amino acids are substituted in the portion excluding the 12th and 13th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. , Deleted, added, and / or inserted amino acid sequences. Here, the “plurality” means 1 to 5, preferably 1 to 4.

本発明におけるTALEは、HBV DNAのセンス鎖、又はアンチセンス鎖上の特定の塩基配列に対して特異的に結合することができるように上記ユニットが組み合わせられた改変型のTALEである。本発明におけるTALEが標的とする塩基配列は、HBV DNA上の領域より任意に選択すること可能であるが、好ましくはHBVの遺伝子型（A,B,C型）の全てにおいて保存されている領域から選択する。当該保存された領域は、遺伝子型A,B,C型の遺伝子配列をホモロジー検索に付すことにより得ることができる。このような領域としてHBVポリメラーゼ遺伝子中の塩基配列（配列番号２〜４のいずれか）からなる領域がある。この領域はPreC/C及びポリメラーゼコード領域の重複部位である。本発明においては、この領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖上の15〜30個の連続した塩基からなる配列をTALEの標的配列とすることができる。   The TALE in the present invention is a modified TALE in which the above units are combined so that it can specifically bind to a specific base sequence on the sense strand or antisense strand of HBV DNA. The nucleotide sequence targeted by TALE in the present invention can be arbitrarily selected from the region on HBV DNA, but is preferably a region conserved in all of the HBV genotypes (A, B, C types) Select from. The conserved region can be obtained by subjecting the gene sequences of genotypes A, B, and C to homology search. As such a region, there is a region consisting of a base sequence (any one of SEQ ID NOs: 2 to 4) in the HBV polymerase gene. This region is an overlapping site of PreC / C and polymerase coding region. In the present invention, a sequence consisting of 15 to 30 consecutive bases on the sense strand and antisense strand in this region can be used as a TALE target sequence.

ただし、本発明において、第１の融合タンパク質に含まれるTALEの標的配列とされるセンス鎖上の塩基配列と、第２の融合タンパク質に含まれるTALEの標的配列とされるアンチセンス鎖上の塩基配列とは相補的な関係になく、かつ、両標的配列によって挟まれる領域にエンドヌクレアーゼによって切断される領域が配置される。エンドヌクレアーゼによって切断される領域の長さは、他方のTALEの標的配列に最も近い側の端から2〜30塩基、好ましくは5〜25塩基程度とすることができる。この長さは、本発明に用いられるエンドヌクレアーゼの種類や、TALEとエンドヌクレアーゼを連結するリンカーの長さなどの要因に応じて、最適な切断が得られるように適宜選択することができる。   However, in the present invention, the base sequence on the sense strand that is the target sequence of TALE contained in the first fusion protein and the base on the antisense strand that is the target sequence of TALE contained in the second fusion protein A region that is not complementary to the sequence and that is cleaved by the endonuclease is disposed in a region sandwiched by both target sequences. The length of the region cleaved by the endonuclease can be about 2 to 30 bases, preferably about 5 to 25 bases from the end closest to the target sequence of the other TALE. This length can be appropriately selected according to factors such as the type of the endonuclease used in the present invention and the length of the linker that links TALE and the endonuclease so as to obtain an optimal cleavage.

本発明におけるTALEの標的配列は、上記保存されている領域より公知の手法、例えば、TALEN（登録商標） Hitソフトウェアプログラム (http://talen-hit.cellectis-bioresearch.com/search)を使用して選択することができる。   The target sequence of TALE in the present invention is known from the above conserved region, for example, using a TALEN (registered trademark) Hit software program (http://talen-hit.cellectis-bioresearch.com/search). Can be selected.

好ましくは、本発明におけるTALEの標的配列は、HBVポリメラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号２〜４のいずれか）における9〜25番目の塩基を含むか当該塩基からなる領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖、ならびに48〜64番目の塩基を含むか当該塩基からなる領域のセンス鎖及びアンチセンス鎖より選択される。より好ましくは、本発明におけるTALEは、HBV DNAのセンス鎖上：5’-TAGAAGAAGAACTCCCT-3’（配列番号５）又はアンチセンス鎖上：5’-TTCTGCGACGCGGCGAT-3’（配列番号６）を標的配列とし、当該配列に特異的に結合する。   Preferably, the target sequence of TALE in the present invention includes a sense strand and an antisense strand in the region containing or consisting of the 9th to 25th bases in the base sequence of the HBV polymerase gene (any one of SEQ ID NOs: 2 to 4) And a sense strand and an antisense strand of a region containing or consisting of the 48th to 64th bases. More preferably, the TALE in the present invention is targeted on the sense strand of HBV DNA: 5′-TAGAAGAAGAACTCCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 5) or on the antisense strand: 5′-TTCTGCGACGCGGCGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 6). And specifically binds to the sequence.

２．HBV特異的人工DNAヌクレアーゼ
本発明のHBV特異的人工DNAヌクレアーゼ（以下、「HBV特異的ヌクレアーゼ」と記載する。）は、上記HBV DNAのセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合することができるTALEと当該TALEに機能し得るかたちで連結されたエンドヌクレアーゼを含む第１の融合タンパク質、ならびに、上記HBV DNAのアンチセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合することができるTALEと当該TALEに機能し得るかたちで連結されたエンドヌクレアーゼを含む第２の融合タンパク質、を含む。なお、本明細書中において、本発明のHBV特異的人工DNAヌクレアーゼに含まれる融合タンパク質を、HBV特異的人工DNAヌクレアーゼの「サブセット」とよぶ場合がある。本発明において、「融合タンパク質」と「サブセット」なる用語は相互互換的に使用される。 2. HBV-specific artificial DNA nuclease The HBV-specific artificial DNA nuclease of the present invention (hereinafter referred to as “HBV-specific nuclease”) can specifically bind to a specific region on the sense strand of the HBV DNA. A TALE capable of specifically binding to a specific region on the antisense strand of the HBV DNA, and a first fusion protein comprising an endonuclease linked in a form capable of functioning to the TALE and the TALE A second fusion protein comprising an endonuclease linked in a functional manner to TALE. In the present specification, the fusion protein contained in the HBV-specific artificial DNA nuclease of the present invention may be referred to as a “subset” of the HBV-specific artificial DNA nuclease. In the present invention, the terms “fusion protein” and “subset” are used interchangeably.

本発明において利用可能なエンドヌクレアーゼとしては、HBV DNAの塩基配列非依存的に、二量体を形成して2本鎖DNAを切断するものであればよい。これによって本発明のHBV特異的ヌクレアーゼにおいては、第１の融合タンパク質のTALE部分及び第２の融合タンパク質のTALE部分がそれぞれ配列特異的にHBV DNAと結合し、そしてその近傍において第１の融合タンパク質に連結されたエンドヌクレアーゼと第２の融合タンパク質に連結されたエンドヌクレアーゼとが二量体を形成し2本鎖HBV DNAを切断する。   Any endonuclease that can be used in the present invention may be any that forms a dimer and cleaves double-stranded DNA independently of the base sequence of HBV DNA. Thereby, in the HBV-specific nuclease of the present invention, the TALE part of the first fusion protein and the TALE part of the second fusion protein each bind to HBV DNA in a sequence-specific manner, and in the vicinity thereof, the first fusion protein The endonuclease linked to the second fusion protein and the endonuclease linked to the second fusion protein form a dimer and cleave the double-stranded HBV DNA.

このようなエンドヌクレアーゼとして、DNA認識機能ドメインが除去されたIIS型のクラスに属するエンドヌクレアーゼを利用することができる。IIS型のクラスに属するエンドヌクレアーゼは一般的に、DNA認識機能ドメインとDNA切断機能ドメインを含み、DNA認識機能ドメインがDNA配列を認識・結合し、そしてDNA認識機能ドメインが結合したDNA配列の外側でDNA切断機能ドメインがDNAを切断する。したがって、DNA認識機能ドメインを除去することによって配列非依存的にDNAを切断することが可能なエンドヌクレアーゼを得ることができる。DNA認識機能ドメインが除去されたエンドヌクレアーゼは一般的な遺伝子組換え手法を用いて製造することが可能であり、またIIS型のクラスに属する種々のエンドヌクレアーゼの遺伝子情報は既に公知となっており、製造に際してはこれらの遺伝子情報を利用することができる。例えば、DNA認識機能ドメインが除去されたFoKIが既に公知となっており（特開2013-31447号公報）、本発明においてはこのような変異型のFoKIを利用することができる。このような変異型のFoKIとしては配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むか、係るアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。   As such an endonuclease, an endonuclease belonging to the IIS class from which the DNA recognition function domain has been removed can be used. Endonucleases belonging to the IIS type class generally include a DNA recognition functional domain and a DNA cleavage functional domain. The DNA recognition functional domain recognizes and binds to a DNA sequence, and outside the DNA sequence to which the DNA recognition functional domain is bound. The DNA cleavage functional domain cleaves DNA. Therefore, an endonuclease capable of cleaving DNA in a sequence-independent manner can be obtained by removing the DNA recognition function domain. Endonucleases from which the DNA recognition functional domain has been removed can be produced using general gene recombination techniques, and gene information of various endonucleases belonging to the IIS type class is already known. These genetic information can be used for production. For example, FoKI from which the DNA recognition function domain has been removed is already known (Japanese Patent Laid-Open No. 2013-31447), and such a mutant FoKI can be used in the present invention. Examples of such mutant FoKI include a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or consisting of such an amino acid sequence.

ここで「機能し得るように連結された」とは、第１の融合タンパク質のTALE部分及び第２の融合タンパク質のTALE部分がそれぞれ配列特異的にHBV DNAに結合した状態において、第１の融合タンパク質のエンドヌクレアーゼと第２の融合タンパク質のエンドヌクレアーゼとが二量体を構成し2本鎖DNAを切断し得るように、TALEとエンドヌクレアーゼとがそれぞれ連結されていることを意味する。TALEとエンドヌクレアーゼとは、機能し得るように連結される限り、直接又は適当なリンカーを介して間接的に連結することができる。好ましくは、TALEとエンドヌクレアーゼとは、リンカーを介して連結される。リンカーは公知のアミノ酸リンカー（例えば、特開2013-31447号公報に記載されるリンカー）を利用することができる。アミノ酸リンカーの長さは、エンドヌクレアーゼによる最適な切断が得られるように調節することが可能であり、例えば2〜40残基程度の長さから適宜選択することができる。この長さは、本発明に用いられるエンドヌクレアーゼの種類や、両標的配列によって挟まれる領域の長さなどの要因に応じて、最適な切断が得られるように適宜選択することができる。エンドヌクレアーゼはTALEのN末及びC末のいずれの側にも連結することが可能であるが、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質のTALEの各標的配列に挟まれる領域にてエンドヌクレアーゼによるDNAの切断が効率的に生じるように、第１の融合タンパク質のTALE部分及び第２の融合タンパク質のTALE部分がHBV DNAに結合した状態において、他方のTALEに近い側の各TALE末端にエンドヌクレアーゼを連結することができる。   Here, “operably linked” means that the first fusion protein and the TALE portion of the second fusion protein are sequence-specifically bound to HBV DNA, respectively. It means that TALE and the endonuclease are linked so that the endonuclease of the protein and the endonuclease of the second fusion protein constitute a dimer and can cleave the double-stranded DNA. TALE and endonuclease can be linked directly or indirectly via a suitable linker as long as they are operably linked. Preferably, TALE and endonuclease are linked via a linker. As the linker, a known amino acid linker (for example, a linker described in JP-A-2013-31447) can be used. The length of the amino acid linker can be adjusted so as to obtain an optimal cleavage by an endonuclease, and can be appropriately selected from a length of about 2 to 40 residues, for example. This length can be appropriately selected so as to obtain an optimal cleavage according to factors such as the type of endonuclease used in the present invention and the length of the region sandwiched between both target sequences. The endonuclease can be linked to either the N-terminus or C-terminus of TALE, but the endonuclease is located in the region between the TALE target sequences of the first fusion protein and the second fusion protein. So that the TALE part of the first fusion protein and the TALE part of the second fusion protein are bound to HBV DNA so that the cleavage of DNA by E.coli occurs efficiently at the end of each TALE end closer to the other TALE. Nucleases can be ligated.

第１の融合タンパク質、及び、第２の融合タンパク質は、TALEとエンドヌクレアーゼに加えてさらに、核局在シグナル（Nuclear localization signal：NLS）を含む。核局在シグナルを含むことによって、第１の融合タンパク質、及び、第２の融合タンパク質は、導入／発現された細胞において核内へと移行される。NLSとしては公知のものを利用することができ、例えば-PKKKRKV-（配列番号１０）などが挙げられる。NLSは当該融合タンパク質のN末及びC末のいずれの側にも連結することが可能であるが、好ましくはエンドヌクレアーゼが連結された側とは反対側のTALEに連結する。NLSは適当なリンカーを介して連結されてもよいし、または直接連結されてもよい。   The first fusion protein and the second fusion protein further contain a nuclear localization signal (NLS) in addition to TALE and endonuclease. By including a nuclear localization signal, the first fusion protein and the second fusion protein are translocated into the nucleus in the introduced / expressed cell. As NLS, known ones can be used, and examples thereof include -PKKKRKV- (SEQ ID NO: 10). NLS can be linked to either the N-terminus or C-terminus of the fusion protein, but is preferably linked to the TALE on the side opposite to the side to which the endonuclease is linked. NLS may be linked via a suitable linker or directly linked.

第１の融合タンパク質、及び、第２の融合タンパク質には、必要に応じてさらに、膜透過ペプチド（例えば、Tat、オリゴアルギニン、DrosophilaのAntennapedia タンパク質由来ペプチド（penetratin））や標識ペプチド（His等）を含めてもよい。膜透過ペプチドを含むことによって、投与された第１の融合タンパク質、及び、第２の融合タンパク質は細胞内へと移行される。膜透過ペプチドや標識ペプチドは当該融合タンパク質のN末又はC末のいずれの側にも連結することができる。   The first fusion protein and the second fusion protein may further include a membrane-penetrating peptide (eg, Tat, oligoarginine, Drosophila Antennapedia protein-derived peptide (penetratin)) or a labeled peptide (His, etc.) as necessary. May be included. By including the membrane-penetrating peptide, the administered first fusion protein and second fusion protein are transferred into the cell. Membrane-permeable peptides and labeled peptides can be linked to either the N-terminus or C-terminus of the fusion protein.

本発明においてHBV特異的ヌクレアーゼに含まれる第１の融合タンパクとしては例えば配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むか、係るアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、また第２の融合タンパクとしては例えば配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むか、係るアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。また、本発明において第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質には、元のタンパク質の活性、すなわちTALE部分がHBV DNA上の標的配列に特異的に結合し、エンドヌクレアーゼ部分がHBV DNAを切断する活性を保持する限り、配列番号７又は配列番号８で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むか係るアミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。ここで「複数個」とは1〜20個、好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。さらに、本発明において第１の融合タンパク及び第２の融合タンパクには、元のタンパク質の活性を保持する限り、配列番号７又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか係るアミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール）)等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。   In the present invention, the first fusion protein contained in the HBV-specific nuclease includes, for example, a polypeptide comprising or consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and examples of the second fusion protein include A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or consisting of such an amino acid sequence is exemplified. In the present invention, the first fusion protein and the second fusion protein include the activity of the original protein, that is, the TALE portion specifically binds to the target sequence on HBV DNA, and the endonuclease portion cleaves HBV DNA. A polypeptide comprising such an amino acid sequence comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 Including. Here, the term “plurality” means 1 to 20, preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5. Furthermore, in the present invention, the first fusion protein and the second fusion protein may contain 80% or more, more preferably 90% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 as long as the activity of the original protein is maintained. %, More preferably 95% or more, and most preferably 99% or more of a polypeptide comprising an amino acid sequence having such sequence identity. Comparison of amino acid sequences can be performed by a known method, for example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information) etc. It can be used by setting.

第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は慣用の液相合成法、固相合成法などのペプチド合成法、自動ペプチド合成機によるペプチド合成などによって製造してもよいし、あるいは以下に記載する、第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質をコードするDNAを用いた遺伝子組換え法によって製造してもよい。遺伝子組換え法においては、第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを適当な宿主細胞にベクターを導入し、細胞を培養し、培養物から目的のタンパク質を回収することを含む。宿主細胞としては、E. coli、酵母、SF9、SF21、COS1、COS7、CHO、HEK293など周知の細胞を用いることが可能である。   The first fusion protein and the second fusion protein may be produced by a conventional liquid phase synthesis method, a peptide synthesis method such as a solid phase synthesis method, peptide synthesis using an automatic peptide synthesizer, or the like, or described below. Alternatively, it may be produced by a gene recombination method using DNA encoding the first fusion protein or the second fusion protein. In the gene recombination method, an expression vector containing DNA encoding the first fusion protein or the second fusion protein is introduced into an appropriate host cell, the cell is cultured, and the target protein is recovered from the culture. Including doing. As host cells, well-known cells such as E. coli, yeast, SF9, SF21, COS1, COS7, CHO, HEK293 can be used.

製造された第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質は、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLCなどのクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、免疫吸着法などにより、回収又は精製することができる。   The produced first fusion protein or second fusion protein can be obtained by a conventional method, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, HPLC chromatography, ammonium sulfate, etc. It can be recovered or purified by fractionation, ultrafiltration, immunoadsorption, or the like.

HBV特異的ヌクレアーゼの活性は、Single Strand Annealing (SSA)アッセイ等の公知の手法によって評価することができる。すなわち、HBV特異的ヌクレアーゼの標的部位によって中断された非機能的レポーター遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を発現する宿主細胞（例えば酵母）に、以下に記載するHBV特異的ヌクレアーゼをコードするDNA又は当該DNAを含む発現ベクターを導入し、HBV特異的ヌクレアーゼを発現させる。HBV特異的ヌクレアーゼによって、その標的部位にてDNAの二本鎖切断(DSB)が誘導されるとレポーター遺伝子は、宿主細胞の一本鎖アニーリング（SSA）機構によって再構成される。レポーター遺伝子の発現量は、用いたレポーター遺伝子に応じた一般的な検出方法によって検出・定量することができ、当該レポーター遺伝子の発現量が、HBV特異的ヌクレアーゼの活性を反映する。   The activity of the HBV-specific nuclease can be evaluated by a known technique such as Single Strand Annealing (SSA) assay. That is, to a host cell (for example, yeast) expressing a non-functional reporter gene (for example, β-galactosidase gene) interrupted by the target site of the HBV-specific nuclease, DNA encoding the HBV-specific nuclease described below or An expression vector containing DNA is introduced to express an HBV-specific nuclease. When a double-strand break (DSB) of DNA is induced at its target site by the HBV-specific nuclease, the reporter gene is reconstituted by the host cell single-strand annealing (SSA) mechanism. The expression level of the reporter gene can be detected and quantified by a general detection method corresponding to the reporter gene used, and the expression level of the reporter gene reflects the activity of the HBV-specific nuclease.

３．HBV特異的ヌクレアーゼをコードするDNA及び発現ベクター
本発明のHBV特異的ヌクレアーゼに含まれる第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質コードするDNAならびにHBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクターは、当業者にとって周知であるように、遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。例えば、Xanthomonas属細菌を、乳鉢などを用いて液体窒素中で摩粋後、例えばフェノール/クロロホルム法、グアニジウム法又はフェノール/SDS法により全RNAを抽出する。必要に応じて、RNAをオリゴ（dT）セルロースカラムに通してpoly(A)+RNAを得るか、あるいは、poly(A)+RNAから既知の逆転写反応を経てcDNAを作製する。NCBI、GenBank等のデータバンクにアクセスすることによって入手可能であるTALEの公知塩基配列を基にプライマーを設計し、上記RNAまたはcDNAを鋳型としてPCRを行い菌体のTALEユニットをコードするDNAをクローニングする。（必要に応じて）PCRによる特異的変異導入法などの公知の手法によってTALEユニット中の12番目及び13番目の残基（可変残基）をコードする塩基配列を改変し、アデニン、グアニン、シトシン、チミンのいずれかの塩基を特異的に認識し得るTALEユニットをコードするDNAを作製する。HBV DNA上の標的配列に応じて、各塩基を認識・結合するユニットを連結させることによって本発明におけるTALE部分をコードするDNAを得ることができる。得られたTALE部分をコードするDNAを、上記エンドヌクレアーゼ、リンカー、核局在シグナル等をコードするDNAと所定の順序で連結することによって第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質コードするDNAを得ることができる。 3. DNAs and expression vectors encoding HBV-specific nucleases DNAs encoding the first and second fusion proteins contained in the HBV-specific nuclease of the present invention and expression vectors for HBV-specific nucleases are well known to those skilled in the art. As is the case, it can be produced using genetic engineering techniques. For example, Xanthomonas bacteria are brewed in liquid nitrogen using a mortar or the like, and then total RNA is extracted by, for example, the phenol / chloroform method, the guanidinium method, or the phenol / SDS method. If necessary, RNA is passed through an oligo (dT) cellulose column to obtain poly (A) + RNA, or cDNA is prepared from poly (A) + RNA through a known reverse transcription reaction. Primers are designed based on the known nucleotide sequences of TALE, which can be obtained by accessing data banks such as NCBI, GenBank, etc., and PCR is performed using the above RNA or cDNA as a template to clone the DNA encoding the TALE unit of the cells. To do. (If necessary) The base sequence encoding the 12th and 13th residues (variable residues) in the TALE unit is modified by known methods such as specific mutagenesis by PCR, and adenine, guanine, and cytosine A DNA encoding a TALE unit capable of specifically recognizing any base of thymine is prepared. According to the target sequence on HBV DNA, DNA encoding the TALE moiety in the present invention can be obtained by linking units that recognize and bind each base. A DNA encoding the first fusion protein or the second fusion protein is obtained by ligating the DNA encoding the obtained TALE moiety with the DNA encoding the endonuclease, linker, nuclear localization signal, etc. in a predetermined order. Can be obtained.

本発明においては、配列番号７又は配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質をコードするDNAとして、例えば配列番号１１又は１２の塩基配列からなるDNAを利用することができる。   In the present invention, as the DNA encoding the first fusion protein or the second fusion protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, for example, the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or 12 is used. can do.

第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質をコードするDNAは、被験体／宿主細胞に適合性を有する適当な発現ベクターに、プロモーター及び／又はその他の制御配列と機能し得るかたちで連結して挿入する。ここで「機能し得るかたちで連結して挿入する」とは、当該発現ベクターが導入された細胞において、プロモーター及び／又はその他の制御配列の制御の下、第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質が発現されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。１つの発現ベクター中に第１の融合タンパク質をコードするDNA及び第２の融合タンパク質をコードするDNAを含めてもよいし、第１の融合タンパク質をコードするDNA及び第２の融合タンパク質をコードするDNAをそれぞれ別々の発現ベクター中に含めてもよい。好ましくは、第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAとはそれぞれ別々の発現ベクター中に含める。   The DNA encoding the first fusion protein or the second fusion protein is ligated to an appropriate expression vector compatible with the subject / host cell in such a way that it can function with a promoter and / or other control sequences. insert. Here, “to be ligated and inserted in a functional manner” means that the first fusion protein or the second fusion is performed under the control of a promoter and / or other regulatory sequences in a cell into which the expression vector has been introduced. It means that a promoter and / or other control sequences are linked and incorporated into a vector so that the protein is expressed. The DNA encoding the first fusion protein and the DNA encoding the second fusion protein may be included in one expression vector, or the DNA encoding the first fusion protein and the second fusion protein are encoded. Each DNA may be included in a separate expression vector. Preferably, the DNA encoding the first fusion protein and the DNA encoding the second fusion protein are each contained in separate expression vectors.

本発明において用いることができるベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどが挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えばpTAL等を使用することができる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を使用することができる。   Examples of vectors that can be used in the present invention include plasmid vectors, viral vectors, and non-viral vectors. As the plasmid vector, for example, pTAL can be used. As a virus vector, an adenovirus vector, a retrovirus vector, a lentivirus vector, or the like can be used.

ベクターに組み込むことができるプロモーター及び／又はその他の制御配列は特に限定されないが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、tRNAプロモーター、H1プロモーター、U6プロモーター、ポリメラーゼII系プロモーター、CMVプロモーターなど、その他の調節エレメントなど（例えば、ターミネーター配列）を適宜選択することができる。   Promoters and / or other control sequences that can be incorporated into the vector are not particularly limited, but are constitutive promoters, tissue-specific promoters, time-specific promoters, tRNA promoters, H1 promoters, U6 promoters, polymerase II promoters, CMV promoters And other regulatory elements (eg, terminator sequences) can be selected as appropriate.

第１の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクター、及び第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターの構造及び構成は、TALE部分を除く部分において同一の構造及び構成であってもよいし、異なる構造及び構成を有していてもよい。   The structure and configuration of the expression vector containing the DNA encoding the first fusion protein and the expression vector containing the DNA encoding the second fusion protein may be the same structure and configuration except for the TALE portion. However, they may have different structures and configurations.

このように作製された発現ベクターは、導入された細胞内で第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を発現し、核内に移行した第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は、HBV DNA（存在すれば）を特異的に切断することができる。   The expression vector thus prepared expresses the first fusion protein and the second fusion protein in the introduced cell, and the first fusion protein and the second fusion protein transferred into the nucleus are HBV. It can specifically cleave DNA (if present).

なお、本発明における第１の融合タンパク質をコードするDNA及び第２の融合タンパク質をコードするDNA、並びにそれらを含む発現ベクターは、TALEN（登録商標）を製造するメーカー（例えば、Cellectis bioresearch (Paris, France)）に製造を委託することができる。   In the present invention, the DNA encoding the first fusion protein, the DNA encoding the second fusion protein, and an expression vector containing them are produced by a manufacturer (eg, Cellectis bioresearch (Paris, France)).

４．医薬組成物
本発明の医薬組成物は有効成分としてHBV特異的ヌクレアーゼ発現ベクター、より詳細には上記第１の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクター、及び第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを含む。 4). Pharmaceutical Composition The pharmaceutical composition of the present invention comprises an HBV-specific nuclease expression vector as an active ingredient, more specifically an expression vector containing DNA encoding the first fusion protein, and DNA encoding the second fusion protein. Containing expression vectors.

あるいは、本発明の医薬組成物は有効成分としてHBV特異的ヌクレアーゼ、より詳細には上記第１の融合タンパク質、及び第２の融合タンパク質を含む。ただし、ここで第１の融合タンパク質、及び第２の融合タンパク質は膜透過ペプチドを有し、投与後に細胞内へ移行する。   Alternatively, the pharmaceutical composition of the present invention contains an HBV-specific nuclease as an active ingredient, more specifically, the first fusion protein and the second fusion protein. However, here, the first fusion protein and the second fusion protein have a membrane-permeable peptide and migrate into the cell after administration.

本発明の医薬組成物は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、注射による局所投与、腹腔または胸腔への投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投与、経皮吸収または直腸内投与など）によって投与することができる。また、発現ベクターがプラスミドベクターや非ウイルスベクターである場合には、遺伝子治療の分野で用いられている種々の遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、またはリポフェクション法）を適宜用いて投与することができる。   The pharmaceutical composition of the present invention is administered orally or parenterally (for example, intravenous administration, intraarterial administration, local administration by injection, administration to the abdominal cavity or thoracic cavity, subcutaneous administration, intramuscular administration, sublingual administration, transdermal For example, by absorption or rectal administration). When the expression vector is a plasmid vector or a non-viral vector, various gene transfer methods used in the field of gene therapy (for example, calcium phosphate method, DEAE dextran method, electroporation method, or lipofection method) Can be administered as appropriate.

本発明の医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。具体的には注射剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤等の各種製剤形態に調製することができる。   The pharmaceutical composition of the present invention can be made into a suitable dosage form depending on the administration route. Specifically, injections, suspensions, emulsifiers, ointments, creams, tablets, capsules, granules, powders, pills, fine granules, troches, rectal administration, oily suppositories, water-soluble It can be prepared in various pharmaceutical forms such as suppositories.

これらの各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、および安定化剤などを用いて常法により製造することができる。   These various preparations are commonly used excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives. , And can be produced by conventional methods using colorants, flavoring agents, and stabilizers.

第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAとは、あるいは、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とは、それぞれ別個の製剤中に含めてもよいし、あるいは同一の製剤中に含めてもよい。別個の製剤中に含める場合において、第１の融合タンパク質をコードするDNAの剤形と第２の融合タンパク質をコードするDNAの剤形とは、あるいは、第１の融合タンパク質の剤形と第２の融合タンパク質の剤形とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。   The DNA encoding the first fusion protein and the DNA encoding the second fusion protein, or the first fusion protein and the second fusion protein may be included in separate formulations, Or you may include in the same formulation. When included in separate formulations, the DNA dosage form encoding the first fusion protein and the DNA dosage form encoding the second fusion protein, or the first fusion protein dosage form and the second The dosage form of the fusion protein may be the same or different.

本発明の医薬組成物は、HBVに感染している、又はHBV感染の危険にある被験体に対して投与することができる。投与量は被験体の年齢、体重、感染の重篤度などの要因によって変化し得るが、第１の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクター及び第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターをそれぞれ、１回の投与につき体重1kgあたり0.00001mg〜100mg、好ましくは0.0001mg〜10mgの範囲から適宜選択される量を投与することができる。あるいは、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質をそれぞれ、１回の投与につき体重1kgあたり0.00001mg〜100mg、好ましくは0.0001mg〜10mgの範囲から適宜選択される量を投与することができる。第１の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターと第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターの投与量、あるいは、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質の投与量は同一であってもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一である。投与スケジュールは、被験体の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、本発明の医薬組成物を被験体に対して、１日に１回または複数回（例えば、２回、３回またはそれ以上）、毎日または週に２〜５日の連続投与を１〜８週間にわたって、投与することができる。第１の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターと第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターとがそれぞれ別個の製剤中に含まれる場合、あるいは、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とがそれぞれ別個の製剤中に含まれる場合において、各製剤は同時に投与してもよいし、細胞内（より詳細には核内）にて導入／発現された第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が共存し得る範囲において非同時に投与してもよい。   The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject infected with HBV or at risk of HBV infection. Although the dosage may vary depending on factors such as the age, weight, severity of infection, etc. of the subject, the expression vector containing the DNA encoding the first fusion protein and the expression containing the DNA encoding the second fusion protein Each vector can be administered in an amount appropriately selected from the range of 0.00001 mg to 100 mg, preferably 0.0001 mg to 10 mg per kg body weight per administration. Alternatively, the first fusion protein and the second fusion protein can each be administered in an amount appropriately selected from the range of 0.00001 mg to 100 mg, preferably 0.0001 mg to 10 mg per kg body weight per administration. The dosage of the expression vector containing the DNA encoding the first fusion protein and the expression vector containing the DNA encoding the second fusion protein, or the dosage of the first fusion protein and the second fusion protein are the same. They may be different or different but are preferably the same. The dosing schedule may vary depending on factors such as the subject's age, weight, disease severity, etc., but the pharmaceutical composition of the invention may be administered to the subject once or multiple times per day (eg, 2 Twice, three times or more), daily or 2-5 consecutive days per week can be administered over 1-8 weeks. When the expression vector containing the DNA encoding the first fusion protein and the expression vector containing the DNA encoding the second fusion protein are contained in separate preparations, respectively, or the first fusion protein and the second When the fusion proteins are contained in separate preparations, the preparations may be administered simultaneously, or the first fusion protein introduced and expressed in the cell (more specifically, in the nucleus) and the first fusion protein They may be administered non-simultaneously as long as the two fusion proteins can coexist.

本発明の医薬組成物に含まれる発現ベクターは導入された被験体の細胞において転写・翻訳され、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を発現することができる。また、本発明に医薬組成物に含まれる第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質は、膜透過ペプチドにより細胞内に移行される。その後、発現された、あるいは移行された第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は核内に移行し、HBV DNA（より詳細にはHBV cccDNA）に特異的に結合し、各融合タンパク質のエンドヌクレアーゼが二量体を構成して、HBV DNA（より詳細にはHBV cccDNA）の2本鎖DNAを切断し、HBVの複製を阻害することができる。   The expression vector contained in the pharmaceutical composition of the present invention can be transcribed and translated in the introduced subject's cells to express the first fusion protein and the second fusion protein. Moreover, the 1st fusion protein and 2nd fusion protein which are contained in the pharmaceutical composition in this invention are transferred into a cell by a membrane permeation peptide. Thereafter, the expressed or transferred first fusion protein and the second fusion protein move into the nucleus, specifically bind to HBV DNA (more specifically, HBV cccDNA), and end of each fusion protein. Nucleases can form dimers and cleave double stranded DNA of HBV DNA (more specifically, HBV cccDNA) to inhibit HBV replication.

本発明の医薬組成物は、HBV感染の前に被験体に投与することによって、被験体におけるHBVの増殖を阻害することができHBV感染を予防することができる。また、本発明の医薬組成物は、HBVに持続的に感染している被験体に投与することによって、肝細胞の核内に存在するHBV cccDNAを切断することが可能であり、HBV感染を根治することができる。   By administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject prior to HBV infection, the growth of HBV in the subject can be inhibited and HBV infection can be prevented. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can cleave HBV cccDNA present in the nucleus of hepatocytes by administering it to a subject who is persistently infected with HBV, and radically cures HBV infection. can do.

次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in more detail, this invention is not limited to these.

［材料及び方法］
１．HBV特異的ヌクレアーゼの設計及び構築
HBVの17クローン (遺伝子型A：X51970, AM282986, AY161149, AF373065, AF297621；遺伝子型B：AB073858, AB033554, AF100309, D00329, D00330；遺伝子型C：AB246345, NC_003977, AB033556, AB231908, AY123041, AB014381, AY206389)について、HBVポリメラーゼ遺伝子領域のホモロジーを検索し、全ての遺伝子型で保存されている領域を同定した。この領域の配列を元に、TALEN（登録商標） Hitソフトウェアプログラム (http://talen-hit.cellectis-bioresearch.com/search)を使用して、HBV特異的ヌクレアーゼの標的部位を決定した。HBV特異的ヌクレアーゼ発現プラスミドの合成はCellectis bioresearch (Paris, France)に委託した。 [Materials and methods]
1. Design and construction of HBV-specific nuclease
17 clones of HBV (genotype A: X51970, AM282986, AY161149, AF373065, AF297621; genotype B: AB073858, AB033554, AF100309, D00329, D00330; genotype C: AB246345, NC_003977, AB033556, AB231908, AY123041, AB014381, AY206389 ), The homology of the HBV polymerase gene region was searched, and the region conserved in all genotypes was identified. Based on the sequence of this region, the target site of HBV-specific nuclease was determined using the TALEN® Hit software program (http://talen-hit.cellectis-bioresearch.com/search). Synthesis of HBV-specific nuclease expression plasmid was commissioned to Cellectis bioresearch (Paris, France).

HBV特異的ヌクレアーゼの活性は、HBV特異的ヌクレアーゼを発現するプラスミドを有する第１のハプロイド酵母、及び非機能的LacZ遺伝子（HBV特異的ヌクレアーゼの標的配列を含む領域によって中断されている）を担持するプラスミドを有する第2のハプロイド酵母を用いたSingle Strand Annealing (SSA)アッセイにより評価した。   The activity of the HBV-specific nuclease carries the first haploid yeast with a plasmid that expresses the HBV-specific nuclease, and a non-functional LacZ gene (interrupted by the region containing the target sequence of the HBV-specific nuclease) Evaluated by Single Strand Annealing (SSA) assay using a second haploid yeast with plasmid.

２．ヒト化キメラマウスの初代肝細胞の単離
ヒト肝臓を有するヒト化キメラマウスは公知の手法により作製した。すなわち、凍結保存されたヒト肝細胞（BD Bioscience (CA, USA)）2〜4週齢の免疫不全肝障害マウス(uPA/SCID) (Tateno C et al. Am J Pathol. 2004;165:901-912.)に移植した。移植から7〜11週後に、ヒトアルブミンの高い血中レベル(>12 mg/mL)を示すマウスより、ヒト肝細胞を二段階のコラゲナーゼ灌流法を用いる公知の手法(Yamasaki C et al. Drug Metab Pharmacokinet. 2010;25(6):539-550.)により単離した。得られたヒト肝細胞は、I型コラーゲンをコートしたプレート中、ウシ胎仔血清を添加したDlbecco改変Eagle培地にて培養した。 2. Isolation of primary hepatocytes from humanized chimeric mice Humanized chimeric mice having a human liver were prepared by a known technique. That is, cryopreserved human hepatocytes (BD Bioscience (CA, USA)) 2-4 weeks old immunodeficient hepatopathy mice (uPA / SCID) (Tateno C et al. Am J Pathol. 2004; 165: 901- 912.). Seven to eleven weeks after transplantation, mice that show high blood levels of human albumin (> 12 mg / mL) were used to extract human hepatocytes using a known technique using a two-stage collagenase perfusion method (Yamasaki C et al. Drug Metab Pharmacokinet. 2010; 25 (6): 539-550.). The obtained human hepatocytes were cultured in a Dlbecco modified Eagle medium supplemented with fetal calf serum in a plate coated with type I collagen.

３．HBV接種源
遺伝子型A(AB246337)及びC (AB246345)のHBVプラスミドにてそれぞれ形質転換されたHepG2細胞の培養上清（名古屋市立大学医学研究科田中靖人博士より譲渡されたもの(Sugiyama M et al. HEPATOLOGY 2006; 44:915-924.)）を、ヒト化キメラマウスにそれぞれ注射した。高レベルのHBV 血症が安定して観察された後、それぞれのマウスより血清を回収した。これらの血清を、本実験にて接種源として用いた。 3. HBV inoculation source Culture supernatant of HepG2 cells transformed with HBV plasmids of genotypes A (AB246337) and C (AB246345) (assigned by Dr. Hiroto Tanaka, Graduate School of Medicine, Nagoya City University) al. HEPATOLOGY 2006; 44: 915-924.)) were each injected into humanized chimeric mice. Serum was collected from each mouse after a high level of HBVemia was observed stably. These sera were used as inoculum in this experiment.

４．ヒト血清アルブミンの測定
キメラマウスの血中ヒト血清アルブミンレベルは、Alb-IIキット(Eiken Chemical, Tokyo, Japan)を製造元の指示書に従い使用して測定した。 4). Measurement of human serum albumin The blood human serum albumin level of chimeric mice was measured using an Alb-II kit (Eiken Chemical, Tokyo, Japan) according to the manufacturer's instructions.

５．HBV DNAの定量
HBVゲノムDNAの抽出及び定量は、公知の手法により行った。すなわち、培養上清又は細胞よりDNAを、SMI test EX R&Dキット(NIPPON Genetics Co.Ltd, Tokyo, Japan)を製造元の指示書に従い使用して抽出した。HBVゲノムDNAの定量は、Universal master mix II (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)及びCFX96 real-time PCR detection system (Bio-Rad, CA, USA)を使用するquantitative real-time polymerase chain reaction（qPCR）にて行った。30μlの増幅反応混合物（5μl DNA溶液, 200nM フォワードプライマー, 200nM リバースプライマー, 300nM TaqManプローブ、15μl Universal master mix II）を以下の条件の増幅反応に供した：50℃にて2分間；95℃にて10分間；続いて、95℃にて20秒間及び60℃にて1分間を53サイクル。定量においては、HBVゲノムが挿入された組換えプラスミドの10倍希釈系列を使用して得られた標準曲線を用いた。 5. Quantification of HBV DNA
Extraction and quantification of HBV genomic DNA was performed by a known method. That is, DNA was extracted from the culture supernatant or cells using the SMI test EX R & D kit (NIPPON Genetics Co. Ltd, Tokyo, Japan) according to the manufacturer's instructions. Quantification of HBV genomic DNA was performed using a quantitative real-time polymerase chain reaction (Universal master mix II (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) and CFX96 real-time PCR detection system (Bio-Rad, CA, USA)). qPCR). 30 μl of amplification reaction mixture (5 μl DNA solution, 200 nM forward primer, 200 nM reverse primer, 300 nM TaqMan probe, 15 μl Universal master mix II) was subjected to amplification reaction under the following conditions: 50 ° C. for 2 minutes; 10 minutes; followed by 53 cycles of 95 ° C for 20 seconds and 60 ° C for 1 minute. For quantification, a standard curve obtained using a 10-fold dilution series of a recombinant plasmid into which the HBV genome was inserted was used.

６．酵素免疫吸着測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)）
HBs抗原濃度は、酵素免疫吸着測定(ELISA) Kit (TFB, Tokyo, Japan)を製造元の指示書に従い使用して測定した。 6). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
HBs antigen concentration was measured using an enzyme immunosorbent assay (ELISA) Kit (TFB, Tokyo, Japan) according to the manufacturer's instructions.

７．間接免疫蛍光分析
HBVに感染した初代細胞の免疫蛍光分析は、一次抗体として抗HBs抗原モノクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific K.K. Kanagawa, Japan)、二次抗体として抗ヤギIgG Alexa-594 (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan)を用いて行った。核染色には、Hoechst 33342 (Dojindo, Kumamoto, Japan)を用いた。 7). Indirect immunofluorescence analysis
Immunofluorescence analysis of primary cells infected with HBV was performed using anti-HBs antigen monoclonal antibody (Thermo Fisher Scientific KK Kanagawa, Japan) as the primary antibody and anti-goat IgG Alexa-594 (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan) as the secondary antibody. Used. Hoechst 33342 (Dojindo, Kumamoto, Japan) was used for nuclear staining.

８．トランスフェクション
ヒト化キメラマウスの初代肝細胞へのmGFP発現プラスミド又はHBV特異的ヌクレアーゼ発現ベクターのトランスフェクションは、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (Roche Diagnostics, Almere, Netherlands)を製造元の指示書に従い使用して行った。 8). Transfection of primary hepatocytes of humanized chimeric mice using XGFP-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (Roche Diagnostics, Almere, Netherlands) according to the manufacturer's instructions. I went.

９．ウェスタンブロット
細胞を溶解バッファー(1% SDS, 0.5% Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA及び1 mMジチオスレイトールを含有する10 mM Tris (pH 7.4))に懸濁し、得られたタンパク質サンプルを8%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、そしてPVDF (polyvinylidene difluoride)メンブレン (Immobilon-P; Millipore, Billerica, MA, USA)に転写した。HBV特異的ヌクレアーゼが有するHA-tagをウサギ抗HAモノクローナル抗体(3F10) (Roche Diagnostics, Almere, Netherlands)にて検出した。 9. Western blot Cells obtained by suspending cells in lysis buffer (10 mM Tris (pH 7.4) containing 1% SDS, 0.5% Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA and 1 mM dithiothreitol) Samples were electrophoresed on 8% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel and transferred to a PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (Immobilon-P; Millipore, Billerica, MA, USA). The HA-tag possessed by the HBV-specific nuclease was detected with a rabbit anti-HA monoclonal antibody (3F10) (Roche Diagnostics, Almere, Netherlands).

１０．HBV cccDNAの定量
上記「５．HBV DNAの定量」と同様に、細胞からDNAを抽出した後、HBVcccDNAを検出するためのqPCRを、5μl DNAサンプル及び20μl PCR mixture (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて、CFX96 real-time PCR detection system (Bio-Rad, CA, USA)を使用して行った。HBV cccDNA に対するプローブは以下のものを使用した： 5’-6FAM-CGTCGCATGGARACCACCGTGAACGCC-BHQ1-3’（配列番号１３）。HBV cccDNAに対するプライマーは0.9μM、プローブは0.4μMの濃度にてそれぞれ使用した。増幅反応は以下の条件にて行った：50℃にて2分間；95℃にて10分間；続いて、95℃にて10秒間、58℃にて5秒間、63℃にて10秒間、及び72℃にて20秒間を55サイクル。定量においては、HBVゲノムが挿入された組換えプラスミドの10倍希釈系列を使用して得られた標準曲線を用いた。 10. Quantification of HBV cccDNA In the same manner as in “5. USA) using the CFX96 real-time PCR detection system (Bio-Rad, CA, USA). The following probe for HBV cccDNA was used: 5'-6FAM-CGTCGCATGGARACCACCGTGAACGCC-BHQ1-3 '(SEQ ID NO: 13). Primers for HBV cccDNA were used at a concentration of 0.9 μM, and probes at a concentration of 0.4 μM. The amplification reaction was performed under the following conditions: 50 ° C. for 2 minutes; 95 ° C. for 10 minutes; followed by 95 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, 63 ° C. for 10 seconds, and 55 cycles of 20 seconds at 72 ° C. For quantification, a standard curve obtained using a 10-fold dilution series of a recombinant plasmid into which the HBV genome was inserted was used.

１１．細胞生存アッセイ
細胞生存率は、cell counting kit (Dojindo, Kumamoto, Japan)を製造元の指示書に従い使用して生細胞数を計測することによって行った。 11. Cell viability assay Cell viability was determined by counting the number of viable cells using a cell counting kit (Dojindo, Kumamoto, Japan) according to the manufacturer's instructions.

１２．統計的分析
統計的分析はStudent-t検定にて行い、p値 < 0.05を有意差ありと判断した。 12 Statistical analysis Statistical analysis was performed by Student-t test, and p-value <0.05 was judged to be significant.

［結果］
１．HBV特異的ヌクレアーゼ
17クローンに由来するHBVポリメラーゼ遺伝子領域のホモロジー検索の結果、全ての遺伝子型で保存されている領域を同定した（図１(A)）。この領域はPreC/C及びポリメラーゼコード領域の重複部位であった（図１(B)における(d)）。この領域より、センス鎖上：5’-TAGAAGAAGAACTCCCT -3’（配列番号５）及びアンチセンス鎖上：5’-TTCTGCGACGCGGCGAT-3’（配列番号６）を標的配列として選択し、HBV特異的ヌクレアーゼを構築した。HBV特異的ヌクレアーゼの第1のサブセット（配列番号７）（配列番号５で示される塩基配列を標的とする）の発現ベクター：pTAL.CMV.T7.HBV-L、ならびに、HBV特異的ヌクレアーゼの第2のサブセット（配列番号８）（配列番号６で示される塩基配列を標的とする）の発現ベクター：pTAL.CMV.T7. HBV-Rの模式図をそれぞれ図２(A)及び(B)に示す。 [result]
1. HBV-specific nuclease
As a result of homology search of HBV polymerase gene regions derived from 17 clones, regions conserved in all genotypes were identified (FIG. 1 (A)). This region was an overlapping site of PreC / C and polymerase coding region ((d) in FIG. 1 (B)). From this region, on the sense strand: 5′-TAGAAGAAGAACTCCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and on the antisense strand: 5′-TTCTGCGACGCGGCGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 6) are selected as target sequences, and an HBV-specific nuclease is selected. It was constructed. Expression vectors for the first subset of HBV-specific nucleases (SEQ ID NO: 7) (targeting the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5): pTAL.CMV.T7.HBV-L, and the HBV-specific nuclease Schematic diagrams of expression vectors: pTAL.CMV.T7.HBV-R in the subset of 2 (SEQ ID NO: 8) (targeting the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6) are shown in FIGS. 2 (A) and 2 (B), respectively. Show.

得られたHBV特異的ヌクレアーゼの活性は酵母を用いたSingle Strand Annealing (SSA)アッセイにより確認した。   The activity of the obtained HBV-specific nuclease was confirmed by Single Strand Annealing (SSA) assay using yeast.

２．ヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞におけるHBV増殖
ヒト肝臓を有するヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞にて、HBVの増殖が可能であるか否かを調べたるためにHBV感染実験を行った。図３(A)に記載のプロトコルに従い、細胞を播種した後HBV接種源を用いてHBV感染(遺伝子型A及びC)させ、感染から0, 2, 7, 12, 17及び22日目の培養上清及び細胞を回収し、当該上清中及び細胞中のHBV DNAをqPCRにて定量した。 2. HBV proliferation in primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice HBV infection experiments were performed to examine whether or not HBV could be propagated in primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice having a human liver. In accordance with the protocol described in FIG. 3 (A), cells were seeded and then infected with HBV (genotypes A and C) using an HBV inoculum, and cultured on days 0, 2, 7, 12, 17 and 22 after infection. The supernatant and cells were collected, and HBV DNA in the supernatant and cells was quantified by qPCR.

上清中のHBV DNAレベルは両遺伝子型共に、2及び7日目におよそ104 copies/mlに達し、その後22日目にはおよそ105-106 copies/mlまで増加した（図３（B））。細胞中のHBV-DNAレベルもまた、22日目にはおよそ105-106 copies/mlまで増加した（図３（C））。さらに、間接免疫蛍光分析においては、HBs抗原が細胞にて発現していることが観察された（図３（D））。 The HBV DNA level in the supernatant for both genotypes reached approximately 10 4 copies / ml on days 2 and 7 and then increased to approximately 10 5 -10 6 copies / ml on day 22 (FIG. 3 ( B)). HBV-DNA levels in the cells also increased to approximately 10 5 -10 6 copies / ml on day 22 (FIG. 3 (C)). Furthermore, in indirect immunofluorescence analysis, it was observed that HBs antigen was expressed in cells (FIG. 3 (D)).

これらの結果は、HBVがヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞に感染し、当該細胞にて複製・増殖できることを示す。   These results indicate that HBV can infect primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice and can replicate and proliferate in these cells.

３．HBV特異的ヌクレアーゼによるHBV感染の阻害
HBV特異的ヌクレアーゼによる前処理により、HBV感染を阻害できるか否かを調べた。HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクターをヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞にトランスフェクトし、HBV特異的ヌクレアーゼの発現をウェスタンブロット法により確認した。ヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞にHBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクター（pTAL.CMV.T7.HBV-L及びpTAL.CMV.T7. HBV-R）をトランスフェクトし（０日目）、その後HBV(遺伝子型C)を感染させ（1日目）、そして7日目に肝細胞を回収した（図４（A））。対照として、HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクターに代えてmGFP発現プラスミドを用いて同様に操作して得られたヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞を用いた。 3. Inhibition of HBV infection by HBV-specific nucleases
It was examined whether pretreatment with HBV-specific nuclease can inhibit HBV infection. HBV-specific nuclease expression vectors were transfected into primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice, and the expression of HBV-specific nucleases was confirmed by Western blotting. HBV-specific nuclease expression vectors (pTAL.CMV.T7.HBV-L and pTAL.CMV.T7.HBV-R) were transfected into primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice (day 0), and then HBV (Genotype C) was infected (day 1), and hepatocytes were collected on day 7 (FIG. 4 (A)). As a control, primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice obtained in the same manner using an mGFP expression plasmid instead of an expression vector for an HBV-specific nuclease were used.

HBV感染肝細胞における細胞内HBV cccDNAを定量した結果、HBV特異的ヌクレアーゼで前処理された細胞において遺伝子型Cに由来するHBV cccDNA量が、HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクター（pTAL.CMV.T7.HBV-L及びpTAL.CMV.T7. HBV-R）の用量依存的に、減少していることが確認された（図４(B)）。   As a result of quantification of intracellular HBV cccDNA in HBV-infected hepatocytes, the amount of HBV cccDNA derived from genotype C in cells pretreated with HBV-specific nuclease was higher than that of HBV-specific nuclease expression vector (pTAL.CMV.T7. HBV-L and pTAL.CMV.T7.HBV-R) were confirmed to decrease in a dose-dependent manner (FIG. 4 (B)).

これらの結果は、HBV特異的ヌクレアーゼによる前処置によって、肝細胞へのHBV感染を阻害できることを示す。   These results indicate that pretreatment with HBV-specific nuclease can inhibit hepatocyte HBV infection.

４．HBV持続感染に対するHBV特異的ヌクレアーゼの効果
次に、HBVが持続的に感染した状況下における、HBV特異的ヌクレアーゼの効果について調べた。上記したとおり、HBVに感染したヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞におけるHBV DNAレベルは、感染から22日目まで増加してプラトーに達した。この結果を鑑みて、HBV(遺伝子型C)を感染させてから25日後に、HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクター（pTAL.CMV.T7.HBV-L及びpTAL.CMV.T7. HBV-R）をトランスフェクトし（０日目）、その7日後に肝細胞を回収した（図５（A））。対照として、HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクターに代えてmGFP発現プラスミドを用いて同様に操作して得られたヒト化キメラマウス由来の初代肝細胞を用いた。 4). Effect of HBV-specific nuclease on HBV persistent infection Next, the effect of HBV-specific nuclease in the situation where HBV was persistently infected was examined. As described above, HBV DNA levels in primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice infected with HBV increased until the 22nd day after infection and reached a plateau. In view of this result, 25 days after infection with HBV (genotype C), HBV-specific nuclease expression vectors (pTAL.CMV.T7.HBV-L and pTAL.CMV.T7.HBV-R) were used. The cells were transfected (day 0), and hepatocytes were collected 7 days later (FIG. 5 (A)). As a control, primary hepatocytes derived from humanized chimeric mice obtained in the same manner using an mGFP expression plasmid instead of an expression vector for an HBV-specific nuclease were used.

HBV感染肝細胞における細胞内HBV cccDNAを定量した結果、HBV特異的ヌクレアーゼにより処理され細胞において遺伝子型Cに由来するHBV cccDNA量が、HBV特異的ヌクレアーゼの発現ベクター（pTAL.CMV.T7.HBV-L及びpTAL.CMV.T7. HBV-R）の用量依存的に、減少していることが確認された（図５(B)）。   As a result of quantification of intracellular HBV cccDNA in HBV-infected hepatocytes, the amount of HBV cccDNA that was treated with HBV-specific nuclease and derived from genotype C in the cells was reduced to the expression vector (pTAL.CMV.T7.HBV- L and pTAL.CMV.T7.HBV-R) were confirmed to decrease in a dose-dependent manner (FIG. 5 (B)).

以上より、HBV特異的ヌクレアーゼによる処置によって、感染によるHBV cccDNA量の増大を防ぎ、またHBV持続感染におけるHBV cccDNA量を減少させることが可能であることが示された。   From the above, it was shown that treatment with an HBV-specific nuclease can prevent an increase in the amount of HBV cccDNA due to infection and reduce the amount of HBV cccDNA in persistent HBV infection.

本発明のHBV特異的ヌクレアーゼによれば、感染によるHBV cccDNA量の増大を防ぎ、またHBV持続感染におけるHBV cccDNA量を減少させることが可能である。したがって、本発明のHBV特異的ヌクレアーゼを利用することによって、HBV感染の予防ならびにHBV感染の寛解又は根治を可能としHBV治療の新たな治療手段として大いに貢献することが期待できる。   According to the HBV-specific nuclease of the present invention, it is possible to prevent an increase in the amount of HBV cccDNA due to infection, and to reduce the amount of HBV cccDNA in persistent HBV infection. Therefore, the use of the HBV-specific nuclease of the present invention can be expected to contribute to the prevention of HBV infection and the remission or cure of HBV infection as a new therapeutic means for HBV treatment.

Claims (9)

B型肝炎ウイルス（HBV）DNAのセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALE (Transcription Activator-Like Effectors)と、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとが連結されてなる第１の融合タンパク質；ならびに
HBV DNAのアンチセンス鎖上の特定の領域に特異的に結合するように改変されたXanthomonas属細菌由来のTALEと、配列非依存性のエンドヌクレアーゼとが連結されてなる第２の融合タンパク質、
を含む人工DNAヌクレアーゼであって、
該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質が配列番号２〜４のいずれかで示される塩基配列を有するセンス鎖及びそのアンチセンス鎖より選択される15〜30個の連続した塩基からなる領域に対してそれぞれ結合し、該第１の融合タンパク質が結合するセンス鎖上の領域と第２の融合タンパク質が結合するアンチセンス鎖上の領域は相補的でなく、かつ、両領域によって挟まれる領域にて該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質に連結するエンドヌクレアーゼがHBV DNAを切断し、かつ、該第１の融合タンパク質及び該第２の融合タンパク質が核移行シグナルペプチドを含む、上記人工DNAヌクレアーゼ。 TALE (Transcription Activator-Like Effectors) from the genus Xanthomonas modified to specifically bind to a specific region on the sense strand of hepatitis B virus (HBV) DNA, a sequence-independent endonuclease, A first fusion protein comprising:
A second fusion protein comprising TALE derived from a genus Xanthomonas modified so as to specifically bind to a specific region on the antisense strand of HBV DNA and a sequence-independent endonuclease;
An artificial DNA nuclease comprising
The first fusion protein and the second fusion protein are composed of a sense strand having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 4 and 15 to 30 consecutive bases selected from the antisense strand. The region on the sense strand that binds to each region, to which the first fusion protein binds, and the region on the antisense strand to which the second fusion protein binds are not complementary and are sandwiched by both regions An endonuclease linked to the first fusion protein and the second fusion protein in a region cleaves HBV DNA, and the first fusion protein and the second fusion protein comprise a nuclear translocation signal peptide , The above artificial DNA nuclease. 第１の融合タンパク質が配列番号５で示される塩基配列からなる領域と特異的に結合し、かつ第２の融合タンパク質が配列番号６で示される塩基配列からなる領域と特異的に結合する、請求項１に記載の人工DNAヌクレアーゼ。   The first fusion protein specifically binds to a region consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 5, and the second fusion protein specifically binds to a region consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 6 Item 4. The artificial DNA nuclease according to Item 1. 配列非依存性のエンドヌクレアーゼが、DNA認識機能ドメインが除去されたFokIエンドヌクレアーゼである、請求項１又は２に記載の人工DNAヌクレアーゼ。   The artificial DNA nuclease according to claim 1 or 2, wherein the sequence-independent endonuclease is a FokI endonuclease from which a DNA recognition function domain has been removed. 第１の融合タンパク質が配列番号７で示されるアミノ酸配列からなり、かつ第２の融合タンパク質が配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の人工DNAヌクレアーゼ。   The artificial DNA nuclease according to claim 1 or 2, wherein the first fusion protein consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the second fusion protein consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工DNAヌクレアーゼをコードするDNAであって、第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAを含む、上記人工DNAヌクレアーゼをコードするDNA。   The artificial DNA nuclease encoding the artificial DNA nuclease according to any one of claims 1 to 4, comprising a DNA encoding the first fusion protein and a DNA encoding the second fusion protein. DNA encoding 請求項５に記載の人工DNAヌクレアーゼをコードするDNAを含む発現ベクターであって、第１の融合タンパク質をコードするDNAと第２の融合タンパク質をコードするDNAが同一のベクター中に含まれるか、または別々のベクター中に含まれる、上記発現ベクター。   An expression vector comprising DNA encoding the artificial DNA nuclease according to claim 5, wherein the DNA encoding the first fusion protein and the DNA encoding the second fusion protein are contained in the same vector, Or the expression vector, contained in a separate vector. 請求項６に記載の発現ベクターを含む、HBV DNAを切断するための医薬組成物。   A pharmaceutical composition for cleaving HBV DNA, comprising the expression vector according to claim 6. HBV DNAがHBV cccDNAである、請求項７に記載の医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the HBV DNA is HBV cccDNA. HBV感染を治療又は予防するための、請求項７又は８に記載の医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 7 or 8, for treating or preventing HBV infection.
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