JP2014511108A - マイクロコンタクトスタンピングのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

基板上にプリントするため、または基板上の材料をマスクするためのスタンプを使用するシステムおよび方法を提供する。１つの特定の実施形態において、システムおよび方法は、複数の堅いポストを有するマイクロコンタクトスタンプを含み、そのポストの各々は、その遠位端に弾性パッドを有する。各ポストが、ガイドプレート内で長手方向に動きうるように、各ポストは、ガイドプレートに設けられた開口部内にはめられる。ガイドプレートは、多様な開口部を含み、その開口部は、典型的に、マイクロタイタープレートのウェルに整列させられる。開口部は、典型的にガイドプレートの全体の厚さを貫いて延びる。弾性部材は、ガイドプレートの１つの面にあり、弾性部材は、開口部のうちの１つ以上の上に広がり、それによって、ポストを定位置に保持する。

Description

（関連出願への参照）
本願は、米国特許出願第１３／０１１，７３４号（２０１１年１月２１日出願、名称「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏ−ｃｏｎｔａｃｔ Ｓｔａｍｐｉｎｇ」）に基づく優先権を主張し、これによって、その全体が参照によって援用される。

（発明の分野）
本明細書中に説明されるシステムおよび方法は、基板表面に細胞のパターンを形成する方法およびシステムに関連する。

（背景）
あつらえの細胞培養環境は、大きな期待を提供する。細胞培養および細胞同時培養は、科学者が、細胞の性質を発見すること、および提案された治療薬剤が、特定の疾患を治療することに効果的、かつ安全であり得るかどうかを安全に決定することを可能にし得る。微小パターン細胞培養開発における最近の進歩は、多細胞共同体の構造−機能の関係の理解を強めることにおいて非常に貴重であるとわかってきた。そのような微小パターン細胞培養は、特に正確かつ確実な細胞間隔が達成される場合に、細胞間相互作用に対するより多くの制御をもたらす。微小環境レベルにおける組織構成の研究は、脈管形成、肝細胞機能、骨由来細胞の石灰化、および神経の成長円錐ガイダンスのように多様な領域に対する見識を明らかにしてきた。そのうえ、微小パターン細胞培養は、研究者に、彼らの実験を評価し、それによって、より効果的かつ能率的に試験および実験を並行して行う能力を提供する。これは、科学的発見が生じ得る割合および新薬の開発速度を増加させて、より素早く特定の疾患のメカニズムを解明する。

しかし、ミクロンレベルの細胞アイランドを形成することは、細胞が、ミクロンで測定されるほど十分に接近して間隔を開けられるように、少量の細胞を正確に操作し得るツールを要求するので、ミクロンレベルの細胞アイランドを形成することは、困難な工程であり得る。そのうえ、細胞アイランドを作る必要がある細胞および他の生物学的材料は、デリケートでありかつすぐに死滅しやすく、それによって、操作されている生物学的材料にとって痛烈でも、その他有害でもない操作技術を要求する。

数多くの技術が、基板に細胞アイランドを形成するために研究されてきた。これらの技術は、ガラス基板のフォトリソグラフィーによる化学的変形と、細胞材料を基板に運ぶ液体の滴を分配する小さな低温プリントヘッドを使用するジェットプリント技術とを含む。１つのそのようなプリント技術は、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのＤｉｇｉｌａｂ Ｃｏｍｐａｎｙによって製造および販売されているＣｅｌｌｊｅｔ ｃｅｌｌ ｐｒｉｎｔｅｒを含む。Ｃｅｌｌｊｅｔ ｐｒｉｎｔｅｒは、細胞を含む液体の小滴を分配する液体分配動作の一部として細胞を液体プリントする。小滴は、マイクロタイタープレート上に、またはマルチプレートに分配され得る。細胞アイランドを形成する他の技術は、マイクロコンタクトプリントと、レーザー指向細胞書き込み（ｌａｓｅｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌ ｗｒｉｔｉｎｇ）とを含む。直接のマイクロコンタクトプリントは、典型的に、構造化された安価なエラストマースタンプの使用を含み、そのスタンプは、通例、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で作られ、そのスタンプは、ミクロンスケールにおけるレリーフパターンを有する。これらのスタンプは、通例、対象の基板表面上に分子を平行に堆積させることを可能にする。接触中、ＰＤＭＳスタンプからの材料は、基板上に移動させられる。この移動は、スタンプ表面から基板への分子の能率的かつ通例素早い移動を要求する。１つのそのような技術は、Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｉｃｒｏ−ｃｏｎｔａｃｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｔｈｉｂａｕｌｔら、Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）３：７に説明されている。本参照文献に説明されるように、電子ビームリソグラフィーアプローチは、液体ＰＤＭＳが注がれ得るシリコーンマスターモールドをエッチングために使用された。液体ＰＤＭＳは、脱気されて、それから熱硬化され得る。ＰＤＭＳは、それから、マスターから取り外されることにより、表面の化学的性質に応じて、複数回使用され得るスタンプを提供する。スタンプのミクロンフィーチャーは、基板に接触して、接触点において基板上に材料をプリントする。工程の成功は、一部、エラストマースタンプが基板とうまく接触することにかかっている。

エラストマースタンプのミクロンフィーチャーと基板との間の物理的接触は、正確に、かつスタンプの全域で一貫してなされなけらばならず、そうでなければ、エラストマー材料は、エッチング工程中に適切なマスクとして働くことも、所望の材料を基板上にプリントすることもしない。一部だけの接触がなされ、その結果は、パターンの境界を正しく形成しているが、そのパターンの内側部分に対してうまい接触をなしていない「コーヒーリング」パターンであることは、時には事実である。正しいパターン形成の失敗は、試験または実験の計画が、従われることができないことを意味し、これは、パターニングされた基板が実験内で使用されることを妨げ得る。

したがって、改良されたマイクロコンタクトスタンプおよびスタンプ工程を提供するシステムおよび方法に対する技術のニーズがある。

（発明の概要）
本明細書中に説明されるシステムおよび方法は、特に、マイクロコンタクトスタンプを含み、そのマイクロコンタクトスタンプは、パターニングスタンプとして用いられることにより、マイクロタイタープレートのウェルの底部に細胞のパターンを形成し得る。本明細書中に説明されるマイクロコンタクトスタンプは、向上したウェル間およびプレート間の再現性を提供し、本明細書中に説明されるマイクロコンタクトスタンプは、一組のスタンピングポストを提供し、その一組のスタンピングポストは、互いに対して個々に動くことにより、基板表面とのより一貫した接触を達成し、それによって、向上した反復可能性および確実性を有する正確に形成された細胞パターンを生成し得る。他の局面において、本明細書中に説明されるシステムおよび方法は、プリントまたはマスキングによって細胞のパターンを形成する方法と、細胞のパターンを形成するスタンプを製造する方法とを含む。しかし、本明細書中に説明されるシステムおよび方法は、他の適した用途のために適合させられかつ変形され得ること、ならびにこれらの追加および変形は、本明細書の範囲から逸脱しないことが、理解される。

特定の実施形態において、システムは、基板の表面上に細胞のパターンを形成するデバイスを含む。デバイスは、ガイドプレートであって、そのガイドプレートは、上部表面と、下部表面と、プレートを通って延びかつ基板の表面上の位置に整列するように配列されている複数の開口部とを有する、ガイドプレートと、それぞれの開口部内にはめられた複数のポストと、弾性材料から形成された複数のパッドであって、その複数のパッドは、基板の表面に突き当たる隆起したプラトーのパターンを有し、その複数のパッドの各々は、それぞれのポストの遠位表面に固定されている、複数のパッドと、ポストをガイドプレート内に接続している弾性変形可能部材とを有し得る。

必要に応じて、デバイスは、力学的負荷をガイドプレートの上部表面にわたって加えるための、ガイドプレートの上部表面の上方に配置されたクランププレートも含み得る。クランプは、パッドを基板の表面に対してシールするように選択された力を用いて、クランププレートをガイドプレートに対して押しつけ得る。

いくつかの実施形態において、弾性変形可能結合部は、弾性的に変形可能な材料の区分を含む。弾性変形可能結合部は、ガイドプレートの上部表面の上方に配置されかつ必要に応じて付着した発泡体パッドを含み得、結合部の少なくとも一部のＩＬＤ（たとえば、発泡体パッドの最初の１０００分の５インチのＩＬＤ）は、ポストの遠位端上のパッドのパターンを変形させるのに要求される力よりも小さい。結合部は発泡体パッドであり得るが、開口部内へはめられた発泡体ボタン、開口部内にはめられたエアブラダー、ばねおよび他の力学的要素、または他の任意の適したメカニズムが、用いられ得る。

典型的に、いつもではないが、パッドは、基板の表面に突き当たる弾性マスクを含む。パッドは、生物学的材料を基板の表面に送達するプリントパッドであり得、パッドは、エッチングまたは洗浄工程中に、表面の一部をマスクするマスクであり得る。

必要に応じて、ガイドプレートは、プラズマガスを開口部内へ送達するために、開口部と流体的に連絡しているガスチャンネルを含む。ガイドプレートの開口部は、複数のポストを、複数ウェルマイクロタイタープレートのウェルと整列して配置するように配列され得る。ポストは、堅いアクリルポストを含み得、パッドはＰＤＭＳを含み得る。

いくつかの実施形態において、ポストは、ポストが、開口部を通過することを防ぐ維持部材を有する。

別の局面において、本発明は、細胞のパターンを表面上に形成するタイプのパターニングマスクを作る製造方法を含む製造方法を提供する。これらの方法は、所望のパターンを有し、かつ力学的力に対するいくらかの弾性を有する材料から作られているマスクを提供することと、マスクをポストの一端に取り付けることと、ポストがガイドプレート内に可動に配置されることにより、ポストの直線的な動きを可能にするように、ポストをガイドプレート内に挿入することと、ポストが、ガイドプレート内に圧縮可能層によって保持されるように、圧縮可能層をガイドプレート上に提供して、ポストに接触させることとを含み得る。

いくつかの実施において、方法は、マスクを変形させるのに要求される力よりも小さい力で弾性的に屈するように選択されたＩＬＤ（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｏａｄ ｄｅｆｅｃｔｉｏｎ）を有する圧縮可能層を選択することを含む。必要に応じて、複数のガスチャンネルは、プラズマガスを開口部内へ送達するために、開口部と流体的に連絡するように形成され得る。ポストは、マイクロタイタープレートのウェル内にはまるように選択された直径を有する堅い円筒形の部材として形成され得る。

さらなる局面において、本発明は、マイクロタイタープレートのウェル内に細胞のパターンを形成する方法を提供し、たとえば、その方法は、ガイドプレートであって、そのガイドプレートは、上部表面と、下部表面と、ガイドプレートから延びかつマイクロタイタープレートのウェルに整列するように配列された複数の開口部とを有する、ガイドプレートと、それぞれの開口部内にはめられた複数のポストであって、その複数のポストは、複数のポストの遠位端上に弾性パッドを有し、そのパッドは、細胞のパターンを形成する隆起したプラトーを有する、複数のポストと、ポストをガイドプレート内に接続している弾性変形可能結合部とを有するマイクロコンタクトスタンプを提供して、マイクロコンタクトスタンプをマイクロタイターウェル内にはめて、マイクロコンタクトスタンプをマイクロタイタープレートに対して押し込むクランプ力を加えることにより、パッドをマイクロタイタープレートのウェルの底部表面に対して押しつける。

そのような方法において、だれでも、弾性パッドに細胞を塗布して、パッドをウェルの底部表面に対して押しつけることにより、ウェルの表面上に細胞をプリントし得る。代替の実施において、だれでも、マイクロタイターウェルの底部表面に細胞付着材料を塗布して、開口部と流体的に連絡しているガスチャンネルをガイドプレートに形成して、ガスチャンネルを通して開口部内へプラズマガスを送達することにより、マイクロタイターウェルの表面から細胞付着材料をエッチングし得る。

本発明の他の用途および変形は、一部、自明であり、一部、本明細書中に示されるシステムおよび方法についての以下の説明から示される。

（図面の簡単な説明）
前記のことおよび本発明の他の目的および利点は、添付の図面を参照して、以下の本発明のさらなる説明からより完全に認識される。
図１は、本発明に従うマイクロコンタクトスタンプの一実施形態を描写する。 図２Ａは、図１のスタンプを異なる視点から描写する。 図２Ｂは、図１のスタンプのパッドの拡大図を描写する。 図３Ａ〜３Ｂは、図１に描写されたマイクロコンタクトスタンプの特定の別個の要素を描写する。 図３Ａ〜３Ｂは、図１に描写されたマイクロコンタクトスタンプの特定の別個の要素を描写する。 図４Ａ〜４Ｂは、１つのガイドプレートの概略図を描写する。 図６は、２４個のウェルのマイクロタイタープレート内にはめられた図１のマイクロコンタクトスタンプの側面図を描写する。 図７は、マイクロタイタープレートの表面に対して押しつけられているマイクロコンタクトスタンプの切断側面図を描写する。 図８は、エッチングされた基板領域によって囲まれた細胞アイランドを描写する。

（例証された実施形態の説明）
次に、本発明の全体の理解を提供するために、マイクロコンタクトスタンプシステムを含む特定の例証の実施形態が、説明され、そのマイクロコンタクトスタンプシステムは、パターニングスタンプとして使用されることにより、マイクロタイタープレートのウェルの底部にパターンを形成し得、そのマイクロタイタープレートは、向上したウェル間およびプレート間の再現性を提供するために使用される。一実施形態において、マイクロコンタクトスタンプは、一組のスタンピングポストを提供し、その一組のスタンピングポストは、互いに対して個々に動くことにより、基板表面とのより一貫した接触を提供し、それによって、向上した反復可能性および確実性を有する正確に形成された細胞パターンを生成し得る。しかし、本明細書中に説明されるシステムおよび方法は、他の適した用途のために適合させられかつ変形され得ること、ならびにそのような他の追加および変形は、本明細書の範囲から逸脱しないことが、当業者によって理解される。

本明細書中に説明されるように、マイクロコンタクトスタンプは、エッチング工程の間に、コーティングされた表面を覆いかつ保護するパターンマスクとして使用され、それによって、コーティングのパターンを表面に残し得る。次のステップにおいて、細胞が、コーティングに付着して、エッチング工程によって残されたパターンにおいて細胞のアイランドを形成するように、細胞は、パターン上で洗われ得る。あるいは、マイクロコンタクトスタンプは、細胞または他の材料を直接基板表面（たとえば、スライド、複数ウェルマイクロタイタープレートの底部壁、またはマルチプレート）上にプリントするために使用され得る。さらに他の使用および用途は、本明細書中に説明されるシステムおよび方法によって扱われ得る。

一実施形態において、マイクロコンタクトスタンプは、複数の開口部を有するガイドプレートを有する。ポストは、開口部の各々内へスライドし、ポストは、縁を一端に有し、その縁は、開口部よりも大きく、ポストが完全に貫いてスライドすることを防ぐ。弾性部材は、ガイドプレート上にはまり、弾性部材は、ポストが開口部内に保持されるようにポストを覆う。

使用において、マイクロコンタクトスタンプは、各ポストが、マイクロタイタープレートのそれぞれのウェル内にはまるように、マイクロタイタープレートの上方に整列させられて、マイクロタイタープレート内へはまり得る。ガイドプレートに加えられ、かつマイクロタイタープレートの底部表面の方へ下向きに指向された力は、ポストのそれぞれの端における弾性パッドを、マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルの底部表面と接触させる。各ポストが、マイクロタイターウェルの底部表面と接触する場合、マイクロタイターウェルの底部表面に対して加えられる力は、開口部の上方に配置された弾性部材の弾性特性によって、一部、調節される。一実施形態において、弾性部材は、連続気泡ポリウレタン発泡体の層である。この発泡体パッドの弾性特性は、連続気泡発泡体パッドのＩＬＤ（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｏａｄ ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）特性に関連づけられ得る。したがって、ポストがマイクロタイターウェルの底部表面に対して押す力は、そのポストをガイドプレートの開口部内に保持する発泡体パッド弾性部材のＩＬＤによって調節される。

図１は、マイクロコンタクトスタンプ１０の一実施形態を描写する。特に、図１は、複数のポスト１２を有するマイクロコンタクトスタンプ１０を描写し、その複数のポスト１２の各々は、ポスト１２の遠位端に設けられたそれぞれの弾性パッド１８を有する。各ポストは、ガイドプレート１４内の開口部（示されていない）内にはめ込まれる。弾性部材２０は、ガイドプレートの上方にあり、図１において、弾性部材２０は、材料（たとえば、連続気泡発泡材料、ラテックス材料、または他のいくつかの弾性材料）のパッドとして描写される。

描写されたポスト１２は、典型的に、堅い材料から形成され、描写されたポスト１２は、典型的に、アクリルから作られるが、任意の適した材料が、用いられ得る。図１に示されている実施形態において、複数のポスト１２があり、その複数のポスト１２の各々は、ガイドプレート１４における開口部を通してはまり、ガイドプレート１４から下向きに延びている。図２は、図１のマイクロコンタクトスタンプ１０を異なる視点から描写する。特に図２Ａは、上に向いている場合のポスト１２を示し、マイクロコンタクトスタンプ１０のさかさまの図を提示する。図２Ａは、ポスト１２が、ガイドプレート１４内に据えられて、行および列のマトリックスにおいて整列させられることを図示する。図２Ａに示されている行および列は、各ポスト１２が、マイクロタイタープレートのウェルのうちのそれぞれのウェル内にはまるように、選択されることにより、対応するマイクロタイタープレートのウェルに整列する。支柱ポスト１２は、図２に示されているような円筒形であり、ポスト１２の形状および幅は、ポスト１２が、マイクロタイタープレートの対応するウェル内にはまるように（好ましくは、ぴったりとはまるようにだが）選択される。図２Ａにさらに示されているように、弾性パッド１８の各々は、それぞれのポスト１２の遠位端上に中心を有する。各弾性パッド１８は、形が円形であり、約２〜３ミリメートルの厚さを有する。弾性パッド１８は、支柱ポスト１２の直径よりも小さい直径を有する。弾性パッド１８の特定の直径は、各マイクロタイターウェルの底部に形成される細胞アイランドの数に関連するので、弾性パッド１８の特定の直径は、用途の基準に従って選択される。そのうえ、弾性パッド１８のより小さな直径は、いくつかの実施形態において、リングが細胞アイランドの周縁部の周りに形成されることを可能にし、そのリングは、細胞およびマイクロタイタープレートの側壁からの間隔を提供し得、そのリングは、アイランド内の細胞が吸い上げ得る他の材料（繊維芽細胞、増殖培地、または他のいくつかの材料）を運び得る周縁部リングを必要に応じて含み得る。図２Ａは、ガイドプレート１４が、複数のエッチングガス行チャンネル２２およびエッチングガス列チャンネル２４を含むことをさらに描写する。この特定の実施形態において、マイクロコンタクトスタンプは、マスクとして用いられ、そのマスクは、エッチング工程の間に、プレート上の材料を覆う目的のために、エラストマー弾性パッド１８をマイクロタイタープレートの表面に対して押し、それによって、その材料をエッチング剤（典型的に、エッチングガス）から保護する。エッチングガスは、少なくとも一部、チャンネル２２および２４を通して導入され得る。これらのチャンネルは、ガスが、ガイドプレート１４の表面全域に流れて、マイクロタイタープレート内へ下ることを可能にし、弾性パッド１８によって覆われていないマイクロタイタープレートの底部表面の一部をエッチングする。図２Ａに描写されているスタンプ１０は、２４個のポストを有し、したがって、図２Ａに描写されているスタンプ１０は、２４個のウェルのプレートを用いた使用のために設計されている。しかし、他の実施形態において、スタンプは、９６個のウェル、３８４個のウェル、６１２個のウェル、または任意のサイズのマイクロタイタープレートのためのポストを有し得る。さらに、他の実施形態において、ポストは、代わりのウェルシャフトの一部分に合わせるための代替形状、またはウェルを有しないスライド、またはガラスまたはスチレンプレートを用いた使用のためのものであり得る。

弾性パッド１８は、典型的に、エラストマー（一般に、ＰＤＭＳ）である。一実施形態において、ＰＤＭＳ弾性パッドは、キャスティング工程によって作られ、そのキャスティング工程は、エッチング工程の間にマスクとしてはたらくスタンプとしてＰＤＭＳパッド１８を製作する。１つの特定の実施形態において、ＰＤＭＳ弾性パッド１８は、ＰＤＭＳ−ｓｙｌｇａｒｄ １８４ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｅｌａｓｔｏｍｅｒ ｋｉｔから作られる。エラストマーは、モールド内へ注がれ、エラストマーは、真空によってモールド内で脱気され、それから、ＰＤＭＳがその場で硬化することを可能にする。硬化後、ＰＤＭＳマイクロパターンシートが、モールドから取り外され得、個々のボタンが、打ち抜かれ得る。あるいは、個々のボタンは、個々にキャストされ、かつ／または取り外され得る。スタンプは、それから、ポスト１２の遠位端に付けられ得、モールドが、新たな弾性パッド１８を形成するために再び使用され得るように、モールドは、掃除されることにより、あとに残されたすべての硬化していないＰＤＭＳおよび材料を取り除く。

次に、パッド１８を形成するための１つの特定の工程が、説明される。この工程において、パッド１８は、約１２ｍｍの直径を有するエラストマーディスクとして形成され、パッド１８は、約４８のデュロメーターＳｈｏｒｅ−Ａスケールを有し得るが、任意の適した硬度が使用され得、選択された実際の硬度は、少なくとも一部、用途（たとえば、パッドが、マスクとして使用されているか、またはプリントスタンプとして使用されているか）によって決まる。間隔をあけられたプラトーのパターンが、パッド１８上に形成される。１つの特定の例において、各プラトーは、幅約５００ミクロン、高さ約１００ミクロンであり、プラトー間のピッチは、約１２００ミクロンである。１つのそのようなパッド１８は、図２Ｂに描写され、図２Ｂは、図２Ａに示されたポスト１２の端上のパッド１８のうちの１つのクローズアップ拡大図を示す。特に、図２Ｂは、プラトー２６のパターンを有する場合のパッド１８の表面を示し、各プラトー２６は、直径（Ｄ）約５００ミクロンであり、個々のプラトー２６間のピッチ（Ｐ）は、約１２００ミクロンである。これらの間隔および寸法は、例および例証の目的のためだけのものであり、決して制限するものであるとみなされない。使用において、プラトー２６は、マイクロタイタープレートウェルの底部表面に接触し、ウェルの底部に塗布された、表面に細胞が付着させられることを可能にするコラーゲン層、または他の生物学的または化学的物質または他の処理剤を覆う。リソグラフィーによってエッチングされたフィーチャーを有するシリコンウェーハマスターモールドを使用するパッド形成のための１つの例示工程が、下記に提示される。

シリコンウェーハマスターモールドを使用する、ウェルスタンプのＰＤＭＳキャスティングのための例示工程。

材料：ＰＤＭＳ−Ｓｙｌｇａｒｄ １８４ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ Ｋｉｔ；正味：．５ｋｇ；Ｔｅｆｌｏｎ９６および２４のウェルモールド、アルミニウムフォイル、波形プラスチック、６×６”ガラスプレート、ボアホールを有する６×６”ｍａｃｏｒセラミック、厚さ１／１６”の６×６”シリコーンラバー、トルエン７０％ＥＴｏＨ。

方法：前のキャスティングの後、各サイクル２０分の数サイクルにわたって、Ｂ１５００Ａ−ＭＴＨ ＶＷＲ超音波処理器における１インチのトルエンについての超音波処理によって、すべてのモールド部分を入念に掃除した。ねじを含めたすべてのモールド部分を衛生的にした後、いずれの残っているＰＤＭＳも、こすり落としたか、またはみがき落とした。いずれの残っているＰＤＭＳ粒子もモールドにおけるねじ穴から外へ吹き出すために、圧縮窒素を使用した。すべてのＰＤＭＳを、取り除く。超音波処理およびきれいなトルエンを用いた最後のすすぎ、それから拭いて乾かすことで、掃除を終える。それから、蒸気を取り除くためにＹａｍｏｔｏ ＡＤＰ−３１ ｖａｃｕｕｍにおいて、または部分的な真空のもと、すべての部分を、１００℃で数時間乾かす。

シリコンウェーハマスターモールドを、組み立てて、液体ＰＤＭＳを受け入れかつ硬化し得るモールドアセンブリにした。モールドを、水平な表面上に配置し、水平精度についてチェックした。ガラスプレートおよびセラミックプレートを、組み立ててクランプすることにより、ＰＤＭＳが注がれ得るモールドを形成する。１０：１の比率においてＰＤＭＳポリマーを提供された開始剤と混合した。混合物を、５分間遠心分離機にかけることにより、混合中に導入された空気を取り除いた。それから、ＰＤＭＳを、モールド内へ注ぎ、反復サイクルにおいて真空によって脱気した。視覚による検査が、シリコンマスターモールドのフィーチャーに閉じ込められたすべての空気／ガスが取り除かれたことを表示するまで、サイクルを、反復した。脱気後、キャスティングを、室温に一晩中置いた。一晩中の硬化後、キャスティングを、数時間の追加の硬化のために６０℃のオーブンに移動させた。それから、モールドを、室温まで冷まし、現時点で形成されかつ硬化されたＰＤＭＳスタンプを、注意して、モールドから取り外した。

一実施形態において、モールドを、直径１００ｍｍのシリコンウェーハから作成した。ウェーハに、ウェーハ表面の大部分を覆っているエッチングされた円形のウェルの密集した配列を提供した。一例において、ウェーハ厚さは、約０．４〜０．６ｍｍであった。円形のウェルは、直径約５００ミクロンであり、六方最密パターンにおける円の中心間が１２００ミクロンの均一な間隔を有し、１００ミクロンの深さまでエッチングした。一実施形態において、ウェーハ内で１．０ミクロンの深さ許容差を達成するために、ＳＯＩ（Ｓｉｌｉｃｏｎ ｏｎ ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）ウェーハを使用した。ウェーハの底部において埋められた酸化物層は、シリコンエッチング工程をしっかり止めることを提供した。滑らかなシリコン表面を残すために、埋められた酸化物層を、取り除き得る。

図１および２Ａから、ＰＤＭＳスタンプが、モールドから取り外されて、ポスト１２の遠位端に取り付けられ得ることをだれでも理解し得る。描写された実施形態において、ＰＤＭＳスタンプは、高さ約．３ｃｍおよび直径約１ｃｍの円筒形のボタンである。図２Ｂに示されているように、ＰＤＭＳスタンプの露出した表面は、間隔をあけられた複数のプラトーを含み、そのプラトーは、基板に接触して、ＰＤＭＳの残りを基板表面から分離する。

図１に戻ると、弾性部材２０が、側面図の視点から示されている。描写された弾性部材２０は、浮動するポスト１２の上方に配置された発泡体パッドである。一実施形態において、パッドは、ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ部品番号８６２３５Ｋ１７２によって製造された、背部が付着性のすぐれた弾性の厚さ半インチのパッドである。描写された実施形態において、弾性部材２０は、ガイドブロック１４の全上部表面を覆う。ポストが、ブロックから落下することができないように、および実際は、ポストが、１センチメートルの何分の１よりも大きく軸方向に動くことを抑制されるように、弾性部材２０は、ガイドブロック１４内にポスト１２を保持する。図７を参照して説明されるように、弾性部材の負荷たわみおよびチャンネル弾性特性は、各ポスト１２が、軸方向に動くこと、および開口部内で多少「浮動する」ことを可能にする。これは、ＰＤＭＳプラトーが、マイクロタイターウェルの底部表面との正確な物理的接触をより確実になすことを可能にする。

代替実施形態は、弾性発泡体栓を含み得、その弾性発泡体栓は、開口部内にはまり、ポストの上方およびソリッドプレートの下に位置する。本代替実施形態において、弾性栓は、ポスト１２とガイドプレートを覆っているプレートとの間に挟まれる。これは、ポスト１２が、弾性発泡体栓を押し、それによって抵抗する力を加えることを可能にし、その抵抗する力は、スタンプの下の任意の基板の表面の方へ下向きにポスト１２を押し込む。本実施形態において、発泡体栓によって加えられた弾性力は、パッド１８が基板表面に対して押される場合にパッド１８を変形させるのに要求される力よりも小さいように選択され、それによって、理論によって拘束されないが、基板表面上に形成されたパターンのゆがみを低減する。

図３Ａおよび３Ｂは、別個の要素としてガイドプレート１４およびポスト１２を描写する。図３Ａは、均等に間隔をあけられた複数の開口部２８を有する長方形のプラスチックプレートとしてガイドプレート１４を示す。描写された実施形態において、ガイドプレート１４は、２４個の開口部２８を有し、その開口部２８の各々は、２４個のウェルのマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに整列させられる。描写されたガイドプレート１４は、ポスト１２がガイドプレート１４内で軸方向に動く場合に、ポスト１２の横方向の動きまたは移動を低減するように選択された厚さを有する。そのような場合、ポスト１２は、マイクロタイタープレートの底部壁に直交する軸方向経路に沿ってガイドプレート１４によってガイドされる。ポスト１２は、その遠位端でパッド１８を運び、パッド１８の露出した表面は、マイクロタイターウェルの底部表面に実質的に平行である。したがって、ガイドプレート１４は、ポスト１２を軸方向に上下にガイドし、ガイドプレート１４は、パッド１８の露出した表面を、マイクロタイタープレートの底部表面またはマイクロコンタクトスタンプを用いて処理されている任意の基板表面と平行に接触させる。図３Ａにさらに示されているように、チャンネル２２および２４は、ガイドプレート１４の下側を通って、行および列として延びる。図３Ａに描写された各開口部２８は、複数のチャンネルエッジ３０を有する。各チャンネルエッジ３０は、チャンネル２２または２４を通って進むガスが、開口部内へ進んで結局はマイクロタイタープレートのウェル内へ下ることを可能にする。図３Ａに描写された実施形態において、チャンネルエッジが、異なる開口部にわたった流体の連絡を提供するように、各開口部２８は、４つのチャンネルエッジ３０を有し、その結果、プレートの下に流れるガスは、各開口部２８およびマイクロタイタープレートの各ウェル内へ進み得る。

図３Ｂは、１つのポスト１２を描写する。ポスト１２は、縁３２を有する円筒形の本体であり、その縁３２は、ポスト１２の主要な本体よりも大きな直径を有する。一実施形態において、ポスト１２は、アクリルから作られ、形が円筒形であるが、用いられる材料ならびにポストのサイズおよび形状は、考慮中の用途によって決まり、当業者は、ポストのサイズおよび形状を用途に適切なように変え得る。

図４Ａおよび４Ｂは、ガイドプレート１４の異なる視点からの概略図を提供する。図４Ａは、ガイドプレート１４の鳥瞰図を提供し、図４Ａは、ガイドプレート１４の表面全域で選択的かつ均等に間隔をあけられた２４個の開口部を示す。図４Ａに描写された実施形態において、ガイドプレートは、長さ約１３センチメートル、幅約９センチメートルである。各開口部は、直径約１．５センチメートルである。図４Ｂは、ガイドプレート１４の切断側面図を提示する。図４Ｂは、ガイドプレート１４を通して延びる開口部２８が、下部部分３８よりも大きい直径の第一の部分３４を有することを示し、上部部分３４は、シェルフ４０を提供し、そのシェルフ４０は、ポスト１４上の対応するシェルフに突き当たる。図４Ｂは、チャンネルエッジ３０をさらに描写し、そのチャンネルエッジ３０は、ガイドプレート１４の外部からガイドプレート１４の内部および別個の開口部２８内への流体の連絡を提供する。

図５は、本発明に従う１つのポストの概略図を描写する。

図５は、ポスト１２の断面側面図を概略的に図示する。特に、図５は、ポスト本体４２よりも大きな直径のポスト縁３２を含むポスト１２を示す。図５におけるポストは、長さ約１．１８センチメートルであり、ポスト本体４２について直径約．６センチメートルであり、より大きなポスト縁３２について直径約６．５センチメートルである。ポスト縁３２の底部端は、図４Ｂに示されたアクリルガイドプレート１４におけるシェルフ４０に突き当たり、それによって、ポスト１２が、図示されたガイドプレート１４において、図示されたガイドプレートの開口部２８を通過することを防ぐ。

描写された実施形態において、ポスト本体４２は、開口部２８内へスライドし、「エアギャップ」が、ポスト本体４２と開口部２８の側壁３８との間に存在するように、ポスト本体４２は、開口部２８にはまる。ギャップのサイズは、用途にしたがって変わり得るが、典型的に、ギャップは、チャンネル２２および２４を通過するエッチングガスが、チャンネルエッジ３０上を通って、ギャップを通過してマイクロタイタープレートの底部壁に至ることを可能にするほど十分に大きい。ギャップサイズは、約１．５ｍｍであり、ギャップサイズは、用途に応じて、．５ｍｍよりも小さくあり得る。だれでも、真空を引き込むことにより、ポストの周りのいずれの空気も抜き取り、それから基板表面に接触しているポスト間のギャップ内へ進むＯ_２を加え得、Ｏ_２は、プラズマによってイオン化されることにより、行われるエッチング工程のためのイオンを生成する。図２Ａを参照して上記で論じられたように、ポスト１２の遠位端上の弾性パッド１８は、ポスト本体４２の直径およびマイクロタイターウェル（示されていない）の直径よりも小さい直径を有する。これは、ガスを受け得る弾性パッドの周りに周縁部リングを提供する。一実施において、ガスは、ガラスまたはポリスチレン基板表面に置かれた材料をエッチングするために使用されるエッチングガスである。

代替実施形態において、ガスは、基板上に材料を堆積させるために堆積材料を運ぶキャリアーガスであり得るか、またはガスは、成長増強剤または栄養源を運び得るか、または成長増強剤または栄養源であり得る。他のタイプのキャリアーガスが使用され得、他の流体（たとえば、行われるエッチングが、イオン化されたガスとは対照的に液体エッチング剤によってなされる化学的工程であるので、通例プラズマフィールドの必要がないエッチング工程を行う液体化学薬品）も、使用され得る。

図６を見ると、上記に説明されたマイクロコンタクトスタンプが、描写され、マイクロコンタクトスタンプは、マイクロタイタープレート内にはまることにより、描写されたマイクロコンタクトプリントアセンブリ５０を形成する。特に、図６は、発泡体パッド５２、ガイドプレート５４、マイクロタイタープレート６０、およびポスト６２を描写する。パッド５２、プレート５４、およびポスト６２は、マイクロコンタクトスタンプ５６の一部であり、マイクロコンタクトスタンプ５６の一部は、マイクロタイタープレート６０内に、取り外し可能かつ取り替え可能に配置される。アセンブリ５０は、２つのクランププレート７０および７２の間に挟まれる。クランププレート７０および７２は、典型的に、アセンブリ５０の頂部および底部を完全に覆う平らな透明なアクリルプレートである。プレート７０および７２は、長方形であり、各角に圧縮ボルトのためのスロットがある。図６は、１つのそのような圧縮ボルト８２の側面図を描写し、明快さの目的のために、他のボルトは示されていない。

圧縮ボルト８２は、プレート７０および７２の両方におけるスロット（示されていない）を通過し、スラストワッシャー７８が上部プレート７０上にあり、ナット８０が底部プレート７２の下にある。描写されたボルト８７は、ボルト８２が手で容易に締められることを可能にするつまみねじの頭を有し、このように、２つのプレート７０および７２の間のアセンブリ５０を圧縮し、ポスト１２および弾性パッド１８をマイクロタイタープレート６０のそれぞれのウェルの底部表面に押しつける力を発生させる。他のクランプまたは押しつけデバイスは、スタンプ５２をマイクロタイタープレート６０内へ押し込むために使用され得、図６に描写されたクランププレート７０および７２は、用いられ得るシステムおよびデバイスのタイプの単なる例証である。

図７は、マイクロタイタープレート６０の底部基板壁９６に押しつけられている１つのポスト６２の断面図を描写する。特に、図７は、マイクロタイタープレート６０のウェル１００内のポスト６２を描写する。ポスト６２が底部基板壁９６に押しつけられる場合に、ポスト６２が圧縮プレート７０の方へ上向きに動くことが可能なように、ポスト６２は、ガイドプレート５４の開口部２８内で浮動する。図７にさらに描写されているように、弾性パッド９０は、複数の平らなパッド９２を含み、平らなパッド９２は、パッド９０上にパターンを形成し、平らなパッド９２は、同様に底部壁９６に接触し、基板底部壁９６上の同様のパターンを覆う。図示されているように、ポスト６２の頂部が、弾性パッド５２を押しかつ圧縮するように、ポスト６２は、開口部２８を通って上向きに動き得る。これは、図７において、パッド５２の誇張された圧縮部９８によって描写される。典型的な実施において、パッド５２は、ヒトの目が感知し得るよりも本質的に小さい量だけ圧縮する。パッド９２は、底部壁９６と選択的に接触させられる。典型的な実施形態において、各ウェル１００の底部表面９６は、互いに１０００分の１〜１０００分の２インチ以内にある。同様に、各ポスト６２、弾性パッド９０、および底部パッド９２についての許容差はまた、約１０００分の１インチである。したがって、ガイドプレート５４からプレート６０のウェルの異なる底部表面９２までの距離は、１０００分の１〜１０００分の３インチのオーダーで変わり得、その結果、それぞれの各ポスト６２は、パッド５２を同様の量だけ圧縮し得る。

図８Ａは、不十分に形成された細胞アイランドを描写し、図８Ｂは、適切に形成された細胞アイランドを描写する。図８Ａにおいて、細胞アイランドは、エッチングされたきれいな基板のリングによって囲まれ、そのリングは、今度は、細胞材料のフィールドによって囲まれている。対照的に、図８Ｂは、エッチングされたきれいな表面のフィールドによって囲まれている細胞アイランドを示す。図８Ａにおいて、細胞アイランド間に存在する細胞材料のフィールドは、弾性パッド９０が基板表面に接触していたか、またはその他、弾性パッド９０がその表面をエッチングガスから保護したことを表示している。どちらの場合も、結果は、エッチングガスが、細胞アイランド間から細胞材料を取り除かなかったことである。理論によって拘束されないが、図８Ａに図示されたエッチングの失敗は、ポスト６２が１０００分の１インチと１０００分の３インチとの間であった距離を遠く過ぎてウェル１００内へ押しつけられていることに起因するパッド９２および９０の過度の圧縮から生じることが理解される。この過大な填充は、エラストマーパッドを圧縮し、エラストマーパッドを変形させて、変形させられたパッドが、エッチング工程中に基板に接触して、基板を覆う原因となった。パッド９２を表面９６に適切に接触させるのに要求される正確さは、数千分の１インチの範囲内にあるので、弾性部材５４によって定位置に保持された浮動するポスト６２は、ばね力または負荷たわみ特性を提供し、ばね力または負荷たわみ特性は、たわみ負荷力がパッド９０および９２の変形力特性を超える前に、ポスト６２が、１０００分の数インチの距離、パッド５４内へ押し込まれることを可能にする。つまり、弾性パッド５４の負荷たわみ力は、変形させられたパッド９０および９２が、基板表面９６に、不適切に接触する（ほとんど接触しないか、接触しすぎるかのどちらか）原因となるほど十分な量、エラストマーパッド９０および９２を変形させるのに要求される力よりも小さいように選択される。

当業者は、ありふれた実験法のみを使用して、多くの本明細書中に説明された実施形態および実施と同等のものを知るか、または確かめることが可能である。

したがって、本発明は、本明細書中に説明された実施形態に制限されないが、本発明は、法のもと可能な限り広く解釈される以下の特許請求の範囲から理解されることが理解される。

Claims (20)

1. 基板の表面上に細胞のパターンを形成するデバイスであって、該デバイスは、
   ガイドプレートであって、該ガイドプレートは、上部表面と、下部表面と、該ガイドプレートを通って延びかつ該基板の該表面上の位置に整列するように配列された複数の開口部とを有する、ガイドプレートと、
   各々がそれぞれの開口部内にはめられた複数のポストと、
   弾性材料から形成された複数のパッドであって、該複数のパッドは、該基板の該表面に突き当たる隆起したプラトーのパターンを有し、該複数のパッドの各々は、それぞれのポストの遠位表面に固定された、複数のパッドと、
   該ポストを該ガイドプレート内に接続している弾性変形可能結合部と
   を含むデバイス。
2. 力学的負荷を前記ガイドプレートの前記上部表面にわたって加えるための、該ガイドプレートの上部表面の上方に配置されたクランププレートをさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記パッドを前記基板の表面に対してシールするように選択された力を用いて、前記クランププレートを前記ガイドプレートに対して押しつけるためのクランプをさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
4. 前記弾性変形可能結合部は、弾性的に変形可能な材料の区分を含む、請求項１に記載のデバイス。
5. 前記弾性変形可能結合部は、前記ガイドプレートの前記上部表面に付着した発泡体パッドを含む、請求項１に記載のデバイス。
6. 前記発泡体パッドの最初の１０００分の５インチのＩＬＤは、前記ポストの前記遠位端上の該パッドの前記パターンを変形させるのに要求される力よりも小さい、請求項５に記載のデバイス。
7. 前記パッドは、前記基板の表面上の生物学的材料に突き当たる弾性マスクを含む、請求項１に記載のデバイス。
8. 前記パッドは、生物学的材料を前記基板の前記表面に送達するプリントパッドを含む、請求項１に記載のデバイス。
9. 前記ガイドプレートは、プラズマガスを前記開口部内へ送達するために、該開口部と流体的に連絡しているガスチャンネルを含む、請求項１に記載のデバイス。
10. 前記ガイドプレートの開口部は、前記複数のポストを、複数ウェルマイクロタイタープレートのウェルと整列して配置するように配列されている、請求項１に記載のデバイス。
11. 前記ポストは、堅いアクリルポストを含み、前記パッドはＰＤＭＳを含む、請求項１に記載のデバイス。
12. 前記ポストは、該ポストが、前記開口部を通過することを防ぐ維持部材を有する、請求項１に記載のデバイス。
13. 細胞のパターンを表面上に形成するタイプのパターニングマスクを作る製造方法であって、該製造方法は、
    所望のパターンを有し、かつ力学的力に対するいくらかの弾性を有する材料から作られたマスクを提供することと、
    該マスクを、突出したポストの一端において該突出したポストに取り付けることと、
    該ポストが、ガイドプレート内に可動に配置されることにより、該ポストの直線的な動きを可能にするように、該ポストを該ガイドプレート内に挿入することと、
    該突出したポストが、該ガイド内に圧縮可能層によって保持されるように、該圧縮可能層を該ガイドプレート上に提供して、該突出したポストに接触させることと
    を含む、製造方法。
14. 前記マスクを変形させるのに要求される力よりも小さい力で弾性的に屈するように選択されたＩＬＤを有する圧縮可能層を選択することをさらに含む、請求項１３に記載の製造方法。
15. プラズマガスを前記開口部内へ送達するために、該開口部と流体的に連絡している複数のガスチャンネルを形成することをさらに含む、請求項１３に記載の製造方法。
16. マイクロタイタープレートのウェル内にはまるように選択された直径を有する堅い円筒形の部材として前記ポストを形成することをさらに含む、請求項１３に記載の製造方法。
17. マイクロタイタープレートのウェル内に細胞のパターンを形成する方法であって、該方法は、
    マイクロコンタクトスタンプを提供することであって、該マイクロコンタクトスタンプは、
    ガイドプレートであって、該ガイドプレートは、上部表面と、下部表面と、該ガイドプレートから延びかつ該マイクロタイタープレートの該ウェルに整列するように配列された複数の開口部とを有する、ガイドプレートと、
    それぞれの開口部内にはめられた複数のポストであって、該複数のポストは、該複数のポストの遠位端上に弾性パッドを有し、該パッドは、細胞の該パターンを形成する隆起したプラトーを有する、複数のポストと、
    該ポストを該ガイドプレート内に接続している弾性変形可能結合部と
    を有する、ことと、
    該マイクロコンタクトスタンプを該マイクロタイターウェル内にはめることと、
    該マイクロコンタクトスタンプを該マイクロタイタープレートに対して押し込むクランプ力を加えることにより、該パッドを該マイクロタイタープレートの該ウェルの底部表面に対して押しつけることと
    を含む、方法。
18. 前記弾性パッドに細胞を塗布することと、該パッドを前記ウェルの前記底部表面に対して押しつけることにより、該ウェルの該表面上に該細胞をプリントすることとをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記マイクロタイターウェルの前記底部表面に細胞付着材料を塗布することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
20. 前記開口部と流体的に連絡しているガスチャンネルを前記ガイドプレートに形成することと、
    該ガスチャンネルを通して該開口部内へプラズマガスを送達することにより、前記マイクロタイターウェルの前記表面から前記細胞付着材料をエッチングすることと
    をさらに含む、請求項１９に記載の方法。

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