JP2014508508A - リゾビウム・トロピシにより生産される生体高分子塩 - Google Patents

Abstract

本開示は農業用製品に関して土壌浸食、土壌汚染の防止および種子発芽の増大のための方法および組成物に関する。特定の方法は旱魃状態に耐えるように種子をコーティングすることに関する。他の方法は旱魃状態に対する耐性、または浸食防止、粉塵管理もしくは汚染土壌の浸食防止のための生体高分子を含む土壌組成物に関する。

Description

本発明の分野は一般に、リゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｉ）により生産される生体高分子塩に関する。さらに、本発明の分野はリゾビウム・トロピシにより生産される生体高分子塩を製造および使用する方法に関する。

旱魃は米国で他の自然災害よりも多くの人々に影響を及ぼすだけでなく、最もコストがかかり取扱いの難しい問題の１つでもある。これは旱魃自体の性質によるものである。旱魃は遅発的現象であり、その深刻度は多数の測定基準を用いて決定される。例えば、竜巻やハリケーンとは異なり、旱魃の影響は非構造的であり、極めて広範囲で、州や国の境界にわたることもあり、このことが評価や鎮静活動をより困難にしている。米国では農業での旱魃関連の損失は平均して年間６０億〜８０億ドルの間である。また、旱魃の長期化および重大化は気候変動モデルの一部と考えられる。都市部では芝生や庭の維持などの非農業的使用に大量の水資源を消費する。水資源が限られている自治体は、水不足の際には芝生への灌水を低減または削減する場合が多い。先進国は発展途上国よりも旱魃の緩和に掛けるための資源を多く持ってはいるが、旱魃に取り組む準備行動は同様に後手に回り、多大な社会的、経済的損害をもたらす。農業対策が不十分であれば旱魃などの自然災害からの経済的損害はしのぐことはできず、結局、農事業が置き去りにされるか、避けることがほぼ可能な借金の蓄積に直面することになる。

１つの重大な土壌保全問題が浸食である。土壌浸食は急傾斜地または丘陵地と砂地という２つの地形において最も重要である。都心の成長が主要な農地の広い面積を使ってしまう。農村人口が増えるにつれ、農業は急傾斜地形の上の斜面へと移動していき、常に浸食というマイナスの結果を伴うか、湿地帯へ侵入して同時に水文学にも影響を及ぼす。そこは砂質の耕作限界土壌であり、そこにはほとんどの場合、資金力の乏しい農家が手に負えない問題が存在する。このようなシステムの影響力は過去には無視できるほどに小さかったが、この状況は急速に変化している。人口増加とそれに伴う食糧需要が増えれば、耕作可能な作付けのためにストレスを受けた生態系の搾取が増大することになる。この見通しから、耕作限界の砂質土壌が、持続可能な方法で土壌を使用するために開発すべき農業および研究の次の新領域であると見ることは重要である。もしこれらが農業発展の次の新領域となれば、研究開発が取り組むべき挑戦は、これらの土壌を利用した農業の経済的生き残りである。

多くの国に砂質土壌があり、それらは現在耕作されている土地に比べて質は劣るが、おそらく急傾斜地または湿地帯よりははるかにましである。これらの土地に対するストレス因子としては、養分の欠乏、浸食の受けやすさ、保水力の低さ、および土壌の団粒性の低さが挙げられる。これらのストレス因子を最小のコストで補正できるということが、これらの耕作限界土壌を改良するための主要な駆動力となる。灌漑用水も多くの国では限りある資源である。時間が経つにつれ、この状況は土壌分解のために悪化し、この土壌分解がやがて土壌の性能を低下させる。食糧生産力を高めるために大規模灌漑計画を選択した国には一般に、乾燥および半乾燥環境での灌漑に伴う塩類集積および／またはアルカリ化によるリスクがある。世界の乾燥諸国では、その土地で食糧を生産することができないということに直面する以前に、水の供給が制限因子となるであろう。灌漑用水の使用を減らせば、農業慣行の健全性および持続性が改善されるであろう。さらに、土壌の健全性を改善すれば、生物燃料用のものをはじめ、耕作限界地で生育可能な作物の範囲が広がる。

国連ミレニアム・プロジェクトの重要な勧告の１つは、「小規模農家のための、化学肥料の無償または助成配給およびアグロフォレストリーによる、養分欠乏土壌の土地への土壌養分の大規模補充」である。先進国では、農業およびアグロフォレストリーにおいて合成肥料の使用が拡がっている。農業用肥料の２つの主成分が窒素とリンである。一般に、窒素は液肥散布機によって、必要量よりも過剰に土壌に施与される。リンの場合も同様に、固体の無機形態であるが、同じく極めて過剰な量が散布機によって施与される。余分なものは放流水への表面水の流出において可溶化と運搬に利用可能となり、地方および国家の生態系に対して多大な生態学的影響を持つ。合成肥料の使用はここ５０年着実に増加しており、ほぼ２０倍増加し、現在の増加率は毎年肥料２２００万トンである。土壌は毎年の施肥によってプラスの栄養収支を維持し続けている。過剰な肥料使用からの放流水中の窒素およびリンの増加は富栄養化と藻類の異常発生を招くことがあり、毒素が放出され、その地の生物相を維持する酸素が水から奪われる。これは作物収量の増大には極めて効果的ではあるが、過剰量の農業流出を招き、メキシコ湾に見られるような大規模な酸欠海域を作り出すことがある。これらの酸欠海域はあらゆる自然の野生生物に打撃を与え、影響を受けた領域を、極限状態で生存することができる限られた数種を除いたあらゆる種に致死的なものとする。必要なのは、土壌の質を改善し、生産性を引き上げ、環境に持続可能な長期的フットプリントを備え得る、土壌浸食および農業慣行に対する環境的に持続可能なアプローチである。現在の慣行では、適切な用法および手順をもってしても適切な方式でこれらの問題に取り組むことはできない。

旱魃に立ち向かうための１つのアプローチとしては、保水高分子の使用によるものがある。合成高分子も生体高分子もモノマー単位の繰り返しからなっている。基本構造とは化学組成と繰り返し単位の配列を表して用いられる。石油系モノマーを用いて製造された多くの合成高分子は単純で変化のない構造を持ち、一般に、繰り返し単位の配列が統計学的に制御されているランダム共重合体である。これに対して、多くの生体高分子は架橋（水素結合、疎水性会合、多価イオン配位などによる）によって機能的にコンパクトな形状に折りたたむことができる。この変化はその形状だけでなく、化学特性にも生じる。さらに、生体高分子は、特異性の高い官能基を提示する複雑なペンダント部分を持っている場合が多い。生体高分子に利用可能な単分散性の特異的構造は、多くの合成高分子に見られる多分散性のランダムな構造に優る明確な利点をもたらす。

リゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｉ）ＡＴＣＣ４９６７２は、目録に掲載されているマメ科植物の共生根粒菌である。リゾビウム・トロピシはまた、そのゲル様の細胞外高分子物質（ＥＰＳ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の生産に関しても知られている。リゾビウムにより生産される多くのＥＰＳは、グルクロン酸を含有する多糖類である。この構造にはいくつかの例外が報告されている。ＥＰＳの機能には、表面粘着、バイオフィルムへの細胞の自己粘着、保護バリアの形成、根の周囲の保水、および養分蓄積がある。

ＥＰＳまたは生体高分子は、繰り返しモノマーから構成される鎖様分子であるという点では合成高分子と同じである。しかしながら、Ｒ．トロピシにより生産された生体高分子（リゾビウム・トロピシ生体高分子［ＲＴＢＰ：Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｉ ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ］またはリゾビウム・トロピシのエキソポリサッカライド（または細胞外高分子物質）［ＲＴＥＰＳ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ］）は、それを合成的に誘導される石油系高分子よりも有利とする様々な化学的および物理的特徴を有する。合成高分子の合成は、従来、モノマーが適時に１つ高分子鎖に付加される連鎖重合およびモノマーの鎖が直接結合する逐次重合の２つの方法のうちの１つに従う。このような重合は、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ：ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ポリアミド６，６（ナイロン）、およびポリテトラフルオロエチレン（テフロン）のような一般的な石油化学製品をもたらす。合成重合には大量のエネルギーとコストのかかる原料を必要とし、腐食性の化学処理を含み、相当な量の温室効果ガスを排出する。世界の石油生産の８％もが原料として、または高分子製造にエネルギーを供給するために燃焼され、高分子の合成に回る。ＥＰＳは必要とするエネルギーが非常に少ない環境に優しい様式で製造することができる。さらに、生体高分子は生分解性である。合成高分子とは対照的に、生体高分子は従来の高分子よりも複雑で多様な構造を示す。ＲＴＥＰＳは建設、特に、発塵抑制、重金属溶出対策および土壌安定化に使用するために合成高分子を超えるその利点に関して検討されてきた。

土壌安定剤および発塵抑制剤であることに加え、生体高分子は農業および植物生長の有意な改善のための土壌改良剤としての実用的用途を有する。生体高分子は根の構造を劇的に増やし、節密度を高め、果実収量を増し、バイオマスの有意な増加をもたらす。従来、作物生産を増大させるために化学肥料が用いられ、１９世紀以来、農業慣行に広く用いられてきた。しかしながら、行き渡ったリン、窒素およびカリウムの農業適用は流出によって河川、湖および海を汚染するに至った。生態系の崩壊は、現在のメキシコ湾における災害などの、さらに、大規模な藻類の異常発生およびよく知られた死の海域の形で噴出した。さらに、肥料使用を増やしても農業生産性における同様の増大に値しなかった。実際、エーカー（４０４７ｍ^２）当たりの農業収量はここ１０年にわたって落ち続けている。従来の肥料のコストが増し、これらの資材の過剰使用からの汚染が増し、予見できる未来において問題が悪化するだけであるものと思われる。これらの肥料の使用に関連する栄養流出の増大とコスト増は、農業コミュニティーと環境にさらに打撃を与える方向に進むだけであろう。

リゾビウム・トロピシ由来のＥＰＳは独特な粘着性かつ保護力のあるバイオフィルムを形成する性質を持っている。ｅｘ ｓｉｔｕで「成長した」ＥＰＳの粘着性および保水性は、従来の技術が実施可能でない、また、環境に優しく、持続可能な化学物質使用の必要が高まっている状況で、粉塵および浸食対策に有用であり得る。粉塵および浸食対策に使用される従来の化学物質で最も効果的であることが分かっているものは、塗料工業の副産物に由来する。これらの副産物は、精製およびさらなる加工をしているうちに、毒性がいっそう高まり、環境蓄積をもたらす。それらの毒性は最初に用いられた際には、すぐには明らかにならないが、時間が経つにつれ、その蓄積が生態系への打撃をもたらす。さらに、生分解に要する時間枠はエンドユーザーの数世代を優に超える。このような時間枠のために、この資材はあらゆる実用目的で環境中に存続することになる。

ＥＰＳは広範な商用、医用および工業用の用途に使用するために検討されている。具体的な用途としては、廃水および天然水からの重金属の吸着、油に汚染された海砂中の多環芳香族炭化水素のバイオレメディエーション（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ；生物による環境汚染の修復）、および活性汚泥の処理が挙げられる。

Ｒ．トロピシ生体高分子を浸食耐性のある改良土壌の作出のために使用することができれば、最適農地でも名ばかりの農地でも作物収量を大幅に高めることができる。また、処理済みの農地から流出した表面水を受け取った領域における表面水の水質も向上する。

本開示の方法および組成物は、浸食の軽減、種子発芽の増大および農業生産の増大に使用するための生体高分子塩およびそれらの製造に関する。

特定の実施形態は、リゾビウム・トロピシの生命活動によって生産された少なくとも１種類の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）の生体高分子を含む塩を製造する方法、ならびにそれらから生産された塩に関する。

いくつかの実施形態によれば、本方法は、リゾビウム・トロピシの培養物を、水と第一の栄養素セットを含む容器に入れること（ここで、この第一の栄養素セットは少なくとも１種類の酵母、少なくとも１種類の糖、少なくとも１種類のリン酸カリウム、および少なくとも１種類の塩化カルシウムを含む）；該培養物を均一に混合されたリアクターにて好気的条件下、１８．３〜４０．６℃（６５〜１０５°Ｆ）の温度で維持すること（ここで、この好気的条件は少なくとも０．１ｍｇ／Ｌの溶存酸素レベルを含む）；この水−栄養素混合物を４〜８週間の培養期間で培養し、培養期間中に少なくとも１種類のフラボノイドおよび糖を含む少なくとも１回の追加栄養素を添加すること；培養済み材料のＥＰＳ濃度が、容器から取り出す前に必ず少なくとも４ｇ／Ｌとなっているようにすること；フラッシュ蒸発、凍結乾燥、回転蒸発、真空蒸留、スチーム蒸発、接触乾燥、煮沸、溶媒沈殿、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれかによって脱水混合物を生成すること；この混合物にアルカリ剤を、該混合物がｐＨ約９．５〜１３に達するまで添加して乾燥塩を回収することを含み得る。

他の実施形態によれば、本方法は、組成物を培養すること（ここで、この組成物はリゾビウム・トロピシの培養物、水、少なくとも１種類の酵母、少なくとも１種類の糖、少なくとも１種類のリン酸カリウム、および少なくとも１種類の塩化カルシウムを含み、培養は１８．３〜４０．６℃（６５〜１０５°Ｆ）の温度で行われ、培養は好気的条件で行われ、好気的条件は少なくとも０．１ｍｇ／Ｌの溶存酸素レベルを含み、培養は４〜８週間の培養期間で行われる）；培養期間中に組成物に少なくとも１回の追加栄養素を添加すること（ここで、少なくとも１回の追加栄養素は少なくとも１種類のフラボノイドおよび糖を含む）；組成物のＥＰＳ濃度が少なくとも４ｇ／Ｌになった時に組成物から培養済み組成物を回収すること；培養済み組成物をフラッシュ蒸発、凍結乾燥、回転蒸発、真空蒸留、スチーム蒸発、接触乾燥、煮沸、溶媒沈殿、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれかによって脱水すること；培養済み組成物にアルカリ剤を添加してｐＨを約９．５〜１３とすること；および培養済み組成物から塩を回収することを含み得る。

他の実施形態は、このようにして生産された塩を使用する方法に関する。
本開示の特定の実施形態は、リゾビウム・トロピシの生命活動によって生産された少なくとも１種類の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）の生体高分子の塩に関し、該乾燥塩は、リゾビウム・トロピシの培養物を水および栄養素の少なくとも１種類の容器に入れること；該培養物および水−栄養素混合物を、該培養物および水−栄養素混合物が９．５〜１３の範囲のｐＨに達するまで維持すること；および該混合物を脱水して脱水混合物を生成することによって製造される。

具体的実施形態では、脱水混合物は、培養物および水栄養素混合物の少なくとも１０重量％である。
具体的実施形態では、塩の作出に用いられる栄養素は、１種類以上のフラボノイドを含む。なおさらなる実施形態では、フラボノイドは、ブチン、エリオジクチオール、ヘスペレチン、ヘスペリジン、ホモエリオジクチオール、イソサクラネチン、ナリンゲニン、ナリンギン、ピノセンブリン、ポンシリン、サクラネチン、サクラニン、ステルビンまたはそれらの組合せを含む。具体的実施形態では、１種類以上のフラボノイドはナリンゲニンである。

特定の実施形態は、生体高分子の塩の製造に関する。
本開示の特定の実施形態は、種子を発芽促進剤としての生体高分子塩でコーティングすること、およびペレット化材に配合することを含む、種子発芽を増大させる方法に関する。

本開示の特定の実施形態は、土壌に生体高分子塩を加えて土壌の約０．２重量％〜約１０重量％の塩を含む土壌混合物を作出することを含む、種子発芽を増大させる方法に関する。

本開示の他の特定の実施形態は、土壌に生体高分子塩を加えて土壌の約０．２重量％〜約１０重量％の塩を含む土壌混合物を作出することによって土壌浸食を防止する方法に関する。

さらに、土壌浸食に関する本発明の特定の実施形態は、土壌に土壌の約０．２重量％〜約１０重量％の塩を混合することを含む、重金属汚染の防止に関する。
本発明の他の実施形態は、土壌に生体高分子塩を加えて土壌の約０．２重量％〜約１０重量％の塩を含む土壌混合物を作出することによって農業生産を増大させる方法に関する。特定の実施形態では、生体高分子塩は金属キレート剤である。具体的実施形態では、被キレート金属はアルミニウムである。他の実施形態では、生体高分子塩は土壌に０．１ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）〜２０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で加える。

本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、詳細な説明および具体例は本開示の具体的な実施形態を示しており、本開示の趣旨および範囲の中で様々な変更および改変が当業者には本詳細な説明から明らかとなるので、単に例として示されるものであると理解すべきである。

本発明のこれらのおよび他の特徴、態様および利点は、以下の記載および添付の特許請求の範囲、ならびに添付図面を参照すればよりよく理解できる。
いくつかの図面は種々の実施形態の機能的ブロックの概略図を示す。これらの機能的ブロックは必ずしも物理的成分の分割を示すものではない。種々の実施形態は図面に示されている構成および手段に限定されないと理解すべきである。

土壌に生体高分子を少量添加すると、無添加の場合よりも飽和土壌中の含水率が上がることを示す写真である。 時間に対する空気中への水分損失をプロットした図であり、生体高分子で処理した土壌の空気中への水分損失は非処理の土壌サンプルに比べて少ないことを示す。 種々の原料で生産した生体高分子の分子量に対する保持時間をプロットした図であり、生体高分子の特性がリゾビウム・トロピシに供給された原料によって変化したことを示す。 コーンシロップ、廃糖蜜およびマルトースに基づく生体高分子の赤外スペクトルを示す。 土壌に０．２重量％の生体高分子を添加した場合に、種々の生体高分子画分により８５％相対湿度雰囲気中の空気から取り込んだ水分を示す図である。 中規模降雨ライシメータの概略図である。 実弾射撃試験系の写真である。 実弾射撃試験系（ＬＦＬ）の２枚の写真であるが、試験土壌を充填していないＬＦＬと充填したＬＦＬを示している。 毎週１０Ｌの水を１０週間加えることによって米国北東部の年間降雨を１０週間模擬した降雨事象を伴う実弾射撃試験系を示す写真である。 浸出・流出水中の金属およびその他の汚染物の濃度を測定することによって汚染土壌に対する降雨の影響を分析するために用いた静的ライシメータの一連の写真である。 １年の模擬風化後に対照（非処理）土壌および生体高分子で改良した土壌からの下層浸出・流出水で検出された総鉛（Ｐｂ）量を示す図である。 １年の模擬風化後に対照（非処理）土壌および生体高分子で改良した土壌からの上層浸出・流出水で検出された総鉛（Ｐｂ）量を示す図である。 斜面安定性ボックスを示す写真である。左は非改良対照セル、右は０．２％生体高分子セル。 シルト質土壌型（黄土）が生体高分子の添加率の増加に伴って土壌の「崩落」（赤線で示す）の減少および安定性の増大を示すことを示した一連の写真である。 土壌型および生体高分子の添加率による損失量を示す図である。 非処理対照に対する、生体高分子で改良した土壌の表面の耐久性および浸食耐性の写真比較である。 対照と生体高分子で改良したＡＰＧ土壌（シルト質粘土）からの浸出・流出水中のＴＳＳの比較を示す図である。 非処理盛土における、非処理対照に対する重量％としての土壌損失を示す図である。 対照盛土と生体高分子で処理した盛土の総懸濁固体量（ＴＳＳ：total suspended solids）を示す図である。 非処理または生体高分子で処理した種々の土壌の盛土中に留まっている重量を時間の関数として示す図である。 模擬風化期間２．５年で盛土の流出水および浸出水中の総懸濁固体量により測定した際の堆積物損失の減少を示す図である。 ３種類の添加率および３種類の相対湿度にて生体高分子で処理したシルト質砂土壌からの損失量を示す図である。 漸増添加率の生体高分子で処理した土壌からの表面流出水の出現を示す写真である。 生体高分子で処理した土壌および非処理土壌に関する、５０番ふるい上に保持される土壌量（０．２９７ｍｍより大きい粒子）を比較した２つの図を示す。 毎週６回の降雨事象にわたって消失した斜面安定性土壌量を示す図である（生体高分子の添加率を変えた２つの土壌型から３．５か月に相当）。 含水率０％にて種々の添加率の生体高分子塩で改良したシルト質砂土壌の乾燥圧縮降伏応力を示す図である。 含水率８％にて種々の添加率の生体高分子塩で改良したシルト質砂土壌の湿潤圧縮降伏応力を示す図である。 模擬旱魃状態下での生体高分子コーティングおよび非コーティングの植物生存率を示す図である。 旱魃状態下で生体高分子（左）および非コーティング（右）から生育した植物を示す一連の写真である。 生体高分子でコーティングした種子と非コーティング種子（対照）の間の発芽率（％）の比較を示す図であり、種子発芽率および旱魃耐性に対する生体高分子コーティングの効果を示す（Ａは発芽率であり、Ｂは生存率である）。 生体高分子コーティングの存在は植物生存率を４２％高めたが、生存率は生体高分子コーティングの量によって影響を受けなかったことを示す図である。 植物が成熟に達し、果実を付けたところで、１．５週間水を断ったことを示すグラフを示す図である。 植物の根量（重量）もまた、生体高分子で改良した土壌では非改良対照よりも増加することを示す図である。 非処理対照の、植え付け後１週間および植え付け後３週間の植物生長を示す一連の写真である。 生体高分子で処理した場合の、植え付け後１週間および植え付け後３週間の植物生長を示す一連の写真である。 生体高分子合成ワークフローの概略ブロック図を示す。 スイートハラペーニョペッパー圃場試験において無作為に選択した株のおよその位置の概略図である。 対照のエーカー（４０４７ｍ^２）当たりの収量は４７３ｋｇ（１０４２．６ポンド）であったのに対し、生体高分子で処理したスイートハラペーニョペッパーのエーカー（４０４７ｍ^２）当たりの収量は５５９ｋｇ（１２３３．３ポンド）であり、１８．３０％増加したことを示す図である。 スイートハラペーニョペッパーの２回目の収穫において、対照の収量が２８４ｋｇ（６２５．１ｌｂｓ）／エーカー（４０４７ｍ^２）であり、生体高分子で処理した植物では３３８ｋｇ（７４４．３ｌｂｓ）／エーカー（４０４７ｍ^２）であったことを示す図である。 スイートハラペーニョペッパーにおいて対照と生体高分子で処理したものの根量の比較を示す図である。 対照１区と生体高分子処理１区の２試験区において生産されたローマトマト果実の箱詰め（binned）重量のヒストグラムを示す。 植物の生活環の間に記録されたローマトマト１株当たりの果実数を示す図である。 記録されたローマトマト１果当たりの質量を示す図であり、生体高分子で処理した株では１０．９％増を示した。 生育６週目の対照株に比べた処理株における、トマト株の物理的測定値を示す図である。 生体高分子で処理したものと対照ローマトマト株との特徴の比較を示す図であり、処理株では植物の生長力の改善が見られる。 ２回の商用収穫期の間の処理株と対照株のトマト株収量を示す図である。 ２回の商用収穫期の間の処理株と対照株のトマト株平均果実数を示す図である。 対照株と処理株のロメインレタス収量を示す図であり、処理株では３６３％増を示す。 対照に従って生産されたレタスの根と本発明の処理を施したレタスの根を並べて比較したものであり、処理株では微細な構造の著しい増加が見られる。 バミューダグラス試験１日目の２区画を示す。 バミューダグラス試験８日目の各区画を２種類の距離から撮影した写真を示す。 バミューダグラス試験１３日目の各区画を２種類の距離から撮影した写真を示す。 バミューダグラス試験１６日目の各区画を２種類の距離から撮影した写真を示す。 バミューダグラス試験２日目の各区画を２種類の距離から撮影した写真を示す。 バミューダグラス試験２０日目のコアサンプルの写真を示す。 対照領域および処理領域の双方で２０日後のバミューダグラス試験領域の無作為な領域から採取したコアサンプル当たりの平均バイオマスを示す図である。 バミューダグラス試験２９日目の各区画の写真を示す。 ２９日後のバミューダグラス試験領域の無作為な領域から採取したコアサンプル当たりの平均バイオマスを示す図である。 ２９日目の非処理のバミューダグラス根と処理したバミューダグラス根の写真を示す。 ３９日目の非処理のバミューダグラス根と処理したバミューダグラス根の写真を示す。 ３９日目のバミューダグラスのコアサンプル当たりの平均バイオマスを示す図である。 ５７日目のバミューダグラスのコアサンプル当たりの平均バイオマスを示す図である。 処理した、また非処理のレタス種子に関して２４時間後および４８時間に発芽した種子のパーセンテージを示す図である。 模擬旱魃下で処理した、また非処理のトマト株およびズッキーニ株により生産された果実量を示す図である。 処理した、また非処理のトマト株の根におけるアルミニウム濃度を示す図である。 処理した、また非処理のダイズの根におけるアルミニウム濃度を示す図である。 処理した、また非処理のレタスの根におけるアルミニウム濃度を示す図である。 スイスチャード、ケンタッキービーン、綿、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、およびキュウリを含む種々の対照種子および生体高分子で処理した種子に関して１０日後の発芽率の比較を示す図である。 ８本の非処理スイートハラペーニョペッパー対照サンプルに対して８本の処理したスイートハラペーニョペッパーサンプルでは根量および微細構造が増加したことを示す一連の写真である。 生育６週間後に撮影した写真であり、植物の生育周期の初期段階での有意な改善および応答を示すために、左に非処理ダイズ区、右に処理ダイズ区を示す。 ダイズ圃場試験の結果を示す図であり、処理区画と非処理区画の区画当たりの平均収量（３区画の平均）を示す。

本発明は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明ならびにその中に含まれる例を参照すればより容易に理解することができる。全ての数値は、明示されているいないに関わらず、本明細書では、「約」という用語によって修飾されるものとする。この「約」という用語は一般に、当業者が挙げられている値と等価である（すなわち、同じ機能または結果を有する）とみなす数値範囲を表す。多くの場合、「約」という用語は、最も近い有効数字にまるめられる数を含み得る。

種々の実施形態は、リゾビウム・トロピシの生命活動によって生産された少なくとも１種類の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）の生体高分子を含む塩に関する。この塩はＥＰＳをある下限および／または上限を有する範囲内の量で含み得る。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、および１０重量％の塩から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、塩は０．８〜８重量％のＥＰＳを含む。

他の実施形態は、塩を生産する方法および本発明の方法によって生産された塩に関する。一実施形態によれば、この塩は組成物を培養することを含むプロセスによって生産することができ、ここで、この組成物はリゾビウム・トロピシの培養物、水、少なくとも１種類の酵母、少なくとも１種類の糖、少なくとも１種類のリン酸カリウム、および少なくとも１種類の塩化カルシウムを含む。

該組成物は、ある下限および／または上限を有する範囲内の量の水を含み得る。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、および９９重量％から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、組成物は９４〜９９重量％の水を含み得る。

該組成物は、ある下限および／または上限を有する範囲内の量の少なくとも１種類の酵母を含み得る。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、および０．３重量％から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、組成物は０．０５〜０．２重量％の少なくとも１種類の酵母を含み得る。

該組成物は、ある下限および／または上限を有する範囲内の量の少なくとも１種類の糖を含み得る。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、１．０５、１．１、１．１５、１．２、１．２５、１．３、１．３５、１．４、１．４５、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、１．８、１．８５、１．９、１．９５、および２重量％から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、組成物は０．１０〜１重量％の少なくとも１種類の糖を含み得る。

該組成物は、ある下限および／または上限を有する範囲内の量の少なくとも１種類のリン酸カリウムを含み得る。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、および５重量％から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、組成物は０．５〜３重量％の少なくとも１種類のリン酸カリウムを含み得る。

該組成物は、ある下限および／または上限を有する範囲内の量の少なくとも１種類の塩化カルシウムを含み得る。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９、および０．０２重量％から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、組成物は０．００１〜０．０１重量％の少なくとも１種類の塩化カルシウムを含み得る。

培養はある下限および／または上限を有する範囲内の温度で行うことができる。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は１０、１２．８、１５．６、１８．３、２１．１、２３．９、２６．７、２９．４、３２．２、３５、３７．８、４０．６、４３．３、４６．１、４８．９、および５１．７℃（５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、および１２５°Ｆ（Fahrenheit））から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、培養は１８．３〜４０．６℃（６５〜１０５°Ｆ）の温度で行うことができる。

培養は好気的条件で行うことができる。好気的条件はある下限および／または上限を有する範囲内の溶存酸素レベルを含み得る。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、および８ｍｇ／Ｌから選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、好気的条件は少なくとも０．１ｍｇ／Ｌの溶存酸素レベルを含み得る。特定の実施形態によれば、好気的条件は少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ〜水が酸素で飽和する飽和レベルまでの溶存酸素レベルを含む。

培養は、ある下限および／または上限を有する範囲内の持続期間を有する培養期間で行うことができる。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、および８０日から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、培養は約４〜８週間の培養期間で行うことができる。特に好ましい実施形態によれば、培養期間は約６週間すなわち約４２日であり得る。

特定の実施形態によれば、培養工程中に、ＥＰＳはある下限および／または上限を有する範囲内の割合で生成させることができる。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、および１５ｇ／週から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、培養工程中に、ＥＰＳは１ｇ／週〜１０ｇ／週の速度で生成される。

特定の実施形態によれば、本方法はさらに、培養期間中に組成物に少なくとも１回の追加栄養素を添加することを含み、ここで、この少なくとも１回の追加栄養素は、少なくとも１種類のフラボノイドおよび少なくとも１種類の糖を含む。特定の実施形態によれば、フラボノイドはブチン、エリオジクチオール、ヘスペレチン、ヘスペリジン、ホモエリオジクチオール、イソサクラネチン、ナリンゲニン、ナリンギン、ピノセンブリン、ポンシリン、サクラネチン、サクラニン、ステルビン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。特定の好ましいフラボノイドはナリンゲニンである。

特定の実施形態によれば、本方法はさらに、組成物のＥＰＳ濃度がある下限および／または上限を有する範囲内になった時に組成物から培養済み組成物を回収することを含む。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｇ／Ｌから選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、本方法はさらに、組成物のＥＰＳ濃度が少なくとも４ｇ／Ｌとなった時に組成物から培養済み組成物を回収することを含む。

特定の実施形態によれば、本方法はさらに、フラッシュ蒸発、凍結乾燥、回転蒸発、真空蒸留、スチーム蒸発、接触乾燥、煮沸、溶媒沈殿、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれかによって培養済み組成物を脱水することを含む。接触乾燥が特に好ましい。

特定の実施形態によれば、培養済み組成物は組成物の重量と比例した重量を有し、この培養済み組成物はある下限および／または上限を有する範囲内にある。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は、元の組成物の重量の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０重量％から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、脱水工程後に培養済み組成物は組成物の少なくとも１０重量％となる。

特定の実施形態によれば、本方法はさらに、培養済み組成物にアルカリ剤を添加してある下限および／または上限を有する範囲内のｐＨとすることを含む。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、１１．９、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、１２．９、１３、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、１３．９、および１４から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、本方法はさらに、培養済み組成物にアルカリ剤を添加してｐＨを約９．５〜１３とすることを含む。

特定の実施形態によれば、アルカリ剤は水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、およびそれらの組合せからなる群から選択される。特定の実施形態によれば、アルカリ剤は生成工程の前に添加される。特定の実施形態によれば、アルカリ剤はある下限および／または上限を有する範囲内の量で添加することができる。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７重量％から選択することができる。例えば、特定の好ましい実施形態によれば、０．０５〜５重量％のアルカリ剤の塩が添加される。

最後に、特定の実施形態によれば、本方法はさらに、培養済み組成物から塩を回収することを含む。他の実施形態は、下記のように、該塩を用いる方法に関する。
別の実施形態は、リゾビウム・トロピシの生命活動によって生産された少なくとも１種類の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）の生体高分子を含む塩に関する。乾燥塩は０．８〜８重量％のＥＰＳを含み得る。他の実施形態は該乾燥塩を生産する方法、ならびに該方法によって生産された塩に関する。例えば、上記のような乾燥塩は、水および第一の栄養素セットを含む組成物にリゾビウム・トロピシの培養物を添加することを含むプロセスによって生産することができ、この第一の栄養素セットは少なくとも１種類の酵母、少なくとも１種類の糖、少なくとも１種類のリン酸カリウム、および少なくとも１種類の塩化カルシウムを含み得る。いくつかの実施形態によれば、該組成物は９４〜９９重量％の水、０．０５〜０．２重量％の少なくとも１種類の酵母、０．１０〜１重量％の少なくとも１種類の糖、０．５〜３重量％の少なくとも１種類のリン酸カリウム、および０．００１〜０．０１重量％の少なくとも１種類の塩化カルシウムを含み得る。

本方法はさらに、該組成物を均一に混合されたリアクターにて好気的条件下、１８．３〜４０．６℃（６５〜１０５°Ｆ）の温度で維持することを含むことができ、この好気的条件は少なくとも０．１ｍｇ／Ｌのリアクター内溶存酸素レベルを含み得る。好気的条件は少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ〜水が酸素で飽和する飽和レベルまでの溶存酸素レベルを含み得る。

次に、本方法は、４〜８週間の培養期間で、好ましくは６週間の培養期間で水−栄養素混合物を培養すること、および培養期間中に少なくとも１種類のフラボノイドおよび糖を含む少なくとも１回の追加栄養素を添加することを含み得る。フラボノイドはブチン、エリオジクチオール、ヘスペレチン、ヘスペリジン、ホモエリオジクチオール、イソサクラネチン、ナリンゲニン、ナリンギン、ピノセンブリン、ポンシリン、サクラネチン、サクラニン、ステルビン、およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましくは、フラボノイドはナリンゲニンであり得る。

本方法はまた、培養済み材料のＥＰＳ濃度が、容器から取り出す前に必ず少なくとも４ｇ／Ｌとなっているようにすることも含み得る。
本方法のいくつかの実施形態はまた、フラッシュ蒸発、凍結乾燥、回転蒸発、真空蒸留、スチーム蒸発、接触乾燥、煮沸、溶媒沈殿、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか、好ましくは接触乾燥によって脱水混合物を生成することを含む。このＥＰＳ生成工程は１ｇ／週〜１０ｇ／週の速度で行うことができる。脱水混合物は培養物および水栄養素混合物の少なくとも１０重量％を占め得る。

本方法はさらに、この混合物にアルカリ剤を、該混合物がｐＨ約９．５〜１３に達するまで添加して乾燥塩を回収することを含み得る。アルカリ剤は生成工程の前または後に添加することができる。アルカリ剤は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態によれば、０．０５〜５重量％のアルカリ剤の塩が添加される。

現在のところ、土壌浸食および農業および植物生育適用において現行使用されている石油系高分子よりも生体高分子の多くの利点がある。例えば、生体高分子を使用すれば、非重合モノマーなどの有害生成物および副生成物の漏出を止めることができる。他の利点としては、外国産の石油への依存減が含まれる。生体高分子の成分はほとんどの土壌に天然に存在し、環境に良いと考えられる。

土壌にＲＴＢＰを少量添加すると、添加しない場合よりも飽和土壌に捕捉される超過水のパーセンテージが増える。図１は、土壌にＲＴＢＰを少量添加すると、添加しない場合よりも飽和土壌に捕捉される超過水のパーセンテージが増えることを示す。より具体的には、図１は、生体高分子を含まない第一の容器１０１、１重量％の生体高分子を含む第二の容器１０２、および３重量％の生体高分子を含む第三の容器１０３を示す。第一の容器１０１は、第一の水相１０４と第一の飽和土壌相１０５を含む。第二の容器１０２は、第二の水相１０６と第二の飽和土壌相１０７を含む。第三の容器１０３は、第三の水相１０８と第三の飽和土壌相１０９を含む。第二の飽和土壌相１０７は、第一の飽和土壌相１０５よりも１５．５重量％多い水を含む。第三の飽和土壌相１０９は、第一の飽和土壌相１０５よりも３８．５重量％多い水を含んでいた。従って、飽和土壌に１重量％の生体高分子を加える特定の実施形態では、飽和土壌にさらに１５．５％の水が存在する。土壌に３重量％の生体高分子を加える他の実施形態では、飽和土壌にさらに３８．５％の水が存在する。

本開示の特定の実施形態では、保水を考える場合、図２に示されるように、ＲＴＢＰで処理された土壌の空気中への水分損失が非処理土壌サンプルに比べて少なくなる。要するに、砂壌土のトレイを準備し、秤量した。ある特定のトレイの土壌に本発明の材料を土壌の０．２重量％混合した。各トレイに同じ重量の水を加え、土壌を過飽和とした。余分な水をトレイから出し、完全飽和とした。次に、トレイを２８℃の制御環境チャンバーに入れた。各トレイの質量を長期間記録した。各記録から結果としての重量を残留水分含量として計算した。図２は３回の分析の平均である。旱魃状態では、長期間にわたる高い保水力が、そうでなければ枯死してしまうおそれのある植物の生存率を高くするよう保証することができる。このような高い生存率は旱魃に関連する打撃を緩和する助けとなり、さらに、市場向きの、おそらくは収益のある作物を生産し得る。このような保護的手段がなければ、全作物および年間収益が失われるおそれがある。

本発明の選択的実施形態では、細菌リゾビウム・トロピシがex situで生体高分子を生産し、これが細菌培養物から回収され、土壌に加えられると工学特性が改善される。例えば、ＥＰＳに特定の官能基を付加すると重金属キレート剤ならびに浸食／粉塵対策剤となる。リゾビウム・トロピシＥＰＳに修飾を行うと、使用現場において水で再構成することができる輸送可能な製品が製造できる。さらに、本発明の選択的実施形態では、土壌に０．１乾重％加えると、リゾビウム・トロピシＡＴＣＣ４９６７２により生産された細胞外多糖類（ＥＰＳ）は、土壌の透水係数を３桁引き下げる。

本発明の選択的実施形態では、リゾビウム・トロピシＡＴＣＣ４９６７２により生産されたＥＰＳに行った修飾により、溶液から沈殿し、再水和によりその元の形態へ戻すことのできる乾燥塩が得られる。１つの成果は、例えば震動したり湿潤／乾燥周期を受けたりするなど、土壌が乱された場合にも、その場に留まってさらなる共有結合を作り出す土壌改良剤である。さらに、少量の生体高分子を加えると、元の改良適用で達成されるものに等しいか、またはそれを超えるレベルにまで土壌強度を高めるアミド形成縮合反応を生じさせることができる。

選択的実施形態では、水和型ＲＴＢＰ塩を種子のコーティングに使用すると、少ない水やりで高い発芽率が得られる。さらに、実生を人工的旱魃に曝すと、生体高分子コーティング種子から生育した植物は、非コーティング種子の場合よりも旱魃状態に対する耐性が有意に高くなる。生体高分子塩を土壌に混合すると、表面水流出中の懸濁固体の減少によって測定されるように、表面浸食が減少する。また、ＲＴＢＰ塩を使用すると、温度休眠が有意に弱まり、従って、全ての種子の、自然温度範囲外で発芽する能力が高まる。

選択的実施形態では、リゾビウム・トロピシ生体高分子塩は新規な方法によって製造され得る。特定の実施形態では、該塩はフラボノイドの使用によって製造され得る。特定の実施形態では、任意のフラボノイドを使用可能である。フラボノイドの例としては、限定されるものではないが、２−フェニルクロメン−４−オン（２−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造から誘導されたフラボノイド、３−フェニルクロメン−４−オン（３−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造から誘導されたフラボノイドまたは４−フェニルクマリン（４−フェニル−１，２−ベンゾピロン）構造から誘導されたフラボノイドが挙げられる。具体的なフラボノイドとしては、ケルセチン、エピカテキン、ヘスペリジン、ルチン、ナリンゲニン、ルテオリン、アピゲニン、タンゲリチン（ｔａｎｇｅｒｉｔｉｎ）、ケンフェロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、ミリセチン、フィセチン、イソラムネチン、パキポドール、ラムナジン、エリオジクチオール、ホモエリオジクチオール、タキシフォリン、ジヒドロケンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、ゲニステイン、ダイゼイン、グリシテイン、カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）、３−没食子酸カテキン（Ｃｇ）、３−没食子酸ガロカテキン（ＧＣｇ））、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、３−没食子酸エピカテキン（ＥＣｇ）、３−没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣｇ）、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジンまたはペチュニジンが挙げられる。特定の選択的実施形態では、本生体高分子塩の生産に使用されるフラボノイドは、ブチン、エリオジクチオール、ヘスペレチン、ヘスペリジン、ホモエリオジクチオール、イソサクラネチン、ナリンゲニン、ナリンギン、ピノセンブリン、ポンシリン、サクラネチン、サクラニンまたはステルビンの１つ以上を含み得る。なおさらなる実施形態では、フラボノイドはナリンゲニンである。

フラボノイドの使用が意図されるこのような実施形態では、生体高分子塩の生産は所望により参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる米国特許第７，８２４，５６９号に記載されているようなエタノールを含む工程を除いてもよい。さらにまた、生体高分子塩の濃縮は脱水によるものでもよい。特定の実施形態では、生体高分子塩は、生体高分子塩を生産するために使用するリアクターから取り出された際に脱水される。特定の実施形態では、脱水は、バイオリアクターから取り出された、生体高分子塩を含有する非脱水溶液に比べて容積を約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％減じる。例えば、脱水は容積を約７５％減じることができる。

本開示のいくつかの実施形態は、上記の塩を使用することによる農業および植物生育の改善を含む。本開示の他の実施形態は、上記の塩を使用することによる土壌浸食および粉塵対策を含む。本開示のさらなる実施形態は、上記の塩を使用することによる金属のキレート化を含む。

いくつかの実施形態は、種子を本塩で発芽促進することによって１つ以上の種子の休眠を軽減する方法に関する。いくつかの実施形態は、１つ以上の種子のコーティングまたはペレットに本塩を配合することによって１つ以上の種子の休眠を軽減する方法に関する。

いくつかの実施形態は、土壌に本塩を加えて土壌の約０．２重量％〜約１０重量％の塩を含む土壌混合物を作出することを含む、種子の発芽を増大させる方法に関する。いくつかの実施形態は、種子を本塩でコーティングすることを含む、種子の発芽を増大させる方法に関する。本開示の選択的実施形態は、種子の発芽を増大させる、または生体高分子塩による金属のキレート化によって食糧を増産する方法に関する。アルミニウムの毒性は、世界の耕作適地の半分を超える土地で農業生産性を著しく制限する世界的な農業問題である。この問題は、酸性土壌が多い発展途上国の大部分で特に重大である。アルミニウムの存在と植物成長の低さに関する１つの仮説は、アルミニウムが根茎のいくつかの対象に結合して細胞分裂を遮断し、ＤＮＡに傷害を与え、最終的に植物成長を中断させるというものである。もう１つの仮説は、ＡｔＡＴＲと呼ばれる植物細胞内の因子があり、これが植物に過剰なアルミニウムからの傷害を警戒させ、成長を停止するための、内蔵されているＤＮＡ監視系として機能するというものである。

いくつかの実施形態は、土壌に本塩を加えて土壌の約０．２重量％〜約１０重量％の塩を含む土壌混合物を作出することによって土壌浸食を防止する方法に関する。土壌浸食の防止は重金属汚染を防ぐことができる。本開示の選択的実施形態は、生体高分子塩を用いた土壌浸食の防止によって重金属汚染を軽減する方法に関する。特定の実施形態では、生体高分子塩はある下限および／または上限を有する範囲内の量で土壌と混合すればよい。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、１．０５、１．１、１．１５、１．２、１．２５、１．３、１．３５、１．４、１．４５、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、１．８、１．８５、１．９、１．９５、２、２．０５、２．１、２．１５、２．２、２．２５、２．３、２．３５、２．４、２．４５、２．５、２．５５、２．６、２．６５、２．７、２．７５、２．８、２．８５、２．９、２．９５、３、３．０５、３．１、３．１５、３．２、３．２５、３．３、３．３５、３．４、３．４５、３．５、３．５５、３．６、３．６５、３．７、３．７５、３．８、３．８５、３．９、３．９５、４、４．０５、４．１、４．１５、４．２、４．２５、４．３、４．３５、４．４、４．４５、４．５、４．５５、４．６、４．６５、４．７、４．７５、４．８、４．８５、４．９、４．９５、５、５．０５、５．１、５．１５、５．２、５．２５、５．３、５．３５、５．４、５．４５、５．５、５．５５、５．６、５．６５、５．７、５．７５、５．８、５．８５、５．９、５．９５、６、６．０５、６．１、６．１５、６．２、６．２５、６．３、６．３５、６．４、６．４５、６．５、６．５５、６．６、６．６５、６．７、６．７５、６．８、６．８５、６．９、６．９５、７、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５、７．５、７．５５、７．６、７．６５、７．７、７．７５、７．８、７．８５、７．９、７．９５、８、８．０５、８．１、８．１５、８．２、８．２５、８．３、８．３５、８．４、８．４５、８．５、８．５５、８．６、８．６５、８．７、８．７５、８．８、８．８５、８．９、８．９５、９、９．０５、９．１、９．１５、９．２、９．２５、９．３、９．３５、９．４、９．４５、９．５、９．５５、９．６、９．６５、９．７、９．７５、９．８、９．８５、９．９、９．９５、および１０重量％から選択することができる。例えば、流域への汚染土壌の浸食を防ぐためには、生体高分子塩を生体高分子約０．０１％〜約１０％の量で土壌と混合すればよい。具体的実施形態では、生体高分子は土壌の総重量の約０．２〜約１％を占める。

いくつかの実施形態は、土壌に本塩を土壌の０．１重量％〜３重量％の量で加えることによって、農作物および緑化地における旱魃状態を緩和する方法に関する。本開示の特定の実施形態は、土壌の保水を高めることに関する。具体的実施形態では、土壌は生体高分子塩をある下限および／または上限を有する範囲内の量で含み得る。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、および１０重量％から選択することができる。例えば、土壌は、土壌の保水に用いるために約０．５重量％〜約１０重量％の生体高分子塩を含み得る。他の実施形態では、生体高分子の組成は土壌の約１重量％〜約４重量％の間である。乾燥環境において保水が望まれる特定の実施形態では、土壌は約０．２重量％の生体高分子を含み得る。

いくつかの実施形態は、土壌に本塩をある下限および／または上限を有する範囲内の量で加えることによって農作物および緑化地における旱魃状態を緩和する方法に関する。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、および２００ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）から選択することができる。例えば、いくつかの好ましい実施形態は、土壌に本塩を２ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）〜１１０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で加えることによって農作物および緑化地における旱魃状態を緩和する方法に関する。

いくつかの実施形態は、土壌に本塩を加えてある下限および／または上限を有する範囲内の量の塩を含む土壌混合物を作出することによって農業生産を増大させる方法に関する。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は土壌混合物の０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、および１５重量％から選択することができる。例えば、いくつかの好ましい実施形態は、土壌に本塩を加えて土壌の約０．２重量％〜約１０重量％の塩を含む土壌混合物を作出することによって農業生産を増大させる方法に関する。

いくつかの実施形態は、土壌に本塩をある下限および／または上限を有する範囲内の量で加えることによって農業生産を増大させる方法に関する。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、および２５ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）から選択することができる。例えば、いくつかの好ましい実施形態は、土壌に本塩を０．１０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）〜２０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で加えることによって農業生産を増大させる方法に関する。本塩は金属キレート剤であり得る。金属はアルミニウムであり得る。

いくつかの実施形態は、土壌に本塩をある下限および／または上限を有する範囲内の量で加えることによってマメ科植物の根粒形成を増大させる方法に関する。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、および２５ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）から選択することができる。例えば、いくつかの好ましい実施形態は、土壌に本塩を０．１ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）〜２０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で加えることによってマメ科植物の根粒形成を増大させる方法に関する。

いくつかの実施形態は、土壌に本塩を土壌の０．１重量％〜３重量％の割合で加えることによって植物生長を回復させるために金属汚染土壌を改良する方法に関する。
いくつかの実施形態は、土壌に本塩をある下限および／または上限を有する範囲内の量で加えることによって、土壌浸食を防止するために草を活着させる方法に関する。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、１．０５、１．１、１．１５、１．２、１．２５、１．３、１．３５、１．４、１．４５、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、１．８、１．８５、１．９、１．９５、２、２．０５、２．１、２．１５、２．２、２．２５、２．３、２．３５、２．４、２．４５、２．５、２．５５、２．６、２．６５、２．７、２．７５、２．８、２．８５、２．９、２．９５、３、３．０５、３．１、３．１５、３．２、３．２５、３．３、３．３５、３．４、３．４５、３．５、３．５５、３．６、３．６５、３．７、３．７５、３．８、３．８５、３．９、３．９５、４、４．０５、４．１、４．１５、４．２、４．２５、４．３、４．３５、４．４、４．４５、４．５、４．５５、４．６、４．６５、４．７、４．７５、４．８、４．８５、４．９、４．９５、および５ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）から選択することができる。例えば、いくつかの好ましい実施形態は、土壌に本塩を０．１ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）〜２ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で加えることによって、土壌浸食を防止するために草を活着させる方法に関する。

さらなる実施形態では、本発明の改良はある下限および／または上限を有する範囲内の割合で施すことができる。この範囲はその下限および／または上限を含んでも含まなくてもよい。下限および／または上限は０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、および２０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）から選択することができる。例えば、本発明の改良は農業成長を増進するために０．０５ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）〜２０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で適用することができる。

実施例
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を示すために含められる。当業者は、以下の実施例に開示される技術は本発明の実施において十分機能することが本発明者らによって見出された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができると考えるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を鑑みて、開示されている具体的な実施形態に多くの変更をなすことができ、なお本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく好ましいまたは同等の結果を得ることができると考えるべきである。以下の実施例は例として示されるものであり、これに限定されるものではない。

実験１：生体高分子の生産
プロセスの変更は生体高分子の構造および官能性を変化させることが見出されている。コーンシロップ、マルトース、ソルガムおよび廃糖蜜の４種類の糖源をリゾビウム・トロピシによる生体高分子の生産の原料として試験した。異なる糖源を用いると、異なる化学的相対性および官能基を有する生体高分子が生じることが見出されている。異なる炭素源から生産された生体高分子間の物理的違いには色および質感の変化が含まれた。化学的に違いはフーリエ変換赤外分光分析法（ＦＴ−ＩＲ）およびゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて検討した。重金属の安定化のためには、水中の土壌粒子の移動と重金属の運搬を減じるために吸着された金属と土壌粒子の周囲で生体高分子が架橋することが重要である。図３は、リゾビウム・トロピシに供給した原料に基づいて変化した生体高分子の特性を示す。

減衰全反射光学セルとともにＦＴ−ＩＲを用い、３種類の生体高分子（全てリゾビウム・トロピシを３つの異なる炭素源とともに用いて生産した）の化学的官能性を評価した。図４はコーンシロップ、廃糖蜜およびマルトースに基づく生体高分子の赤外スペクトルを示す。

コーンシロップは、マルトース高分子で見られたものよりも多いアルコール官能基を有するマルトース成長材料と同等のカルボン酸含量を生じた。コーンシロップは主としてグルコース単位を含む。廃糖蜜は、マルトースまたはコーンシロップに基づく材料よりも多くのカルボン酸基を生じ、コーンシロップ原料生体高分子で示されたものとおよそ同程度のアルコール官能基化であった。サトウキビ廃糖蜜中の糖はより複雑な組合せであり、４％グルコース、７％フルクトース、および３１％スクロースから構成される。

ＦＴ−ＩＲデータは、陽子を得て他の生体高分子鎖との架橋を受けるとますます大きな高分子単位を作る本生体高分子塩の能力を示し得る。アミン部分と陽子を得たカルボン酸基との反応による炭素−窒素共有結合の形成は、生体高分子塩としての生体高分子サンプルとｐＨ低下後の同じ生体高分子塩を比較することによって見て取れる。

ゲル浸透クロマトグラフィーは固定相として用いる膨潤高分子に対する個々の相対的サイズに基づいて個々の分子を分離するので、材料の保持時間と分子量の間に相関を見出すことができる。サイズ排除カラムでのゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて、コーンシロップ、およびモラセスシュガー原料で成長させた生体高分子塩の分子量画分の分布を調べた。結果を図３に示す。各ＲＴＢＰは成分の、異なる、独特な分子量分布を示した。例えば、廃糖蜜由来生体高分子は、極めて小さい分子量範囲（およそ１５０Ｄａ）とそれよりずっと大きい８００Ｄａ範囲の双方の成分を示した。他方、コーンシロップ由来ＢＰは、より多数の小分子量成分（１００〜２００Ｄａ）を示した。これらの特徴はまた、回分時間および回分式リアクターの共鳴時間（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｔｉｍｅ）にわたる原料投入量に依存する。

生体高分子を生成する１つの方法として、ナリンゲニンなどのフラボノイドの使用によるものがある。この方法では、リゾビウム・トロピシの増殖向けに培養液が開発される。培養液を作製するには、２０Ｌの水に以下の成分：１）２０ｇの酵母；２）５０ｇの糖、例えばマンニトール；３）１９０．２ｇのＫＨ_２ＰＯ_４；４）１０ｇのＫ_２ＨＰＯ_４；５）２．０ｇのＭｇＳＯ_４；６）３ｇのＣａＣｌ_２および０．００１３ｇのフラボノイドであるナリンゲニンを添加する。

この培養液をオートクレーブにかけ、蒸煮しない温度まで冷却されたところで、それをリアクターに加え、すぐにリゾビウム・トロピシを加えることができる。生体高分子リアクターのｐＨがおよそ１１となった後（低くて９．５、高くて１３であり得る）、次にこの材料を乾燥させて、最初の容積より最大約９０％前後少ない容積のスラリーとすることができる。この工程を、米国特許第７，８２４，５６９号（参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる）のエタノール抽出工程の代用とすることができる。

実験２：ＲＴＢＰの分画
処理中、エタノール：水比が異なれば質感および色の物理的特徴が異なる生体高分子塩が生じることが見出された。このことは廃糖蜜から生産された生体高分子で特に明白であり、これはまたＧＰＣに２つのピークを持っていた。このことは生体高分子のサイズ画分が異なる可能性を示し、それらはまた化学的特定も異なり得る。

分離工程は、２つ以上の成分の溶液を組成の異なる２つ以上の生成物に分離する任意の操作の組合せである。分画とは、ある量の混合物がそれより少量の複数種（画分）（勾配に従って組成が異なる）に分割される分離プロセスである。画分は個々の成分の具体的特性の違いに基づいて収集される。このプロセスは、多くの異なる石油製品を形成するために石油およびガス工業によって油の分画に首尾よく活用されてきた。１９５０年代に開発された溶媒に基づく分画は、食品工業で融解特性の異なる脂肪を生産するために使用されてきた。生物燃料の開発への関心の高まりととともに、有機溶媒に基づく分画技術（有機溶媒プロセス（ｏｒｇａｎｏｓｏｌｖ ｐｒｏｃｅｓｓ））を用いたセルロースおよび他の生物燃料資源の分画が広く受け入れられるようになった。

生体高分子の分画、特に流動場分画は、新しく、拡大している領域の技術である。流動場分画は、混合物中の種々の成分の移動度の違いによって分離を行うために混合物に混合物流と垂直に流動場をかけるという分離技術である。この流動場は重力、遠心分離、磁気、温度または直交流であり得る。

Ｒ．トロピシにより生産されるＥＰＳ生体高分子の親水性のために、明澄化および脱水したバイオリアクター生成物中に存在する他の化合物から生体高分子を分離するのに有用な方法は、溶液にエタノールを加え、この時に極性が低くなった溶媒混合物から親水の生体高分子を分離するというものである。この研究では、種々の特性および挙動を有するＲＴＥＰＳ画分を生産するために、明澄化および脱水したバイオリアクター生成物中の生体高分子の相対的疎水性および分子量を、エタノール：水比の低い溶媒に基づく分画スキームとともに用いた。明澄化および脱水したバイオリアクター生成物から生体高分子を分離するためにエタノール：水比の低い溶液を用いる場合、エタノール：水比のより高い溶液から分離されるＲＴＥＰＳに比べて低い保水特徴を有する分子量の大きな高分子が得られる。

実験２：材料
分画プロセスのバルク溶液として使用するために水に溶かした廃糖蜜由来生体高分子の濃混合物を調製した。エタノールを種々の量で用いて水から種々の生体高分子画分を分離した。分画は、リアクターとしての混合プレート上に設置した７．６リットル（２ガロン）バケツの使用を見込んだ小規模で行った。この小規模設計では、溶液から固体を分離するために緩慢な重力沈降プロセスの代わりに遠心機を使用することもできた。

バルク生体高分子溶液は、まず、８０リットルの生体高分子をエタノールに６０％の比率で混合することによって調製した。この混合物から生じた固体を一晩沈降させ、溶液から分離し、高ｐＨ（ｐＨ＞１２）の少量の水に溶かした。これを十分に混合し、生体高分子水の濃溶液を作製した。

各２リットルの濃生体高分子バルク溶液を用いて３つの分画プロセスを同時に行った。この溶液から、３０、４０、５０、および６５％比のエタノール：生体高分子を用いて４つの画分を作出した。これらの画分はエタノール比率が最低のものから最高のものの順で行った。３０％比のエタノールは、バルク生体高分子溶液に０．８５リットルのエタノールを加えることによって作出した。この混合物を固体が存在しなくなるまで十分に混合した。この比率のエタノールによって水から遊離させた生体高分子画分を遠心機を用いて混合物から分離した。デカントした液体残留物を全て合わせて７．６リットル（２ガロン）バケツに戻し、次の比率のエタノールを加え、このプロセスを繰り返した。

前の画分の沈降工程からの残留デカントに漸増容積のエタノールを混合し、遠心機を用いた沈降プロセスを繰り返すことにより、以下の各画分を作出した。各工程で加えたエタノールの容積を表１に示す。

３０％混合物から得られた画分は予想されたよりもずっと大容積であったが、４０、５０、および６５％混合物では生じた生体高分子は極めて少容積であった。このことは、比率の高い画分からの生体高分子の大部分が３０％画分の沈降段階の間に捕捉されたことを示す。これらの種々の画分をさらに分離するために、３０％エタノール比率から得られた生体高分子固体をｐＨ＞１２の３リットルの水に溶かし、３．８リットルの生体高分子混合物を作製した。その後、同じ比率のエタノールを用い、この混合物に対してこれらの分画工程を繰り返し、生体高分子の３０、４０、５０、および６５％画分を得た。このプロセスによって種々の画分をさらに分離することができ、比率の高い画分から得られた生体高分子の容積が多かった。これらのさらなる量の生体高分子をそれぞれ、事前に得られたそれらの容積に加えた。表２は各画分を得るために加えたエタノール容積を示す。

３０％混合物から固体を分画するこのプロセスをさらに１回繰り返し、確実に生体高分子画分が完全に分離されるようにした。この段階のために、事前に３０％混合物から回収された生体高分子固体をｐＨ＞１２の水に溶かして２．５リットルの生体高分子混合物とした。表３は各画分を得るためにこの混合物に加えたエタノール容積を示す。

得られた生体高分子画分を、純粋エタノールを混合し、その液体をデカントすることを数回繰り返して乾燥させた。エタノールは生体高分子から水を遊離させ、過剰水を固体から取り除くことができる。これらの固体を５５℃の炉に入れ、乾燥プロセスを完了させた。完全に乾燥したところで、サンプルをプラネタリーミルを用いて摩砕し、ホモジナイズして最終生成物とした。

静的ライシメータと実弾射撃ライシメータの双方で浸出・流出水の総懸濁固体（ＴＳＳ；ｔｏｔａｌ ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｓｏｌｉｄｓ）および濁度を測定した。Ｈａｃｈ ＤＲ／２００分光光度計を用いてサンプルのＴＳＳおよび濁度を分析した。これらのサンプルを、懸濁固体の場合には８１０ｎｍで、濁度の場合には４５０ｎｍで読み取った。

総（消化物）金属は、ＵＳ ＥＰＡ ＳＷ−８４６メソッド３０１５（１９９９）に従い、消化した後に水性サンプル（浸出・流出水）について測定した。溶解した金属は、サンプルを０．４５マイクロメートルフィルターで濾過した後に測定した（メソッド３０１０、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＰＨＡ）１９９８）。分析はＰｅｒｋｉｎｓ Ｅｌｍｅｒ Ｏｐｔｉｍａ ３０００（ＳＷ−８４６メソッド６０１０）またはＰｅｒｋｉｎｓ Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ ６０００（ＳＷ−８４６メソッド６０２０）のいずれかで誘導結合プラズマ（ＩＣＰ；Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ）を用いて行った。

図５は、種々の生体高分子画分（土壌に０．２重量％の生体高分子を添加）を用いた場合に８５％相対湿度雰囲気下で空気中から獲得した水分を示す。
実験３：盛土式小銃射撃場
重金属流去の範囲は水および空気の双方による土壌浸食に関係し、広範囲の維持管理を必要とし、そのコストは７０億ドルに相当することが知られている。金属汚染塵は軍隊の潜在的健康問題でもある。訓練および試験に使える時間を最大にする持続可能であって、なお環境上適正な方式で軍事施設を管理することができるということは、フル稼働の十分に訓練された戦力を維持するという重要な側面である。懸念される軍需品の金属としては、鉛、アンチモン、クロム、銅、鉄および亜鉛その他がある。これらの金属が土壌中に存在すると、水質および金属の敷地外流出に関連する多数の環境問題を生じる。

小銃弾薬は一般にＰｂ^２＋合金であり、主としてＰｂ^２＋からなり、少量のアンチモン（Ｓｂ−硬化剤）およびその他の金属を含み、銅（Ｃｕ）および亜鉛（Ｚｎ）薬莢／ジャケットに覆われている。米国環境保護庁（ＵＳＥＰＡ；Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ）は、１９９０年代後半では、米国で生産された全鉛２０億トンのうちおよそ１億６千万ポンドが銃弾または鉛弾の製造に充てられたと見積もっている。いくつかの金属は流出および／または浸出水中の懸濁固体に関連するようになる。これらの懸濁固体物質は土壌の間隙構造中にコロイド状、および場合によっては陽イオンまたは陰イオン金属として混入する。２０を超える小銃射撃場での試験では、ＳＡＦＲ（ｓｍａｌｌ ａｒｍｓ ｆｉｒｉｎｇ ｒａｎｇｅｓ）を離れた鉛の大部分は流出表面水中に懸濁固体として存在することが示された。これにより、土壌構造を通じた浅い地下水面などの地表下の水への垂直移動が見込まれる。やがて、これらの物質は水から沈降し、最初にそれらの軍需品金属が堆積した問題の領域よりも著しく広い領域に拡がる。重金属を含む粉塵も軍隊の潜在的健康問題である。重金属の敷地外流出をなくし、汚染された堆積物の域外流出を軽減することは、小銃射撃場（ＳＡＦＲ）施設の管理の一環である。

ＳＡＦＲを長期間使用すると、標的内およびその付近に堆積した使用済み弾薬から鉛汚染が起こる。金属は離散粒子（完全な銃弾または弾丸、および破片）、金属塩（風化産物）、および溶解金属または土壌基質に吸着された金属複合体の形態で存在する。鉛の９６％を超えるものが完全な銃弾または弾丸またはその破片として存在することが報告されている。その区域の構造にもよるが、標的または衝撃盛土の周囲の土壌を高速で貫く鉛銃弾は衝撃の際にガラス化して、個々の土壌粒子上に「融解部」を形成し得る。その後、金属はいくつかの方法で土壌と相互作用し得る：１）土壌の粒子物質の表面との相互作用（吸着）；２）特定の夾雑物との相互作用（化学吸着と呼ばれる反応）；３）無機および有機配位子との相互作用による錯体の形成；および４）無機土壌成分（例えば、炭酸塩、硫酸塩、水酸化物、硫化物）との相互作用による沈殿またはイオン複合体の形成。

表面土壌中の元素に曝された鉛弾薬は最終的に酸化して可溶性のイオン形態となることを示している研究者もいる。
活動中のＳＡＦＲからの鉛の流出を管理するために最適管理慣行（ＢＭＰ；Ｂｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）が提案されている。これらには、雨水流出を管理する植生法、雨水を管理するための物理的方法、盛土設計の変更、ジオシンセティック（ｇｅｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）素材の使用、土壌から大きな銃弾破片を除去するための物理的分離技術、および土壌改良が含まれる。自然土壌改良には、土壌への石灰、鉄またはリン酸塩の添加が含まれる。これらの化学物質は土壌中での鉛の腐食を軽減し、吸着によって土壌間隙水に鉛イオンを結合するか、または鉛イオンの沈殿および比較的不溶性の鉛種の形成を促進する。

土壌の光学的特性を効率的に改良することができるということは、現行の軍事上の法則に直結する。Ｒ．トロピシ生体高分子塩を用いた試験では、本生体高分子を軍需品成分（例えば、鉛、アンチモンなどの金属）に汚染された射撃場の土壌と混合すると、浸出水中に放出される金属量が少なくなることが示された。生体高分子安定剤を使用すれば石油に基づく材料への依存度が減り、長期に渡る足跡は残らない。生体高分子は、現在用いられている石油化学系高分子土壌添加剤の有効な代替物となることが示された。

実験３：材料および方法
静的中規模降雨ライシメータを用いて、静的条件下で表面流出水と浸出水の双方において生体高分子が重金属流出を軽減することができるかどうかを評価した。静的ライシメータ中の土壌を混合炭素源原料から生産した０．２％生体高分子で改良した。対照を非改良土壌とした。各ライシメータには毎週降雨処理を施した。

動的実弾射撃ライシメータを用いて、実弾射撃実行後に生体高分子が表面水流出と浸出水中への重金属流出を軽減することができるかどうかを評価した。実弾射撃ライシメータ中の土壌をコーンシロップ、廃糖蜜またはソルガム供給原料のいずれかから生産した０．２％（ｗ：ｗ）の生体高分子で改良した。実弾射撃を受けなかった非改良土壌と毎週実弾射撃を受けた非改良土壌の２つの対照を用いた。全てのライシメータには毎週降雨処理を施した。

両試験からの浸出・流出水の重金属および総懸濁固体量（ＴＳＳ）を分析した。
実弾射撃ライシメータ中の土壌における金属の不動化に最も成果があることが分かった生体高分子を有機溶媒および遠心分離手順を用いて分画し、分子量の大きい画分を得た。これらの画分を分析し、サイズ排除ゲル浸透クロマトグラフィーによって分子量分布を比較した。実弾射撃ライシメータ試験で、これらの画分の土壌において金属混入盛土を安定化させる能力を比較した。浸出・流出水の重金属およびＴＳＳを分析した。

静的試験系は中規模降雨ライシメータに基づく（図６）。静的とは、ライシメータに用いられる土壌に軍需品残渣が混入し、時間が経過しているということを表す。各ライシメータには毎週降雨処理を施した。年間降雨および風化を模擬するためにこれらのライシメータとともに人工降雨の送達系を用いる。これらのライシメータは、土壌に浸透する浸出水ならびに土壌表面からの流出水の回収が可能なように設計されていた。およそ２．５年の模擬風化時間を、南東部の年間平均降雨量１１９〜１３０ｃｍ（４７〜５１インチ）に基づいて見積もった。

アバディーン性能試験場（ＡＰＧ；Ａｂｅｒｄｅｅｎ Ｐｒｏｖｉｎｇ Ｇｒｏｕｎｄ）からの土壌を図６に示されるように静的降雨ライシメータで０．２％生体高分子（ｗ：ｗ）を用いて評価し、各降雨事象後にその非処理対照と比較した。ＡＰＧ土壌はシルト質粘土（ＣＬ；Ｓｉｌｔｙ Ｃｌａｙ）として分類される。

降雨処理を毎週、１６週間続けた（温帯北東部の年間降雨量に相当）。浸出・流出水サンプルを毎週、降雨事象の２４時間後に回収した。各容積を測定および記録し、ＴＳＳおよび金属の分析のためにサンプルを分割した。

実弾射撃試験系は、ライシメータに積載された土壌に実弾射撃の弾薬が付加されるという点で静的試験と異なる。ＬＦＬは盛土への活発な銃弾の集積または非盛土土壌に対する影響を考慮するものであり、総懸濁固体量への銃弾の集積の動的効果を反映する。ＬＦＬはまた、銃弾と銃弾との衝撃の影響および衝撃領域における土壌の乱れの全般的影響を考慮する。ＬＦＬセルの一例を図７に示す。このセルは銃弾の跳飛を防ぐためにＳＡＣＯＮ（商標）ブロックで囲まれている。上には噴出する土壌が隣接するセルに混入しないように合板がかけられている。この処理性試験のため、標的衝撃領域を模擬するために盛土の下端部が外側に延長されていた。この下端部は、盛土回収系（上層浸出水）とは異なるその独自の浸出物回収系（下層浸出水）を備えていた。この系を図８に示すが、試験土壌を充填していないＬＦＬと試験土壌を充填したＬＦＬが示されている。より具体的には、図８は実弾射撃試験系８００の２枚の写真を示す。実弾射撃試験系８００は試験土壌を充填していないもの（左の画像）と充填したもの（右の画像）を示す。実弾射撃試験系８００は上層浸出水回収装置８０１と下層浸出水回収装置８０２を含み、これらは実弾射撃試験系８００の上層および下層からの浸出水を回収するために使用できる。

３種類の生体高分子の、土壌中の重金属の安定化における有効性を調べた。生体高分子は３種類の異なる炭素源：ソルガム、廃糖蜜、およびコーンシロップを用いて生産した。
各セルは、添加率０．５％（ｗ：ｗ）で３種類の生体高分子のうちの１つで改良された土壌を含んだ。表４はライシメータセルの内容物をまとめたものである。実弾射撃ライシメータに用いた土壌はフォートレナードウッドからのものであり、砂礫を含む砂質シルト（６．６％砂礫、４２．７％砂、５０．７％微粒子）として分類される。

本試験には２つのＭ１６Ａ２兵器を用いた。試験射撃のケイデンスは１分間当たり２〜３発とした。１回当たり５．５６ｍｍの銃弾を１５０Ｍ−１６発用い、１０週間、毎週、盛土に着弾させた。各セルに計１５００発の銃弾を着弾させた。土壌が隣接するライシメータに飛び散らないようにライシメータの上面と下端部には合板をかけた。

降雨事象は、１０週間、毎週、１０Ｌの水を加えることによって、米国北東部の年間降雨を１０週間模擬した。図９は、１０週間、毎週、１０Ｌの水を加えることによって、米国北東部の年間降雨を１０週間模擬する降雨事象を伴う実弾射撃試験系を示す写真である。

流出水および浸出水を回収して実験室に送り、濾過後に誘導結合プラズマ光学分光法を用いて可溶性金属（＜０．４５マイクロメートル）分析を行い、総懸濁固体量を重量測定により求め、懸濁固体含有水を微生物による酸消化を用いて消化し、濾過した消化物を、誘導結合プラズマ光学分光法を用いて分析した。鉛は域外流出を論じる際に最も問題視する重金属であるが、全ての軍需品由来金属の溶解濃度と総濃度の双方を定量した：鉛（Ｐｂ）、クロム（Ｃｒ）、銅（Ｃｕ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、バナジウム（Ｖ）、アンチモン（Ｓｂ）、およびヒ素（Ａｓ）。

実験３：結果
浸出・流出水中の金属および他の汚染物の濃度を測定することによって汚染土壌に対する降雨の影響を分析するために用いた中規模技術である静的ライシメータを図６に示す。

１年の模擬風化の後に対照（非処理）土壌および生体高分子で改良した土壌からの下層浸出・流出水中に検出された総鉛（Ｐｂ）量を図１１および図１２に示す。より具体的には、図１１は、１年の模擬風化の後に対照（非処理）土壌および生体高分子で改良した土壌からの下層浸出・流出水中に検出された総鉛（Ｐｂ）量を示す。図１１では、処理土壌および非処理土壌の双方で、溶解した鉛の値はこの方法の検出限界よりも下であるか検出限界付近であった。図１２は、１年の模擬風化の後に対照（非処理）土壌および生体高分子で改良した土壌からの上層浸出・流出水中に検出された総鉛（Ｐｂ）量を示す。図１２では、処理土壌および非処理土壌の双方で、溶解した鉛の値はこの方法の検出限界よりも下であるか検出限界付近であった。

処理土壌および非処理土壌の双方で、溶解した鉛の値はこの方法の検出限界よりも下であるか検出限界付近であった。１年の模擬風化の後に対照（非処理）土壌および生体高分子で改良した土壌からの上層浸出・流出水中に検出された総鉛（Ｐｂ）量を図１２および１３に示す。処理土壌および非処理土壌の双方で、溶解した鉛の値はこの方法の検出限界よりも下であるか検出限界付近であった。

図１０は、盛土の風化および盛土における「崩落」の発生の際、土壌が盛土の下端に向かって移動するのに伴うＴの傾斜角の変化を示す。
ＬＦＬのライシメータ回収系の上層と下層の双方から浸出水を回収した。固体／改良剤接触時間は下端の基部で回収された浸出水（下層浸出水）ではずっと長かった。

対照土壌および廃糖蜜由来生体高分子で改良した土壌からの下層および上層浸出水中の総鉛濃度をそれぞれ図１２および１３に示す。廃糖蜜に基づく生体高分子は鉛の不動化に有意に良好であり、また、コーンシロップまたはソルガム由来生体高分子のいずれよりもその性能の一貫性も高かった。より具体的には、着弾対照および生体高分子で改良した土壌からの上層および下層浸出水中の溶解Ｐｂ量を表５に示す。溶解Ｐｂの量は、廃糖蜜由来生体高分子で土壌を改良した場合に上層および下層浸出水の双方で最低であった。４回の降雨事象の後（４か月の風化に相当）、対照（着弾）土壌および生体高分子で改良したライシメータからの上層および下層浸出水中の溶解鉛の量。

実験４：盛土式小銃射撃場
訓練および試験に使える時間を最大にする持続可能であって、なお環境上適正な方式で軍事施設を管理することができるということは、フル稼働の十分に訓練された戦力を維持するという重要な側面である。重金属の敷地外流出をなくし、堆積物の域外流出を軽減し、区域の盛土傾斜に対する浸食の影響を顕現することは、小銃射撃場（ＳＡＦＲ）施設の管理の一環である。現地管理要員の立場からは、管理区域に浸食のない土壌を供給できることが、最新かつ有効な戦力の重要な側面である。

２０を超える小銃射撃場での試験では、盛土式ＳＡＦＲを離れた鉛の大部分は流出表面水中に懸濁固体として存在することが示された。懸濁固体の移動を軽減するために現在用いられている方法は、浸食対策としてのジオテキスタイルまたは植生区域の設置である。鉛、銅および亜鉛の高い区域での浸食対策としての植物の選択および使用には、どの種にこれらの金属に耐性があるか、ならびにどの種が有害金属を過剰蓄積しないかを理解する必要がある。金属の栄養的移動または植物デトリタスによる敷地外への金属流出の可能性を軽減するためには、茎葉における重金属の蓄積は避けなければならない。しかしながら、植物は直接小銃射撃を受ける区域では生存できない。ジオテキスタイルおよび他の難燃性材料も直接射撃を受ける区域では使用できず、織布の完全性が破壊されれば、もはや設計されたようには、また、射撃リスクに対する機能はなくなる。

実験４：材料および方法
浸食および堆積物の運搬を斜面安定性および表面土壌耐久性の双方で評価した。生体高分子改良剤による浸食対策を評価するために２つの処理性試験を設計した。土の盛土に対して静止特徴を持つ角度で浸食を評価するために模擬試験盛土を構築し、これを用いて土壌損失量を実験的に測定した。シルト質砂（ＳＭ；Ｓｉｌｔｙ Ｓａｎｄ）、およびシルト（Ｓ；Ｓｉｌｔ）土壌種を０％、０．２％、および０．５％生体高分子（ｗ：ｗ）の用量比で処理し、同じ土壌種の非処理対照と比較した。

さらに、中規模降雨ライシメータを用いて、生体高分子の土壌浸食軽減能および堆積物運搬を表面流出水と浸出水の双方で評価した。
２つの土壌種を３種類の生体高分子添加率；０％（対照）、０．２％ｗ：ｗ、および０．５％ｗ：ｗで検討した。土壌種はシルト質砂（ＳＭ）、およびシルト（Ｓ）であった（表６）。

斜面安定性ボックスを１．９０５ｃｍ厚の高密度ポリエチレンから構築した。各ボックスは０．７８７４ｍ×０．７８７４ｍ×０．６０９６ｍ（内部長×幅×高さ）の寸法であった。水に浮遊している浸出物および堆積物をポリエチレンパンに回収した。図１３に斜面安定性ボックスを示す（左が非改良対照セル、右が０．２％生体高分子セル）。図１３で、右の生体高分子改良土壌からの浸出水は透明であった。土壌種は左から右へ、シルト質砂対照、シルト対照、シルト質砂０２％ＢＰ、シルト０．２％ＢＰである。

アバディーン性能試験場（ＡＰＧ）からの土壌を、０．２％生体高分子（ｗ：ｗ）を用いて標準降雨ライシメータ（図６）で評価し、各降雨事象の後にその非処理対照と比較した。ＡＰＧ土壌はシルト質粘土（ＣＬ）と分類される。

年間降雨および風化を模擬するためにこれらのライシメータとともに人工降雨の送達系を用いる。これらのライシメータは、土壌に浸透する浸出水ならびに土壌表面からの流出水の回収が可能なように設計されていた。およそ２．５年の模擬風化時間を、南東部の年間平均降雨量１１９〜１３０ｃｍ（４７〜５１インチ）に基づいて見積もった。

斜面安定性試験では、各斜面安定性ボックスで毎週降雨事象を施し、浸出・流出水を回収した。土壌移動および浸食能を評価するために、各模擬盛土の傾斜角を１週おきに空間的に測定した。具体的には、斜面安定性ボックスの敷地床面積に堆積した土壌の量の増加（模擬盛土における損失土壌量を構成する）を記録した。

中規模実験降雨ライシメータを用い、浸出・流出水中の総懸濁固体量（ＴＳＳ）および濁度を、０．２％生体高分子（ｗ：ｗ）で改良したＡＰＧ土壌で測定し、各降雨事象後にその非処理対照と比較した。Ｈａｃｈ ＤＲ／２００分光光度計を用いてサンプルのＴＳＳおよび濁度を分析した。サンプルを、懸濁固体の場合には８１０ｎｍで、濁度の場合には４５０ｎｍで読み取った。

実験４：結果
図１４は、生体高分子の添加率が増すにつれて斜面安定性が上昇することを示す。安定性は、安定性ボックスの下端部の土壌量の増加と盛土傾斜（崩落）の角度の変化（ブレークポイント）によって評価した。盛土面のブレークポイントより下により多くの堆積物が落ちる場合に斜面安定性の低下を示し、図１４に示されるように、このブレークポイントは盛土面の上に移動する。

年間の降雨に相当する一連の降雨事象の後、非処理のシルト質砂土壌では４０．０ｋｇ（全土壌量の６９％）の土壌量が失われた。非処理のシルト質土壌では、３２．０ｋｇ、すなわち総量の６６％が失われた。これに対し、同じ土壌を０．２％生体高分子（ｗ：ｗ）で処理した場合には、失われたのは８．０ｋｇ（全量のおよそ１７％、シルト質砂）および１．０ｋｇ（全量のおよそ１％、シルト土壌）であった。各「盛土」から失われた量を図１５に土壌種ごとおよび生体高分子の添加率ごとに示す。非処理土壌はそれぞれ最大土壌量を失い、０．２％生体高分子（ｗ：ｗ）で処理したシルト質砂がこれに次いだ。０．２％または０．５％生体高分子（ｗ：ｗ）のいずれかで処理したシルト質土壌および０．５％生体高分子（ｗ：ｗ）で処理したシルト質砂はそれぞれ、１年の模擬風化の間、安定した量を維持していた。

生体高分子で処理した土壌は、２．５年を超える風化に相当する２０回の降雨事象の後にも表面耐久性と浸食耐性を示し続けた。これは、非処理土壌において地表下の砂礫が風化に曝された場合に、土壌表面の検査から明らかである。図１６は、非処理対照に優る生体高分子により改良された土壌の表面耐久性および浸食耐性の写真である。非処理土壌１６０１および生体高分子処理土壌１６０３は表面水流出に曝された。より具体的には、非処理土壌１６０１および生体高分子処理土壌１６０３は、２．５年を超える降雨に相当する１９回の降雨事象に曝された。非処理土壌１６０１の拡大図１６０２と生体高分子処理土壌１６０３の拡大図１６０４を比較することにより分かるように、生体高分子処理土壌１６０３はより大きな浸食耐性を示した。

処理および非処理ＡＰＧ土壌からの流出水および浸出水において堆積物量を測定した。図１７は、対照および生体高分子で改良したＡＰＧ土壌（シルト質粘土）からの浸出・流出水におけるＴＳＳの比較を示す図である。生体高分子による改良は流出水中のＴＳＳに７８％の減少をもたらした。浸出水中のＴＳＳの減少はおよそ５０％であった。

図１８は、非処理盛土の土壌損失を非処理対照に対する重量％として示す。図１８では、ＩＡＡＰはアイオワ州陸軍弾薬工場の土壌である。図１９は、対照盛土と生体高分子処理盛土における総懸濁固体量（ＴＳＳ）を示す。図２０は、非処理または生体高分子で処理した種々の土壌の盛土に残留する重量を時間の関数として示す。図２１は、２．５年の模擬風化時間で盛土の流出水および浸出水中の総懸濁固体量によって測定される堆積物損失の軽減を示す。降雨は米国南東部の年間平均降雨量１１９〜１３０ｃｍ（４７〜５１インチ）に基づく。

生体高分子を土壌に加え、および降雨または通常の土壌水分によって含水すると、土壌が緩衝材として働き、生体高分子塩のイオン特性が中和される。その後、生体高分子はそれ自体と、また、土壌基質の成分と反応を始め得る。反応性のある架橋生体高分子はより大きな分子量および低い水親和性を有する。それは生体高分子マトリックス内の個々の土壌粒子を一緒に連結する。改良された土壌の個々の土壌粒子は可動性が大幅に低下し、透水係数が有意に低下し、かつ、圧縮強度は合成高分子によってもたらされるものと同等である。土壌の物理的形態におけるこの粒子レベルでの変化は、土壌強度の増大と土壌浸食の軽減をもたらす。堆積物運搬の研究では、生体高分子土壌改良剤が表面水浸食および浸出水における粒子運搬を有意に軽減することができたことが示された。

実験５：区域の浮遊塵の軽減
国家環境大気質基準（ＮＡＡＱＳ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｍｂｉｅｎｔ Ａｉｒ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ）は、国内の屋外空気に適用される大気浄化法（Ｃｌｅａｎ Ａｉｒ Ａｃｔ）（４２ Ｕ．Ｓ．Ｃ． ７４０１以下参照）の典拠の下に米国環境保護庁（ＵＳＥＰＡ）により制定された基準である。大気浄化法は１９６３年に通過し、１９７０年と１９９０年に大幅に修正された。一次基準は、子供、高齢者および呼吸器系疾患罹患者などの感受性集団を含め、十分な安全の余裕をもって人の健康を保護するように設計されている。二次基準は、汚染物質の既知のまたは予想される有害作用から公共の福祉を保護するように設計されている（例えば、建築物外壁、視程、作物および家庭内動物）。

ＮＡＡＱＳは、ＥＰＡに６つの基準大気汚染物質：１）オゾン（Ｏ_３）；２）粒子物質（ＰＭ１０、粗粒子：粒径２．５マイクロメートル（μｍ）〜１０μｍおよびＰＭ２．５、細粒子：粒径２．５μｍ以下）；３）一酸化炭素（ＣＯ）；４）二酸化硫黄（ＳＯ_２）；５）酸化窒素（ＮＯ_ｘ）および６）鉛（Ｐｂ）に対する基準を設定することを求めている。連邦規則集（Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）第４０巻に挙げられており、これを表７に示す。

訓練および試験に使える時間を最大にする持続可能であって、なお環境上適正な方式で軍事施設を管理することができるということは、フル稼働の十分に訓練された戦力を維持するという重要な側面である。軍事施設周辺の粉塵の発生を管理することは、１９４６年以来、工兵隊（Ｃｏｒｐｓ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）の関心事となってきた。軍事作戦区域の粉塵管理は独自の取り組みを含む。軍は、離着陸場、ヘリポート、宿営区域、道路、および戦車が通った跡（粉塵の存在が軍事作戦に有害となる）の粉塵を抑制する有効かつ効率的な手段を要している。ヘリコプターを粉塵の舞う環境で飛ばすと、回転翼およびエンジンは、浮遊土壌粒子によって引き起こされる表面浸食のために通常の寿命のわずか１／３〜１／２が経過したところで交換しなければならない。車両機動から生じた軍事施設周辺の粉塵雲は、敵軍に戦略上の作戦を容易に認識できるサインを与え、空中要員および地上要員双方の視程を損なう。粉塵はそれ自体、地上部隊にとって安全上有害であり、射程兵器からの粒子状重金属が混入すればさらに危険なものとなる。

実験５：材料および方法
処理性試験に用いた土壌は、０．５％砂礫、７７．２％砂、および２２．３％微粒子から構成される、非塑性のシルト質砂（ＳＭ）に分類されるものであった。３種類の生体高分子添加率０．１％、０．２％および０．５％（ｗ：ｗ）と非処理対照（蒸留水）で粉塵抑制を測定した。試験プロトコールは、Ｒｕｓｈｉｎｇ， Ｊ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ， Ｊ．Ｋ． ２０１０により開発されたものであった。Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｕｓｔ ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｃｉｖｉｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２２（１１）， ＤＯＩ：１０．１０６１／（ＡＳＣＥ）ＭＴ．１９４３−５５３３．００００１２２，参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。

実験５：結果
生体高分子施与により処理された、また処理しなかったシルト質砂土壌からの損失量および相対湿度を図２２に示す。この図は、土壌に０．５％／ｗｔの添加率で加えた生体高分子が全ての相対湿度で対照よりも粉塵発生を軽減することを示し、熱帯環境および乾燥環境の双方で機能することが示唆される。

Ｒｕｓｈｉｎｇ／Ｎｅｗｍａｎ粉塵測定システムを用いた反復試験では、様々な相対湿度で粉塵発生に統計学的に有意な変動は見られない。土壌に０．５％（ｗ：ｗ）の添加率で加えた生体高分子は全ての相対湿度で対照よりも粉塵発生を軽減し、乾燥環境および熱帯環境の双方で十分な機能を果たすであろうことが示唆される。０．５％の添加量は、処理する土壌の深さに応じ、エーカー（４０４７ｍ^２）当たりの適用率の範囲を表す。下記表８は、この土壌種からの浮遊塵の軽減を達成するために要したエーカー（４０４７ｍ^２）当たりの生体高分子の量を示す。

処理する土壌の深さに応じ、少量の生体高分子改良剤を用いて大面積の土壌からの粉塵発生を軽減することができた。この生体高分子の天然で生物起源である性質は、粉塵対策技術としての生体高分子の使用に伴う環境への影響を大幅に軽減すると思われる。さらに、ＲＴＢＰで改良した土壌の植被促進傾向は、粉塵発生区域の周辺での損失量を軽減し、そこで植物が生存して表土を安定化させることができると思われる。

生体高分子を、高濃度の微粒子を含み、浸食および粉塵の問題が起こりやすいシルト質砂土壌に加えた。試験した最高土壌添加率である０．５％生体高分子（ｗ：ｗ）で、試験した全ての相対湿度において対照よりも風による土壌の損失量が軽減された。

実験６：土壌の安定化
建設区域周辺の土壌浸食を管理するもう１つの手段が緑化である。欠点は、有効な植生緩衝ゾーンを確立するのに必要とされる時間および労力、ならびに水である。植物生育の促進、維持管理時間の短縮および水使用の削減は表面水の水質を改善するだけでなく、建設コストも低減するであろう。

暴風雨の際の生体高分子の土壌安定化特性を評価するための実験を、革新的な中規模降雨実験ライシメータを用いて行った（図６、７）。図６を参照すると、ライシメータ６００は、不織性のジオテキスタイルファブリック６０１で裏打ちされたタンク６０９を含んでもよく、その中に複数の層６０２、６０３および６０４が含まれている。層６０２は１２．７ｃｍ（５インチ）の土壌であり得る。層６０３は１０．２ｃｍ（４インチ）の砂であり得る。層６０４は７．６ｃｍ（３インチ）の豆砂利であり得る。ライシメータ６００は一側面に配置された６０５から降雨流出を得ることができる。６０５からの降雨流出は閉止弁６０６を含んでもよく、降雨流出を内径２．５ｃｍ（１インチ）のチューブ６０７から表面流出回収容器（示されていない）へ誘導することができる。

実験ライシメータには土壌を充填し、様々な処理選択に曝すことができる。実験ライシメータはまた、降雨事象の後に表面水流出を回収するように設計されている。本明細書では、土壌浸食および表面水流出中の懸濁固体を軽減し、土壌強度を高め、さらに模擬旱魃条件下で植被の定着速度を高める生体高分子の能力を示す。

実験６：材料および方法
中規模降雨土壌ライシメータは、１．９１ｃｍ（３／４インチ）厚の高密度ポリエチレンから構築され、７８．７ｃｍ×７８．７ｃｍ×６０．７ｃｍ（内部長×幅×高さ、３１インチ×３１インチ×２４インチ）の寸法である。ライシメータの構築および使用は他所に記載されている（図６、７参照）。ライシメータは、毎週の降雨事象の後に浸出・流出水サンプルを分離できるように設計されている。各実験には、１年の降雨（米国の温帯北東部の平均）に相当する量を１６週間に等分して配分する。

これらの試験には２種類の土壌を用いた。１つは０．５％砂礫、７７．２％砂、２２．３％微粒子から構成されるシルト質砂（ＳＭ）である。そのｐＨは５．７であり、比重は２．６８であり、土壌は非塑性であった。もう１つは０％砂礫、１．１％砂および９８．９％微粒子からなるシルト質土壌（Ｓ）であった。そのｐＨは８．７であり、比重は２．７３であり、塑性指数は４であった。これらの土壌種は双方とも浸食を受けやすいことが知られている。

乾燥生体高分子塩をシルト質砂土壌に０〜０．５質量％の添加率で加え、ライシメータに入れた。毎週流出水を回収し、容積を測定し、各サンプルの総懸濁固体量（ＴＳＳ）および濁度を分析した。ＴＳＳはＡＳＴＭメソッド２５４０Ｂを用いて測定した。濁度は比濁計によって測定した。

斜面安定性の変化は、１５か月に相当する降雨に関して、流出水だけを回収するライシメータを用いて調べた。各ライシメータは１６８．８ｋｇの土壌を保持していた。シルト質砂とシルトの２種類の土壌を用い、それぞれを０質量％、０．２質量％、または０．５質量％の生体高分子で処理した。各降雨事象の後に、流出水を回収し、ＴＳＳを分析し、失われた土壌の質量を求めるための測定を行った。

種々のシルト質砂ブレンドの土壌強度を調べた。この土壌は、８７％コンクリート砂および１３％シルトからなるＳＭ（砂質シルト）（アメリカ地質調査所［ＵＳＧＳ；Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｇｅｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｒｖｅｙ］分類）である。この土壌は、湿潤状態では強度が低く、乾燥状態では強度が高いために選択した。試験プロトコールは、一定のひずみ速度をかけながら被験体の最大荷重応答（降伏応力）を測定する単純な一軸圧縮強度である。小サンプル（２．５ｃｍ×５．１ｃｍ）（１インチ×２インチ）を２０５０〜２１６０ｋｇ／ｍ^３（１２８〜１３５ｌｂｓ／ｆｔ３）の範囲の密度で調製し、０．８３８ｍｍ（０．０３３インチ）／分の一定ひずみ速度をかけた。湿潤状態および乾燥状態の双方の試験を行った。湿潤状態では、サンプルは含水率８％で調製し、型から取り出した後すぐに試験した。乾燥状態では、サンプルを一定重量に達するまで１０５℃の炉に入れ、試験前に１時間、周囲条件で冷ましたこと以外は同様に調製した。

実験６：結果
図２３は、土壌を漸増添加率の生体高分子で処理した場合に、降雨ライシメータから得られた表面水流出の外観を比較したものである。添加率が高いほど低い濁度を示す。図２３に示されるように、沈降後の濁度は、生体高分子の添加率が増すにつれて低くなることが分かった。

また、ライシメータの土壌表面も模擬年間降雨による浸食の影響を示した。非処理土壌の表面は洗い流されて下層の砂礫が露出していた。生体高分子で改良した土壌の表面は健全であった。

表面水浸食による土壌からの損失量を生体高分子で処理した土壌と非処理土壌で比較する。図２４は、＃５０ふるい上に保持される土壌量（０．２９７ｍｍより大きい粒子）を生体高分子で処理した土壌と非処理土壌で比較した２つの図を示す。処理土壌（右）は＃５０ふるい上に保持される土壌量（粒子＞０．２９７ｍｍ）が多く、従って、表面水流出によって運搬されないことを示す。さらに、非処理土壌では、懸濁固体の量と同様に、粒径＜０．２９７ｍｍの土壌が多かった。

浸食はまた、斜面安定性の関数でもある。生体高分子で処理したシルト質砂土壌およびシルト質土壌を含むライシメータを年間相当の模擬降雨事象の後に、前面斜面の崩壊および流出水中へ失われた土壌量に関して調べた。図２５は、種々の生体高分子添加率での２種類の土壌からの、毎週６回の降雨事象（３．５か月に相当）にわたる斜面安定性土壌損失量を示す図である。全ての処理に関して、最初の土壌量１６８．８ｋｇを基に計算した。

図２６では、０．５、１、および２％のＥＰＳ生体高分子塩を含む乾燥ＳＭ土壌の強度を、含水率０％の非改良対照と比較した。この土壌は、乾燥状態で、添加率１および２％の生体高分子によって増強された実質的強度を示す。湿潤状態では（図２７）、土壌強度は極めて低い（砂画分の多いシルト質砂に典型的である）。生体高分子の添加により湿潤状態での土壌強度が増し、これは斜面安定性損失量で見られたデータ傾向と一致している。

Ｒ．トロピシＥＰＳの本来の能力は、土壌水分と栄養素の保持、土壌の有機物の増大、および自己粘着性である。Ｒ．トロピシ生体高分子をシルト質土壌および砂質シルト質土壌に加えると、土壌強度が増し、水浸食による土壌微粒子の損失が少なくなる。これらの変化は双方とも、乱された土壌からの土壌損失の軽減をもたらす。

実験７：旱魃状態下で種子の発芽率を高めるためのＲＴＢＰ塩
旱魃は米国で他の自然災害よりも多くの人々に影響を及ぼすだけでなく、最もコストがかかり取扱いの難しい問題の１つでもある。これは旱魃自体の性質によるものである。旱魃は遅発的現象であり、その深刻度は多数の測定基準を用いて決定される。例えば、竜巻やハリケーンとは異なり、旱魃の影響は非構造的であり、極めて広範囲で、州や国の境界にわたることもあり、このことが評価や鎮静活動をより困難にしている。Ｒ．トロピシ生体高分子塩は、種子のコーティングに用いると、少ない水やりで高い発芽率が得られた。さらに、実生を人工的旱魃に曝すと、生体高分子コーティング種子から生育した植物は、非コーティング種子の場合よりも旱魃状態に対する耐性が有意に高くなった。

実験７：材料および方法
ＲＴＢＰを用い、１回のコーティング（生体高分子１０ｍｇ）または３回コーティング（生体高分子３０ｍｇ）（各コーティング間に乾燥時間を設けた）のいずれかで種子をコーティングした。対照は非コーティング種子とした。種子発芽試験のためのＡＳＴＭメソッドＥ−１９６３−０９に記載されている方法に従い、種子を同じ個別土壌ポットで生育させた。種子を植え込んだ後、１個体当たり１日当たり２０ｍｌの水で各ポットに灌水した。各試験条件（対照、１０ｍｇ、３０ｍｇ）について発芽率を算出した。３週間の灌水生育後、６日間水を断って模擬旱魃状態を作り出した。その後、全ての植物に灌水し、全ての被験体に関して回復（茎および葉への水の流入による乾燥した外観の軽減および土壌表面からの茎および葉の持ち上がりと定義）を記録した。

保水は、土壌サンプルに種々の濃度の生体高分子を添加することにより測定した。土壌の最初の乾重を測定した。生体高分子を添加した水を各土壌サンプルに加え、再び秤量した。生体高分子添加水は、既知量の生体高分子を既知量の水に加えることによって作製した。およそ１０ｍＬの水を各土壌サンプルに加えた。次に、これらのサンプルを室温で保管し、所定の時間蒸発させた。乾燥期間中、サンプルの個々の質量を測定した。

活着した植物を模擬菜園に移植した。これらの植物体に生体高分子を種々の濃度で加え、実が付くまで生育させた。模擬旱魃（一定の日数、水を断つ）を行った。その後、植物体に再び灌水し、最大成長まで戻した。その後、植物体が生産した果実を秤量した。

種子発芽ポット試験を、ＡＳＴＭメソッドＥ−１９６３−０９を用いて行った。図２９は、旱魃状態下で生体高分子区（左）および非コーティング区（右）から生育した植物を示す一連の写真である。図３０および３１は、生体高分子でコーティングした種子と非コーティング種子、ならびに被覆度（生体高分子１０ｍｇと３０ｍｇ）の発芽率、および模擬旱魃後の植物回復を比較したものである。より具体的には、図３０は、生体高分子でコーティングした種子と非コーティング種子（対照）の間の発芽率（％）の比較を示す図であり、種子発芽率および旱魃耐性に対する生体高分子コーティングの効果を示す（Ａは発芽率であり、Ｂは生存率である）。また、図３１は、生体高分子コーティングの存在は植物生存率を４２％高めたが、生存率は生体高分子コーティングの量によって影響を受けなかったことを示す図である。図３０および３１は、生体高分子のコーティングが厚いほど発芽率が高かったことを示す。１０ｍｇ処理の種子および３０ｍｇ処理の種はいずれも、非処理種子よりも有意に高い発芽率を示した（非処理４３％に対して処理種子では７３％／８３％）。生体高分子コーティングの存在は植物生存率を４２％高めたが、生存率は生体高分子コーティングの量によって影響を受けなかった。

図２３は、中規模降雨ライシメータシステムを用いた概念実証において、生体高分子で処理した土壌と非処理（対照）土壌からの総懸濁固体量（ＴＳＳ）損失を比較したものである。降雨後の土壌表面の外観の変化を処理土壌と非処理土壌で比較する。

図２９は、ＲＴＢＰコーティング種子から生育した植物は、対照の非コーティング種子に比べて成長速度が速かったことを示す。発芽の改善（休眠の軽減）により、植え付けに必要な種子の量を減らすことができ、高温または低温、また水が制限された状況など、不良な作付け条件でも発芽が見込める。

図３０は、生体高分子でコーティングした種子と非コーティング種子、ならびに被覆度（生体高分子１０ｍｇと３０ｍｇ）の発芽率、および模擬旱魃後の植物回復を比較したものである。生体高分子のコーティングが厚いほど発芽率は高かった。１０ｍｇ処理の種子および３０ｍｇ処理の種はいずれも、非処理種子よりも有意に高い発芽率を示した（非処理４３％に対して処理種子では７３％／８３％）。生体高分子コーティングの存在は植物生存率を４２％高めたが、生存率は生体高分子コーティングの量によって影響を受けなかった。図２８は、模擬旱魃条件下での生体高分子コーティング区および非コーティング区の植物生存率を示す図である。

図３２は、植物が成熟に達し、果実を付けたところで、１．５週間水を断ったことを示すグラフである。この模擬旱魃後に、再び植物に通常通り、果実の生産が終わるまで灌水した。図３２は、生体高分子処理土壌を使用すると、旱魃条件で作物収量が劇的に増大することを示す。さらに、含水率が高いほど、作物収量により大きな有効性をもたらす。また、図３３に示されるように、植物の根量（重量）も、生体高分子改良土壌では非改良対照よりも増大する。

旱魃条件下での発芽率および成長の双方の改善のために自身の内部で固有の水供給源を維持する種子を生産できることで、１）世界の耕作限界農地での作物生産の増大；２）開発の進んだ農地での作物生産の信頼性の増大；３）非処理種子を用いた場合と同等の作物収量を上げるのに必要とされる種子数の削減；４）砂漠化の軽減、および５）都市環境での水使用の削減（芝生の手入れ、ゴルフコース）が可能となる。

実験８：農地の土壌浸食対策のためのＲＴＢＰ
世界の農地のおよそ４０％が浸食による土壌損失によって深刻な衰退に見舞われている。これは表面水の水質に影響を及ぼすだけでなく、農地自体の栄養状態にも影響を及ぼす。質の悪い農地では作物収量の低下が起こり、次に、食物価格の高騰が起こり、食用作物の存在量が減る。ドミノ式に、農業生産者は農地を改善するために化学物質に基づく肥料に目を向け、これが表面水における硝酸塩およびリン酸塩の増加を招き、放流水の富栄養化が高まり、表面水の水質が全体的に低下する。生体高分子塩を土壌に混合すると、流出する表面水中の懸濁固体の減少によって評価されるように、表面浸食の軽減がもたらされる。

実験８：材料および方法
ＲＴＢＰ塩を低レベル（０．０５〜５質量％）で土壌に混合すると、降雨および／または表面水が処理された土壌を通過する際に土壌粒子が生体高分子マトリックス内に結合され、水による運搬が阻止されるように土壌挙動が改善される。ＲＴＥＰＳは、固体または水／ゲル混合物として表面に適用することで混合することができる。この改良は湿潤または乾燥適用と組み合わせた土壌混同によってより深部に導入することができる。

ＲＴＢＰ処理土壌および非処理土壌を充填した中規模降雨ライシメータを用いて試験を行った。
実験８：結果
図２３は、中規模降雨ライシメータシステムを用いた概念実証において、生体高分子で処理した土壌と非処理（対照）土壌からの総懸濁固体量（ＴＳＳ）損失を比較したものである。降雨後の土壌表面の外観の変化を処理土壌と非処理土壌で比較する。

図３４は、非処理対照と生体高分子で処理した場合の、植え付け後１週間および植え付け後３週間の植物成長を示す。
実験９〜１６：生体高分子の合成
用いた生体高分子は、標準的生産方法に従い、米国特許第７，８２４，５６９号からの改変法を用いて細菌Ｒ．トロピシを培養して、合成した。図３５に、生体高分子合成ワークフロー３５００の概略ブロック図が示されている。ボックス３５０１では、バイオリアクター３５０２を培養材料で満たすことができる。ボックス３５０３では、バイオリアクター３５０２から材料の一部または全てを取り出すことができる。ボックス３５０４で水酸化物を加えることによって溶解を誘導することができる。ボックス３５０４ではｐＨを１０より高くすることができる。ボックス３５０４から回収された材料はボックス３５０６で蒸発によって濃縮することができ、ボックス３５０８で濃縮高分子を回収することができる。

実験９〜１６のため、Ｒ．トロピシを、２．２６ＣＦＭ（ｃｕｂｉｃ ｆｅｅｔ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）の速度で空気を供給する個別ポンプと連結した散気システムを取り付けた小型バイオリアクター（約１９リットル（５ガロン［ｇａｌ］））で培養した。培養物は細菌と専売培養液との混合物から構成された。培養物を分割するのに十分大きな量に達したところで、材料を約１０ＣＦＭの中規模バイオリアクター（約２０９リットル（５５ｇａｌ））に移した。細菌は、生体高分子合成のため、これらの中規模バイオリアクターから、蠕動ポンプによって２５〜５５ＣＦＭで、１１４００Ｌ（３０００ｇａｌ）と１９０００Ｌ（５０００ｇａｌ）のバイオリアクタータンクに移した。大型バイオリアクターには電動リングコンプレッサーまたは容積式ブロワから空気を供給した。大きい方のバイオリアクターにはまた、一貫した混合物を維持するために再循環式片吸込遠心ポンプも取り付けた。

Ｒ．トロピシを過剰栄養条件で増殖させた。リアクターの容量一杯になるまで培養物の容積を増した。容量一杯になり、培養物が完全に確立されたところで、次に、ナリンゲニン（４’，５，７−トリヒドロキシフラバノン）の導入によってこの細菌に根粒形成させた（Ｐｏｕｐｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｉ Ａｒｅ Ｓｕｌｆａｔｅｄ ｏｒ Ｎｏｎｓｕｌｆａｔｅｄ Ｃｈｉｔｏｐｅｎｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ Ｔｅｒｍｉｎｕｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌｕｍｅ ３２， １９９３参照）。根粒形成したところで、細菌に糖のみを供給した（他の全ての栄養素はなお過剰に存在すると思われたため）。アルカリ塩の化学的付加によって非架橋ＲＴＥＰＳがin situで形成され、得られた生体高分子／細菌混合物を適用および使用のために回収した。

実験９〜１６：試験
作物収量、根の発達、種子の発芽率および旱魃耐性に対するＲＴＢＰ適用の効果を調べる一連の農業試験を行った。様々な植物種を試験した：スイートハラペーニョペッパー、ローマトマト、ズッキーニ、ロメインレタス、ダイズ、およびバミューダグラス、ならびに８種の異なる植物種からの種子。圃場試験は米国内の多様な選択農地で行った。

実験９：スイートハラペーニョペッパー試験
スイートハラペーニョペッパーの試験はアリゾナ州のマリコパで行った。スイートハラペーニョペッパーの植物体は全て、温室で種子から植物体が７．６ｃｍ（３インチ）の高さになるまで生育させた。７．６ｃｍ（３インチ）に達したところで、１エーカー（４０４７ｍ^２）分のペッパーを、根鉢を生体高分子と肥料の混合物中に浸漬することによって処理した。２２．８リットル（６ガロン）の生体高分子（およそ１２５ｇ／エーカー（４０４７ｍ^２））を６８．４リットル（１８ガロン）の肥料／水混合物に加え、その後、温室ペッパースターター植物を浸漬し、次に、２つの対照エーカーの間に植え付けた。対照エーカーは生体高分子を含まない肥料混合物に浸漬した。対照エーカーと処理エーカーの双方の植物に地表下点滴灌漑システムによって灌水した。２回の収穫からなる通常の生産周期を遂行した。植物個体数を数えたところ、区画の平均は一列当たりおよそ１０２５株で、１エーカー（４０４７ｍ^２）当たり１６列であることが分かった。処理エーカーについては１〜１６，０００の範囲の５つの数字を無作為に発生させ、各対照エーカーについては１〜１６，０００の範囲の２つの数字を無作為に発生させた。１５週間後、図３６に示されるように、選択された数で始まる３０株のセットから少なくとも７．６ｃｍ（３インチ）の長さのグリーンペッパーを収穫した。より具体的には、図３６は、スイートハラペーニョペッパー圃場試験おいて無作為に選択した株のおよその位置の概略図を示す。さらに４週間後、同じ株で２回目の収穫を行った。この時、長さ２．５ｃｍ（１インチ）を超える全てのペッパーを選択した。各収穫からの収量を記録し、分析した（表１０参照）。

実験９：スイートハラペーニョペッパーの結果
一列当たりの平均株数は１０２５であった。各エーカーはおよそ１６列の植物からなった。対照ペッパー試験の収量は４７３ｋｇ（１０４２．６ｌｂｓ）／エーカー（４０４７ｍ^２）であった。処理エーカーの収量は５５９ｋｇ（１２３３．３ｌｂｓ）／エーカー（４０４７ｍ^２）であった。ペッパーを処理した結果、１回目の収穫に１８．３％の増産が見られた。エーカー（４０４７ｍ^２）当たりの収量は、エーカー（４０４７ｍ^２）当たりの平均株数と３０株当たりの平均収量から算出した。例えば、最も北のエーカーは平均１６９６株／列であり、平均収量は１２．９３ｋｇ／３０株であった。

表９は、図３６に示される一列当たりの平均スイートハラペーニョペッパー株数を示し、スイートハラペーニョペッパー試験のレイアウトと位置を示す。

乱数発生器により株を選択した後に、３０株の連続する株当たりのペッパー収量を測定した。表１０に得られた測定値を報告する。表１０に示されるように、生体高分子による処理からの収量増加率％は１回目のペッパー収穫で１８．３％であった。

図３７は、対照のエーカー（４０４７ｍ^２）当たりの収量は４７３ｋｇ（１０４２．６ポンド）であったのに対し、生体高分子で処理したスイートハラペーニョペッパーのエーカー（４０４７ｍ^２）当たりの収量は５５９ｋｇ（１２３３．３ポンド）であり、１８．３０％増加したことを示す図である。２回目の収穫の増加率％は１９．１％であった（対照２８４ｋｇ（６２５．１ｌｂｓ）／エーカー（４０４７ｍ^２）、処理３３８ｋｇ（７４４．３ｌｂｓ）／エーカー（４０４７ｍ^２））。

表１１は、スイートハラペーニョペッパーの２回目の収穫の結果を示す。３０株（乱数発生器により選択）の平均を用い、エーカー（４０４７ｍ^２）当たりの収量を算出した（圃場試験のエーカー（４０４７ｍ^２）当たりの平均株数を用いて算出）。対照に比べて処理株では１９．１％の収量増が見られた。

図３８は、スイートハラペーニョペッパーの２回目の収穫において、対照の収量が２８４ｋｇ（６２５．１ｌｂｓ）／エーカー（４０４７ｍ^２）であり、生体高分子で処理した植物では３３８ｋｇ（７４４．３ｌｂｓ）／エーカー（４０４７ｍ^２）であったことを示す図である。

スイートハラペーニョペッパー根の表面積、幅、高さ、および根の湿重をＷｉｎＲｈｉｚｏソフトウエアによって収集し、表１２に報告する。サンプリングした対照株に比べて、スイートハラペーニョペッパー根の総面積には３３．５％の増加が見られ、平均幅の１．３％増と高さの９．０％増を伴っていた。また、生体高分子処理によって得られた根の湿重には３３．３％の増加、収量には３７．２％の増加が見られた。全体的に見て、生体高分子で処理したスイートハラペーニョペッパーの根は株の物理的特性の増大をもたらした。

表１２は、数株のスイートハラペーニョペッパーを掘り上げ、面積、幅、高さ、および重量を含む様々な物理的特性を分析した後に得られたデータをまとめたものである。

図３９は、スイートハラペーニョペッパーにおいて対照と生体高分子で処理したものの根量の比較を示す図である。図３９に示されるように、ペッパーを処理すると、対照に比べて根量の有意な増加がもたらされた。図６８は、８本の非処理スイートハラペーニョペッパー対照サンプルに対して８本の処理したスイートハラペーニョペッパーサンプルでは根量および微細構造が増加したことを示す一連の写真である。

実験１０：ローマトマト試験
ローマトマト試験はアリゾナ州で行った。植物体は、温室にてピートポットで種子から２週間、実生が１２．７〜２５．４ｃｍ（５〜１０インチ）の高さになるまで生育させた。３週目の始めに、これらの実生を、コンポスト有機物からなる土壌を満たした２つの別個の屋外菜園の植え床に移植した。処理区および対照区の双方に１２−１０−５肥料を散布した。振動ファン式スプリンクラーを用い、定期的灌水計画を設定した。生体高分子はまず、処理区菜園に新たに移植したトマトに３．５ｇ／株（または２．８ｇ／平方フィート）の割合で側方施与（灌注しない）することによって与えた。５週間後、２回目の施肥を行った。７週間後、従前に側方施与を行った株に生体高分子を再び４．０ｇ／株（または３．２ｇ／平方フィート）の割合で施与した。１０週間後に熟した果実が現れ始め、１２週間後に毎日収穫を始めた。作物収量、果実質量、および１株当たりの果実数に関するデータを５週間の収穫期間にわたって収集した。

実験１０：ローマトマトの試験結果
生体高分子で処理したローマトマト株は、１株当たりの果実、果実当たりの重量、および１株当たりの節の数を含む、全ての物理的特徴に増加をもたらした。対照植物体の平均は１株当たり３１．１果であったのに対し、生体高分子で処理した株の平均は１株当たり４６果であり、４７．９％増であった。

図４０は、対照１区と生体高分子処理１区の２試験区において生産されたローマトマト果の箱詰め（binned）重量のヒストグラムを示す。処理されたローマトマト果は、大きく、かつ、重くなった。大きな果実も成熟期間は対照植物と同じであり、大規模な商業適用の実施に役立つ。

図４１は、植物の生活環の間に記録されたローマトマト１株当たりの果実数を示す図である。生体高分子で処理したローマトマト株は１株当たり４７．９％の果実増を示した。この果実の増加は、本発明の処理株と対照株とで同じ期間に収穫された植物に由来するものであった。このことは、果実生産の成熟に遅延はないこと、および本発明の材料は品質および収穫に必要な時間枠を変えることなく、現状の農業慣行に組み込むことができることを示唆する。

図４２は、記録されたローマトマト１果当たりの質量を示す図であり、生体高分子で処理した植物では１０．９％増を示した。
６週間後に、ローマトマトの草丈、枝および葉の数を分析した。結果を表１３にまとめる。表１３に示されるように、トマトを処理すると、対照トマトと比べて、平均草丈、枝数、および葉数がそれぞれ４５．５％、５２．５％、３１．９％増加した。

図４３は、生育６週目の対照株に比べた処理株における、トマト株の物理的測定値を示す図である。図４３に示されるように、全体的に見て、トマト株の健康状態は生体高分子の使用によって向上する。植物の生活環の初期により速やかに活着させることで、環境ストレスに対する耐性の増大、果実生産の増大、ならびに得られる果実の生長力および健康の増進がもたらされる。

図４４は、生体高分子で処理したローマトマト株と対照株の間の特徴の比較を示す図であり、処理した株では植物の生長力の改善が示される。図４４に示されるように、対照に比べて処理した株では、全植物重に有意な増加が見られた。このことは、処理した株が、最初の処理時だけでなく、その株の一生を通じて本発明の材料に有意な応答を示したということを示唆する。植物重が改善されれば、より有効な栄養素の取り込みおよび植物体内の、また果実への輸送が可能となる。対照区に比べた処理区の根量の増加は、有意な改善を示す。

図４５は、２回の商用収穫期の間の処理植物と対照植物のローマトマト株収量を示す図である。これらの株では有意な増加が示された。１回目の収穫では有意な収量増加が見られた。２回目の収穫ではより大きな収量増加が見られ、この株が、一生の間により高い収量を上げ、より強く、より長く持続する株となることを示唆する。これに対応して、図４６は、２回の商用収穫期の間の処理株と対照株のトマト株平均果数を示す図である。果実生産は両収穫において処理株で増加した。

実験１１：レタスの試験
試験はロメインレタスに対し、アリゾナ州のシルトローム土壌で行った。株は、温室にてピートポットで種子から２週間、７．６〜１２．７ｃｍ（３〜５インチ）の高さまで生育させた。これらの実生を、コンポスト有機物からなる土壌を満たした２つの別個の屋外菜園の植え床に移植した。処理区および対照区の双方に１２−１０−５肥料を散布した。振動ファン式スプリンクラーを用い、定期的灌水計画を設定した。ＲＴＢＰはまず、試験植え床の１つに新たに移植したレタスに３．５ｇ／個体（または２．８ｇ／平方フィート）の割合で側方施与（灌注しない）することによって与えた。５週間後、２回目の施肥を行った。７週間後、従前に側方施与を行った植物体に生体高分子を再び４．０ｇ／個体（または３．２ｇ／平方フィート）の割合で施与した。１１週間後に、根の構造を保存するように注意しながら株を掘り上げた。植物重、長さおよび直径、ならびに根鉢重、長さおよび直径に関するデータを収集した（表１４Ａ−Ｂ参照）。次に、根の金属含量を分析した（§２．３．７参照）。

実験１１：ロメインレタスの試験結果
ロメインレタスは８週間目に収穫した。対照植物に比べて処理植物では、平均最長葉高に８２．０％の増加、平均最長根に１６．８％の増加、平均根容積に５５．４％の増加、およびレタス結球平均径に２２．０％の増加が見られた。また、根の平均重量に１６２．３％の増加および１株当たりの全平均ロメインレタス重量に３６３．６％の増加が見られた。

成熟レタスを収穫し、葉高、最長根、バルク根、およびレタス結球径を記録した。これらの結果を表１４−Ａおよび１４−Ｂに再現する。これらの表に示されるように、生体高分子で処理したレタスは、全ての物理的測定値で％増加を示した。

収穫後、根の重量とともにレタスの全重量を記録した。結果を表１５にまとめる。この表に示されるように、生体高分子で処理したレタスは実質的な％増加を示す。

図４７は、対照株と処理株のロメインレタス収量を示す図である。１株当たりの収量に有意な増加が見られた。対照株に比べて処理株では３６３％の改善が示された。処理したロメインレタスの全ての特徴が、処理した場合に、対照に比べて生長力および大きさの増加を示した。図４８は、対照に従って生産されたレタスの根と生体高分子で処理したレタスの根を並べて比較したものである。ロメインレタス根の微細構造の増加が見られ、本発明の材料が所望の植物特性を増進する傾向が示された。

実験１２：バミューダグラスの試験
バミューダグラス種子を用い、傾斜土壌区で試験を行った。２区画は一貫した完全日照の、北に面する丘陵斜面に位置した。６時間おきに０．１０６ｃｆｍで１０分間水を供給するようにスプリンクラーの時間を合わせた。両区画を深さ２．５ｃｍ（１インチ）まで耕起した。その後、試験区にＲＴＢＰを１ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で施与した。ＲＴＢＰは０．２５〜２ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の範囲で施与することができる。これらの傾斜区にバミューダグラス種子を９０７ｇ（２ｌｂ）／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で蒔き、６．３５ｍｍ（１／４インチ）の目の細かいマルチの層で覆い、最初の灌水を行った。１０日後、灌水計画を１２時間おきに７分に減らした。毎日、質的な写真記録をとった。

定量的バイオマス分析は生育２０、２９、および３６日後に採取したサンプルについて行った。各区画のバミューダグラスを区画の境界線から１フィート内側に設けた５×５の格子に分割した。これらの２５マスに、左上から始めて標準的な読み方で続け、１〜２５のラベルを付けた。乱数発生器を用い、各区画について１〜２５の範囲の３つの数字を無作為に発生させた。無作為に選択されたマスの中央から、５．１ｃｍ（２インチ）径のＰＶＣコアサンプラーを土壌に１５．２ｃｍ（６インチ）貫入させ、中に入った土壌とバイオマスを取り出すことにより、バイオマスサンプルを採取した。バイオマスは土を洗い落とし、８０℃で少なくとも１６時間乾燥させた。乾重バイオマスの測定値を記録した（表１６参照）。

実験１２：バミューダグラスの試験結果
コアサンプル由来平均バミューダバイオマスのバミューダグラス試験区画からのコアサンプル。生育周期の２０日目にコアサンプルを採取し、バイオマスを記録した。２０日目の平均対照バイオマスは０．０７３ｇであったのに対し、平均生体高分子処理バイオマスは０．２４３３ｇであった。バミューダグラス区画を生体高分子で処理すると、３３２％の増加が見られた。２９日目の平均対照バイオマスは０．３９ｇであったのに対し、平均生体高分子処理コアサンプルのバイオマス平均は０．８１ｇであり、２０７％の増加が見られた。

２０日目に、試験区の無作為な領域（乱数発生器により選択）から３種類のコアサンプルを採取した。図５５に示されるように、バイオマス重量を算出したところ、生体高分子処理区では３３２％の増加を示した。

バミューダグラス試験区画の２９日目に、試験区の無作為な領域（乱数発生器により選択）からコアサンプルを採取した。次に、図５７に示されるように、バイオマス重量を算出したところ、対照区に比べて処理区ではバイオマスに一貫した有意な増加が見られた。

図４９は、バミューダグラス試験１日目の、発明の処理１区と対照１区の２区画を示す。日照、土壌組成および斜度などの条件は区画間で一致させた。実生には定期的灌水計画を維持した。

図５０は、バミューダグラス試験８日目の各区画を２種類の距離から撮影した写真を示す。処理区では活着が始まっていたが、対照区では生長がほとんど見られなかった。
図５１は、バミューダグラス試験１３日目の各区画を２種類の距離から撮影した写真を示す。本発明の処理区の速やかな活着は、対照に比べて有意に旺盛な被覆率を示した。対照区での活着は処理区に比べて遅かった。

図５２は、バミューダグラス試験１６日目の各区画を２種類の距離から撮影した写真を示す。処理区の活着は有意に良好であり、活着したバミューダグラスの葉身の長さは対照区のものよりも有意に長かった。

図５３は、バミューダグラス試験２０日目の各区画を２種類の距離から撮影した写真を示す。
図５４は、バミューダグラス試験２０日目のコアサンプルの写真を示す。処理区ではバイオマス密度に有意な改善が見られた。

図５５は、２０日目のバミューダグラスのコアサンプル当たりの平均バイオマスを示す図である。処理区は２０日目で対照区よりもバイオマスに３３２％の増加を示し、対照よりも植物系のはるかに速く、広範囲の活着を示す。

図５６は、バミューダグラス試験２９日目の各区画の写真を示す。
図５７は、２９日目のバミューダグラスのコアサンプル当たりの平均バイオマスを示す図である。本発明の処理土壌のコアサンプルは、対照に比べて、旱魃を生き残り、栄養素を取り込み、勢いおよび生長力の増進をもたらすのにより適した、はるかに広範囲の根系を示す。

図５８は、２９日目の非処理のバミューダグラス根と処理したバミューダグラス根の写真を示す。図５８は、処理したバミューダグラス根において微細な根の構造の有意な増加を示す。

図５９は、３９日目の非処理のバミューダグラス根と処理したバミューダグラス根の写真を示す。微細構造の有意な改善が、栄養素を取り込み、環境ストレス状態に耐える能力の増強に相当する。

図６０は、３９日目のバミューダグラスのコアサンプル当たりの平均バイオマスを示す図である。
図６１は、５７日目のバミューダグラスのコアサンプル当たりの平均バイオマスを示す図である。試験は５７日後に行った。最後のサンプル採取を行ったところ、処理区では対照区よりもバイオマスの有意な増加を示した。処理区は対照区よりも全バイオマスにおいて１７０％の増加を示し、本発明の材料は、草に適用した場合、生長特性を有意に増大させることを示唆する。

処理区の活着および初期発芽は対照に比べて有意に改善された。被覆の確立に必要な初期時間は少なくとも１週間改善された。根系を観察したところ、はるかに良く確立された根系および微細構造がおそらく栄養素の取り込み、およびより良く確立された植被に表れる生長特性の増大を可能とした。処理区およびそれらのより良く確立された根系は、旱魃、ならびに温度の変動、補給のない栄養素の減少、およびアルミニウムによる微量毒性などの環境ストレスに対する耐性を増す。

本発明の材料を用いれば、バミューダグラスに関連するものなどの植物生長の速やかな確立が土壌浸食を軽減し、典型的な風化が急速な浸食を招き得る区域で斜面を維持する助けとなり得る。土壌浸食の防止の他、本発明の材料によって与えられるような植物生長の速やかな確立は、浸食を受けた土壌の流出からの金属汚染を防ぐことができる。これにより現場環境の質が改善され、現地の水流への集積を防ぐことができる。栄養素および堆積物の集積が水系における富栄養化への最大の原因であるので、本発明の材料は速やかに植被を確立し、土壌を安定化させることでこの問題を防ぐ助けとなり得る。

実験１３：種子コーティングの適用
種子を生体高分子でコーティングすると発芽率および実生の旱魃耐性が改善され、土壌の植被が改善される。

植被の確立および維持の容易さは、２種類の濃度の生体高分子で処理した種子と生体高分子を含まない種子の発芽率を比較し、それらの実生を旱魃条件下に置き、その後、灌水を再開した際の回復率を観察することによって測定した。種子を０ｍｇ、１０ｍｇまたは３０ｍｇの生体高分子でコーティングし、風乾させた。種子発芽試験に関するＡＳＴＭメソッドＥ−１９６３−０９に記載されている方法に従い、種子を同じ各土壌ポットで生育させた。種子を植え込んだ後に１日当たり１個体当たり２０ｍｌの水を用いて各ポットに灌水した。各試験条件ごとに発芽率を算出した。３週間灌水して生長させた後、６日間水を断ち、模擬旱魃状態を作り出した。その後、全ての植物に灌水し、全ての被験体に関して回復（茎および葉への水の流入による乾燥した外観の軽減および土壌表面からの茎および葉の持ち上がりと定義）を記録した。

建設過程で植被を維持することは、最も有効な浸食管理慣行の１つである（２）。図３０は、生体高分子コーティング種子と非コーティング種子、ならびに被覆度（生体高分子１０ｍｇと３０ｍｇ）の発芽率を比較したものである。発芽率は生体高分子のコーティングが厚くなるほど高くなった。１０ｍｇおよび３０ｍｇで処理した種子は双方とも非処理種子よりも有意に高い発芽率を示した（非処理４３％に対して処理種子では７３％および８３％）。

生体高分子で処理した種子および非処理種子からの実生の旱魃回復率を図２８に比較する。生体高分子コーティングの存在は植物生存率を４２％高めたが、生存率は生体高分子コーティングの量によって影響を受けなかった。

１０ｍｇおよび３０ｍｇをコーティングした種子に由来する植物は非処理種子に由来する植物よりも強制的旱魃状態に耐性が高かった。生体高分子は種子および土壌の保水力を高め、植え付けおよび植被表面の維持に要する水を削減する。植物の確立および維持するための水が少なくて、表面水の流出を抑えるための植被を形成することができれば、建設地および土壌の乱れた都市区域でのコスト削減が図れるであろう。

数品種の種子でラグドール（Ｒａｇｄｏｌｌ）種子発芽試験を行った。ラグドール種子発芽試験の手順は周知である。１つのラグドール種子発芽試験法の記載としては、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＮｅｗｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｅｄ Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ（“Ｒａｇ−Ｄｏｌｌ” Ｔｅｓｔ）， ＳＳ−ＡＧＲ−１７９， Ｆｌｏｒｉｄａ Ｆｏｒａｇｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， １９９９を参照。この試験は、いくつかの異なる植物種：ケンタッキービーン、スイスチャード、綿、キュウリ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、およびカボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）を用いた発芽試験からなった。紙（ｒａｇ）をＲＴＢＰ溶液に浸漬した。

種子の列をペーパータオルで覆い、これを個別のトレイに置き、温室で発芽させた。２４時間おきにタオルを湿らせ、常時一定水分を確保した。各群の合計発芽種子を記録した（表１７）。

レタス種子を発芽促進剤としてのＲＴＢＰを用いて処理した。種子をＲＴＢＰで発芽促進し、乾燥させた。次に、処理した種子を、温度休眠を試験するために高温下でラグ法により２４〜４８時間発芽させた。発芽率の高いもの（休眠が浅い）と発芽率の低いもの（休眠が深い）の２品種の種子を試験した。双方とも高温下で試験した。

実験１３：種子コーティング適用の結果
表１７は、ラグ法による種子発芽の結果を示す。対照区は、ＲＴＢＰ処理区に比べて低い発芽率を示す。

図６７および表１７は、ケンタッキービーン、スイスチャード、綿、キュウリ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、およびカボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）の種子発芽データを示す。これらのデータは試験１０日後の発芽率を示す。ＲＴＢＰで処理した種子は、対照よりも発芽した種子のパーセンテージが高かった。

図６２は、処理した、また非処理のレタス種子に関して２４時間後および４８時間に発芽した種子のパーセンテージを示す図である。休眠の浅い種子も深い種子も、本発明の処理を行った場合に温度休眠を打破し、対照に比べて発芽の増大を示した。

実験１４：模擬旱魃試験
模擬旱魃状態をローマトマト、ズッキーニ、およびスイートハラペーニョペッパーの３種類の植物種で試験した。

トマトおよびズッキーニ旱魃試験では、温室内で種子から植物体を生育させた。十分な大きさに達したところで、それらを粘土／シルト混合物からなる土壌の入った、２つの別個の菜園の植え床に移植した。処理区の植え床には生体高分子を側方施与（灌注しない）により３．５ｇ／株の割合で適用した。両植え床に、２日おきの灌注灌漑を使用する定期的灌水を設定した。実が付き始めたところで、水を断って旱魃条件を模擬した。９日後に、残りの植物生産周期のために灌水プログラムと定期的な施肥を再開した。４週間後、生体高分子を処理区植物に側方施与により４ｇ／株の割合で再び与えた。各植物種の質量収量に関するデータを収集した。

温室のスイートハラペーニョチリペッパー株を、コンポスト有機物からなる鉢植え用土を入れた２つの別個の菜園の植え床に植え付けた。両区画に１２−１０−５肥料を散布し、振動ファン式スプリンクラーを用いて最小限の灌水計画を設定した。生体高分子はまず、新たに移植したペッパー株に３．５ｇ／株（または２．８ｇ／平方フィート）の割合で側方施与（灌注しない）することによって与えた。５週間後、２回目の施肥を行った。７週間後、従前に側方施与を行った株に生体高分子を再び４．０ｇ／株（または３．２ｇ／平方フィート）の割合で施与した。１０週間後に熟した果実が現れ始め、１２週間後に毎日収穫を始めた。作物収量、果実質量、および１株当たりの果実数に関するデータを５週間の収穫期間にわたって収集した（表１８参照）。

実験１４：模擬旱魃試験の結果
表１９は、模擬旱魃条件下のトマトおよびズッキーニの２種類の植物種における対照区および生体高分子処理試験区の比較を示す。生体高分子処理株は１株当たりの収量に有意な改善を示し、トマトでは対照区よりも処理区で平均１株当たり３２８％の増加を示し、処理区ズッキーニ株では対照区よりも７５７％の増加を示す。

図３２は、模擬旱魃条件で生体高分子処理により果実生産の増大が得られたことを示す図である。図３２に示されるように、生体高分子処理後にトマトでは３２８．４％、ズッキーニでは７５７．０％の果実収量の増大が見られた。

図６３は、模擬旱魃下で処理した、また非処理のトマト株の根の平均質量を示す図である。根量構造における有意な増加がおそらく栄養素および水の取り込みを増大させることができ、模擬旱魃の際に株の生長力を高めた。

実験１５：金属分析
誘導結合プラズマ光学分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）試験を植物の根に対して行った。圃場試験から回収した根を１Ｎ ＨＣｌで消化し、攪拌しながら一晩消化した。これらのサンプルを０．２μΜフィルターに通した後、同時多元素検出用のＰｅｒｋｉｎｓ Ｅｌｍｅｒ Ｏｐｔｉｍａ ＴＭ２１００−ＤＶ ＩＣＰ−ＯＥＳを用いてサンプリングした。アルミニウムおよびカルシウムに関してｐｐｍデータを採取した。

図６４は、処理した、また非処理のトマト株の根におけるアルミニウム濃度を示す図であり、対照に比べて、処理株により取り込まれたアルミニウムの量が有意に低下したことを示している。このことは、ＲＴＢＰが処理株の根への取り込みを妨げ、試験を通じて見られた生長特性の増進に相当し得ることを示す。

図６５は、処理した、また非処理のダイズの根におけるアルミニウム濃度を示す図である。処理株では対照株に比べてアルミニウム濃度の減少が見られた。ダイズでは、対照に比べて処理株で１５０％を超える減少が見られた。

図６６は、処理した、また非処理のレタスの根におけるアルミニウム濃度を示す図である。ダイズの分析と同様に、処理植物では対照に比べて根のアルミニウム濃度に１５０％を超える減少が見られた。

実験１６：ダイズの圃場試験
試験はミシシッピー州でダイズについて行った。ダイズは種子で植えた。処理圃場では、休暇中に植え付けした時、ＲＴＢＰ点滴を２ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で行った。対照は非処理のままとした。最初の植え付け時に植物に施肥を行った。灌漑システムは設けず、天水で栽培した。６週間目に質的分析を行ったところ、処理区のダイズは非処理区のダイズの２倍の高さであることが示された。図６９は、生育６週間後に撮影した写真であり、植物の生育周期の初期段階での有意な改善および応答を示すために、左に非処理ダイズ区、右に処理ダイズ区を示す。

最終的なダイズの収穫では、処理したダイズでは対照よりも１９％の平均増収が得られた（表２０および図７０参照）。

表２０は、処理ダイズおよび非処理ダイズそれぞれ３区画の平均から得られたデータを示し、対照に対して処理ダイズでは有意な増加を示す。図７０は、ダイズ圃場試験の結果を示す図であり、処理区画と非処理区画の区画当たりの平均収量（３区画の平均）を示す。処理区画は、対照区画に対して１９％の収量増加を示した。

試験周期の大部分が自然旱魃中であった。生育周期の後半部分にのみ自然降雨があり、作物の収穫が可能であった。これらの結果は通常の灌水周期の際に予測されるものよりも差は小さいが、やはり本発明のＲＴＢＰの乾燥条件のダイズを助ける能力を示すと考えられる。さらに、処理ダイズ試験区画は、非処理試験区画よりも一貫性が高かった。

実験９〜１６：考察
ＲＴＢＰは、広範な適用方法、作物種および土壌種で収量の改善に有意な結果をもたらす。試験した適用方法には、種子コーティング、側方施与、シードトレンチ、シードポット、根鉢浸漬、および表面散布が含まれた。さらに、ＲＴＢＰを、アンモニウムを含んだ従来の肥料に配合したところ、この場合にも対照試験よりも性能の改善を示した。このことは、ＲＴＢＰが、全てとは言えないまでも大部分の農業場面で適用可能であることを示唆する。

ＲＴＢＰの現状の農業慣行への組み込みは、ダイズ、スイカおよびスイートハラペーニョチリペッパーを含む数種の作物では性能を果たした。この生体高分子を、施与からの労力コストの増大をなくすために従来の施肥法の１つに組み込んだ。これらの各試験では１回の適用だけで性能を果たした。この適用は植え付け時期の始めに行った。生体高分子処理区域向けに特別な処理は行わずに、栽培周期の間、規定の農業慣行を続けた。生体高分子処理区域では対照試験区に対して１９％の収量増加が見られた。スイカは生体高分子で処理した場合、対照に対して８１３％の増加が見られ、スイートハラペーニョチリペッパーでは、１回目の収穫と２回目の収穫のそれぞれに１８．７％と１９．１％の増加が見られた。このことは、本生体高分子が追加適用の必要や適用からの労力コストの増大なく、現状の農業慣行において付加的ツールとして有用性を持つことを示唆する。

植物の状態および生長力の改善は植物の生活環を通じて見られた。トマト株では、地上部の草丈の増大、ならびに各株に伴う節および茎葉の数の増大が見られた。様々な段階のトマト株の生長の増大が見られた。ダイズでは、生体高分子で処理した植物は対照物のほぼ２倍の大きさであった。このことは、生体高分子が植物周期の初期に相互作用するとともに植物のより広範な根の発達を可能にするということを示唆する。

初期の性能の増強は全ての作物で見られた。作物によっては、生活環の初期には高い性能を示し、栽培周期の収穫期間には性能は低下したが、対照よりも高いままで維持された。物理的特性の増大は植物生育の初期段階では重要であった。このことは、植物の生育周期に複数回生体高分子で処理すると、植物の一生の最終段階でさらなる増収が得られる得ることを示唆する。

全ての実験過程で見られた１つの機構は、生体高分子処理植物による根域における微細構造の広範囲の発達であった。根の発達を分析した全ての作物で、根系の面積および密度の増大が見られた。この根域発達の増大は栄養素の取り込みの増大を可能とし、より高い収量を上げる植物の能力を改善する。微細構造の範囲が拡大すると土壌中の利用可能な栄養素への接近が容易になり、果実生産の増大と密接に結び付く。

根系への金属の取り込みを数種の作物で追跡した。アルミニウム取り込みの減少は、対照試験区に対して生体高分子で処理した全ての作物で一律に見られた。これに関していくつかの可能性のある機構が存在する。生体高分子は、それをこの明確な目的の適用に理想的なものとする既知のキレート特性を持っている。土壌背景に見られる濃縮物の多くは植物生長におけるアルミニウム毒性の閾値付近であるとは考えられなかったが、アルミニウム取り込みの有意な減少が見られた。他の金属が検出されるという傾向は見られず、これは本生体高分子による土壌中のアルミニウムの結合がある程度優先的であることを示唆する。

旱魃条件試験では、対照作物よりも有意な増大が見られた。数種の植物では、生体高分子で処理した植物は果実収量で有意に対照植物をしのいだ。一般に、模擬旱魃期間の終了付近では、対照植物の活力は大きな影響を受けた。生体高分子で処理した植物は旱魃期間の間もはるかに健全な特徴を維持した。定期的灌水周期を再開した際に、対照植物は旱魃からの回復により長期間を要し、旱魃状態後も生体高分子で処理した植物の性能に達することはなかった。

生体高分子は試験した全ての植物の収量、生長力および物理的特性を大幅に改善する。種子コーティングに応用するにはさらなる実験が必要であるが、農業生産者の現在の道具箱に加わる物として使用すれば大きな潜在的利益があり得る。収量の低下は絶えず農業生産者を悩ませ、これらの試験に用いたＲＴＢＰの組み込みはこれらの傾向を逆転させる助けとなり得る。ＲＴＢＰは天然の微生物により作り出された天然物質であり、「グリーン」で環境に優しく、持続可能な農業利用に役立つ。さらに、農業場面での材料を使用することからもたらされる利益は観葉植物への適用、影響を受けた区域での緑化運動、および斜面安定性のための土壌における生長の確立およびその他の適用を見出せる。このことは本ＲＴＢＰを種々の適用のための確かな土壌添加剤とする。

実験１７
２０Ｌの栄養培養液リアクターを調製した。培養液は２０Ｌの水、２０ｇ酵母、５０ｇの糖、１９０．２ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｇのＫ_２ＨＰＯ_４、２．０ｇのＭｇＳＯ_４、および３ｇのＣａＣｌ_２・Ｈ_２Ｏを含んだ。

Ｒ．トロピシ細菌を上記の培養液の約１／２が入ったバイオリアクターに加えた。培養物を形成させた。培養物が発泡を始めたら、１日おきに２．５Ｌの定率で培養液を、リアクターが２０Ｌの容量一杯になるまで（約８日間）追加した。

リアクターが容量一杯になったところで、毎日サンプルを採取した。容量一杯になってから２日後に、さらに５０ｇの糖を０．００１３ｇのナリンゲニン（５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）クロマン−４−オン、フラボノイドである）とともに追加した。リアクターは約１〜２．５ｍｇ／Ｌの溶存酸素（Ｄ．Ｏ．）レベルで維持した。ＤＯレベルが２〜３ｍｇ／Ｌのレベルに達した時［他の適当なレベルとしては、３ｍｇ／Ｌを超えそのリアクター温度での水溶液の飽和限界まで様々なものを含み、好ましいＤ．Ｏ．レベルは２．５ｍｇ／Ｌであった］、さらに５０ｇの糖を追加した。Ｄ．Ｏ．レベルが１ｍｇ／Ｌ未満に留まっている時点で、速度可変容積式ブロワに連結した微小気泡拡散（０．４５μｍ直列フィルターを通す）によってバイオリアクターに通気してＤ．Ｏ．レベルを高め、それを約１〜２．５ｍｇ／Ｌに維持した。

リアクターは３５℃（９５°Ｆ）に維持した。リアクターを２３．９℃〜４０．６℃（７５°Ｆ〜１０５°Ｆ）の間に維持することによっても同様の結果を得ることができるが、好ましい温度は約３５℃（９５°Ｆ）である。リアクターは６週間培養した。リアクターを４〜８週間培養することによっても同様の結果を得ることができるが、好ましい期間は６週間である。毎日のサンプリング過程で、バイオリアクター内のＥＰＳ濃度の測定を行った。培養が完了したリアクターは少なくとも６ｇ／ＬのＥＰＳを含んでおり、好ましい濃度は８ｍｇ／Ｌであり、ＥＰＳ濃度の範囲は０ｍｇ／Ｌ〜２６ｍｇ／Ｌとなっており、可能性としてはリアクターは６０ｍｇ／Ｌもの高さとなり得る。

６週間で好ましいＥＰＳ濃度に達したら、リアクターの一部を取り出した。この取り出した部分はすぐにアルカリ剤を用いて溶解させた。アルカリ剤は水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。この例で用いる特定のアルカリ剤は好ましいアルカリ剤、すなわち水酸化ナトリウムであった。この溶解部分をｐＨ１１に上昇させた。溶解部分は少なくとも９．５、高くて１３のｐＨに上昇させることができるが、好ましいｐＨは約１１である。これにはアルカリ剤のリアクター部分におけるＥＰＳの約３重量％が必要であった。しかしながら、アルカリ剤のリアクター部分におけるＥＰＳの重量％は、低くてリアクター容積中のＥＰＳの０．５重量％、高くて５重量％であり得る。

次に、この溶解部分に濃縮工程を行い、材料をフラッシュ蒸発、凍結乾燥、回転蒸発、真空蒸留、スチーム蒸発、接触乾燥、煮沸、溶媒沈降、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれかによって脱水した。用いた具体的な方法は、好ましい方法である接触乾燥であった。この結果、溶解材料の容積が減り、８５％減となった。この溶解材料の容積減は少なくとも５％減、高くて９５％減の範囲内で制御することができるが、好ましい容積減は８５％である。

実験１７から、少なくとも０．８重量％のリゾビウム・トロピシ細胞外高分子物質（ＲＴＥＰＳ）〜８重量％のＲＴＥＰＳを含む乾燥塩が得られたが、好ましい濃度は６重量％のＥＰＳであった。

実験１８
アルカリ剤で溶解する前に濃縮工程を行ったこと以外は実験１７と同じ手順を用いた。
より具体的には、培養材料のＥＰＳが十分高濃度となったところで、速やかにその容積を減じた。容積減はフラッシュ蒸発、凍結乾燥、回転蒸発、真空蒸留、スチーム蒸発、接触乾燥、煮沸、溶媒沈殿、およびそれらの組合せによって行うことができる。用いた具体的な方法は好ましい方法である接触乾燥であった。溶解材料の容積減は８５％であった。この溶解材料の容積減は少なくとも５％減、高くて９５％減の範囲内で制御することができるが、好ましい容積減は８５％である。

この容積減部分を次にアルカリ剤を用いて溶解させた。アルカリ剤は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。この実験では、用いた具体的なアルカリ剤は好ましいアルカリ剤である水酸化ナトリウムであった。この溶解部分をｐＨ１１に上昇させた。溶解部分のｐＨは少なくとも９．５、高くて１３に上昇させることができるが、好ましいｐＨは約１１である。このｐＨを達成するにはアルカリ剤のリアクター部分におけるＥＰＳの約３重量％が必要であったが、低くてリアクター容積におけるＥＰＳの０．５重量％、高くて５重量％であり得る。

実験１８から、少なくとも０．８重量％のリゾビウム・トロピシ細胞外高分子物質（ＲＴＥＰＳ）〜８重量％のＲＴＥＰＳを含む乾燥塩が得られたが、好ましい濃度は６重量％のＥＰＳであった。

本発明をその特定の好ましい形態に関してかなり詳細に記載したが、他の形態も可能である。よって、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲は、本明細書に含まれている好ましい形態の記載に限定されるものではない。

本明細書（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示されている特徴は全て、そうではないことが特に明示されない限り、同一、等価または類似の目的を果たす別の特徴に置き換えることができる。よって、そうではないことが特に明示されない限り、開示されている各特徴は、一般的な一連の等価または類似の特徴の単に一例に過ぎない。

Claims (30)

1. リゾビウム・トロピシの生命活動によって生産された少なくとも１種類の細胞外高分子物質（ＥＰＳ：extracellular polymeric substance）の生体高分子を含む塩であって、
   組成物を培養する工程
   （ここで、この組成物はリゾビウム・トロピシの培養物、水、少なくとも１種類の酵母、少なくとも１種類の糖、少なくとも１種類のリン酸カリウム、および少なくとも１種類の塩化カルシウムを含み、
   培養は１８．３〜４０．６℃（６５〜１０５°Ｆ）の温度で行われ、
   培養は好気的条件で行われ、好気的条件は少なくとも０．１ｍｇ／Ｌの溶存酸素レベルを含み、
   培養は４〜８週間の培養期間で行われる）、
   培養期間中に組成物に少なくとも１回の追加栄養素を添加する工程（ここで、少なくとも１回の追加栄養素は少なくとも１種類のフラボノイドおよび少なくとも１種類の糖を含む）、
   組成物のＥＰＳ濃度が少なくとも４ｇ／Ｌになった時に組成物から培養済み組成物を回収する工程、
   培養済み組成物をフラッシュ蒸発、凍結乾燥、回転蒸発、真空蒸留、スチーム蒸発、接触乾燥、煮沸、溶媒沈殿、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれかによって脱水する工程、
   培養済み組成物にアルカリ剤を添加してｐＨを約９．５〜１３とする工程、および
   培養済み組成物から塩を回収する工程
   を含む方法によって生産される塩。
2. 脱水工程後に、培養済み組成物が組成物の少なくとも１０重量％となる、請求項１に記載の塩。
3. フラボノイドがブチン、エリオジクチオール、ヘスペレチン、ヘスペリジン、ホモエリオジクチオール、イソサクラネチン、ナリンゲニン、ナリンギン、ピノセンブリン、ポンシリン、サクラネチン、サクラニン、ステルビン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の塩。
4. フラボノイドがナリンゲニンである、請求項１に記載の塩。
5. 培養済み組成物の脱水が接触乾燥を含む、請求項１に記載の塩。
6. 培養工程中にＥＰＳが１ｇ／週〜１０ｇ／週の速度で生成される、請求項１に記載の方法。
7. アルカリ剤が水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
8. アルカリ剤が生成工程の前に添加される、請求項１に記載の塩。
9. ０．０５〜５重量％のアルカリ剤の塩が添加される、請求項１に記載の塩。
10. 好気的条件が少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ〜水が酸素で飽和する飽和レベルまでの溶存酸素レベルを含む、請求項１に記載の塩。
11. 組成物が
    ９４〜９９重量％の水、
    ０．０５〜０．２重量％の少なくとも１種類の酵母、
    ０．１０〜１重量％の少なくとも１種類の糖、
    ０．５〜３重量％の少なくとも１種類のリン酸カリウム、および
    ０．００１〜０．０１重量％の少なくとも１種類の塩化カルシウム
    を含む、請求項１に記載の塩。
12. ０．８〜８重量％のＥＰＳを含む、請求項１に記載の塩。
13. 種子を請求項１に記載の塩で発芽促進することによって１つ以上の種子の休眠を軽減する方法。
14. １つ以上の種子のコーティングまたはペレットに請求項１の塩を配合することによって１つ以上の種子の休眠を軽減する方法。
15. 土壌に請求項１に記載の塩を加えて土壌の約０．２重量％〜約１０重量％の塩を含む土壌混合物を作出することを含む、種子の発芽を増大させる方法。
16. 土壌に請求項１に記載の塩を加えて土壌の約０．２重量％〜約１０重量％の塩を含む土壌混合物を作出することによって土壌浸食を防止する方法。
17. 浸食の防止が重金属汚染を防ぐ、請求項１６に記載の方法。
18. 土壌に請求項１に記載の塩を加えて土壌の約０．２重量％〜約１０重量％の塩を含む土壌混合物を作出することによって農業生産を増大させる方法。
19. 土壌に請求項１に記載の塩を０．１０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）〜２０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で加えることによって農業生産を増大させる方法。
20. 塩が金属キレート剤である、請求項１９に記載の方法。
21. 金属がアルミニウムである、請求項２０に記載の方法。
22. 土壌に請求項１に記載の塩を０．１ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）〜２０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で加えることによってマメ科植物の根粒形成を増大させる方法。
23. 土壌に請求項１に記載の塩を２ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）〜１１０ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で加えることによって農作物および緑化地における旱魃状態を緩和する方法。
24. 土壌に請求項１に記載の塩を土壌の０．１重量％〜３重量％の割合で加えることによって農作物および緑化地における旱魃状態を緩和する方法。
25. 土壌に請求項１に記載の塩を土壌の０．１重量％〜３重量％の割合で加えることによって、植物生長を回復させるために金属汚染土壌を改良する方法。
26. 土壌に請求項１に記載の塩を０．１ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）〜２ｋｇ／エーカー（４０４７ｍ^２）の割合で加えることによって、土壌浸食を防止するために草を活着させる方法。
27. 浸食の防止が栄養素および堆積物の水体への集積を防ぐ、請求項２６に記載の方法。
28. 種子を請求項１に記載の塩でコーティングすることを含む、種子の発芽を増大させる方法。
29. リゾビウム・トロピシの生命活動によって生産された少なくとも１種類の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）の生体高分子を含む塩を製造する方法であって、
    リゾビウム・トロピシの培養物を、水と第一の栄養素セットとを含む容器に入れる工程（ここで、この第一の栄養素セットは少なくとも１種類の酵母、少なくとも１種類の糖、少なくとも１種類のリン酸カリウム、および少なくとも１種類の塩化カルシウムを含む）、
    該培養物を均一に混合されたリアクターにて好気的条件下、１８．３〜４０．６℃（６５〜１０５°Ｆ）の温度で維持する工程（ここで、この好気的条件は少なくとも０．１ｍｇ／Ｌの溶存酸素レベルを含む）、
    この水−栄養素混合物を４〜８週間の培養期間で培養し、培養期間中に少なくとも１種類のフラボノイドおよび糖を含む少なくとも１回の追加栄養素を添加すること；
    培養済み材料のＥＰＳ濃度が、容器から取り出す前に必ず少なくとも４ｇ／Ｌとなっているようにする工程、
    フラッシュ蒸発、凍結乾燥、回転蒸発、真空蒸留、スチーム蒸発、接触乾燥、煮沸、溶媒沈殿、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれかによって脱水混合物を生成する工程、および
    この混合物にアルカリ剤を、該混合物がｐＨ約９．５〜１３に達するまで添加して乾燥塩を回収する工程
    を含む方法。
30. 組成物を培養する工程
    （ここで、この組成物はリゾビウム・トロピシの培養物、水、少なくとも１種類の酵母、少なくとも１種類の糖、少なくとも１種類のリン酸カリウム、および少なくとも１種類の塩化カルシウムを含み、
    培養は１８．３〜４０．６℃（６５〜１０５°Ｆ）の温度で行われ、培養は好気的条件で行われ、好気的条件は少なくとも０．１ｍｇ／Ｌの溶存酸素レベルを含み、
    培養は４〜８週間の培養期間で行われる）、
    培養期間中に組成物に少なくとも１回の追加栄養素を添加する工程（ここで、少なくとも１回の追加栄養素は少なくとも１種類のフラボノイドおよび糖を含む）、
    組成物のＥＰＳ濃度が少なくとも４ｇ／Ｌになった時に組成物から培養済み組成物を回収する工程、
    培養済み組成物をフラッシュ蒸発、凍結乾燥、回転蒸発、真空蒸留、スチーム蒸発、接触乾燥、煮沸、溶媒沈殿、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれかによって脱水する工程、
    培養済み組成物にアルカリ剤を添加してｐＨを約９．５〜１３とする工程、および
    培養済み組成物から塩を回収する工程
    を含む方法。