JP2014505480A - Virus-resistant transgenic silkworm - Google Patents
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Abstract
ウイルス抵抗性トランスジェニックカイコおよびその作製の方法が、本明細書で提供される。本明細書で開示するトランスジェニックカイコは、少なくとも2つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAの同時および構成的発現を示す。本発明のトランスジェニックカイコは、バキュロウイルスのウイルス遺伝子のRNA干渉(RNAi)媒介抑制によって作製される。 Viral resistant transgenic silkworms and methods for their production are provided herein. The transgenic silkworms disclosed herein exhibit simultaneous and constitutive expression of double stranded RNA of at least two viral genes. The transgenic silkworm of the present invention is produced by RNA interference (RNAi) mediated suppression of baculovirus viral genes.
Description
本発明は、トランスジェニック昆虫、家畜化されたカイコ、ボンビックス・モリ(Bombyx mori L.)におけるバキュロウイルス感染の抑制のためのRNA干渉(RNAi)の使用に関する。PiggyBacトランスポゾンベースのベクターによって、我々は、4つの必須ウイルス遺伝子、すなわち、前初期-1(immediate early-1; ie-1)、後期エフェクター因子(late effector factors; lef1および3)およびp74に対する二本鎖RNAを構成的に産生するトランスジェニックカイコの18のホモ接合系統を得た。 The present invention relates to the use of RNA interference (RNAi) for the suppression of baculovirus infection in transgenic insects, domesticated silkworms, Bombyx mori L .. With the PiggyBac transposon-based vector, we have two essential viral genes: two for early early-1 (ie-1), late effector factors (lef1 and 3) and p74. Eighteen homozygous lines of transgenic silkworms that constitutively produce strand RNA were obtained.
家畜化されたカイコ、ボンビックス・モリは、重大な経済的重要性を有する主要な鱗翅目の昆虫であり、ゲノム解析のための理想的な鱗翅目モデル系ともみなされている(Nagaraju J and Goldsmith MR (2002) Silkworm genomics - progress and prospects. Current Science 83: 415-425; Nagaraju J, Klimenko V and Couble P (2000) The silkworm Bombyx mori, a model genetic system. In Encyclopedia of Genetics, ed. Reeves E. (Fitzroy Dearborn, London), pp. 219-239)。経済的昆虫および遺伝的ツールとしてのその有用性に加えて、カイコの産業的適用が、PiggyBacトランスポゾンベースのベクターを使用した、成功的な生殖系列遺伝子導入によって、増大している(Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki T, Chantal T, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc T, Bernard M, Gerard C, Paul S, Malcolm F, Jean-Claude P and Pierre C (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology 18: 81-84)。この鱗翅目は、インドにおける何百万の農家に生計を提供するのだが、農家の収入は、ウイルスボンビックス・モリ核多角体病ウイルス(BmNPV)によって引き起こされる重度のバキュロウイルス病害のために影響される。作物の損失のほと
んど50%が、バキュロウイルスによって占められている。バキュロウイルス感染サイクルの最後に産生される多角ウイルス体(polyhedral viral body)の頑強な性質は、特に夏および暑く湿った季節において広く蔓延したウイルス感染を助長する。したがって、BmNPV抵抗性カイコ株の開発は、絹繭収穫高を安定化し、絹生産高を改善し、その結果、養蚕の経済を改善するための最大の優先事項である。
The domesticated silkworm, Bombix mori, is a major lepidopteran insect of significant economic importance and is also regarded as an ideal lepidopteran model system for genome analysis (Nagaraju J and Goldsmith MR (2002) Silkworm genomics-progress and prospects.Current Science 83: 415-425; Nagaraju J, Klimenko V and Couble P (2000) The silkworm Bombyx mori, a model genetic system.In Encyclopedia of Genetics, ed.Reeves E. (Fitzroy Dearborn, London), pp. 219-239). In addition to its usefulness as an economic insect and genetic tool, the industrial application of silkworms has been augmented by successful germline gene transfer using PiggyBac transposon-based vectors (Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki T, Chantal T, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc T, Bernard M, Gerard C, Paul S, Malcolm F, Jean-Claude P and Pierre C (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon- derived vector. Nature Biotechnology 18: 81-84). The Lepidoptera provide livelihoods for millions of farmers in India, but farmers' incomes are impacted by severe baculovirus disease caused by the virus Bombyx Mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) Is done. Almost 50% of crop losses are accounted for by baculovirus. The robust nature of the polyhedral viral body produced at the end of the baculovirus infection cycle facilitates widespread viral infections, especially in the summer and hot and humid seasons. Therefore, the development of BmNPV resistant silkworm strains is the primary priority for stabilizing silk cocoon yields and improving silk production and consequently improving the sericulture economy.
BmNPVは、バキュロウイルス科のメンバーであり、節足動物、主に昆虫に感染する無脊椎動物ウイルスの14の主要なファミリーの1つである(van Regenmortel MH, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo MA, McGeoch DJ, Pringle CR and Wickner RB (2000) Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Academic Press, San Diego, Wien New York.; Murphy FA, Fauquet CM, Bishop DHL, Ghabrial SA, Jarvis AW, Martelli GP, Mayo MA and Summers MD (1995) Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Virus. (Springer Verlag, Wien, New York)。バキュロウイルスの大部分のように、BmNPVは、宿主特異的であり、ボンビックス・モリN(BmN)細胞に対して高い感染性であるが、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) 21 (Sf21)細胞において複製しない(Kondo A and Maeda S (1991) Host range expansion by recombination of the baculoviruses Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of Virology 65: 3625-3632)。バキュロウイルスの生活環は、カイコが、多角封入体(Polyhedral Inclusion Body; PIB、封入体由来ウイルス(occlusion derived virus)としても知られている)として葉上に残された環境に抵抗性のウイルス粒子を食べた場合に生じ、中腸のアルカリ性の環境に入った時に、受容体を通しての中腸細胞中への侵入を獲得する遊離ウイルス粒子(free virion)を放出する。細胞内で、ウイルス遺伝子は、宿主RNAポリメラーゼIIによって、前初期-1 (ie-1)、ie-2などの初期遺伝子が、初期プロモーターから転写され、一時的な様式で転写を開始する(Huh NE and Weaver RF (1990a) Categorizing some early and late transcripts directed by the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of General Virology 71: 2195-2200)。これに、アマニチン抵抗性ウイルスRNAポリメラーゼが、極後期遺伝子(very late gene)の転写を開始する間、他の後期エフェクター因子(lef)の発現が続く(Huh NE and Weaver RF (1990b) Identifying the RNA polymerases that synthesize specific transcripts of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of General Virology 71: 195-201)。最後に、多角外被内に被包されたウイルス粒子が、細胞溶解および感染した幼虫の完全な分解によって、環境に放出される。PIBと対照的に、多角カバーなしで細胞内で形成される遊離ウイルス(free virus)(発芽型ウイルス(Budded Virus-BV)として知られている)は、個体内感染(intra-individual infection)を開始する。幼虫の気管系は、バキュロウイルスが、基底層を通過し、感染を蔓延させるための主要なチャネルを提供する(Engelhard E, Kam-Morgan L, Washburn J and Volkman L (1994) The insect tracheal system: A conduit for the systemic spread of Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 3224-3227)。 BmNPV is a member of the Baculoviridae family and is one of 14 major families of invertebrate viruses that infect arthropods, primarily insects (van Regenmortel MH, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo MA, McGeoch DJ, Pringle CR and Wickner RB (2000) Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Academic Press, San Diego, Wien New York .; Murphy FA, Fauquet CM Bishop DHL, Ghabrial SA, Jarvis AW, Martelli GP, Mayo MA and Summers MD (1995) Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Virus. (Springer Verlag, Wien, New York). BmNPV is host-specific and highly infectious to Bombix Mori N (BmN) cells, but does not replicate in Spodoptera frugiperda 21 (Sf21) cells (Kondo A and Maeda S (1991) Host range expansion by recombination of the baculovir Journal of Virology 65: 3625-3632) Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and Autographa californica nuclear polyhedrosis virus.Journal of Virology 65: 3625-3632) Life cycle of baculovirus is polyhedral inclusion body (PIB, inclusion body-derived virus (occlusion derived virus). (also known as `` virus '') occurs when you eat virus particles that are resistant to the environment left on the leaves, and when you enter the alkaline environment of the midgut, through the receptor into the midgut cells Release free virions that gain invasion. In the cell, the viral gene is transcribed from the early promoter by host RNA polymerase II from the early promoter-1 (ie-1), ie-2, and begins transcription in a transient manner (Huh). NE and Weaver RF (1990a) Categorizing some early and late transcripts directed by the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of General Virology 71: 2195-2200). This is followed by the expression of other late effector factors (lef) while Amanitin-resistant viral RNA polymerase initiates transcription of the very late gene (Huh NE and Weaver RF (1990b) Identifying the RNA polymerases that synthesize specific transcripts of the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Journal of General Virology 71: 195-201). Finally, the viral particles encapsulated in the polyhedron are released into the environment by cell lysis and complete degradation of the infected larvae. In contrast to PIB, free virus (known as Budded Virus-BV), which forms in cells without a multifaceted cover, causes intra-individual infection. Start. The larval tracheal system provides the main channel for baculoviruses to pass through the basal layer and spread the infection (Engelhard E, Kam-Morgan L, Washburn J and Volkman L (1994) The insect tracheal system: A conduit for the systemic spread of Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 3224-3227).
プラスミドDNA複製を使用することによって、ie-1、lef-1、lef-2およびlef-3などのlef遺伝子は、複製に必須であることが示された(Lu A and Miller L (1995) The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA replication. Journal of Virology 69: 975-982)。バキュロウイルス前初期-1 (ie-1)遺伝子は、ウイルス複製に必要な5つの必須遺伝子の1つである(Lu A and Miller L (1995) The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA replication. Journal of Virology 69: 975-982; Kool M, Ahrens C, Goldbach R, Rohrmann G and Vlak J (1994) Identification of genes involved in DNA replication of the Autographa californica baculovirus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 11212-11216)。IE-1は、ie-2、39Kおよびp35を含めた初期遺伝子のプロモーターを活性化することが示唆され(Carson D, Summers M and Guarino L (1991) Molecular analysis of a baculovirus regulatory gene. Virology 182: 279-286; Guarino LA and Summers MD (1986) Functional mapping of a trans-activating gene required for expression of a baculovirus delayed-early gene. Journal of Virology 57: 563-571; Nissen MS and Friesen PD (1989) Molecular analysis of the transcriptional regulatory region of an early baculovirus gene. Journal of Virology 63: 493-503)、直接的または間接的に後期遺伝子の発現に関与する(Passarelli A and Miller L (1993) Three baculovirus genes involved in late and very late gene expression: ie-1, ie-n, and lef-2. Journal of Virology 67: 2149-2158)。DNA複製に重要な後期発現因子の1つは、後期および極後期遺伝子発現に関与する遺伝子lef-1である(Kool M, Ahrens C, Goldbach R, Rohrmann G and Vlak J (1994) Identification of genes involved in DNA replication of the Autographa californica baculovirus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 11212-11216)。LEF-1は、DNA複製の開始に必須であるDNAプライマーゼである(Isobe R, Kojima K, Matsuyama T, Quan GX, Kanda T, Tamura T, Sahara K, Asano SI and Bando H (2004) Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms. Archives Virology 149: 1931-1940)。しかしながら、lef-1単独のRNAi媒介ノックダウンは、バキュロウイルス増殖の完全な抑止を示さなかった(Isobe R, Kojima K, Matsuyama T, Quan GX, Kanda T, Tamura T, Sahara K, Asano SI and Bando H (2004) Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms. Archives Virology 149: 1931-1940)。 By using plasmid DNA replication, lef genes such as ie-1, lef-1, lef-2 and lef-3 have been shown to be essential for replication (Lu A and Miller L (1995) The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA replication. Journal of Virology 69: 975-982). The baculovirus immediate early-1 (ie-1) gene is one of five essential genes required for viral replication (Lu A and Miller L (1995) The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA Journal of Virology 69: 975-982; Kool M, Ahrens C, Goldbach R, Rohrmann G and Vlak J (1994) Identification of genes involved in DNA replication of the Autographa californica baculovirus.Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 11212 -11216). IE-1 is suggested to activate the promoters of early genes including ie-2, 39K and p35 (Carson D, Summers M and Guarino L (1991) Molecular analysis of a baculovirus regulatory gene.Virology 182: 279-286; Guarino LA and Summers MD (1986) Functional mapping of a trans-activating gene required for expression of a baculovirus delayed-early gene.Journal of Virology 57: 563-571; Nissen MS and Friesen PD (1989) Molecular analysis of the transcriptional regulatory region of an early baculovirus gene.Journal of Virology 63: 493-503), directly or indirectly involved in the expression of late genes (Passarelli A and Miller L (1993) Three baculovirus genes involved in late and very late gene expression: ie-1, ie-n, and lef-2. Journal of Virology 67: 2149-2158). One of the late expression factors important for DNA replication is lef-1, a gene involved in late and extreme late gene expression (Kool M, Ahrens C, Goldbach R, Rohrmann G and Vlak J (1994) Identification of genes involved. in DNA replication of the Autographa californica baculovirus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 11212-11216). LEF-1 is a DNA primase essential for initiation of DNA replication (Isobe R, Kojima K, Matsuyama T, Quan GX, Kanda T, Tamura T, Sahara K, Asano SI and Bando H (2004) Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms. Archives Virology 149: 1931-1940). However, RNAi-mediated knockdown of lef-1 alone did not show complete suppression of baculovirus growth (Isobe R, Kojima K, Matsuyama T, Quan GX, Kanda T, Tamura T, Sahara K, Asano SI and Bando H (2004) Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms. Archives Virology 149: 1931-1940).
Lef-3遺伝子は、DNA複製に必要な、バキュロウイルスによってコードされる遺伝子の別の必須の初期クラスである(Lu A and Miller L (1995) The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA replication. Journal of Virology 69: 975-982; Kool M, Ahrens C, Goldbach R, Rohrmann G and Vlak J (1994) Identification of genes involved in DNA replication of the Autographa californica baculovirus. Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 11212-11216; Li Y, A L Passarelli AL and Miller LK (1993) Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression. Journal of Virology 67: 5260-5268)。LEF-3は、推定上のDNAヘリカーゼ、P143の核局在化を媒介する(Wu Y and Carstens EB (1998) A baculovirus single-stranded DNA binding protein, LEF-3, mediates the nuclear localization of the putative helicase P143. Virology 247: 32-40, Chen Z and Carstens EB (2005) Identification of domains in Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus late expression factor 3 required for nuclear transport of P143. Journal of Virology 79: 10915-10922)ホモ三量体を形成する、一本鎖DNA結合タンパク質である(Wu Y and Carstens EB (1998) A baculovirus single-stranded DNA binding protein, LEF-3, mediates the nuclear localization of the putative helicase P143. Virology 247: 32-40)。 The Lef-3 gene is another essential early class of genes encoded by baculovirus that is required for DNA replication (Lu A and Miller L (1995) The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA. Journal of Virology 69: 975-982; Kool M, Ahrens C, Goldbach R, Rohrmann G and Vlak J (1994) Identification of genes involved in DNA replication of the Autographa californica baculovirus.Proceedings National Academy of Sciences USA 91: 11212 -11216; Li Y, AL Passarelli AL and Miller LK (1993) Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression. Journal of Virology 67: 5260-5268). LEF-3 mediates nuclear localization of P143, a putative DNA helicase (Wu Y and Carstens EB (1998) A baculovirus single-stranded DNA binding protein, LEF-3, mediates the nuclear localization of the putative helicase P143. Virology 247: 32-40, Chen Z and Carstens EB (2005) Identification of domains in Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus late expression factor 3 required for nuclear transport of P143. Journal of Virology 79: 10915-10922) A single-stranded DNA binding protein that forms (Wu Y and Carstens EB (1998) A baculovirus single-stranded DNA binding protein, LEF-3, mediates the nuclear localization of the putative helicase P143. Virology 247: 32-40) .
P74は、病原性に必須である(Kuzio J, Jaques R and Faulkner P (1989) Identification of p74, a gene essential for virulence of baculovirus occlusion bodies. Virology 173: 759-763)が、DNA複製に関連していない、ウイルス粒子のODV型において発見される外被タンパク質である(Kuzio J, Jaques R and Faulkner P (1989) Identification of p74, a gene essential for virulence of baculovirus occlusion bodies. Virology 173: 759-763; Faulkner P, Kuzio J, Williams GV and Wilson JA (1997) Analysis of P74, a PDV envelope protein of Autographa californica nucleopolyhedrovirus required for occlusion body infectivity in vivo. Journal of General Virology 78: 3091-310)。それは、バキュロウイルスの生活環において後期に転写され、経口的接種の間、中腸へのウイルス粒子の付着を助けると考えられている(Haas-Stapleton EJ, Washburn JO and Volkman LE (2004) P74 mediates specific binding of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus occlusion-derived virus to primary cellular targets in the midgut epithelia of Heliothis virescens larvae. Journal of Virology 78: 6786-6791)。 P74 is essential for virulence (Kuzio J, Jaques R and Faulkner P (1989) Identification of p74, a gene essential for virulence of baculovirus occlusion bodies.Virology 173: 759-763) but is associated with DNA replication. Vulology 173: 759-763; Faulkner (Kuzio J, Jaques R and Faulkner P (1989) Identification of p74, a gene essential for virulence of baculovirus occlusion bodies. P, Kuzio J, Williams GV and Wilson JA (1997) Analysis of P74, a PDV envelope protein of Autographa californica nucleopolyhedrovirus required for occlusion body infectivity in vivo. Journal of General Virology 78: 3091-310). It is transcribed late in the life cycle of baculovirus and is thought to help adhere viral particles to the midgut during oral inoculation (Haas-Stapleton EJ, Washburn JO and Volkman LE (2004) P74 mediates specific binding of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus occlusion-derived virus to primary cellular targets in the midgut epithelia of Heliothis virescens larvae. Journal of Virology 78: 6786-6791).
RNA干渉(RNAi)は、遺伝子ノックダウンにつながる選択的mRNA破壊の現象である(Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S and Mello C (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811)。RNAiは、現在、古代の抗ウイルス戦略であると考えられており(Lindenbach B and Rice C (2002) RNAi targeting an animal virus: news from the front. Molecular Cell 9: 925-927; Downward J (2004) RNA interference. British Medical Journal 328: 1245-1248)、その一部を細胞機械が遺伝子調節機構にも利用している(Denli AM and Hannon GJ (2003) RNAi: an ever-growing puzzle. Trends in Biochemical Sciences 28: 196-201; Agrawal N, Dasaradhi PV, Mohmmed A, Malhotra P, Bhatnagar RK and Mukherjee SK (2003) RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and Molecular Biology Review 67: 657-685)。RNAiは、カイコB. moriを含めた多くの節足動物種において働くことが示され(Riu HL, Li W-X and Ding S-W (2004) RNA-based immunity in insects. In SGM symposium 63: Microbe-vector interactions in vector-borne diseases, ed. S. H. Gillespie, G. L. S. A. O. (Cambridge University Press) pp. 63-74)、スポドプテラ・フルギペルダにおけるAcNPV増殖を抑止することが実証された(Valdes VJ, Sampieri A, Sepulveda J and Vaca L (2003) Using double-stranded RNA to prevent in vitro and in vivo viral infections by recombinant baculovirus. Journal of Biological Chemistry 278: 19317-19324)一方、lef-1単独およびie-1単独を標的とするRNAiは、B. moriにおけるBmNPV増殖を効率的に抑制するために効果的ではなかった(Isobe R, Kojima K, Matsuyama T, Quan GX, Kanda T, Tamura T, Sahara K, Asano SI and Bando H (2004) Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms. Archives Virology 149: 1931-1940; Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms, Insect Molecular Biology 16: 635-644)。 RNA interference (RNAi) is a phenomenon of selective mRNA destruction leading to gene knockdown (Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S and Mello C (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811). RNAi is currently considered an ancient antiviral strategy (Lindenbach B and Rice C (2002) RNAi targeting an animal virus: news from the front.Molecular Cell 9: 925-927; Downward J (2004) RNA interference. British Medical Journal 328: 1245-1248), part of which is also used by cellular machinery for gene regulation (Denli AM and Hannon GJ (2003) RNAi: an ever-growing puzzle. Trends in Biochemical Sciences 28: 196-201; Agrawal N, Dasaradhi PV, Mohmmed A, Malhotra P, Bhatnagar RK and Mukherjee SK (2003) RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and Molecular Biology Review 67: 657-685). RNAi has been shown to work in many arthropod species, including silkworm B. mori (Riu HL, Li WX and Ding SW (2004) RNA-based immunity in insects. In SGM symposium 63: Microbe-vector interactions in vector-borne diseases, ed.SH Gillespie, GLSAO (Cambridge University Press) pp. 63-74), demonstrated to suppress AcNPV proliferation in Spodoptera frugiperda (Valdes VJ, Sampieri A, Sepulveda J and Vaca L (2003) Using double-stranded RNA to prevent in vitro and in vivo viral infections by recombinant baculovirus.Journal of Biological Chemistry 278: 19317-19324) On the other hand, RNAi targeting lef-1 alone and ie-1 alone is B It was not effective to efficiently suppress BmNPV proliferation in mori (Isobe R, Kojima K, Matsuyama T, Quan GX, Kanda T, Tamura T, Sahara K, Asano SI and Bando H (2004) Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms. Archives Virology 149: 1931-1 940; Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms, Insect Molecular Biology 16: 635-644).
本発明の一態様は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むRNAセンス鎖、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)に関する。 One aspect of the invention is a small hairpin RNA (shRNA) for RNAi-mediated suppression of baculovirus infection in insects, the group consisting of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14 The present invention relates to a short hairpin RNA (shRNA) comprising an RNA sense strand comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from: a spacer sequence, and an antisense RNA strand complementary to the sense RNA strand.
本発明の別の態様は、組換えDNA構築物であって、
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、または配列番号14に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、アンチセンス方向にあり、dsRNA分子を産生するポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖およびその相補的なポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖、その相補的なポリヌクレオチドおよびスペーサーポリヌクレオチド配列;または
・プロモーターに作動可能に連結している、本発明において開示するshRNAをコードするポリヌクレオチド
を含む、組換えDNA構築物に関する。
Another aspect of the invention is a recombinant DNA construct comprising:
A polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14 in the antisense orientation and producing a dsRNA molecule; or SEQ ID NO: 11, A sense strand of a polynucleotide comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 and its complementary polynucleotide; or SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: A sense strand of a polynucleotide comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, its complementary polynucleotide and spacer polynucleotide sequences; or A set comprising polynucleotides encoding the shRNA disclosed in the present invention that are operably linked For example relates to a DNA construct.
本発明のさらに別の態様は、バキュロウイルスに対する抵抗性のあるトランスジェニック昆虫の作製の方法であって、昆虫を、本発明において開示する組換え構築物で形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニック昆虫を選択するステップとを含む方法に関する。 Yet another aspect of the present invention is a method of producing a transgenic insect resistant to baculovirus comprising transforming an insect with a recombinant construct disclosed in the present invention, and resistance to baculovirus. Selecting a transgenic insect exhibiting
本発明のさらに別の態様は、本発明において開示する低分子ヘアピン型RNA(shRNA)または本発明において開示する組換えDNA構築物を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫に関する。 Yet another aspect of the present invention relates to a baculovirus resistant transgenic insect that expresses a small hairpin RNA (shRNA) disclosed in the present invention or a recombinant DNA construct disclosed in the present invention.
本発明のさらなる態様は、本発明において開示する低分子ヘアピン型RNA(shRNA)または本発明において開示する組換えDNA構築物を発現するトランスジェニックバキュロウイルス抵抗性昆虫子孫に関する。 A further aspect of the invention relates to transgenic baculovirus resistant insect progeny expressing the small hairpin RNA (shRNA) disclosed in the present invention or the recombinant DNA construct disclosed in the present invention.
本発明の目的
本発明の主要な目的は、ウイルス感染に対する改善された抵抗性を示すトランスジェニックカイコを作製することである。
Objects of the present invention The main object of the present invention is to produce transgenic silkworms that show improved resistance to viral infection.
本発明の目的の1つは、初期バキュロウイルス増殖に必須である適切なウイルス遺伝子の注意深い選択である。 One of the objects of the present invention is the careful selection of appropriate viral genes that are essential for early baculovirus propagation.
本発明の別の目的は、かかるウイルス遺伝子のDNAセグメントの同定である。 Another object of the present invention is the identification of DNA segments of such viral genes.
本発明の別の目的は、すべての組織における導入遺伝子の発現を保証するための、広範に活性のあるプロモーターの下にある、センス方向およびアンチセンス方向の両方における必須ウイルス遺伝子の同定されたDNAセグメントを有する複合ベクターの構築である。 Another object of the present invention is the identification of essential viral genes in both sense and antisense orientation, under a widely active promoter, to ensure transgene expression in all tissues This is the construction of a composite vector having segments.
本発明のさらに別の目的は、初期または後期胚期ならびに成虫期において発現してトランスジェニック同腹の容易なスクリーニングを可能にする、プロモーターの制御下にある適切な選択マーカー遺伝子の包含である。 Yet another object of the present invention is the inclusion of a suitable selectable marker gene under the control of a promoter that is expressed in the early or late embryonic stage as well as the adult stage to allow easy screening of transgenic littermates.
本発明のさらに別の目的は多重必須ウイルス遺伝子の同時のRNAi媒介抑制およびトランスジェニックカイコにおけるバキュロウイルス増殖に及ぼすその効果の評価である。 Yet another object of the present invention is the simultaneous RNAi-mediated suppression of multiple essential viral genes and evaluation of their effects on baculovirus propagation in transgenic silkworms.
本発明のさらなる目的は、トランスジェニック特徴を、トランスジェニックカイコ株×非トランスジェニックカイコ株のF1ハイブリッド子に移入することの実行可能性の研究である。 A further object of the invention is the feasibility study of transferring transgenic features into F 1 hybrids of transgenic silkworm strains × non-transgenic silkworm strains.
本発明の詳細な説明
定義
本明細書において、「アンチセンス」という用語は、本明細書で定義する標的遺伝子との50%を超える、好ましくは80%を超える相同性を有し、標的遺伝子に関して逆の5'から3'方向においてプロモーターに連結している遺伝子またはそれ由来のヌクレオチド配列を表す。
Detailed Description of the InventionDefinitions As used herein, the term "antisense" has a homology of greater than 50%, preferably greater than 80%, with respect to the target gene as defined herein. Represents a gene or nucleotide sequence derived therefrom linked to a promoter in the reverse 5 'to 3' direction.
本明細書において、「RNAi」(RNA干渉)という用語は、標的遺伝子の全体または部分に相当し、二本鎖RNAを生成し、標的遺伝子特異的遺伝子サイレンシング(抑止)をもたらす配列の導入および発現による、標的遺伝子の発現の抑止を表す。一般に、かかるRNAi配列は、その発現が、RNA干渉を形成する、部分的なセンスおよびアンチセンスDNA配列の直線状の配置を含む。 As used herein, the term “RNAi” (RNA interference) corresponds to the whole or part of a target gene, generates double-stranded RNA, and introduces sequences that provide target gene-specific gene silencing (repression) and Represents suppression of target gene expression by expression. In general, such RNAi sequences comprise a linear arrangement of partial sense and antisense DNA sequences whose expression forms RNA interference.
「ポリヌクレオチド」は、複数の重合したヌクレオチド、例えば、少なくとも約15の連続した重合したヌクレオチドを含む核酸分子である。ポリヌクレオチドは、核酸、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはその任意の断片とすることができる。多くの場合において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチド(またはタンパク質)またはそのドメインもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。さらに、ポリヌクレオチドは、プロモーター、イントロン、エンハンサー領域、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位、5'または3'非翻訳領域、レポーター遺伝子、選択マーカーなどを含むことができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAとすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾塩基または修飾主鎖を任意選択で含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムDNAまたはRNA、転写物(mRNAなど)、cDNA、PCR産物、クローン化DNA、合成DNAまたはRNAなどとすることができる。ポリヌクレオチドは、炭水化物、脂質、タンパク質、または他の材料と組み合わせて、形質転換などの特定の活性を行うことまたはペプチド核酸(PNA)などの有用な組成物を形成することができる。ポリヌクレオチドは、センス方向またはアンチセンス方向にある配列を含むことができる。「オリゴヌクレオチド」は、アンプライマー、プライマー、オリゴマー、エレメント、標的、およびプローブという用語と実質的に等しく、好ましくは一本鎖である。 A “polynucleotide” is a nucleic acid molecule comprising a plurality of polymerized nucleotides, eg, at least about 15 consecutive polymerized nucleotides. The polynucleotide can be a nucleic acid, an oligonucleotide, a nucleotide, or any fragment thereof. In many cases, the polynucleotide comprises a nucleotide sequence that encodes the polypeptide (or protein) or a domain or fragment thereof. In addition, the polynucleotide can include a promoter, intron, enhancer region, polyadenylation site, translation initiation site, 5 ′ or 3 ′ untranslated region, reporter gene, selectable marker, and the like. The polynucleotide can be single-stranded or double-stranded DNA or RNA. A polynucleotide optionally includes a modified base or a modified backbone. The polynucleotide can be, for example, genomic DNA or RNA, transcript (such as mRNA), cDNA, PCR product, cloned DNA, synthetic DNA or RNA, and the like. Polynucleotides can be combined with carbohydrates, lipids, proteins, or other materials to perform specific activities such as transformation or to form useful compositions such as peptide nucleic acids (PNA). A polynucleotide can comprise a sequence that is in the sense or antisense orientation. “Oligonucleotide” is substantially equivalent to the terms ampere primer, primer, oligomer, element, target, and probe, and is preferably single stranded.
「遺伝子」または「遺伝子配列」は、遺伝子、その相補物、およびその5'または3'非翻訳領域の部分的または全コード配列を表す。遺伝子は、遺伝の機能単位でもあり、物理的見地において、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNA(またはRNAウイルスの場合、RNA)の分子に沿ったヌクレオチドの特定のセグメントまたは配列である。後者を、化学修飾または折り畳みなどの後のプロセッシングに供して、機能タンパク質またはポリペプチドを得ることができる。遺伝子は、単離されているか、部分的に単離されているか、または生物のゲノムとともに見出すことができる。一例として、転写因子遺伝子は、転写因子ポリペプチドをコードし、これは、転写のイニシエーターとして、機能的であるか、または機能するためにプロセッシングを必要とし得る。 “Gene” or “gene sequence” refers to a partial or complete coding sequence of a gene, its complement, and its 5 ′ or 3 ′ untranslated region. A gene is also a functional unit of inheritance, and in a physical perspective, a specific segment or sequence of nucleotides along the molecule of DNA (or RNA in the case of RNA viruses) that is involved in the production of a polypeptide chain. The latter can be subjected to subsequent processing such as chemical modification or folding to obtain a functional protein or polypeptide. A gene can be isolated, partially isolated, or found with the genome of an organism. As an example, a transcription factor gene encodes a transcription factor polypeptide that is functional or may require processing to function as an initiator of transcription.
作動上、遺伝子は、シス-トランス検定によって定義することができる。シス-トランス検定は、2つの変異が同じ遺伝子において起こるかどうかを決定し、遺伝的に活性のある単位の限界を決定するために使用することができる遺伝子検査である。遺伝子は、コード領域の前にある領域(「リーダー」;上流)およびコード領域に続く領域(「トレーラー」;下流)を一般に含む。遺伝子は、「エキソン」と称される個々のコードセグメント間に位置する、「イントロン」と称される、介在、非コード配列も含むことができる。大部分の遺伝子は、関連プロモーター領域、転写開始コドンの5'にある調節配列を有する(同定可能なプロモーターを有さないいくつかの遺伝子がある)。遺伝子の機能は、エンハンサー、オペレーター、および他の調節エレメントによっても調節され得る。 In operation, a gene can be defined by a cis-trans assay. A cis-trans test is a genetic test that can be used to determine whether two mutations occur in the same gene and to determine the limits of a genetically active unit. A gene generally includes a region preceding the coding region (“leader”; upstream) and a region following the coding region (“trailer”; downstream). A gene can also include intervening, non-coding sequences termed “introns” located between individual coding segments termed “exons”. Most genes have a regulatory sequence in the associated promoter region, 5 'of the transcription start codon (there are some genes that do not have an identifiable promoter). Gene function can also be regulated by enhancers, operators, and other regulatory elements.
構築物:特に明記しない限り、「構築物」という用語は、本発明の1つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド配列を含む組換え遺伝的分子を表す。 Construct: Unless otherwise stated, the term “construct” refers to a recombinant genetic molecule comprising one or more isolated polynucleotide sequences of the present invention.
宿主生物における導入遺伝子発現に使用する遺伝的構築物は、オープンリーディングフレームに作動可能に連結している遺伝子プロモーター配列および任意選択でオープンリーディングフレームの3'下流にある遺伝子終止配列を含む。オープンリーディングフレームは、遺伝子配列の意図された使用次第で、センス方向またはアンチセンス方向に向けることができる。構築物は、選択マーカー遺伝子および遺伝子発現のための他の調節エレメントも含むことができる。 The genetic construct used for transgene expression in the host organism includes a gene promoter sequence operably linked to the open reading frame and optionally a gene termination sequence 3 'downstream of the open reading frame. The open reading frame can be oriented in the sense or antisense direction, depending on the intended use of the gene sequence. The construct can also include a selectable marker gene and other regulatory elements for gene expression.
ベクター:宿主細胞における複製の能力があるかつ/または別のDNAセグメントが付いたセグメントの複製をもたらすために作動可能に連結することができるDNA分子。プラスミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルス、YAC、およびBACは、すべて典型的なベクターである。 Vector: A DNA molecule that is capable of replication in a host cell and / or can be operably linked to effect replication of a segment with another DNA segment. Plasmids, phagemids, cosmids, phages, viruses, YACs, and BACs are all typical vectors.
「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞中に導入するために使用し、それによって形質転換宿主細胞を作製する核酸分子を表す。「ベクター」は、上記の遺伝的構築物に加えて、遺伝的材料、例えば、複製の開始点、選択マーカー遺伝子および当技術分野で既知の他の遺伝的エレメント(例えば、遺伝的材料を宿主細胞のゲノム中に組み込むための配列など)などの、それが1つまたは複数の宿主細胞において複製することを可能にする1つまたは複数の核酸配列を含むことができる。 The term “vector” refers to a nucleic acid molecule that is used to introduce a polynucleotide sequence into a host cell, thereby creating a transformed host cell. In addition to the genetic constructs described above, a “vector” refers to genetic material, such as an origin of replication, a selectable marker gene, and other genetic elements known in the art (eg, One or more nucleic acid sequences that allow it to replicate in one or more host cells, such as sequences for integration into the genome.
本発明は、1つを超える、好ましくは2つを超える、より好ましくは3つを超える、最も好ましくは4つを超えるウイルス遺伝子を同時に標的とすることによる、トランスジェニックカイコにおけるバキュロウイルス増殖のRNA干渉(RNAi)媒介抑制を提供する。本発明は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックカイコの作製のための方法であって、トランスジェニックカイコが、少なくとも2つのウイルス遺伝子、好ましくは3つのウイルス遺伝子、より好ましくは4つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAの同時発現を示す方法も提供する。さらに、本発明は、ハイブリッドカイコ子中へのウイルス抵抗性特徴の移入のための方法を提供する。 The present invention relates to RNA of baculovirus propagation in transgenic silkworms by simultaneously targeting more than 1, preferably more than 2, more preferably more than 3, most preferably more than 4 viral genes. Provides interference (RNAi) mediated suppression. The present invention is a method for the production of a transgenic silkworm that is resistant to baculovirus, wherein the transgenic silkworm comprises at least two viral genes, preferably three viral genes, more preferably four viral genes. Also provided are methods that demonstrate the co-expression of double-stranded RNA. Furthermore, the present invention provides a method for the transfer of virus resistance characteristics into hybrid silkworms.
本発明は、1つを超える、好ましくは2つを超える、より好ましくは3つを超える、最も好ましくは4つを超えるウイルス遺伝子を同時に標的とすることによる、トランスジェニックカイコにおけるバキュロウイルス増殖のRNA干渉(RNAi)媒介抑制であって、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択されるRNA干渉(RNAi)媒介抑制を特に提供する。 The present invention relates to RNA of baculovirus propagation in transgenic silkworms by simultaneously targeting more than 1, preferably more than 2, more preferably more than 3, most preferably more than 4 viral genes. Interference (RNAi) mediated suppression, wherein the viral gene is selected from the group consisting of early-1 gene (ie-1), late effector factors lef-1, lef-3 and p74 genes Provides suppression specifically.
本発明は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックカイコの作製のための方法であって、トランスジェニックカイコが、少なくとも2つのウイルス遺伝子、好ましくは3つのウイルス遺伝子、より好ましくは4つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAの同時発現を示し、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択される方法も提供する。 The present invention is a method for the production of a transgenic silkworm that is resistant to baculovirus, wherein the transgenic silkworm comprises at least two viral genes, preferably three viral genes, more preferably four viral genes. Also provided is a method that exhibits co-expression of double stranded RNA and the viral gene is selected from the group consisting of early-1 gene (ie-1), late effector factors lef-1, lef-3 and p74 genes.
本発明は、少なくとも2つのウイルス遺伝子、好ましくは3つのウイルス遺伝子、より好ましくは4つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAを、構成的および同時に発現するトランスジェニックカイコおよびその子孫であって、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択されるトランスジェニックカイコおよびその子孫をさらに提供する。 The present invention relates to transgenic silkworms and their progeny that constitutively and simultaneously express double-stranded RNA of at least two viral genes, preferably three viral genes, more preferably four viral genes, wherein the viral genes are Further provided is a transgenic silkworm selected from the group consisting of an early-1 gene (ie-1), a late effector factor lef-1, lef-3 and p74 gene and progeny thereof.
さらに、本発明は、ハイブリッドカイコ子中へのウイルス抵抗性特徴の移入のための方法を提供する。 Furthermore, the present invention provides a method for the transfer of virus resistance characteristics into hybrid silkworms.
本発明は、配列番号11に記載のヌクレオチド配列を有する初期-1遺伝子(ie-1)、配列番号12に記載のヌクレオチド配列を有する後期エフェクター因子遺伝子(lef-1)、配列番号13に記載のヌクレオチド配列を有するlef-3遺伝子および配列番号14に記載のヌクレオチド配列を有するp74遺伝子のポリヌクレオチドも提供する。 The present invention includes an early-1 gene (ie-1) having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11, a late effector factor gene (lef-1) having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12, and the sequence set forth in SEQ ID NO: 13. Also provided are polynucleotides of the lef-3 gene having a nucleotide sequence and the p74 gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 14.
本発明は、スペーサーのポリヌクレオチドであって、スペーサーのヌクレオチドが、配列番号15に記載されているスペーサーのポリヌクレオチドをさらに提供する。 The present invention further provides a spacer polynucleotide, wherein the spacer nucleotide is set forth in SEQ ID NO: 15.
本研究において、我々は、ie-1、lef-1、lef-3およびp74遺伝子という多重必須ウイルス遺伝子セグメントを選んで、二本鎖RNA(dsRNA)を産生し、複合ベクターを生成した。我々は、複合ベクターを導入して、トランスジェニックカイコのすべての組織においてdsRNAを発現するトランスジェニックカイコを構築した。我々は、選択された遺伝子に関するdsRNAが、広範に活性のあるプロモーターの下ですべての組織において発現されるように、複合構築物ならびに幼虫および成虫の眼細胞(個眼)において発現されて、トランスジェニック個体の容易なスクリーニングを可能にするマーカー遺伝子を作った。我々は、トランスジェニック特性を、F1ハイブリッド子に移入することにも成功した。 In this study, we chose multiple essential viral gene segments, ie-1, lef-1, lef-3 and p74 genes, to produce double-stranded RNA (dsRNA) and generate a composite vector. We have introduced transgenic vectors to construct transgenic silkworms that express dsRNA in all tissues of the transgenic silkworm. We expressed in transgenic constructs and larval and adult eye cells (single eyes) so that dsRNA for the selected gene is expressed in all tissues under a broadly active promoter, A marker gene was created that allows easy screening of individuals. We also succeeded in transferring the transgenic properties to the F 1 hybrid.
本発明に従って、本発明の実施形態の1つにおいて、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子のポリヌクレオチドおよびアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。 In accordance with the present invention, in one embodiment of the present invention, in the sense-1 orientation of the early-1 gene (ie-1), the late effector factors lef-1, lef-3 and the p74 gene in the polynucleotide and antisense orientation A recombinant vector comprising polynucleotides of early-1 gene (ie-1), late effector factors lef-1, lef-3 and p74 gene, wherein the polynucleotides in the sense and antisense directions are separated by spacer DNA An isolated recombinant vector is provided.
本発明の一実施形態において、センス方向およびアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択される少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。 In one embodiment of the invention, at least two polys selected from the group consisting of early-1 gene (ie-1), late effector factors lef-1, lef-3 and p74 genes in sense and antisense orientation A recombinant vector comprising nucleotides is provided wherein the polynucleotides in sense and antisense orientation are separated by spacer DNA.
本発明の一実施形態において、センス方向およびアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択される少なくとも3つのポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。 In one embodiment of the invention, at least three polys selected from the group consisting of an early-1 gene (ie-1), late effector factors lef-1, lef-3 and p74 genes in sense and antisense orientation A recombinant vector comprising nucleotides is provided wherein the polynucleotides in sense and antisense orientation are separated by spacer DNA.
本発明の別の実施形態において、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、およびlef-3遺伝子のポリヌクレオチドならびにアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、およびlef-3遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。 In another embodiment of the invention, polynucleotides of the early-1 gene in the sense direction (ie-1), late effector factors lef-1 and lef-3 genes and the early-1 gene in the antisense direction (ie -1), a recombinant vector comprising polynucleotides of the late effector factor lef-1 and lef-3 gene, wherein the polynucleotides in sense direction and antisense direction are separated by spacer DNA Is provided.
本発明の別の実施形態において、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)および後期エフェクター因子lef-1遺伝子のポリヌクレオチドならびにアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、および後期エフェクター因子lef-1遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。 In another embodiment of the invention, polynucleotides of early-1 gene (ie-1) and late effector factor lef-1 gene in sense direction and early-1 gene (ie-1) in antisense direction, and A recombinant vector comprising a late effector factor lef-1 gene polynucleotide, wherein the polynucleotides in sense and antisense orientation are separated by spacer DNA, is provided.
本発明の別の実施形態において、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1およびp74遺伝子のポリヌクレオチドならびにアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1およびp74遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。 In another embodiment of the invention, the early -1 gene in the sense direction (ie-1), the late effector factors lef-1 and p74 gene polynucleotides and the early -1 gene in the antisense direction (ie-1) A recombinant vector comprising a late effector factor lef-1 and a polynucleotide of the p74 gene, wherein the polynucleotide in sense and antisense orientation is separated by spacer DNA is provided.
本発明の別の実施形態において、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、lef-3およびp74遺伝子のポリヌクレオチドならびにアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、lef-3およびp74遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。 In another embodiment of the invention, polynucleotides of the early-1 gene (ie-1), lef-3 and p74 genes in the sense direction and the early-1 gene (ie-1) in the antisense direction, lef- A recombinant vector comprising a polynucleotide of 3 and p74 genes, wherein the polynucleotide in sense and antisense orientation is separated by spacer DNA is provided.
本発明の別の実施形態において、センス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)およびp74遺伝子のポリヌクレオチドならびにアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)およびp74遺伝子のポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている組換えベクターが提供される。 In another embodiment of the invention, polynucleotides of early-1 gene (ie-1) and p74 gene in the sense direction and polynucleotides of early-1 gene (ie-1) and p74 gene in the antisense direction A recombinant vector comprising a polynucleotide in which the polynucleotides in sense and antisense orientation are separated by spacer DNA is provided.
本発明のさらなる実施形態において、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックカイコの産生の方法であって、前記方法が、センス方向およびアンチセンス方向にある初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択される少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む組換えベクターを導入するステップを含み、センス方向およびアンチセンス方向にあるポリヌクレオチドが、スペーサーDNAによって分離されている方法が提供される。 In a further embodiment of the invention, a method for the production of a transgenic silkworm resistant to baculovirus, wherein said method comprises an early-1 gene (ie-1) in a sense direction and an antisense direction, a late effector Introducing a recombinant vector comprising at least two polynucleotides selected from the group consisting of the factors lef-1, lef-3 and p74 genes, wherein the polynucleotides in sense and antisense orientation are mediated by spacer DNA An isolated method is provided.
本発明の好ましい実施形態において、少なくとも2つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAを、構成的および同時に発現するトランスジェニックカイコおよびその子孫であって、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択されるトランスジェニックカイコおよびその子孫が提供される。 In a preferred embodiment of the present invention, transgenic silkworms and their progeny that constitutively and simultaneously express double-stranded RNA of at least two viral genes, wherein the viral gene is an early-1 gene (ie-1), Provided are transgenic silkworms and their progeny selected from the group consisting of late effector factors lef-1, lef-3 and p74 genes.
本発明の別の好ましい実施形態において、少なくとも3つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAを、構成的および同時に発現するトランスジェニックカイコおよびその子孫であって、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択されるトランスジェニックカイコおよびその子孫が提供される。 In another preferred embodiment of the invention, a transgenic silkworm and its progeny that constitutively and simultaneously expresses double-stranded RNA of at least three viral genes, wherein the viral gene is an early-1 gene (ie-1 ), A transgenic silkworm selected from the group consisting of late effector factors lef-1, lef-3 and p74 genes and progeny thereof.
本発明の別の好ましい実施形態において、4つのウイルス遺伝子の二本鎖RNAを、構成的および同時に発現するトランスジェニックカイコおよびその子孫であって、ウイルス遺伝子が、初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子から成る群から選択されるトランスジェニックカイコおよびその子孫が提供される。 In another preferred embodiment of the present invention, transgenic silkworms and their progeny that express constitutively and simultaneously double-stranded RNA of four viral genes, wherein the viral gene is an early-1 gene (ie-1) A transgenic silkworm selected from the group consisting of late effector factors lef-1, lef-3 and p74 genes and their progeny is provided.
本発明において開示するトランスジェニックカイコは、バキュロウイルス感染に対する高いレベルのRNA干渉媒介抵抗性を示す。 The transgenic silkworm disclosed in the present invention exhibits a high level of RNA interference mediated resistance to baculovirus infection.
本発明の実施形態の1つは、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むRNAセンス鎖、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。 One embodiment of the present invention is a short hairpin RNA (shRNA) for RNAi-mediated suppression of baculovirus infection in insects, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14. Provided is a small hairpin RNA (shRNA) comprising an RNA sense strand comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of, a spacer sequence, and an antisense RNA strand complementary to the sense RNA strand .
本発明の別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の少なくとも15の連続したヌクレオチドを含むRNAセンス鎖、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。 Another embodiment of the present invention is a small hairpin RNA (shRNA) for RNAi-mediated suppression of baculovirus infection in insects from SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14. Small hairpin RNA (shRNA) comprising an RNA sense strand comprising at least 15 contiguous nucleotides of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of, a spacer sequence, and an antisense RNA strand complementary to the sense RNA strand )I will provide a.
本発明の別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片を含むRNAセンス鎖、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。 Another embodiment of the present invention is a short hairpin RNA (shRNA) for RNAi-mediated suppression of baculovirus infection in insects, a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11, the sequence set forth in SEQ ID NO: 12. An RNA sense strand comprising a fragment of a nucleotide sequence, a fragment of a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and a fragment of a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 14, a spacer sequence, and an antisense RNA strand complementary to the sense RNA strand, Small hairpin RNA (shRNA) is provided.
本発明の別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、センスRNA鎖が、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。 Another embodiment of the present invention is a short hairpin RNA (shRNA) for RNAi-mediated suppression of baculovirus infection in insects, wherein the sense RNA strand is a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11, Provided is a short hairpin RNA (shRNA) comprising a fragment of the nucleotide sequence set forth in No. 12 and a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID No. 13, a spacer sequence, and an antisense RNA strand complementary to the sense RNA strand .
本発明の別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、センスRNA鎖が、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。 Another embodiment of the present invention is a short hairpin RNA (shRNA) for RNAi-mediated suppression of baculovirus infection in insects, wherein the sense RNA strand is a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11, Provided is a short hairpin RNA (shRNA) comprising a fragment of the nucleotide sequence set forth in No. 12 and a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID No. 14, a spacer sequence, and an antisense RNA strand complementary to the sense RNA strand .
本発明のさらに別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、センスRNA鎖が、配列番号11に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。 Yet another embodiment of the present invention is a short hairpin RNA (shRNA) for RNAi-mediated suppression of baculovirus infection in insects, wherein the sense RNA strand is a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11, Provided short hairpin RNA (shRNA) comprising a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 14, a spacer sequence, and an antisense RNA strand complementary to the sense RNA strand To do.
本発明のさらに別の実施形態は、昆虫におけるバキュロウイルス感染のRNAi媒介抑制のための低分子ヘアピン型RNA(shRNA)であって、センスRNA鎖が、配列番号12に記載のヌクレオチド配列の断片、配列番号13に記載のヌクレオチド配列の断片および配列番号14に記載のヌクレオチド配列の断片、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を提供する。 Yet another embodiment of the present invention is a short hairpin RNA (shRNA) for RNAi-mediated suppression of baculovirus infection in insects, wherein the sense RNA strand is a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 12, Provided short hairpin RNA (shRNA) comprising a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and a fragment of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 14, a spacer sequence, and an antisense RNA strand complementary to the sense RNA strand To do.
本発明のさらなる実施形態は、本発明のshRNAであって、配列番号15に記載のスペーサー配列を含む、shRNAを提供する。 A further embodiment of the present invention provides an shRNA of the present invention comprising the spacer sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
本発明の別の実施形態は、組換えDNA構築物であって、
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、または配列番号14に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、アンチセンス方向にあり、dsRNA分子を産生するポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖およびその相補的なポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖、その相補的なポリヌクレオチドおよびスペーサーポリヌクレオチド配列;または
・プロモーターに作動可能に連結している、本発明において開示するshRNAをコードするポリヌクレオチド
を含む、組換えDNA構築物を提供する。
Another embodiment of the invention is a recombinant DNA construct comprising:
A polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14 in the antisense orientation and producing a dsRNA molecule; or SEQ ID NO: 11, A sense strand of a polynucleotide comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 and its complementary polynucleotide; or SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: A sense strand of a polynucleotide comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, its complementary polynucleotide and spacer polynucleotide sequences; or A set comprising polynucleotides encoding the shRNA disclosed in the present invention that are operably linked To provide the example DNA constructs.
本発明のさらに別の実施形態は、本発明において開示する組換えDNA構築物であって、プロモーターが、カイコ細胞質アクチン(Bmactin)プロモーターなどの構成的プロモーターまたはPax(3XP3)プロモーターなどの組織特異的なプロモーターである、組換えDNA構築物を提供する。 Yet another embodiment of the present invention is a recombinant DNA construct disclosed in the present invention, wherein the promoter is a constitutive promoter such as a silkworm cytoplasmic actin (Bmactin) promoter or a tissue specific such as a Pax (3XP3) promoter. A recombinant DNA construct that is a promoter is provided.
本発明において開示する組換えDNA構築物は、2つのプロモーターであって、一方のプロモーターが、カイコ細胞質アクチンタンパク質(Bmactin)をコードする遺伝子の広範に発現する構成的プロモーターを含み、他方が、Paxタンパク質(3XP3)をコードする遺伝子の組織特異的なプロモーターを含む、2つのプロモーターを含む。 The recombinant DNA construct disclosed in the present invention includes two promoters, one of which includes a constitutive promoter that is widely expressed in a gene encoding silkworm cytoplasmic actin protein (Bmactin), and the other is a Pax protein. It contains two promoters, including a tissue specific promoter for the gene encoding (3XP3).
本発明の一実施形態は、化学的にコンピテントな株であるE. coli株one shot INV110(Invitrogen)である宿主細胞を提供する。 One embodiment of the present invention provides a host cell that is the E. coli strain one shot INV110 (Invitrogen), which is a chemically competent strain.
本発明のさらに別の実施形態は、本発明のshRNAをコードするポリヌクレオチドを含む組換えDNA構築物であって、shRNAをコードするポリヌクレオチドが、
a.配列番号16、配列番号17、配列番号18、および配列番号19から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、
b.スペーサー配列、および
c.センス鎖に相補的なアンチセンス鎖
を含む組換えDNA構築物を提供する。
Yet another embodiment of the present invention is a recombinant DNA construct comprising a polynucleotide encoding the shRNA of the present invention, wherein the polynucleotide encoding the shRNA comprises:
a sense strand comprising two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 19,
b. a spacer sequence, and
c. providing a recombinant DNA construct comprising an antisense strand complementary to the sense strand;
本発明において開示する組換えDNA構築物は、レポーター遺伝子をさらに含む。 The recombinant DNA construct disclosed in the present invention further comprises a reporter gene.
本発明のさらなる実施形態は、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、shRNAが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むRNAセンス鎖、スペーサー配列、およびセンスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖を含む、組換えベクターを提供する。 A further embodiment of the invention is a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a small hairpin RNA (shRNA), wherein the shRNA is from SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14. Recombinant vectors comprising an RNA sense strand comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of, a spacer sequence, and an antisense RNA strand complementary to the sense RNA strand are provided.
本発明のさらなる実施形態は、組換え構築物を含む組換えベクターであって、組換え構築物が、
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、または配列番号14に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、アンチセンス方向にあり、dsRNA分子を産生するポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖およびその相補的なポリヌクレオチド;または
・配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖、その相補的なポリヌクレオチドおよびスペーサーポリヌクレオチド配列;または
・プロモーターに作動可能に連結している、本発明において開示するshRNAをコードするポリヌクレオチド
を含む、組換えベクターを提供する。
A further embodiment of the invention is a recombinant vector comprising a recombinant construct, wherein the recombinant construct comprises
A polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14 in the antisense orientation and producing a dsRNA molecule; or SEQ ID NO: 11, A sense strand of a polynucleotide comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 and its complementary polynucleotide; or SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: A sense strand of a polynucleotide comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, its complementary polynucleotide and spacer polynucleotide sequences; or A set comprising polynucleotides encoding the shRNA disclosed in the present invention that are operably linked To provide the e vector.
本発明の別の実施形態は、本発明において開示する低分子ヘアピン型RNA(shRNA)をコードするポリヌクレオチド、または本発明の組換え構築物もしくは本発明の組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。 Another embodiment of the present invention provides a host cell comprising a polynucleotide encoding a small hairpin RNA (shRNA) disclosed in the present invention, or a recombinant construct of the present invention or a recombinant vector of the present invention.
本発明の別の実施形態は、E. coliなどの宿主細胞またはカイコなどの昆虫細胞を提供する。 Another embodiment of the invention provides a host cell such as E. coli or an insect cell such as a silkworm.
本発明のさらに別の実施形態は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニック昆虫の産生の方法であって、本発明の組換え構築物で、昆虫を形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニック昆虫を選択するステップとを含む方法を提供する。 Yet another embodiment of the present invention is a method of producing a transgenic insect resistant to baculovirus comprising transforming an insect with the recombinant construct of the present invention, and resistance to baculovirus. Selecting a transgenic insect to be displayed.
本発明のさらに別の実施形態は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックカイコの産生の方法であって、本発明の組換え構築物で、カイコを形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニックカイコを選択するステップとを含む方法を提供する。 Yet another embodiment of the present invention is a method of producing a transgenic silkworm that is resistant to baculovirus, comprising transforming a silkworm with the recombinant construct of the present invention, and resistance to baculovirus. Selecting a transgenic silkworm to be displayed.
本発明のさらに別の実施形態は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックボンビックス・モリの産生の方法であって、本発明の組換え構築物で、ボンビックス・モリを形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニック昆虫を選択するステップとを含む方法を提供する。 Yet another embodiment of the present invention is a method for the production of a transgenic bombix mori resistant to baculovirus comprising transforming bombix mori with the recombinant construct of the present invention; Selecting a transgenic insect exhibiting resistance to baculovirus.
本発明のさらに別の実施形態は、バキュロウイルスに対する抵抗性があるトランスジェニックボンビックス・モリの産生の方法であって、本発明の組換え構築物で、ボンビックス・モリを形質転換するステップと、バキュロウイルスに対する抵抗性を示すトランスジェニック昆虫を選択するステップとを含み、カイコが、ボンビックス・モリNistari株である方法を提供する。 Yet another embodiment of the present invention is a method for the production of a transgenic bombix mori resistant to baculovirus comprising transforming bombix mori with the recombinant construct of the present invention; Selecting a transgenic insect exhibiting resistance to baculovirus, and providing a method wherein the silkworm is a Bombyx mori Nistari strain.
本発明のさらなる実施形態は、本発明の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫を提供する。 A further embodiment of the invention provides a baculovirus resistant transgenic insect that expresses the short hairpin RNA (shRNA) of the invention.
本発明のさらなる実施形態は、本発明の組換えDNA構築物を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫を提供する。 A further embodiment of the invention provides a baculovirus resistant transgenic insect that expresses a recombinant DNA construct of the invention.
本発明のさらなる実施形態は、本発明の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニックカイコを提供する。 A further embodiment of the present invention provides a baculovirus resistant transgenic silkworm that expresses the short hairpin RNA (shRNA) of the present invention.
本発明のさらなる実施形態は、本発明の組換えDNA構築物を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニックカイコを提供する。 A further embodiment of the present invention provides a baculovirus resistant transgenic silkworm that expresses the recombinant DNA construct of the present invention.
本発明のさらなる実施形態は、本発明の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫子孫を提供する。 A further embodiment of the present invention provides baculovirus resistant transgenic insect progeny expressing the short hairpin RNA (shRNA) of the present invention.
本発明のさらなる実施形態は、本発明の組換えDNA構築物を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニック昆虫子孫を提供する。 A further embodiment of the present invention provides baculovirus resistant transgenic insect progeny expressing the recombinant DNA construct of the present invention.
本発明のさらなる実施形態は、本発明の低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニックカイコ子孫を提供する。 A further embodiment of the present invention provides baculovirus resistant transgenic silkworm progeny expressing the short hairpin RNA (shRNA) of the present invention.
本発明のさらなる実施形態は、本発明の組換えDNA構築物を発現するバキュロウイルス抵抗性トランスジェニックカイコ子孫を提供する。 A further embodiment of the present invention provides baculovirus resistant transgenic silkworm progeny expressing the recombinant DNA construct of the present invention.
本発明は、RNAiおよび遺伝子導入によって産生される、高いレベルのバキュロウイルス抵抗性を有する家畜化されたカイコ株(ボンビックス・モリ)の産生を特に提供する。piggyBacトランスポゾンベースのベクターを構築することによって、我々は、4つのバキュロウイルス遺伝子、すなわち前初期-1遺伝子(ie-1)、後期エフェクター因子lef-1、lef-3およびp74遺伝子に対する二本鎖RNAを構成的に産生するトランスジェニックカイコのいくつかのホモ接合系統を得た。これらのホモ接合系統は、非トランスジェニック対照と比較した場合に、トランスジェニック虫における低い死亡率によって示されるように、B. mori核多角体病ウイルス(BmNPV)感染の抑制を示した。ウイルス増殖における減少も、ウエスタンブロット分析および他の従来の方法によって確認された。この抗ウイルス特性を、B. moriの非トランスジェニック株と交雑させたトランスジェニックカイコ系統のF1ハイブリッド子に移入することに成功した。これらの結果は、我々が、カイコ遺伝子導入と連結して多重必須バキュロウイルス遺伝子を同時に標的とすることによって、高いレベルの抵抗性を有するカイコ株を構築することに成功したことを実証した。 The invention specifically provides for the production of domesticated silkworm strains (Bombix mori) with high levels of baculovirus resistance produced by RNAi and gene transfer. By constructing a piggyBac transposon-based vector, we have double-stranded RNA for four baculovirus genes: the immediate early-1 gene (ie-1), the late effector factors lef-1, lef-3 and p74 genes Several homozygous lines of transgenic silkworms that constitutively produce were obtained. These homozygous lines showed suppression of B. mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) infection as shown by the low mortality in the transgenic worms when compared to non-transgenic controls. A decrease in virus growth was also confirmed by Western blot analysis and other conventional methods. This antiviral property was successfully transferred to F 1 hybrids of transgenic silkworm strains crossed with non-transgenic strains of B. mori. These results demonstrated that we succeeded in constructing silkworm strains with high levels of resistance by linking to silkworm gene transfer and simultaneously targeting multiple essential baculovirus genes.
RNAi機構は、鱗翅目におけるバキュロウイルス感染を抑制することに関する対照的な結果とともに使用されてきた。IE-1の一過性のRNAi媒介ターゲティングによる、Sf9細胞系およびスポドプテラ・フルギペルダにおけるAcNPV増殖の成功したほぼ完全な抑止を示唆する最初の報告があった(Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms. Insect Molecular Biology 16: 635-644)。Isobeら(Li Y, A L Passarelli AL and Miller LK (1993) Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression. Journal of Virology 67: 5260-5268)は、lef-1遺伝子を標的とすることによる、トランスジェニックカイコB. moriにおける中程度のウイルス抑制であるが、完全な保護ではない同様の観察を報告した。標的遺伝子/領域が、RNAi媒介遺伝子抑止の成功を決定するであろうことが既知であるので、これらの対照的な結果は、標的遺伝子における相違によるであろう。遺伝性の、RNAi誘発バキュロウイルス抑止を得ることを考慮して、我々は、必須バキュロウイルス遺伝子ie-1、lef-1、lef-3およびp74を標的とすることによる、トランスジェニックカイコにおけるバキュロウイルス抑止の有効性を観察するための研究を開始した。 The RNAi mechanism has been used with contrasting results regarding suppressing baculovirus infection in Lepidoptera. There was the first report suggesting successful almost complete suppression of AcNPV proliferation in Sf9 cell lines and Spodoptera frugiperda by transient RNAi-mediated targeting of IE-1 (Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms.Insect Molecular Biology 16: 635-644) . Isobe et al. (Li Y, AL Passarelli AL and Miller LK (1993) Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression.Journal of Virology 67: 5260-5268) We reported a similar observation of moderate viral suppression but not complete protection in transgenic silkworm B. mori by targeting the lef-1 gene. These contrasting results may be due to differences in the target gene since it is known that the target gene / region will determine the success of RNAi-mediated gene silencing. In view of obtaining heritable, RNAi-induced baculovirus silencing, we have targeted baculoviruses in transgenic silkworms by targeting the essential baculovirus genes ie-1, lef-1, lef-3 and p74 A study was started to observe the effectiveness of deterrence.
トランスジェニックカイコを得るために、我々は、選択マーカー3XP3-GFPおよび3XP3-DsRed、4つのウイルス遺伝子のセンス、アンチセンスおよび多重遺伝子フリップフロップの二本鎖RNAを発現させるためのDNAを有するpiggyBacトランスポゾンベースのベクターを構築した(図1)。3XP3-GFP選択遺伝子マーカーは、胚において発現されるので、それは、発生の初期でのトランスジェニックカイコの容易なスクリーニングを可能にした。さらに、3XP3-GFPからのGFPの発現は、特定の組織に制限されている。我々は、3XP3-GFP構築物のこの特性を活用して、トランスジェニック体およびバキュロウイルス感染の進行の両方の容易なスクリーニングを促進した。Nistari株の新鮮に産まれた卵にdsRNAを産生するためのプラスミドおよびヘルパープラスミドを同時注入することによって、我々は、トランスジェニックカイコのいくつかの系統を得た。制御された繁殖によって、我々は、18のホモ接合トランスジェニック系統を得、我々は、組換えGFP発現BmNPV、BmNPV-P10GFPを使用して、それらの抗ウイルス活性に関してこれらを試験した。我々は、ウイルスを投与し、死亡率を計算することによって、経口的感染力を試験した。 To obtain transgenic silkworms, we have piggyBac transposon with selectable markers 3XP3-GFP and 3XP3-DsRed, four viral gene sense, antisense and DNA to express double-gene flip-flop double-stranded RNA A base vector was constructed (Figure 1). Since the 3XP3-GFP selectable gene marker is expressed in the embryo, it allowed easy screening of transgenic silkworms at the early stages of development. Furthermore, GFP expression from 3XP3-GFP is restricted to certain tissues. We exploited this property of the 3XP3-GFP construct to facilitate easy screening of both the transgenic body and the progression of baculovirus infection. We obtained several lines of transgenic silkworms by co-injecting freshly born eggs of the Nistari strain with plasmids and helper plasmids to produce dsRNA. By controlled breeding, we obtained 18 homozygous transgenic lines, which we tested for their antiviral activity using recombinant GFP-expressing BmNPV, BmNPV-P10GFP. We tested oral infectivity by administering virus and calculating mortality.
我々の結果は、感染の経路に関係なく、トランスジェニックカイコは、非トランスジェニックカイコ系統よりも、はるかに多く耐性があったことを示す。ウエスタンブロット分析および顕微鏡観察は、ウイルス増殖が、非トランスジェニック体よりもトランスジェニック体において少なかったことを確認する。 Our results show that regardless of the route of infection, transgenic silkworms were much more resistant than non-transgenic silkworm lines. Western blot analysis and microscopic observation confirm that virus growth was less in the transgenic body than in the non-transgenic body.
結論として、我々は、ここで、RNAi媒介バキュロウイルス抵抗性が、家畜化されたカイコB. moriを特に強調して、鱗翅目において可能であり、感染のRNAi媒介ウイルス抑制のための導入遺伝子を有するカイコのトランスジェニック株を、piggyBac媒介生殖系列遺伝子導入によって、産生することに成功することができたことを示した。種々の必須バキュロウイルス遺伝子が標的とされる、多重遺伝子ターゲティングの効果を理解することは興味深いであろう。より良い普遍的なプロモーター、特にバキュロウイルスによって活性化されるものの使用が、標的RNAの二本鎖の駆動体として調査される必要がある。我々は、この方向におけるさらなる研究が、感染のバキュロウイルス抑制のためのツールとしてRNAiを使用することを我々に教えるであろうことを示唆する。 In conclusion, we now note that RNAi-mediated baculovirus resistance is possible in Lepidoptera, with particular emphasis on domesticated silkworm B. mori, and a transgene for RNAi-mediated virus suppression of infection. It has been shown that a transgenic strain of silkworms with a piglet could be successfully produced by piggyBac-mediated germline gene transfer. It will be interesting to understand the effects of multigene targeting, where various essential baculovirus genes are targeted. The use of better universal promoters, especially those activated by baculovirus, needs to be investigated as a double-stranded driver of the target RNA. We suggest that further research in this direction will teach us to use RNAi as a tool for baculovirus suppression of infection.
本発明を、以下の実施例の助けで、詳しく述べる。しかしながら、実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。 The invention is described in detail with the help of the following examples. However, the examples should not be construed as limiting the scope of the invention.
(実施例)
ここで記載する以下の実施例は、例示的目的のみのためであり、考慮される様々な変更形態または変更が当業者に示唆されることになり、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが理解されよう。
(Example)
The following examples described herein are for illustrative purposes only, and various changes or modifications to be considered will be suggested to one skilled in the art, and the spirit and scope of this application as well as the appended claims. It should be understood that it should be included within the scope of
(実施例1)
ベクター
pPIG3XP3GFP-FF
ベクターpPIGA3GFP-FFは、ほとんど普遍的なプロモーターである、カイコ細胞質アクチンプロモーターの下で、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する。このプロモーターによって駆動されるgfpは、広範に発現し、したがって組み込まれていなくてさえも、ベクターを含有しているG0胚または細胞は、蛍光を発し、トランスジェニック体をスクリーニングすることを困難にする。この問題を克服するために、我々は、以前、組込みのためのpiggyBacエレメントの逆方向反復および選択マーカーとして合成の眼特異的プロモーター(3XP3)の制御下にあるGFP遺伝子を有する、遺伝子導入のための3XP3ベースのベクターを開発した(Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms. Insect Molecular Biology 16: 635-644)。この合成のプロモーターは、Paxタンパク質によって、インビボで認識され、下流遺伝子は、組織特異的に発現される。プラスミドpPIG3XP3GFP-FFは、pPIGA3GFP-FFのA3GFPカセットを、Thomasら(Thomas JL, Da Rocha M, Besse A, Mauchamp B and Chavancy G (2002) 3xP3-EGFP marker facilitates screening for transgenic silkworm Bombyx mori L. from the embryonic stage onwards. Insect Biochemistry Molecular Biology 32: 247-253)の3XP3GFPカセットで置き換えることによって構築した。このために、3XP3-GFP断片を、PCRで増幅し、TAベクター中にクローニングし、そこからそれを、制限消化し、NgoMIVおよびSfiI部位間でpPIGA3GFP-FFに動員した。構築物pPIG3XP3GFP-FFを、選択的制限消化および配列決定によって再び確認した。
(Example 1)
vector
pPIG3XP3GFP-FF
The vector pPIGA3GFP-FF expresses green fluorescent protein (GFP) under the silkworm cytoplasmic actin promoter, an almost universal promoter. The gfp driven by this promoter is widely expressed and therefore, even if not integrated, G0 embryos or cells containing the vector fluoresce, making it difficult to screen transgenics . To overcome this problem, we have previously introduced a piggyBac element inverted repeat for integration and a GFP gene under the control of a synthetic eye-specific promoter (3XP3) as a selectable marker for gene transfer. 3XP3-based vectors (Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms. Insect Molecular Biology 16: 635-644). This synthetic promoter is recognized in vivo by the Pax protein, and downstream genes are expressed in a tissue-specific manner. The plasmid pPIG3XP3GFP-FF is an A3GFP cassette of pPIGA3GFP-FF, which was developed by Thomas et al. (Thomas JL, Da Rocha M, Besse A, Mauchamp B and Chavancy G (2002) 3xP3-EGFP marker facilitates screening for transgenic silkworm Bombyx mori L. from the It was constructed by replacing with 3XP3GFP cassette of embryonic stage onwards. Insect Biochemistry Molecular Biology 32: 247-253). For this, the 3XP3-GFP fragment was amplified by PCR and cloned into a TA vector from which it was restriction digested and mobilized to pPIGA3GFP-FF between the NgoMIV and SfiI sites. The construct pPIG3XP3GFP-FF was confirmed again by selective restriction digestion and sequencing.
センス、アンチセンス、および多重遺伝子フリップフロップベクター
ウイルス抵抗性を有するトランスジェニックカイコ株を得るために、我々は、多重必須ウイルス遺伝子を標的とする作業を開始した。ベクターを、piggyBacベクター主鎖を使用して構築した。これらの構築物は、pPiggysense-3XP3-GFP、pPiggyantisense-3XP3-DsRed2およびpPiggymultigene flip-flop-3XP3-DsRed2である。使用するベクターの図表示を、図1において示す。ベクターを、特異的な制限酵素部位を有するプライマーを使用して、それぞれ前初期1遺伝子、後期発現因子 1、3およびB. mori核多角ウイルスの外被タンパク質をコードする、ie-1、lef-1、lef-3およびp74遺伝子およびpPIGA3GFPのgfp遺伝子の領域を増幅することによって構築した(Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki T, Chantal T, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc T, Bernard M, Gerard C, Paul S, Malcolm F, Jean-Claude P and Pierre C (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology 18: 81-84)。単位複製配列を、pCR II Topoベクター(Invitrogen)のT-オーバーハング中にクローニングした(図6)。生じたプラスミドを、Topo-gfp、Topo-ie-1、Topo-lef-1、Topo-lef-3、およびTopo-p74と名付けた。正しい挿入断片を有するこれらのベクターを、制限消化およびDNA配列決定によって確認した。これらの遺伝子は、ウイルス特異的タンパク質を産生し、既知のヒトまたは昆虫遺伝子といかなる相同性も共有しない。ie-1、lef-1、lef-3、p74の標的領域は、ie-1遺伝子に関して配列番号11に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチドポジション141から450であり、lef-1遺伝子に関して配列番号12に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチドポジション80から405であり、lef-3遺伝子に関して配列番号13に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチドポジション391から706であり、p74遺伝子に関して配列番号14に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチドポジション1243から1552である。
Sense, Antisense, and Multigene Flip-Flop Vectors In order to obtain transgenic silkworm strains that are resistant to viruses, we have begun work targeting multiple essential viral genes. The vector was constructed using the piggyBac vector backbone. These constructs are pPiggysense-3XP3-GFP, pPiggyantisense-3XP3-DsRed2, and pPiggymultigene flip-flop-3XP3-DsRed2. A diagrammatic representation of the vector used is shown in FIG. The vectors, ie-1, lef-, encoding the immediate early 1 gene, late expression factor 1, 3 and the coat protein of B. mori nuclear polygonal virus, respectively, using primers with specific restriction enzyme sites. 1, constructed by amplifying the regions of the lef-3 and p74 genes and the gfp gene of pPIGA3GFP (Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki T, Chantal T, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc T, Bernard M, Gerard C, Paul S, Malcolm F, Jean-Claude P and Pierre C (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology 18: 81-84). The amplicon was cloned into the T-overhang of the pCR II Topo vector (Invitrogen) (Figure 6). The resulting plasmids were named Topo-gfp, Topo-ie-1, Topo-lef-1, Topo-lef-3, and Topo-p74. These vectors with the correct insert were confirmed by restriction digestion and DNA sequencing. These genes produce virus-specific proteins and do not share any homology with known human or insect genes. The target region of ie-1, lef-1, lef-3, p74 is nucleotide positions 141 to 450 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11 with respect to the ie-1 gene and set forth in SEQ ID NO: 12 with respect to the lef-1 gene From nucleotide position 80 to 405 of the nucleotide sequence of, nucleotide position 391 to 706 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 for the lef-3 gene, and from nucleotide position 1243 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 14 for the p74 gene 1552.
BmNPVのie-1、lef-1、lef-3およびp74ならびにgfpのDNAを、配列番号1〜10に記載のプライマーを使用して、PCRで増幅した。 BmNPV ie-1, lef-1, lef-3 and p74 and gfp DNA were amplified by PCR using the primers set forth in SEQ ID NOs: 1-10.
典型的なPCR反応は、順方向および逆方向プライマーのそれぞれ25ピコモルを有する50μl最終体積から成った。PCR増幅を、反応毎に、10mM Tris-HCl、(50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01%ゼラチンおよび0.01%Triton X-100を含有するpH8.3)、1mM dNTPおよび5UのTaq DNAポリメラーゼ(NEB、US)において行った。温度サイクリングを、以下の条件を使用して、サーマルサイクラー(PE9700、Applied Biosystems)において行った:95℃で5分の最初の変性; 95℃で30秒;50℃で30秒および72℃で2分の35サイクル、および72℃で10分の最終伸長。PCR産物を、2.0%アガロースゲル上で定量化し、製造業者のプロトコールに従って、Qiagen PCR精製カラムを使用して精製した。精製した産物を、上記のTopoベクター中にクローニングした。 A typical PCR reaction consisted of a 50 μl final volume with 25 pmoles of forward and reverse primers each. PCR amplification, for each reaction, 10mM Tris-HCl, (50mM KCl, 1.5mM MgCl 2, containing 0.01% gelatin and 0.01% Triton X-100 pH8.3) , 1mM dNTP and 5U of Taq DNA polymerase (NEB , US). Temperature cycling was performed on a thermal cycler (PE9700, Applied Biosystems) using the following conditions: initial denaturation at 95 ° C for 5 minutes; 95 ° C for 30 seconds; 50 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 2 seconds 35 cycles per minute, and 10 min final extension at 72 ° C. PCR products were quantified on a 2.0% agarose gel and purified using a Qiagen PCR purification column according to the manufacturer's protocol. The purified product was cloned into the above Topo vector.
pTopoクローンを、one shot INV110 chemically competent E. coli(Invitrogen)に形質転換した(それは、dam-およびdcm-感受性制限酵素での制限消化を可能にするdamおよびdcm欠損を含有するので。damおよびdcm欠損は、これらの部位でメチル化されていないDNAの産生を可能にする)。ブルー/ホワイトスクリーニングを、40μlのX-Gal(40mg/ml)および40μlのイソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG、100mM)を含有するLB寒天板上で行った。白いコロニーを、消化を通しての挿入断片分析のために採取した。期待されたサイズの正しい挿入断片を与えたコロニーを採取した。 The pTopo clone was transformed into one shot INV110 chemically competent E. coli (Invitrogen) (since it contains dam and dcm deletions that allow restriction digestion with dam- and dcm-sensitive restriction enzymes. dam and dcm The deficiency allows the production of DNA that is not methylated at these sites). Blue / white screening was performed on LB agar plates containing 40 μl X-Gal (40 mg / ml) and 40 μl isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG, 100 mM). White colonies were picked for insert analysis through digestion. Colonies that gave the correct insert of the expected size were picked.
DNA配列決定のために、250ngのプラスミドを、8μlのReady reaction mix(BigDye terminator、BDTv 3.0、Applied Biosystems、Foster City、CA)および5ピコモルのM13配列決定プライマーを含む配列決定反応において使用した。使用したサイクリング条件は、以下であった:96℃で10秒、50℃で5秒、60℃で4分の25サイクル。試料を、エタノールで沈殿させ、70%エタノールで洗浄し、Hi-Di(商標)ホルムアミド(Applied Biosystems)に再懸濁した。配列決定を、ABI Prism 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)において行い、各遺伝子断片の無傷さを確認した。 For DNA sequencing, 250 ng of plasmid was used in a sequencing reaction containing 8 μl of Ready reaction mix (BigDye terminator, BDTv 3.0, Applied Biosystems, Foster City, Calif.) And 5 pmoles of M13 sequencing primer. The cycling conditions used were: 25 cycles of 96 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 5 seconds, 60 ° C for 4 minutes. Samples were precipitated with ethanol, washed with 70% ethanol, and resuspended in Hi-Di ™ formamide (Applied Biosystems). Sequencing was performed on ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) to confirm the integrity of each gene fragment.
構築物pPiggysense-3XP3-GFP、pPiggyantisense-3XP3-DsRed2およびpPiggyMultigene flip-flop-3XP3-DsRed2を、以下の一連のクローニングステップ(図7)において得た:
1.lef-3の316bp断片(配列番号18)を、SalI-NheI部位を使用して、pA3DS-FSGベクター主鎖(7624bp)中にクローニングして、単一遺伝子構築物、pA3ΔS-lef3(6057bp)を生成した。形質転換体を、XmnI(lef-3の内部部位)制限消化およびXmnI/ScaI二重消化によって、検証した。XmnI消化は、1遺伝子構築物の6.05kb断片に直線化し、ScaI(主鎖における部位)での二重消化は、DNAストライダー地図パターン(DNA strider map pattern)に従って、323bp産物または挿入断片サイズおよび5.73kb断片を遊離した。
2.ie-1の310bp断片(配列番号16)を、BspEI-SalI部位を使用して、pA3ΔS-lef3ベクター中にクローニングして、pA3ΔS-ie1lef3SG、2つの遺伝子構築物(5929bp)を生成した。形質転換体を、XmnI/HpaI制限系を使用して、連続消化で調べた。2遺伝子構築物のXmn I直線化は、5929bp断片を生じさせ、XmnI/Hpa I連続消化は、339bp、1071bpおよび4519bp断片の期待された3つのバンドを生じさせた。
3.gfpの800bp断片を、PvuI-BamHI部位を使用して、pA3ΔS-ie1lef3ベクター主鎖中にクローニングして、pA3ΔS-gfpie1lef3、3つの遺伝子構築物(6665bp)を生成した。形質転換体を、834bp挿入断片および5834bp主鎖を生じさせたPvuI/EcoRI制限分析で調べた。
4.lef-1クローンの326bp断片(配列番号17)を、BspEI/BamHIを使用して、pA3ΔS-gfpie1lef3ベクター主鎖に加えて、pA3ΔS-gfplef1ie1lef3(6650bp)、4つの遺伝子産物を生成した。形質転換体を、それぞれ、期待された長さ188bp、1410bp、5040bpの3つの断片ならびに期待された長さ1361bpおよび5289bpの2つの断片を生じさせた、HpaIおよびNdeI制限消化を通して確認した。
5.p74の310bp断片(配列番号19)を、AgeI-XbaI部位を使用して、pA3ΔS-gfplef1ie1lef3ベクター主鎖中にクローニングして、5つの遺伝子構築物、pA3ΔS-gfple1ie1lef3p74(6160bp)を生成した。形質転換体を、SalI制限消化を通して確認した。それは、520bp挿入断片および5640bp主鎖を生じさせた。
5つの遺伝子センスに向けられた構築物、pA3ΔS-gfplef1ie1lef3p74を、内部NheI-XbaI部位で消化して、5つの遺伝子の断片のセンスおよびアンチセンスに向けられたプールを生成した。形質転換体を、アンチセンスに向けられたプラスミドに関してスクリーニングした。これを、HindIII/XmnI消化によって確認し、ここで、アンチセンスコロニーは、1.3kb断片を生じさせた一方、センスに向けられたコロニーは、2.2kb断片を生じさせた。
センス構築物-A3:4つの遺伝子およびpoly Aテールとともにgfpが融合したプロモーターを、BglII-NheIおよびBglII-XbaI部位を使用して、pPiggyP25il2-(3XP3-GFP)TQ中にクローニングして、pPiggy-Sense-3XP3-GFPベクター(図1A)を生成した。
アンチセンス構築物-上記のように得られたアンチセンス断片を、pPiggyP25il2-(3XP3-DsRed2)TQ中にクローニングして、pPiggy-Antisense-3XP3.DsRed2ベクター(図1B)を生成した。
6.Multigene Flip-Flop構築物-上記A3:4つの遺伝子とともにgfpが融合したプロモーターを、BglII-AgeI部位を使用して、pP25(sp*)DsRedベクター主鎖中にクローニングして、スペーサー領域(配列番号15)を有するセンス断片、中間ベクター型pP25(sp*)DsRed-A3ΔS Sense.Spacerを生成した。
7.5つの遺伝子のアンチセンス断片を、Sse8337I-AflII部位を使用して、sense-spacerベクター主鎖の中間型中にクローニングして、多重遺伝子構築物のフリップフロップ型、pP25(sp*)DsRed-A3ΔS Sense.Spacer.Antisense.Poly A領域を生成した。
8.中間シャトルベクター、pP25(sp*)Sense-Spacer-Antisenseベクターを、BglIIおよびSfiI部位で消化して、挿入断片のフリップフロップ型を生成した。この挿入断片を、BglII/SfiI部位を使用して、PiggyP25IL2-(3XP3-DsRed2)TQ中にクローニングして、選択マーカー遺伝子としてDsRed2を有するpPiggyA3gfplef1ie1lef3p74.spacer.p74lef3ie1lef1gfp.3XP3-DsRed2ベクター(図1C)を生成した。
The constructs pPiggysense-3XP3-GFP, pPiggyantisense-3XP3-DsRed2 and pPiggyMultigene flip-flop-3XP3-DsRed2 were obtained in the following series of cloning steps (Figure 7):
1.The 316 bp fragment of lef-3 (SEQ ID NO: 18) was cloned into the pA3DS-FSG vector backbone (7624 bp) using the SalI-NheI site to obtain a single gene construct, pA3ΔS-lef3 (6057 bp) Was generated. Transformants were verified by XmnI (internal site of lef-3) restriction digest and XmnI / ScaI double digestion. XmnI digestion was linearized into a 6.05 kb fragment of a single gene construct, and double digestion with ScaI (site in the main chain) followed a 323 bp product or insert size and 5.73 kb according to the DNA strider map pattern. Fragments were released.
2. The 310 bp fragment of ie-1 (SEQ ID NO: 16) was cloned into the pA3ΔS-lef3 vector using the BspEI-SalI site to generate pA3ΔS-ie1lef3SG, two gene constructs (5929 bp). Transformants were examined by continuous digestion using the XmnI / HpaI restriction system. Xmn I linearization of the two gene constructs yielded a 5929 bp fragment, and XmnI / Hpa I sequential digestion yielded the expected three bands of 339 bp, 1071 bp and 4519 bp fragments.
3. The 800 bp fragment of gfp was cloned into the pA3ΔS-ie1lef3 vector backbone using the PvuI-BamHI site to generate pA3ΔS-gfpie1lef3, the three gene construct (6665 bp). Transformants were examined by PvuI / EcoRI restriction analysis that generated an 834 bp insert and a 5834 bp backbone.
4. In addition to the pA3ΔS-gfpie1lef3 vector backbone, pA3ΔS-gfplef1ie1lef3 (6650 bp), four gene products were generated using BspEI / BamHI, a 326 bp fragment of the lef-1 clone (SEQ ID NO: 17). Transformants were confirmed through HpaI and NdeI restriction digests that yielded three fragments of expected lengths 188 bp, 1410 bp, 5040 bp and two fragments of expected lengths 1361 bp and 5289 bp, respectively.
5. The 310 bp fragment of p74 (SEQ ID NO: 19) was cloned into the pA3ΔS-gfplef1ie1lef3 vector backbone using the AgeI-XbaI site to generate five gene constructs, pA3ΔS-gfple1ie1lef3p74 (6160 bp). Transformants were confirmed through SalI restriction digestion. It gave a 520 bp insert and a 5640 bp backbone.
A construct directed to 5 gene senses, pA3ΔS-gfplef1ie1lef3p74, was digested with an internal NheI-XbaI site to generate a pool directed to sense and antisense of the 5 gene fragments. Transformants were screened for plasmids directed to antisense. This was confirmed by HindIII / XmnI digestion, where the antisense colony yielded a 1.3 kb fragment while the colony directed to the sense yielded a 2.2 kb fragment.
Sense construct-A3: A promoter fused with gfp with four genes and a poly A tail was cloned into pPiggyP25il2- (3XP3-GFP) TQ using BglII-NheI and BglII-XbaI sites to create pPiggy-Sense A −3XP3-GFP vector (FIG. 1A) was generated.
Antisense construct—The antisense fragment obtained above was cloned into pPiggyP25il2- (3XP3-DsRed2) TQ to generate the pPiggy-Antisense-3XP3.DsRed2 vector (FIG. 1B).
6.Multigene Flip-Flop construct-A3 above: A promoter in which gfp is fused with the four genes is cloned into the pP25 (sp *) DsRed vector backbone using the BglII-AgeI site and the spacer region (sequence A sense fragment having the number 15), an intermediate vector type pP25 (sp *) DsRed-A3ΔS Sense.Spacer was generated.
7.5 Antisense fragments of the genes were cloned into the middle form of the sense-spacer vector backbone using the Sse8337I-AflII site and the multigene construct flip-flop, pP25 (sp *) DsRed-A3ΔS Sense .Spacer.Antisense.Poly A region was generated.
8. The intermediate shuttle vector, pP25 (sp *) Sense-Spacer-Antisense vector, was digested at the BglII and SfiI sites to generate a flip-flop version of the insert. This insert was cloned into PiggyP25IL2- (3XP3-DsRed2) TQ using the BglII / SfiI site to generate pPiggyA3gfplef1ie1lef3p74.spacer.p74lef3ie1lef1gfp.3XP3-DsRed2 vector (FIG. 1C) with DsRed2 as a selectable marker gene. Generated.
したがって、本発明のshRNAをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、shRNAをコードするポリヌクレオチドが、異なる順序で並べられた2つ以上のヌクレオチドの断片を含む組換えベクターを、ベクターの必要条件および機能性に従って、構築することができる。 Therefore, a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding the shRNA of the present invention, wherein the polynucleotide encoding the shRNA comprises a fragment of two or more nucleotides arranged in a different order, Can be constructed according to requirements and functionality.
(実施例2)
B. moriの生殖系列遺伝子導入
生殖系列遺伝子導入を、本質的にTamuraら、(Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G, Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki T, Chantal T, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc T, Bernard M, Gerard C, Paul S, Malcolm F, Jean-Claude P and Pierre C (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology 18: 81-84)に従って、行った。
(Example 2)
Germline gene transfer in B. mori Germline gene transfer was essentially performed by Tamura et al. (Tamura T, Thibert C, Royer C, Kanda T, Abraham E, Kamba M, Komoto N, Thomas JL, Mauchamp B, Chavancy G , Shirk P, Fraser M, Prudhomme JC, Couble P, Toshiki T, Chantal T, Corinne R, Toshio K, Eappen A, Mari K, Natuo K, Jean-Luc T, Bernard M, Gerard C, Paul S, Malcolm F Jean-Claude P and Pierre C (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology 18: 81-84).
約1000のカイコ卵に、1μg/μlのpPiggy-Sense-3XP3-GFP、および等モル比のヘルパープラスミドを微量注入した。同じ方法で他の構築物、すなわちpPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2およびpPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2も、ヘルパープラスミドとともに注入して、卵を分離し、トランスジェニック体の種々の系統を生成した。生じた卵を、インキュベートし、眼における蛍光の発現によって、それぞれの構築物の組込みに関して分析した。制御した繁殖によって、トランスジェニックカイコの18のホモ接合系統を得た。pPiggy-Sense-3XP3-GFP、pPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2およびpPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2を使用することによって得られたトランスジェニック系統を、それぞれ、Sense(S)、Antisense(AS)およびMultigene flip-flop(MFF)系統と呼ぶ。得られたトランスジェニック系統は、3つのSense、2つのAntisense、5つのSense×Antisenseハイブリッドおよび8つのMFFを含む。 About 1000 silkworm eggs were microinjected with 1 μg / μl of pPiggy-Sense-3XP3-GFP and an equimolar ratio of helper plasmid. In the same way, other constructs, pPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2 and pPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2, were also injected with helper plasmids to isolate the eggs and generate various lines of transgenics . The resulting eggs were incubated and analyzed for integration of each construct by expression of fluorescence in the eye. By controlled breeding, 18 homozygous lines of transgenic silkworms were obtained. Transgenic lines obtained by using pPiggy-Sense-3XP3-GFP, pPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2 and pPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2 were expressed as Sense (S) and Antisense (AS), respectively. And called the Multigene flip-flop (MFF) line. The resulting transgenic line contains 3 Senses, 2 Antisense, 5 Sense × Antisense hybrids and 8 MFF.
(実施例3)
トランスジェニック体の分子特徴分析
4つの必須バキュロウイルス遺伝子に関する二本鎖RNAを産生する導入遺伝子を有するMFFトランスジェニック系統を、カイコゲノムにおける導入遺伝子の挿入断片の部位、それらのコピー数およびそれらの物理的な位置に関して以下のように特徴付けた:
3.1転移因子ディスプレー(TED)方法
転移因子ディスプレー(TED)方法を、van der LindenおよびPlasterk 2004(Van der Linden AM and Plasterk RH (2004) Shotgun cloning of transposon insertions in the genome of Caenorhabditis elegans. Computational and Functional Genomics 5:225-229)の修正プロトコールに従って挿入の部位および挿入のコピー数を同定するために使用した(図2A)。簡潔に述べると、トランスジェニック系統由来のゲノムDNAを、NagarajaおよびNagaraju 1995(Nagaraja GM and Nagaraju J (1995) Genome fingerprinting of the silkworm, Bombyx mori, using random arbitrary primers. Electrophoresis 16:1633-1638)に従って、抽出し、Sau 3Aで消化した。生じた消化されたDNAを、Sau 3Aオーバーハング(Oligo 503および504)を有するベクターカセットにライゲートした。2ラウンドのPCRを、左逆方向反復(LIR)付近のpiggyBac導入遺伝子内に設計したトランスポゾン特異的LIRアウター(outer)(配列番号20-5'-CTCACGCGGTCGTTATAGTT)およびLIRインナー(inner)(配列番号21-5'-GGCGACTGAGATGTCCTAAA)プライマーならびにvan der LindenおよびPlasterkのアダプター特異的505および337NEWプライマーを使用して、行った。PCRの最初のラウンドを、LIRアウターおよび505プライマーを使用して行い、PCRの第2のラウンドを、MBI taqを使用して、LIRインナーおよび337NEWプライマーを使用して行った。第2ラウンドPCR後、単位複製配列の期待されたサイズは、導入遺伝子部分の120bpおよび未知の長さのゲノムDNAを含む120bpを超えた。第2の増幅ステップからのPCR産物を、配列決定のために使用した。第2のPCR反応後、単一PCR増幅産物の形成は、トランスジェニック系統における導入遺伝子の単一コピー挿入の存在を示した(図2B)。TEDを使用して、piggyBacトランスポゾンの左腕を標的とした。
3.2トランスジェニック系統の異なる染色体上での導入遺伝子の位置
挿入の位置を確認するために、PCR産物を、配列決定し、B. moriのゲノム配列全体に対してブラスト探索した。すべてのトランスジェニック系統において、図2Cにおいて示すpiggyBac媒介組込みに特徴的なシグネチャ配列TTAAの存在によって証明されるように、導入遺伝子のゲノム組込みが、piggyBacによって媒介されたことが発見された。これらの配列を、配列のカイコ物理地図アセンブリーに対してブラストし(http://sgp.dna.affrc.go.jp/KAIKO/)、染色体位置および染色体上での導入遺伝子の相対ポジションを、トランスジェニック系統のそれぞれに関して決定した(Table 1(表1)および図2D)。
(Example 3)
Molecular characterization of transgenic bodies
MFF transgenic lines carrying transgenes that produce double-stranded RNA for the four essential baculovirus genes, with respect to transgene insert sites, their copy number and their physical location in the silkworm genome as follows: Characterized:
3.1 Transposable factor display (TED) method The transposable factor display (TED) method is applied to van der Linden and Plasterk 2004 (Van der Linden AM and Plasterk RH (2004) Shotgun cloning of transposon insertions in the genome of Caenorhabditis elegans.Computational and Functional Genomics 5: 225-229) was used to identify the site of insertion and the copy number of the insertion according to the modified protocol (Figure 2A). Briefly, the genomic DNA from the transgenic line was analyzed according to Nagaraja and Nagaraju 1995 (Nagaraja GM and Nagaraju J (1995) Genome fingerprinting of the silkworm, Bombyx mori, using random arbitrary primers.Electrophoresis 16: 1633-1638). Extracted and digested with Sau 3A. The resulting digested DNA was ligated into a vector cassette with Sau 3A overhangs (Oligo 503 and 504). Two rounds of PCR were designed into a piggyBac transgene near the left inverted repeat (LIR) transposon-specific LIR outer (SEQ ID NO: 20-5'-CTCACGCGGTCGTTATAGTT) and LIR inner (SEQ ID NO: 21 -5'-GGCGACTGAGATGTCCTAAA) primer and van der Linden and Plasterk adapter specific 505 and 337NEW primers. The first round of PCR was performed using the LIR outer and 505 primers, and the second round of PCR was performed using the LIR inner and 337NEW primers using MBI taq. After the second round PCR, the expected size of the amplicon exceeded 120 bp of the transgene portion and 120 bp with unknown length of genomic DNA. The PCR product from the second amplification step was used for sequencing. After the second PCR reaction, the formation of a single PCR amplification product indicated the presence of a single copy insertion of the transgene in the transgenic line (FIG. 2B). TED was used to target the left arm of the piggyBac transposon.
3.2 Location of the transgene on different chromosomes of transgenic lines To confirm the location of the insertion, the PCR products were sequenced and blasted against the entire B. mori genome sequence. In all transgenic lines, it was discovered that the genomic integration of the transgene was mediated by piggyBac, as evidenced by the presence of the signature sequence TTAA characteristic of piggyBac-mediated integration shown in FIG. 2C. These sequences are blasted against the silkworm physical map assembly of the sequence (http://sgp.dna.affrc.go.jp/KAIKO/), and the chromosomal location and the relative position of the transgene on the chromosome are translated. Determined for each of the transgenic lines (Table 1 and FIG. 2D).
(実施例4)
トランスジェニックメスと非トランスジェニックオスのハイブリッド
Nistariの非休眠変種は、バキュロウイルス感染に対して比較的抵抗性であり(幼虫あたりLD50〜4000の多角封入体(PIB))、CSR2の休眠変種は、ウイルス感染に対してより影響を受けやすい(LD50〜250PIB/幼虫)。ウイルス感染の抑制を明確に実証するために、我々は、トランスジェニックNistariメスを、カイコの非トランスジェニックBmNPV感受性CSR2変種と交雑した。したがって、我々は、7つのS-As×CSR2系統、4つのMFF×CSR2系統ならびに実験対照系統TAFib6×CSR2およびNM×CSR2のそれぞれ1つを含む13のハイブリッド系統を得た。ハイブリッドを、以下のように経口的に、ウイルス抵抗性に関して試験した。
(Example 4)
Hybrid of transgenic female and non-transgenic male
Non-dormant varieties of Nistari are relatively resistant to baculovirus infection (polygonal inclusion bodies (PIB) with LD50-4000 per larva), and dormant varieties of CSR2 are more susceptible to viral infection (LD50-250PIB / larva). To clearly demonstrate suppression of viral infection, we crossed transgenic Nistari females with silkworm non-transgenic BmNPV sensitive CSR2 variants. Therefore, we obtained 13 hybrid lines, including 7 S-As x CSR2 lines, 4 MFF x CSR2 lines and one experimental control line TAFib6 x CSR2 and NM x CSR2. Hybrids were tested for virus resistance orally as follows.
(実施例5)
トランスジェニックカイコにおけるウイルス接種および死亡率分析
経口接種
我々は、四齢の幼虫あたり12000PIBで、トランスジェニック系統および対照非トランスジェニックNMカイコの経口的BmNPV感染を行った。それぞれの系統の100の健康な幼虫に、BmNPV-P10GFPのPIBを与え、すべてのウイルス粒子を消費した幼虫のみを、保持し、生き残った幼虫がガ期に達するまで、新鮮なクワの葉上で飼育した。
(Example 5)
Viral inoculation and mortality analysis oral inoculation in transgenic silkworms We performed oral BmNPV infection of transgenic lines and control non-transgenic NM silkworms at 12000 PIB per 4th instar larvae. 100 healthy larvae of each strain were given PIB of BmNPV-P10GFP, retaining only the larvae that consumed all the viral particles, and on the fresh mulberry leaves until the surviving larvae reached the moth stage Raised.
組換えBmNPVウイルス(BmNPV-P10GFP)を使用して、PIBを生成した。バキュロウイルスを、BmN細胞において増幅し、細胞培養培地における遊離ウイルスを、実験目的のために使用した。BmNPV-P10GFP PIBを得るために、細胞培養培地における遊離ウイルスを、CSR2株の幼虫の血体腔に注入し、感染後5から6日で、血リンパを、感染した幼虫から採取した。蛍光PIBを、頻回の洗浄によって精製し、血球計を使用して、計数した。野生型BmNPVを、養蚕農家から回収した感染したカイコの血リンパから収集した。血リンパを、遊離ウイルスを得るために使用した。遊離ウイルスのタイターを、プラークアッセイによって、計算し、希釈して、1×107BV/mlの最終濃度を得た。PIBを、カイコの経口的接種を伴う実験において使用した。 Recombinant BmNPV virus (BmNPV-P10GFP) was used to generate PIB. Baculovirus was amplified in BmN cells and free virus in cell culture medium was used for experimental purposes. To obtain BmNPV-P10GFP PIB, free virus in the cell culture medium was injected into the body cavity of CSR2 strain larvae, and hemolymph was collected from the infected larvae 5 to 6 days after infection. Fluorescent PIB was purified by frequent washes and counted using a hemocytometer. Wild-type BmNPV was collected from haemolymph of infected silkworms recovered from sericulture farmers. Hemolymph was used to obtain free virus. Free virus titer was calculated and diluted by plaque assay to give a final concentration of 1 × 10 7 BV / ml. PIB was used in experiments involving oral inoculation of silkworms.
(実施例6)
GP64に対する抗体を使用することによるウエスタンブロット
バキュロウイルスのGP64コートタンパク質に対する市販の抗体を、Novagenから得た。これらの抗体を、BmNPVのGP64と交差反応させた。トランスジェニックおよび対照系統由来の感染した蛹を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)を含有する溶解緩衝液(50mM Tris-Cl、pH8.0、120mM NaCl、0.5%(v/v)NP-40、0.2mMオルトバナジウム酸ナトリウム、100mM NaF)中ですりつぶした。(Sambrook J and Russel DW (2001) In Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, New York)に従って、等量のタンパク質を、SDS-Loading色素において変性させ(ローディング対照としてチューブリンを使用した)、10%SDS-PAGEによって分離し、Hybond P+膜上にブロットした。ウエスタンブロットを、マウス抗GP64抗体で行い、一次抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートした適切な二次抗体を使用して、検出した。タンパク質バンドを、製造業者のプロトコールに従って、化学発光検出試薬(ECL検出キット、Amersham)によって可視化した。展開したバンドを、BioRad gel documentation systemのQuantityOneソフトウェアを使用することによって、濃度測定的に定量化した。
(Example 6)
Western blot by using antibody against GP64 A commercially available antibody against the GP64 coat protein of baculovirus was obtained from Novagen. These antibodies were cross-reacted with BmNPV GP64. Infected sputum from transgenic and control strains were purified from lysis buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 120 mM NaCl, 0.5% (v / v) NP-40, 0.2 containing protease inhibitor cocktail (Sigma). (Sodium ortho orthovanadate, 100 mM NaF). (Sambrook J and Russel DW (2001) In Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, New York). Equal amounts of protein were denatured in SDS-Loading dye (tube as loading control). (Using phosphorus), separated by 10% SDS-PAGE and blotted onto Hybond P + membranes. Western blots were performed with mouse anti-GP64 antibody and primary antibody was detected using an appropriate secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase. Protein bands were visualized with chemiluminescent detection reagents (ECL detection kit, Amersham) according to the manufacturer's protocol. The developed bands were quantified densitometrically by using QuantityOne software from the BioRad gel documentation system.
(実施例7)
RNAi導入遺伝子でのカイコの成功的な生殖系列遺伝子導入
カイコ生殖系列遺伝子導入を、すべての3つの構築物、すなわち、pPiggy-Sense-3XP3-GFP、pPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2およびpPiggy-Multigene flip-flop-3XP3-DsRed2を使用して、達成した。3XP3プロモーターによって駆動された眼におけるGFP/RFPの蛍光の強度に基づいて、いくつかの系統を、Table 2(表2)において示すように選択した。それらを、兄妹交配して、Table 2(表2)において記載したトランスジェニックカイコのいくつかのホモ接合系統を得た。
(Example 7)
Silkworm Successful Germline Gene Transfer with RNAi Transgenes Silkworm germline gene transfer was performed using all three constructs: pPiggy-Sense-3XP3-GFP, pPiggy-Antisense-3XP3-DsRed2, and pPiggy-Multigene flip- Achieved using flop-3XP3-DsRed2. Several lines were selected as shown in Table 2 based on the intensity of GFP / RFP fluorescence in the eye driven by the 3XP3 promoter. They were mated with siblings to obtain several homozygous lines of transgenic silkworms described in Table 2.
ハイブリッドSense×ASと称される、pPiggySense-3XP3-GFP、pPiggyAntisense-3XP3-DsRed2のトランスジェニック系統間のハイブリッドも得て、ウイルスアッセイにおいて使用した。 A hybrid between the transgenic lines of pPiggySense-3XP3-GFP, pPiggyAntisense-3XP3-DsRed2, termed hybrid Sense × AS, was also obtained and used in the viral assay.
(実施例8)
BmNPV食餌実験は、トランスジェニック体における減少した死亡率を示す
我々は、四齢である幼虫あたり12000PIBで、トランスジェニック系統および対照非トランスジェニック(NM)カイコの経口的BmNPV感染を行った。このウイルス用量は、Nistari株に関する既知のLD50(三齢でのLD50約4000PIB/幼虫)を超えているので、我々は、研究を、この用量で開始した。TAFib6、非標的dsRNAを発現するトランスジェニック系統も、対照として使用した。多角体を、1cm直径の新鮮な葉の小片上に広げた。各系統の100の幼虫に、PIBを与え、すべての葉の小片を消費した幼虫のみを保持し、幼虫生活の最後まで新鮮なクワの葉上で飼育した。カイコの死亡率を、出現したガの数を計数することによって、推定した。ウイルスが誘発した死亡率を、感染に屈した幼虫/蛹またはガを分析することによって確認した。各系統の死亡率を、図3において示す。
(Example 8)
BmNPV diet experiments show reduced mortality in transgenics We performed oral BmNPV infection of transgenic lines and control non-transgenic (NM) silkworms at 12000 PIB per 4th instar larvae. This virus dose, because it exceeds a known LD 50 (LD 50 about 4000PIB / larvae in the third instar) on Nistari stock, we are, a study was initiated at this dose. TAFib6, a transgenic line expressing non-targeted dsRNA was also used as a control. The polyhedron was spread on a small piece of 1 cm diameter fresh leaf. 100 larvae of each line were given PIB and only the larvae that consumed all the leaf pieces were retained and raised on fresh mulberry leaves until the end of larval life. Silkworm mortality was estimated by counting the number of moths that appeared. Virus-induced mortality was confirmed by analyzing larvae / pupae or moths that succumbed to infection. The mortality rate for each strain is shown in FIG.
経口的アッセイの顕著な特徴は、四齢のPIBを与えた群において、100%の死亡率が、非トランスジェニックNistari(NM)およびCSR2対照系統において観察された一方で、2つの多重遺伝子フリップフロップ系統(MFF154Cおよび170B)は、わずか20%の死亡率を示したことを示す。結果は、死亡率が、MFF系統において25%未満であり、センスおよびアンチセンスハイブリッドにおける25〜35%の間がそれに続いたことを示唆している。これらの結果は、多重遺伝子ターゲティングが、ウイルス感染負荷が高い場合、特に効果的であることおよびRNAiノックダウンが、ウイルス増殖を抑止するために有益であることも示す。Kanginakudruら、(Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in the transgenic silkworms. Insect Molecular Biology 16: 635-644)の単一ウイルス遺伝子標的構築物と比較して、本多重ウイルス遺伝子標的トランスジェニック体は、経口的ウイルス接種後、少なくとも2倍増加した生存性を示した。 A prominent feature of the oral assay is that two multigene flip-flops were observed while 100% mortality was observed in the non-transgenic Nistari (NM) and CSR2 control lines in the group given the 4-year-old PIB. The lines (MFF154C and 170B) show only 20% mortality. The results suggest that mortality was less than 25% in MFF lines, followed by between 25-35% in sense and antisense hybrids. These results also indicate that multigene targeting is particularly effective at high viral infection loads and that RNAi knockdown is beneficial for inhibiting viral growth. Kanginakudru et al. (Kanginakudru S, Royer C, Edupalli SV, Jalabert A, Mauchamp B, Chandrashekaraiah, Prasad SV, Chavancy G, Couble P and Nagaraju J (2007) Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and In the transgenic silkworms. Insect Molecular Biology 16: 635-644), this multi-viral gene-targeted transgenic has at least a 2-fold increased survival after oral virus inoculation. Indicated.
(実施例9)
トランスジェニックメスおよび非トランスジェニックオスのハイブリッドもウイルス抵抗性を示す
トランスジェニック系統の保護効果が、トランスジェニックおよび非トランスジェニック系統のハイブリッドにおいて観察されるかどうかを試験するために、我々は、トランスジェニックNistari株および非トランスジェニックCSR2のハイブリッドを得て、上記のようにハイブリッドに接種した。ウイルスが誘発した死亡率の傾向および死亡率を抑止する導入遺伝子の能力は、ハイブリッドにおいて親株と同様であった(図4)。生存性は、CSR2のセンス-アンチセンスハイブリッドでの交雑種における(40〜70%)よりも、MFF系統のCSR2交雑種においてより多く(≦75%)、NMおよびCSR2の非トランスジェニックハイブリッドにおいて最も少なかった(<20%)。これらのデータは、バキュロウイルス複製のRNAi媒介抑止が、トランスジェニックおよび非トランスジェニックカイコのハイブリッドを益するであろうという仮説を支持する。
(Example 9)
Transgenic female and non-transgenic male hybrids are also resistant to viruses. To test whether the protective effect of transgenic lines is observed in hybrids of transgenic and non-transgenic lines, we A hybrid of Nistari strain and non-transgenic CSR2 was obtained and inoculated into the hybrid as described above. Trends in virus-induced mortality and the ability of the transgene to suppress mortality were similar to the parent strain in the hybrid (FIG. 4). Viability is higher in CSR2 hybrids of MFF lines (≤75%) than in hybrids with CSR2 sense-antisense hybrids (40-70%), and most in non-transgenic hybrids of NM and CSR2 Less (<20%). These data support the hypothesis that RNAi-mediated suppression of baculovirus replication will benefit hybrids of transgenic and non-transgenic silkworms.
トランスジェニック体におけるバキュロウイルス抵抗性を、血リンパのマイクロリットルあたりのPIBの数によって決定されるように測定し、PIBの数は、図5において示すように、単一ウイルス遺伝子標的トランスジェニック体および非トランスジェニック対照系統と比較して、多重ウイルス遺伝子標的トランスジェニック系統においてはるかに低いことが発見された。
配列番号11は、ie-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す(1755bp、NCBI参照番号:AY048770.1、ボンビックス・モリ核多角体病ウイルスK1前初期タンパク質(ie-1)遺伝子、全コード領域)
配列番号12は、lef-1遺伝子全配列のヌクレオチド配列を示す(813bp;NCBI参照番号:NC_001962.1;ボンビックス・モリNPV、全ゲノム)
配列番号13は、lef-3遺伝子全配列のヌクレオチド配列を示す(1158bp;NCBI参照番号:NC_001962.1;ボンビックス・モリNPV、全ゲノム)
配列番号14は、p74遺伝子全配列のヌクレオチド配列を示す(1938bp;NCBI参照番号:NC_001962.1;ボンビックス・モリNPV、全ゲノム)
配列番号15は、dsRed(赤色蛍光タンパク質)の部分から成るスペーサーのヌクレオチド配列(323bp)を示す
配列番号16:shRNA構築物において使用されるie-1遺伝子の標的領域のヌクレオチド配列、BmNPVのie1全体は、1755bpであり、標的領域は141〜450bp(310bp)ie1である(受託番号AY048770)
配列番号17:shRNA構築物において使用されるlef 1遺伝子の標的領域のヌクレオチド配列、BmNPVのlef1全体は、813bpであり、標的領域は、80〜405bp(326bp)lef1である(受託番号L33180)
配列番号18:shRNA構築物において使用されるlef 3遺伝子の標的領域のヌクレオチド配列、BmNPVのlef3全体は、1158bpであり、標的領域は、391〜706bp(316bp)lef3である(受託番号L33180)
配列番号19:shRNA構築物において使用されるp74遺伝子の標的領域のヌクレオチド配列、BmNPVのp74全体は、1938bpであり、標的領域は、1243〜1552bp(310bp)p74である(受託番号L33180)
Claims (24)
a.配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むRNAセンス鎖、
b.スペーサー配列、および
c.センスRNA鎖に相補的なアンチセンスRNA鎖
を含む、shRNA。 A small hairpin RNA (shRNA) for RNAi-mediated suppression of baculovirus infection in insects,
an RNA sense strand comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14,
b. a spacer sequence, and
c. shRNA comprising an antisense RNA strand complementary to the sense RNA strand.
b.配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖およびその相補的なポリヌクレオチド;または
c.配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列の断片を含むポリヌクレオチドのセンス鎖、その相補的なポリヌクレオチドおよびスペーサーポリヌクレオチド配列;または
d. プロモーターに作動可能に連結している、請求項1に記載のshRNAをコードするポリヌクレオチド
を含む組換えDNA構築物。 a polynucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14, wherein the polynucleotide is in the antisense orientation and produces a dsRNA molecule; or
b. a sense strand of a polynucleotide comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14 and complementary polynucleotides thereof; or
c. a sense strand of a polynucleotide comprising a fragment of two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14, its complementary polynucleotide and spacer poly Nucleotide sequence; or
d. A recombinant DNA construct comprising a polynucleotide encoding an shRNA according to claim 1 operably linked to a promoter.
a.配列番号16、配列番号17、配列番号18、および配列番号19から成る群から選択される2つ以上のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、
b.スペーサー配列、および
c.センス鎖に相補的なアンチセンス鎖
を含む、請求項9に記載の組換えDNA構築物。 A polynucleotide encoding shRNA
a sense strand comprising two or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 19,
b. a spacer sequence, and
c. The recombinant DNA construct of claim 9, comprising an antisense strand complementary to the sense strand.
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