JP2014212722A - Hepatitis b virus-like particle crystal of octahedral structure - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、八面体構造を有するB型肝炎ウイルス様粒子結晶に関する。 The present invention relates to a hepatitis B virus-like particle crystal having an octahedral structure.
ヒト・ゲノムプロジェクトの結果、人間の遺伝子はおよそ３万種類であることが判明し、これら３万種類の遺伝子から得られる蛋白質の構造と機能を理解しコントロールすることは、医療・医薬品開発を推進していくものであり、すべての疾病・疾患に対する治療が可能になることを意味する。疾患に関わる蛋白質の立体構造が明らかになれば、その触媒部位の特定が可能となり、その立体構造情報をベースとした医薬品の開発が可能となる。現在までに、蛋白質立体構造解析の主たる方法として、Distance Geometry法に基づくNMRによるもの、極低温電子線回折法に基づく電子顕微鏡によるもの、蛋白質の結晶を作製し、この回折現象を利用したX線結晶構造解析法などがある。この中で、X線結晶構造解析法による解析数は他の２つの方法と比べて最も多い。 As a result of the Human Genome Project, it was found that there are about 30,000 human genes, and understanding and controlling the structure and function of proteins derived from these 30,000 genes promotes medical and pharmaceutical development. It means that it will be possible to treat all diseases and disorders. If the three-dimensional structure of a protein related to a disease is clarified, the catalytic site can be specified, and a drug based on the three-dimensional structure information can be developed. To date, the main methods of protein three-dimensional structure analysis include NMR based on Distance Geometry, electron microscopy based on cryogenic electron diffraction, and protein crystals, and X-rays using this diffraction phenomenon. There are crystal structure analysis methods. Among them, the number of analyzes by the X-ray crystal structure analysis method is the largest compared with the other two methods.
現在までに、クローニングされた蛋白質のうち10%程度しか結晶構造解析に至っていない。これは、結晶化条件がその蛋白質の表面構造に強く依存しており、しかも、すべての蛋白質で異なっているため、蛋白質ごとに新たな結晶化条件を探索しなければならないことによる。温度、蛋白質濃度、沈殿剤の種類、pH、精製条件などさまざまな因子が結晶化に影響を与えるので、一種の蛋白質の結晶化条件を検討するのに数千から数万におよぶ実験を行わねばならない。 To date, only about 10% of the cloned proteins have been crystallized. This is because the crystallization conditions strongly depend on the surface structure of the protein, and are different for all proteins, so that new crystallization conditions must be searched for each protein. Various factors such as temperature, protein concentration, type of precipitating agent, pH, and purification conditions affect crystallization, so thousands of to tens of thousands of experiments must be conducted to examine the crystallization conditions for a single protein. Don't be.
ウイルスとは、基本的には蛋白質と核酸からなる粒子で、細胞質をもたず、代謝と自己複製を宿主細胞の機能に完全に依存。宿主によって動物ウイルス、植物ウイルス、細菌ウイルス（バクテリオファージ）に大別され、ゲノムの種類（DNA/RNAおよび一本鎖/二本鎖）で分類される。一般にウイルスの基本構造は、核酸（RNAまたはDNA）を、キャプシド（capsid）と呼ばれる蛋白質の殻で包んだ粒子で、数十nmから数百nmの大きさを有する。キャプシドはウイルスの外殻若しくは内殻を構成する蛋白質であり、カプソメアによって構成されている。キャプシドは、ウイルス侵入、脱コート、複製に重要な役割を有するとされる。かかるキャプシドのX線結晶構造解析は以前から数多くなされている。バクテリオファージ、植物ウイルスをはじめ、動物ウイルスでもポリオウイルス、アデノウイルス、B型肝炎ウイルスなどが解析されており、その立体構造情報（原子座標）は公開データベースであるプロテインデータバンク（Protein Data Bank：PDB）に登録、公開されている。 A virus is basically a particle consisting of a protein and a nucleic acid, has no cytoplasm, and completely depends on the function of the host cell for metabolism and self-replication. Depending on the host, animal viruses, plant viruses, and bacterial viruses (bacteriophages) are broadly classified and classified according to the type of genome (DNA / RNA and single / double stranded). In general, the basic structure of a virus is a particle in which a nucleic acid (RNA or DNA) is wrapped in a protein shell called a capsid and has a size of several tens to several hundreds of nanometers. Capsid is a protein constituting the outer shell or inner shell of a virus, and is composed of capsomeres. Capsids are said to have an important role in virus entry, decapping and replication. Many X-ray crystal structure analyzes of such capsids have been made. Polioviruses, adenoviruses, hepatitis B viruses, and other animal viruses have been analyzed including bacteriophages, plant viruses, etc., and their three-dimensional structure information (atomic coordinates) is protein data bank (Protein Data Bank: PDB) ) Registered and published.
ウイルスのキャプシド蛋白質を利用して、ターゲットとなりうる蛋白質の結晶化に導く方法は、いくつか開示されている。例えば、ウイルスのキャプシド蛋白質とターゲットとなりうる蛋白質を含む会合ユニットを作製し、１種若しくは２種以上の会合ユニットが複数個会合した会合体を含む結晶について開示がある（特許文献１）。ここでは、ターゲットとなりうる蛋白質を解析目的分子とし、会合体の内部に配置されていることを特徴とする。 Several methods have been disclosed that use viral capsid proteins to lead to crystallization of target proteins. For example, an association unit containing a virus capsid protein and a target protein is prepared, and a crystal containing an aggregate in which a plurality of one or two or more association units are associated is disclosed (Patent Document 1). Here, a protein that can be a target is a molecule to be analyzed, and is characterized in that it is arranged inside the aggregate.
ウイルスのキャプシド蛋白質を利用した生体膜内在性ウイルス様粒子及びその製造方法について開示がある（特許文献２）。ここでは、膜内在性ウイルスキャプシドを用いた、膜蛋白質の結晶化方法が開示されている。しかしながら、係る方法に適用可能なターゲット蛋白質はウイルスの膜構造内に埋め込むことができる膜蛋白質のみである。 There is a disclosure of a virus-like particle in a biological membrane using a capsid protein of a virus and a method for producing the same (Patent Document 2). Here, a method for crystallizing a membrane protein using an integral membrane virus capsid is disclosed. However, the only target protein applicable to such a method is a membrane protein that can be embedded in the viral membrane structure.
ウイルスのキャプシド蛋白質若しくはその変異体蛋白質と、目的蛋白質を含む融合蛋白質を作製することによる会合ユニットについて開示がある（特許文献３）。ここでは、前記会合ユニットを作製するためのリンカーとして、グリシン（G）−グリシン（G）−セリン（S）の３残基からなるアミノ酸配列を一単位とし、当該一単位のアミノ酸配列を２〜６個含むペプチドリンカーを用いることで、より効果的に会合ユニットを作製しうることが示されている。このペプチドリンカーを用いることで、会合ユニットが形成され、当該会合ユニットが自己集積することで通常のヒトB型肝炎ウイルスキャプシド（T=4）と同様のウイルス様粒子（T=4）を形成し、当該ウイルス粒子より結晶化可能なことが確認されたことが開示されている。 There is a disclosure of an association unit by producing a fusion protein containing a viral capsid protein or a mutant protein thereof and a target protein (Patent Document 3). Here, as a linker for producing the association unit, an amino acid sequence consisting of three residues of glycine (G) -glycine (G) -serine (S) is used as one unit, and the amino acid sequence of the one unit is represented by 2 to 2. It has been shown that an association unit can be produced more effectively by using a peptide linker containing six. By using this peptide linker, an association unit is formed, and the association unit self-assembles to form a virus-like particle (T = 4) similar to a normal human hepatitis B virus capsid (T = 4). It has been disclosed that crystallization from the virus particles has been confirmed.
ヒトB型肝炎ウイルスT=3又はT=4タイプのキャプシド結晶構造について報告がある（非特許文献１）。また、B型肝炎ウイルスのHBcAg由来のキャプシド構成蛋白質は149アミノ酸残基からなるHB149であること、及びHB149からなる融合蛋白質はウイルス様粒子の形成効率が低いが、HB149のC末端にシステインを付加したHB150がキャプシド構造を安定化させたという報告がある（非特許文献２）。しかしながら、これらの報告で得られた結晶は正二十面体構造により形成されていると考えられていた（図３参照）。 There is a report on the capsid crystal structure of human hepatitis B virus T = 3 or T = 4 type (Non-patent Document 1). In addition, the hepatitis B virus HBcAg-derived capsid component protein is HB149 consisting of 149 amino acid residues, and the fusion protein consisting of HB149 has a low efficiency of forming virus-like particles, but adds a cysteine to the C-terminus of HB149. There is a report that HB150 has stabilized the capsid structure (Non-patent Document 2). However, the crystals obtained in these reports were thought to be formed by an icosahedral structure (see FIG. 3).
ドラッグキャリアに利用されるＥ型肝炎ウイルス様粒子として、発現量が多く、効率的に生産できるＥ型肝炎ウイルス様粒子構成蛋白質と異種蛋白質との融合蛋白質について報告され、略正二十面体の構造を有することが開示されている（特許文献４）。E型肝炎ウイルスはヘペウイルス（Hepeviridae）属に分類され、エンベロープを持たない直径32〜34 nmの球状のRNAウイルスである。しかしながら、ヘパドナウイルス科オルソヘパドナウイルス属に属するDNAウイルスであるB型肝炎ウイルスにおける融合蛋白を用いる技術の開示ではない。 As a hepatitis E virus-like particle used for drug carriers, a fusion protein of hepatitis E virus-like particle constituent protein and heterologous protein that is highly expressed and can be efficiently produced has been reported. (Patent Document 4). Hepatitis E virus is a globular RNA virus with a diameter of 32 to 34 nm that does not have an envelope, and is classified into the genus Hepeviridae. However, this is not a disclosure of a technique using a fusion protein in hepatitis B virus, which is a DNA virus belonging to the genus Orthohepadnavirus belonging to the Hepadnaviridae family.
本発明は、今まで知られていたB型肝炎ウイルス様粒子であるT=3又はT=4タイプのキャプシド構造（図３参照）に比べて、力学的、熱力学的な構造安定性を持つB型肝炎ウイルス様粒子及びその結晶を提供することを課題とする。 The present invention has mechanical and thermodynamic structural stability as compared with the T = 3 or T = 4 type capsid structure (see FIG. 3) which is a conventionally known hepatitis B virus-like particle. It is an object to provide hepatitis B virus-like particles and crystals thereof.
本願発明者らは、上記課題を解決するためにHBcAg由来のキャプシド構成蛋白質に着目し鋭意検討を重ねた結果、力学的、熱力学的に構造安定であり、結晶構造のX線結晶構造解析が可能なB型肝炎ウイルス様粒子及びその結晶を作製することに成功し、本発明を完成した。 In order to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention focused on the HBcAg-derived capsid constituent protein and as a result of repeated studies, the structure is mechanically and thermodynamically stable, and X-ray crystal structure analysis of the crystal structure is possible. The present invention was completed by successfully producing possible hepatitis B virus-like particles and crystals thereof.
即ち本発明は、以下よりなる。
１．149アミノ酸残基及び／又は150アミノ酸残基からなるキャプシド構成蛋白質（Ａ）を直接的又は間接的にペプチドリンカーを介して結合してなる二量体のキャプシド構成蛋白質を含む会合ユニットを基本単位とし、当該会合ユニットを集積した会合体による八面体構造を有するB型肝炎ウイルス様粒子。
２．会合体が、会合ユニットが24個集積して構成される会合体である、前項１に記載のB型肝炎ウイルス様粒子。
３．キャプシド構成蛋白質（Ａ）の第48番目、61番目及び107番目のアミノ酸残基が、それぞれ独立してシステイン又はアラニンである、前項１又は２に記載のB型肝炎ウイルス様粒子。
４．キャプシド構成蛋白質（Ａ）が、以下の配列番号１及び／又は２で表されるアミノ酸配列からなる、前項１〜３のいずれか１に記載のB型肝炎ウイルス様粒子。
１）キャプシド構成蛋白質（Ａ）：
MDIDPYKEFG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHCSP HHTALRQAIL CWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISCLTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVV（配列番号１）
２）キャプシド構成蛋白質（Ａ）：
MDIDPYKVIG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHASP HHTALRQAIL AWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISALTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVVC（配列番号２）
５．会合ユニットが、キャプシド構成蛋白質（Ａ）２分子を含む二量体のキャプシド構成蛋白質の他に、目的蛋白質を含む前項１〜４のいずれか１に記載のB型肝炎ウイルス様粒子。
６．目的蛋白質が、キャプシド構成蛋白質（Ａ）とキャプシド構成蛋白質（Ａ）の間に各々ペプチドリンカーを介して結合しており、当該結合が、各々キャプシド構成蛋白質（Ａ）のC末端側と結合していることを特徴とする、前項５に記載のB型肝炎ウイルス様粒子。
７．目的蛋白質が、ペプチドリンカーを介してキャプシド構成蛋白質（Ａ）とキャプシド構成蛋白質（Ａ）が結合したキャプシド構成蛋白質のC末端側と結合していることを特徴とする、前項５に記載のB型肝炎ウイルス様粒子。
８．ペプチドリンカーが、グリシン（G）−グリシン（G）−セリン（S）の３残基からなるアミノ酸配列を一単位としたときに、当該一単位のアミノ酸配列を１〜１０個含むペプチドである、前項１〜７のいずれか１に記載のB型肝炎ウイルス様粒子。
９．ペプチドリンカーが、以下の１）〜４）に示すペプチドリンカーより選択され、同一又は異なって使用される、前項８に記載のB型肝炎ウイルス様粒子。
１）ペプチドリンカー１：GGSEEE(GGS)7（配列番号３）
２）ペプチドリンカー２：GGSKL（配列番号４）
３）ペプチドリンカー３：(GGS)3KL（配列番号５）
４）ペプチドリンカー４：(GGS)3（配列番号６）
１０．前項７〜９のB型肝炎ウイルス様粒子作製のために使用する、以下に示す以下の１）〜４）に示すペプチドリンカー。
１）ペプチドリンカー１：GGSEEE(GGS)7（配列番号３）
２）ペプチドリンカー２：GGSKL（配列番号４）
３）ペプチドリンカー３：(GGS)3KL（配列番号５）
４）ペプチドリンカー４：(GGS)3（配列番号６）
１１．前項１〜９のいずれか１に記載のB型肝炎ウイルス様粒子から作製されたB型肝炎ウイルス様粒子結晶。
１２．キャプシド構成蛋白質（Ａ）をコードする遺伝子、目的蛋白質をコードする遺伝子及びペプチドリンカーをコードする遺伝子を含む会合ユニット作製用のベクターを用いて、融合蛋白質を発現させて会合ユニットを作製し、得られた会合ユニットを集合させる工程を含む、前項１１に記載のB型肝炎ウイルス様粒子結晶の作製方法。
That is, this invention consists of the following.
1. An associative unit containing a dimeric capsid constituent protein obtained by directly or indirectly binding a capsid constituent protein (A) comprising 149 amino acid residues and / or 150 amino acid residues via a peptide linker A hepatitis B virus-like particle having an octahedral structure of an aggregate obtained by integrating the associated units.
2. 2. The hepatitis B virus-like particle according to item 1 above, wherein the aggregate is an aggregate composed of 24 aggregation units.
3. 3. The hepatitis B virus-like particle according to item 1 or 2, wherein the 48th, 61st and 107th amino acid residues of the capsid constituent protein (A) are each independently cysteine or alanine.
4). 4. The hepatitis B virus-like particle according to any one of items 1 to 3, wherein the capsid component protein (A) comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or 2 below.
1) Capsid constituent protein (A):
MDIDPYKEFG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHCSP HHTALRQAIL CWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISCLTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVV (sequence number 1)
2) Capsid constituent protein (A):
MDIDPYKVIG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHASP HHTALRQAIL AWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISALTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVVC (sequence number 2)
5. 5. The hepatitis B virus-like particle according to any one of items 1 to 4, wherein the association unit contains a target protein in addition to a dimeric capsid constituent protein containing two molecules of the capsid constituent protein (A).
6). The target protein is bound between the capsid component protein (A) and the capsid component protein (A) via a peptide linker, and the bond is bound to the C-terminal side of the capsid component protein (A). 6. The hepatitis B virus-like particle according to item 5 above.
7). 6. The type B according to item 5 above, wherein the target protein is bound to the C-terminal side of the capsid constituent protein (A) and the capsid constituent protein (A) bound via a peptide linker. Hepatitis virus-like particles.
8). When the peptide linker is an amino acid sequence consisting of 3 residues of glycine (G) -glycine (G) -serine (S) as a unit, the peptide linker is a peptide containing 1 to 10 amino acid sequences of the unit. The hepatitis B virus-like particle according to any one of 1 to 7 above.
9. 9. The hepatitis B virus-like particle according to 8 above, wherein the peptide linker is selected from the peptide linkers shown in the following 1) to 4) and is used in the same or different manner.
1) Peptide linker 1: GGSEEE (GGS) 7 (SEQ ID NO: 3)
2) Peptide linker 2: GGSKL (SEQ ID NO: 4)
3) Peptide linker 3: (GGS) 3 KL (SEQ ID NO: 5)
4) Peptide linker 4: (GGS) 3 (SEQ ID NO: 6)
10. The peptide linker shown in the following 1) to 4), which is used for preparing the hepatitis B virus-like particles described in 7 to 9 above.
1) Peptide linker 1: GGSEEE (GGS) 7 (SEQ ID NO: 3)
2) Peptide linker 2: GGSKL (SEQ ID NO: 4)
3) Peptide linker 3: (GGS) 3 KL (SEQ ID NO: 5)
4) Peptide linker 4: (GGS) 3 (SEQ ID NO: 6)
11. A hepatitis B virus-like particle crystal produced from the hepatitis B virus-like particle according to any one of 1 to 9 above.
12 Using a vector for producing an association unit comprising a gene encoding the capsid component protein (A), a gene encoding the target protein, and a gene encoding the peptide linker, the fusion protein is expressed to produce the association unit. A method for producing a hepatitis B virus-like particle crystal according to item 11 above, which comprises a step of assembling the associated units.
本発明の八面体構造を有するB型肝炎ウイルス様粒子結晶は、従来の二十面体構造からなる結晶に比べて非常に力学的、熱力学的に構造安定である。本発明のB型肝炎ウイルス様粒子結晶は、マテリアルサイエンスや生物医薬品の分野において用いられる所望の蛋白質を含むナノプラットフォームとして使用することができる。また、従来結晶化が困難又は不可能であった蛋白質について、容易に結晶化を達成できるようになれば、疾患に関わる蛋白質の立体構造を明らかにすることができ、その触媒部位の特定が可能となる。そして、その立体構造情報をベースとした医薬品の開発が可能となり、産業上非常に有意である。 The hepatitis B virus-like particle crystal having an octahedral structure of the present invention is very mechanically and thermodynamically structurally stable compared to a crystal having a conventional icosahedral structure. The hepatitis B virus-like particle crystal of the present invention can be used as a nanoplatform containing a desired protein used in the fields of material science and biopharmaceuticals. In addition, if it is possible to easily achieve crystallization of proteins that were difficult or impossible to crystallize in the past, the three-dimensional structure of proteins involved in diseases can be clarified, and the catalytic site can be identified. It becomes. And it becomes possible to develop a medicine based on the three-dimensional structure information, which is very significant in industry.
本発明は、八面体構造を有するB型肝炎ウイルス様粒子結晶に関する。本発明のB型肝炎ウイルス様粒子結晶は、キャプシド構成蛋白質（Ａ）を２分子含む「二量体のキャプシド構成蛋白質」と「ペプチドリンカー」を少なくとも含む会合ユニットを基本単位として構成される。会合ユニットには、さらに「目的蛋白質」を含んでいてよい（図１参照）。２種類以上の「会合ユニット」が複数個互いに結合した自己集積体を「会合体」ということができる（図２参照）。本発明のB型肝炎ウイルス様粒子結晶には、上記会合ユニット24個会合した会合体から構成される。 The present invention relates to a hepatitis B virus-like particle crystal having an octahedral structure. The hepatitis B virus-like particle crystal of the present invention is composed of associative units containing at least a “dimer capsid constituent protein” containing two capsid constituent proteins (A) and a “peptide linker”. The association unit may further contain a “target protein” (see FIG. 1). A self-assembled body in which two or more kinds of “association units” are bonded to each other can be referred to as an “aggregate” (see FIG. 2). The hepatitis B virus-like particle crystal of the present invention is composed of an aggregate in which the 24 association units are associated.
本明細書において、「キャプシド構成蛋白質（Ａ）」とは、キャプシドを構成する基本の蛋白質をいう。本明細書において、キャプシド構成蛋白質（Ａ）を構成するアミノ酸は、例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.94, p.9556-61 (1997)（非特許文献２）に示すCp149が挙げられ、さらにはCp149のC末端にシステインを付加し、第48番目、61番目及び107番目のアミノ酸残基はアラニンであるCp150などが挙げられる。具体的には、キャプシド構成蛋白質（Ａ）は149アミノ酸残基及び／又は150アミノ酸残基からからなる蛋白質である。キャプシド構成蛋白質（Ａ）を構成するアミノ酸配列のうち、第48番目、61番目及び107番目のアミノ酸残基が、それぞれ独立してシステイン又はアラニンである。 In the present specification, the “capsid constituent protein (A)” refers to a basic protein constituting the capsid. In this specification, Cp149 shown in, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, p. 956-61 (1997) (Non-patent Document 2) is used as the amino acid constituting the capsid component protein (A). Furthermore, cysteine is added to the C-terminal of Cp149, and the 48th, 61st and 107th amino acid residues are alanine, such as Cp150. Specifically, the capsid component protein (A) is a protein consisting of 149 amino acid residues and / or 150 amino acid residues. Of the amino acid sequences constituting the capsid constituent protein (A), the 48th, 61st and 107th amino acid residues are each independently cysteine or alanine.
配列番号１（HB149）に示すアミノ酸残基数は149個であり、第48番目、61番目及び107番目のアミノ酸残基はシステインである。配列番号２（HB150）に示すアミノ酸残基数は150個であり、第48番目、61番目及び107番目のアミノ酸残基はアラニンであり、C末端にシステインが付加された構造からなる。 The number of amino acid residues shown in SEQ ID NO: 1 (HB149) is 149, and the 48th, 61st and 107th amino acid residues are cysteine. The number of amino acid residues shown in SEQ ID NO: 2 (HB150) is 150, and the 48th, 61st and 107th amino acid residues are alanine, and the cysteine is added to the C-terminal.
１）キャプシド構成蛋白質（Ａ）-HB149：（配列番号１）
MDIDPYKEFG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHCSP HHTALRQAIL CWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISCLTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVV
２）キャプシド構成蛋白質（Ａ）-HB150：（配列番号２）
MDIDPYKVIG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHASP HHTALRQAIL AWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISALTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVVC
1) Capsid constituent protein (A) -HB149: (SEQ ID NO: 1)
MDIDPYKEFG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHCSP HHTALRQAIL CWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISCLTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVV
2) Capsid constituent protein (A) -HB150: (SEQ ID NO: 2)
MDIDPYKVIG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHASP HHTALRQAIL AWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISALTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVVC
キャプシド構成蛋白質（Ａ）-HB149及びHB150をコードする遺伝子の例として、以下の配列番号７及び８に示す塩基配列が挙げられる。
１）キャプシド構成蛋白質（Ａ）-HB149をコードする遺伝子：（配列番号７）
ATGGATATCGATCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTT
２）キャプシド構成蛋白質（Ａ）-HB150をコードする遺伝子：（配列番号８）
ATGGACATTGATCCTTATAAAGTTATCGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATGCGTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCGCGTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTGCGCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTTGC
Examples of genes encoding capsid constituent proteins (A) -HB149 and HB150 include the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 below.
1) Gene encoding capsid constituent protein (A) -HB149: (SEQ ID NO: 7)
ATGGATATCGATCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTT
2) Gene encoding capsid constituent protein (A) -HB150: (SEQ ID NO: 8)
ATGGACATTGATCCTTATAAAGTTATCGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATGCGTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCGCGTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTGCGCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTTGC
本明細書において、「キャプシド構成蛋白質」とは、上記キャプシド構成蛋白質（Ａ）を２分子含む蛋白質であって、キャプシドの構成蛋白質として機能する。キャプシド構成蛋白質を構成する「キャプシド構成蛋白質（Ａ）」は、各々同一、又は別々に149アミノ酸残基及び／又は150アミノ酸残基からなる蛋白質が、直接的又は間接的にリンカーを介して結合していればよい。ここで、本発明の会合ユニットを形成するために必要な２分子のキャプシド構成蛋白質（Ａ）は、HB149同士の組み合わせ、HB149とHB150の組み合わせ、あるいはHB150同士の組み合わせであってもよい。キャプシド構成蛋白質には、キャプシド構成蛋白質（Ａ）２分子の他、目的蛋白質を含んでいてもよい。 In the present specification, the “capsid constituent protein” is a protein containing two molecules of the capsid constituent protein (A) and functions as a constituent protein of the capsid. The “capsid constituent protein (A)” constituting the capsid constituent protein is the same or separately, and a protein consisting of 149 amino acid residues and / or 150 amino acid residues is directly or indirectly bound via a linker. It only has to be. Here, the two capsid constituent proteins (A) necessary for forming the association unit of the present invention may be a combination of HB149, a combination of HB149 and HB150, or a combination of HB150. The capsid constituent protein may contain a target protein in addition to two molecules of the capsid constituent protein (A).
「キャプシド構成蛋白質」に目的蛋白質を含む場合には、（１）目的蛋白質が、キャプシド構成蛋白質（Ａ）とキャプシド構成蛋白質（Ａ）の間に各々ペプチドリンカーを介して結合しており、当該結合が、各々キャプシド構成蛋白質（Ａ）のC末端側と結合していてもよいし、（２）ペプチドリンカーを介してキャプシド構成蛋白質（Ａ）とキャプシド構成蛋白質（Ａ）が結合したキャプシド構成蛋白質のC末端側と結合していてもよい。 When the target protein is included in the “capsid constituent protein”, (1) the target protein is bound between the capsid constituent protein (A) and the capsid constituent protein (A) via a peptide linker. Each may be bound to the C-terminal side of the capsid constituent protein (A), or (2) a capsid constituent protein in which the capsid constituent protein (A) and the capsid constituent protein (A) are bound via a peptide linker. It may be bonded to the C-terminal side.
本明細書において「目的蛋白質」とは、本発明の会合ユニットが自己集積して形成されるキャプシド構造の内部に配置される所望の蛋白質をいう。例えば解析対象蛋白質であってもよいし、当該会合体の内部に配置することで、会合体を新たなドラッグデリバリーシステム（DDS）の手段として使用する場合には、DDSによって送達したい蛋白質であってもよい。そのような蛋白質として、例えば水溶性球状蛋白質が挙げられる。水溶性球状蛋白質は、疎水性、親水性のアミノ酸がバランスよく含まれている。例えば、酵素、抗体、転写因子などの蛋白質が挙げられる。目的蛋白質の大きさは、当該キャプシド構造内に配置可能な大きさであればよく特に限定されない。 In the present specification, the “target protein” refers to a desired protein disposed inside a capsid structure formed by self-assembly of the association unit of the present invention. For example, the protein to be analyzed may be a protein to be delivered by DDS when the aggregate is used as a means of a new drug delivery system (DDS) by being placed inside the aggregate. Also good. Examples of such proteins include water-soluble globular proteins. The water-soluble globular protein contains hydrophobic and hydrophilic amino acids in a well-balanced manner. Examples include proteins such as enzymes, antibodies, and transcription factors. The size of the target protein is not particularly limited as long as it can be arranged in the capsid structure.
本明細書において「ペプチドリンカー」とは、２つのキャプシド構成蛋白質（Ａ）を結合させるため、又はキャプシド構成蛋白質（Ａ）と目的蛋白質を結合させるためのペプチドリンカーをいう。２つのキャプシド構成蛋白質（Ａ）を結合させるためであれば、あるペプチドリンカーとペプチドリンカーの間に「目的蛋白質」が含まれていてもよい。ペプチドリンカーは、「目的蛋白質」がキャプシド構造の内部に配置されるように、用いることができる。 In the present specification, the “peptide linker” refers to a peptide linker for binding two capsid constituent proteins (A) or for binding capsid constituent proteins (A) and a target protein. In order to bind two capsid constituent proteins (A), a “target protein” may be included between a peptide linker and a peptide linker. Peptide linkers can be used such that the “target protein” is located within the capsid structure.
本明細書において、ペプチドリンカーは、２つのキャプシド構成蛋白質（Ａ）を含むキャプシド構成蛋白質と目的蛋白質との複合体形成において、以下の態様に示すように少なくとも一箇所又は二箇所以上の場において使用することができる。目的蛋白質がキャプシド構造の内部に配置され、固定可能であればよく、以下の態様に限定されずペプチドリンカーはさらに多くの箇所において使用することができる。
１）キャプシド構成蛋白質（Ａ）−ペプチドリンカー−キャプシド構成蛋白質（Ａ）−ペプチドリンカー−目的蛋白質
２）キャプシド構成蛋白質（Ａ）−ペプチドリンカー−目的蛋白質−ペプチドリンカー−キャプシド構成蛋白質（Ａ）
In the present specification, the peptide linker is used in a complex of a capsid constituent protein including two capsid constituent proteins (A) and a target protein in at least one place or two or more places as shown in the following embodiments. can do. It is only necessary that the target protein is disposed inside the capsid structure and can be fixed, and the peptide linker is not limited to the following embodiments, and the peptide linker can be used in more places.
1) Capsid constituent protein (A) -peptide linker-capsid constituent protein (A) -peptide linker-target protein 2) Capsid constituent protein (A) -peptide linker-target protein-peptide linker-capsid constituent protein (A)
本発明に適用可能なペプチドリンカーの配列としては、例えば特開２０１２−１２５１９０号公報（特許文献３）に開示されるペプチドを使用することができる。さらには、グリシン（G）−グリシン（G）−セリン（S）の３残基からなるアミノ酸配列を一単位としたときに、当該一単位のアミノ酸配列（以下単に「GGS」という場合もある。）を１〜１０個、好ましくは１〜７個含むことができる。グリシンは側鎖のない疎水性のアミノ酸であり、他のアミノ酸に比べて柔軟性が高い。一方、セリンは水溶性のアミノ酸である。柔軟性及び適度な親水性を確保するために検討した結果、GGSを一単位のアミノ酸配列とすることが効果的であると判断される。 As a peptide linker sequence applicable to the present invention, for example, a peptide disclosed in JP 2012-125190 A (Patent Document 3) can be used. Furthermore, when an amino acid sequence consisting of three residues of glycine (G) -glycine (G) -serine (S) is taken as one unit, the amino acid sequence of the one unit (hereinafter sometimes simply referred to as “GGS”). 1-10, preferably 1-7. Glycine is a hydrophobic amino acid having no side chain and is more flexible than other amino acids. On the other hand, serine is a water-soluble amino acid. As a result of studies to ensure flexibility and moderate hydrophilicity, it is judged that it is effective to make GGS one amino acid sequence.
具体的なペプチドリンカーとして、以下が例示されるが、以下に限定されるものではない。
１）ペプチドリンカー１：GGSEEE(GGS)7（配列番号３）
２）ペプチドリンカー２：GGSKL（配列番号４）
３）ペプチドリンカー３：(GGS)3KL（配列番号５）
４）ペプチドリンカー４：(GGS)3（配列番号６）
Specific examples of the peptide linker include the following, but are not limited to the following.
1) Peptide linker 1: GGSEEE (GGS) 7 (SEQ ID NO: 3)
2) Peptide linker 2: GGSKL (SEQ ID NO: 4)
3) Peptide linker 3: (GGS) 3 KL (SEQ ID NO: 5)
4) Peptide linker 4: (GGS) 3 (SEQ ID NO: 6)
上記ペプチドリンカーをコードする遺伝子の塩基配列として、以下が例示されるが、以下に限定されるものではない。
１）ペプチドリンカー１：GGTGGCTCTGAAGAGGAAGGTGGATCCGGTGGTAGCGGTGGCAGCGGTGGTAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGTGGCAGC（配列番号９）
２）ペプチドリンカー２：GGTGGCAGCAAGCTT（配列番号１０）
３）ペプチドリンカー３：GGTGGCTCTGGGGGGAGCGGTGGGAGCAAGCTT（配列番号１１）
４）ペプチドリンカー４：GGTGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGATCC （配列番号１２）
Examples of the base sequence of the gene encoding the peptide linker include, but are not limited to, the following.
1) Peptide linker 1: GGTGGCTCTGAAGAGGAAGGTGGATCCGGTGGTAGCGGTGGCAGCGGTGGTAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGTGGCAGC (SEQ ID NO: 9)
2) Peptide linker 2: GGTGGCAGCAAGCTT (SEQ ID NO: 10)
3) Peptide linker 3: GGTGGCTCTGGGGGGAGCGGTGGGAGCAAGCTT (SEQ ID NO: 11)
4) Peptide linker 4: GGTGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGATCC (SEQ ID NO: 12)
会合ユニットにおける融合蛋白質、即ち「キャプシド構成蛋白質」と「ペプチドリンカー」と「目的蛋白質」各々の融合蛋白質は、それぞれを構成する蛋白質を融合させる慣用の技術によって作製することができる。例えば、キャプシド構成蛋白質をコードしたDNAの前後又は途中に、目的蛋白質やペプチドをコードするDNAを挿入し、そのDNAを用いて、遺伝子操作により融合蛋白質を作製することができる。他の方法、例えば化学合成や全合成されたDNAによる生合成によって融合蛋白質を作製してもよい。 The fusion proteins in the association unit, that is, the fusion proteins of “capsid constituent protein”, “peptide linker” and “target protein” can be prepared by a conventional technique for fusing the respective constituent proteins. For example, a DNA encoding a target protein or peptide can be inserted before, after or in the middle of a DNA encoding a capsid constituent protein, and a fusion protein can be prepared by genetic manipulation using the DNA. The fusion protein may be produced by other methods such as chemical synthesis or biosynthesis using totally synthesized DNA.
キャプシド構成蛋白質（Ａ）をコードするDNAは、ウイルスに感染した患者、動物、細胞、微生物からポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）法により単離することができる。例えば、B型肝炎ウイルスのHBcAgの場合、慢性活動性B型肝炎感染患者の血清から抽出したcDNAライブラリーから、例えば文献（Antoine Touze, et al., J. Clinical Microbiology, Baculovirus Expression of Chimeric Hepatitis B Virus Core Particles with Hepatitis E Virus Epitopes and Their Use in a Hepatitis E Immunoassay, 37, p.438-441(1999)）に記載のプライマーを用いて、PCR法により単離することができる。ウイルスの遺伝子の配列情報を使って適宜設計することができる。ウイルスのDNA及びアミノ酸配列情報は、例えばNCBI（National Center for Biotechnology Information）のゲノムデータベースに登録されているものを活用することができる。 The DNA encoding the capsid constituent protein (A) can be isolated from patients, animals, cells and microorganisms infected with viruses by the polymerase chain reaction (PCR) method. For example, in the case of HBcAg of hepatitis B virus, from a cDNA library extracted from the serum of a patient with chronic active hepatitis B infection, for example, literature (Antoine Touze, et al., J. Clinical Microbiology, Baculovirus Expression of Chimeric Hepatitis B It can be isolated by PCR using the primers described in Virus Core Particles with Hepatitis E Virus Epitopes and Their Use in a Hepatitis E Immunoassay, 37, p.438-441 (1999). It can design suitably using the arrangement | sequence information of a viral gene. For example, DNA DNA and amino acid sequence information registered in the genome database of NCBI (National Center for Biotechnology Information) can be used.
目的蛋白質は、どのような手段で入手してもよい。例えば、化学合成、動植物や微生物などの目的蛋白質を含む検体からの単離・抽出、目的蛋白質をコードする遺伝子を用いた遺伝子組み換えの手法による蛋白質の生成などが挙げられる。また、目的蛋白質をコードする遺伝子を用いて、本発明の会合ユニットに含まれる目的蛋白質の作製と同時に作製することもできる。 The target protein may be obtained by any means. For example, chemical synthesis, isolation / extraction from a specimen containing a target protein such as animals, plants, and microorganisms, and production of a protein by a genetic recombination technique using a gene encoding the target protein. It can also be produced simultaneously with the production of the target protein contained in the association unit of the present invention using a gene encoding the target protein.
遺伝子組み換えの手法により目的蛋白質、又は目的蛋白質を含む融合蛋白質を作製する場合は、当該目的蛋白質又は当該融合蛋白質をコードする遺伝子についてcDNAを作製し、適切なプライマーを用いて、PCR等の手法により遺伝子を増幅し、PCR産物について自体公知の方法に従い、発現ベクターに組み込ませることができる。PCR法の場合は、用いたプライマーに、予め特定の制限酵素で切断される配列（制限酵素サイト）を組み込んでおけば、発現ベクターの作製はより容易になる。発現ベクターの種類は当該ベクターを組み込ませる予定の宿主の種類に応じて、適宜選択することができる。 When preparing a target protein or a fusion protein containing the target protein by a genetic recombination technique, cDNA is prepared for the target protein or a gene encoding the target protein, and an appropriate primer is used to perform a PCR or other technique. The gene can be amplified and incorporated into an expression vector according to a method known per se for PCR products. In the case of the PCR method, if a sequence (restriction enzyme site) that is cleaved with a specific restriction enzyme is previously incorporated into the primer used, the production of the expression vector becomes easier. The type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host into which the vector is to be incorporated.
上記で作製した発現ベクターを大腸菌などの微生物、植物体、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞又はトランスジェニック動物などの宿主に感染又はリポソームなどとともに取り込ませて、形質転換させ、蛋白質を発現させることができる。また、宿主を用いることなく、無細胞蛋白質発現系を用いて作製することもできる。無細胞蛋白質発現キットは、例えばロッシュリサーチ社から販売されており、蛋白質を簡便かつ短時間で作製することができ、有用な手段の一つである。 The expression vector produced above can be incorporated into a host such as a microorganism such as E. coli, a plant body, a plant cell, an animal cell, an insect cell or a transgenic animal together with infection or liposome, transformed, and allowed to express a protein. it can. Moreover, it can also produce using a cell-free protein expression system, without using a host. The cell-free protein expression kit is sold by, for example, Roche Research, and is a useful means that can produce a protein simply and in a short time.
以上のように設計され、作製された会合ユニットを会合させ、会合体を形成させることができる。具体的には、B型肝炎ウイルスのHBcAgからなる会合ユニットは、HBcAgを大腸菌体内に大量かつ高濃度に発現させることによって、HBcAg会合体形成を誘導させることができる。当然会合体は会合ユニットに比べ、大きくかつ高分子量である。係る大きさや分子量の違いを利用して、例えば公知の精製法であるゲルクロマトグラフィー等の分子ふるいや遠心分離操作で会合体を形成しないものや不純物を取り除くことで、会合体は容易に精製することができる。 The association unit designed and produced as described above can be assembled to form an aggregate. Specifically, an association unit composed of HBcAg of hepatitis B virus can induce HBcAg aggregate formation by expressing HBcAg in a large amount and high concentration in Escherichia coli. Of course, the aggregate is larger and has a higher molecular weight than the association unit. By taking advantage of the difference in size and molecular weight, the aggregate can be easily purified by removing molecular sieves such as gel chromatography, which is a known purification method, and those that do not form aggregates or impurities by centrifugation. be able to.
会合体間の相互作用、すなわち非共有結合性の分子間相互作用を通じて、会合体は結晶化させることができる。会合体間の相互作用が異なれば、その結晶化条件も異なったものになってしまう。本発明で用いられる会合体は、会合体間の相互作用に影響を与えない、すなわち会合体表面の形状、電荷状態に影響を与えることのない様に会合体内部に目的蛋白質を配置させた会合体である。そのため、この会合体は、目的蛋白質を結合させていない会合体と同様の会合体間の相互作用を通じて、同様の結晶化条件で結晶化することができる。 Through the interaction between the aggregates, that is, the non-covalent intermolecular interaction, the aggregate can be crystallized. If the interaction between the aggregates is different, the crystallization conditions are also different. The aggregate used in the present invention does not affect the interaction between the aggregates, that is, the aggregate in which the target protein is arranged inside the aggregate so as not to affect the shape and charge state of the aggregate surface. It is a coalescence. Therefore, this aggregate can be crystallized under the same crystallization conditions through the interaction between the aggregates similar to the aggregate to which the target protein is not bound.
具体的には、目的蛋白質を含む会合体の結晶の調製は以下の手順で進めることができる。得られた会合体は、目的蛋白質を含まない会合体と同等の条件下で、一般的な蛋白質結晶化法を利用して結晶化することができる。例えば、目的蛋白質を含むHBcAg会合体の場合、目的蛋白質を含まないHBcAg会合体と同等の結晶化条件（Samantha A. Wynne et al., Molecular Cell, The crystal structure of the human hepatitis B virus capsid., Vol.3, p.771-780 (1999)）により、最も一般的に利用されているハンギングドロップ蒸気拡散法を用い結晶化することができる。他にも、例えば目的蛋白質を含むバクテリオファージφX174キャプシドの場合、既に報告されている目的蛋白質を含まない会合体の結晶化条件（Terje Dokland et al., Nature, Structure of a viral procapsid with molecular scaffolding, Vol.389, p.308-313(1997)）と同等の結晶化条件により、結晶化することができる。他のウイルスキャプシドで既に結晶構造解析が報告されている会合体については、その結晶化条件を用いて本発明の会合体について同様の結晶化条件で結晶化することができる。特に、硫酸アンモニウム濃度を高くすることにより、相分離状態に導くことで、良質な結晶を得ることができる。 Specifically, the preparation of the aggregate crystals containing the target protein can be carried out by the following procedure. The obtained aggregate can be crystallized using a general protein crystallization method under the same conditions as the aggregate not containing the target protein. For example, in the case of an HBcAg aggregate containing the target protein, crystallization conditions equivalent to those of the HBcAg aggregate not containing the target protein (Samantha A. Wynne et al., Molecular Cell, The crystal structure of the human hepatitis B virus capsid., Vol.3, p.771-780 (1999)), it is possible to crystallize using the most commonly used hanging drop vapor diffusion method. In addition, for example, in the case of bacteriophage φX174 capsid containing the target protein, the crystallization conditions of the aggregate not containing the target protein already reported (Terje Dokland et al., Nature, Structure of a viral procapsid with molecular scaffolding, Vol.389, p.308-313 (1997)), and can be crystallized. With respect to aggregates whose crystal structure analysis has already been reported for other virus capsids, the aggregates of the present invention can be crystallized under the same crystallization conditions using the crystallization conditions. In particular, a high quality crystal can be obtained by increasing the ammonium sulfate concentration to lead to a phase separation state.
結晶化した蛋白質の立体構造を解析する方法としては、X線回折、中性子線回折、電子線回折いずれの方法を用いても解析することができるが、X線回折を用いた結晶構造解析が最も一般的である。通常のX線回折装置を用いてもよいが、例えば、複数の波長の異なる高輝度X線を同時に照射することができるSPring-8等の放射光実験施設のビームラインを利用して解析することにより、短時間でかつ精度のよい回折データ及び立体構造座標を得ることができる。HBcAg会合体等は結晶構造解析の対象としては比較的大きな粒子である。そのため、放射光実験設備のビームラインとしては、ベンディングマグネット(Bending Magnet)方式のビームラインよりもアンジュレーター方式のビームラインの方が、ウイルス様粒子結晶の回折データ収集に適している。 As a method for analyzing the three-dimensional structure of the crystallized protein, it can be analyzed using any of X-ray diffraction, neutron diffraction, and electron diffraction methods, but crystal structure analysis using X-ray diffraction is the most. It is common. A normal X-ray diffractometer may be used, but for example, analysis using a beam line of a synchrotron radiation experimental facility such as SPring-8 that can simultaneously irradiate high-intensity X-rays with different wavelengths. Thus, accurate diffraction data and three-dimensional structure coordinates can be obtained in a short time. HBcAg aggregates and the like are relatively large particles as objects of crystal structure analysis. Therefore, the undulator beam line is more suitable for collecting virus-like particle crystal diffraction data than the Bending Magnet beam line of the synchrotron radiation experiment facility.
通常、蛋白質等の生体高分子のX線結晶構造解析においては、解析対象の立体構造が未知である場合、位相問題を解決するために重原子同型置換体結晶を作製する必要がある。しかし、本発明の結晶の場合、例えば目的蛋白質を内包するHBcAg会合体結晶の場合、HBcAg会合体の結晶解析で用いた位相及び原子座標をそのまま利用することができる。 Usually, in the X-ray crystal structure analysis of biopolymers such as proteins, when the three-dimensional structure to be analyzed is unknown, it is necessary to prepare a heavy atom isomorphous substitution crystal in order to solve the phase problem. However, in the case of the crystal of the present invention, for example, in the case of an HBcAg aggregate crystal containing the target protein, the phase and atomic coordinates used in the crystal analysis of the HBcAg aggregate can be used as they are.
結晶構造解析の結果得られた目的蛋白質の原子座標を用いることによって、目的蛋白質に結合又は作用する分子を設計することができる。また、目的蛋白質が複合体である場合は、複合体を形成している分子間の相互作用を解析することによって、より容易に分子設計することができる。 By using the atomic coordinates of the target protein obtained as a result of the crystal structure analysis, a molecule that binds to or acts on the target protein can be designed. In addition, when the target protein is a complex, it can be designed more easily by analyzing the interaction between the molecules forming the complex.
代表的な分子設計の手法として、例えば、Ａ）対話式の分子モデリングシステムを利用しコンピュータグラフィックス上に目的蛋白質を表示し視覚的に解析し設計する方法、Ｂ）目的蛋白質の結合部位にフィットする分子を自動的に作成するプログラムを使う方法、Ｃ）化合物データベース中の個々の化合物を目的蛋白質の結合部位に自動的にフィットさせてうまくフィットする化合物を見つけだす、in silicoスクリーニング方法、などが挙げられる。これらの手法やそれ以外の手法を単独若しくは適宜組み合わせて使用することで分子設計することができる。 Typical molecular design methods include, for example, A) a method of displaying an objective protein on computer graphics using an interactive molecular modeling system, visually analyzing and designing, and B) fitting a binding site of the objective protein. A method that uses a program that automatically creates molecules to perform, C) an in silico screening method that automatically fits individual compounds in the compound database to the binding site of the target protein, and finds a good fit. It is done. Molecular design can be performed by using these methods or other methods alone or in appropriate combination.
本発明の方法によれば、目的蛋白質又は目的蛋白質を含む融合蛋白質について同じ条件での結晶の作製が可能であるため、それらの解析結果からより容易かつ精密に分子設計することができる。例えば、ある酵素とその酵素に対する酵素阻害活性の強さが異なる一連の阻害剤との複合体を解析することによって、阻害剤の活性の強弱が酵素・阻害剤間のどの相互作用の有無や強弱で生じているかを理解することができる。その結果、より活性の強い阻害剤を設計することができる。さらに、阻害剤の分子構造中で活性発現に寄与している部分と寄与していない部分とを特定できるため、活性を弱めることなく阻害剤の物性や経口吸収性・代謝安定性・毒性などを改善するための分子設計も可能である。また、これら阻害剤と別の酵素との複合体の解析を行えば、一方をより選択的に阻害する阻害剤を設計することができる。酵素阻害剤に限らず、複数の複合体結晶の解析結果を用いることで、より精度の高い分子設計が可能となる。 According to the method of the present invention, a target protein or a fusion protein containing the target protein can be prepared under the same conditions, and therefore, the molecular design can be made more easily and precisely from the analysis results. For example, by analyzing a complex of a certain enzyme and a series of inhibitors with different enzyme inhibitory activities, the strength of the inhibitor activity can be determined by the interaction between the enzyme and the inhibitor. Can understand what is happening. As a result, a more active inhibitor can be designed. Furthermore, because it is possible to identify the part that contributes to the expression of activity and the part that does not contribute to the activity in the molecular structure of the inhibitor, the physical properties, oral absorption, metabolic stability, toxicity, etc. of the inhibitor can be determined without compromising the activity. Molecular design for improvement is also possible. Moreover, if the complex of these inhibitors and another enzyme is analyzed, the inhibitor which inhibits one more selectively can be designed. By using the analysis results of a plurality of complex crystals as well as enzyme inhibitors, molecular design with higher accuracy becomes possible.
本発明の理解を深めるために、以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは、いうまでもない。 In order to deepen the understanding of the present invention, the present invention will be specifically described below with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited thereto.
（実施例１）B型肝炎ウイルス様粒子結晶の作製
本実施例では、オワンクラゲ由来変異型緑色蛍光蛋白質（EGFP）を目的蛋白質としたときの融合蛋白質による会合ユニット、及び会合ユニット集合体によるB型肝炎ウイルス様粒子及びB型肝炎ウイルス様粒子結晶の作製について説明する。
(Example 1) Preparation of hepatitis B virus-like particle crystal In this example, an association unit by a fusion protein and a type B by an assembly unit assembly when Awan jellyfish-derived mutant green fluorescent protein (EGFP) is used as a target protein. The production of hepatitis virus-like particles and hepatitis B virus-like particle crystals will be described.
１）会合ユニットの作製
本実施例では、図４ａ）に示す会合ユニットを作製した。
キャプシド構成蛋白質（Ａ）（HBcAg）をコードする遺伝子、EGFPをコードする遺伝子、及び各ペプチドリンカーをコードする遺伝子、並びに発現ベクターを材料とし、制限酵素及びDNAポリメラーゼを用いて、上記いずれかの組み合わせからなるペプチドリンカーを含む融合蛋白質発現用ベクターを構築した（図４参照）。
1) Production of association unit In this example, the association unit shown in FIG. 4a) was produced.
Any combination of the above, using a restriction enzyme and a DNA polymerase, using a gene encoding capsid component protein (A) (HBcAg), a gene encoding EGFP, a gene encoding each peptide linker, and an expression vector as materials. A fusion protein expression vector comprising a peptide linker consisting of was constructed (see FIG. 4).
遺伝子１：ベクター調製用蛋白質１をコードする遺伝子：（配列番号１３）
ATGGACATTGATCCTTATAAAGTTATCGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATGCGTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCGCGTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTGCGCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTTGCGGTGGCTCTGAAGAGGAAGGTGGATCC
Gene 1: Gene encoding protein 1 for vector preparation: (SEQ ID NO: 13)
ATGGACATTGATCCTTATAAAGTTATCGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATGCGTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCGCGTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTGCGCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTTGCGGTGGCTCTGAAGAGGAAGGTGGATCC
遺伝子２：ベクター調製用蛋白質２をコードする遺伝子：（配列番号１４）
GGTGGTAGCGGTGGCAGCGGTGGTAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGTGGCAGCATGGATATCGATCCTTATAAAGAATTCGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATGCGTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCGCGTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTGCGCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTTGCGGTGGCAGCAAGCTT
Gene 2: Gene encoding protein 2 for vector preparation: (SEQ ID NO: 14)
GGTGGTAGCGGTGGCAGCGGTGGTAGCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGTGGCAGCATGGATATCGATCCTTATAAAGAATTCGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATGCGTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCGCGTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTGCGCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTTGCGGTGGCAGCAAGCTT
遺伝子３：ベクター調製用蛋白質３をコードする遺伝子：（配列番号１５）
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCCGCCGCCGCCGC
Gene 3: Gene encoding protein 3 for vector preparation: (SEQ ID NO: 15)
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCCGCCGCCGCCGC
・ベクター調製用蛋白質１の構成：
キャプシド構成蛋白質（Ａ）-HB150（配列番号２）及び
ペプチドリンカー１の１部（GGSEEEGGS：配列番号１６）
-Composition of protein 1 for vector preparation:
Capsid component protein (A) -HB150 (SEQ ID NO: 2) and part of peptide linker 1 (GGSEEEGGS: SEQ ID NO: 16)
・ベクター調製用蛋白質２の構成：
ペプチドリンカー１の１部（(GGS)6：配列番号１７）
キャプシド構成蛋白質（Ａ）-HB150（配列番号２）
ペプチドリンカー２（GGSKL：配列番号４）
-Composition of protein 2 for vector preparation:
Part of peptide linker 1 ((GGS) 6 : SEQ ID NO: 17)
Capsid component protein (A) -HB150 (SEQ ID NO: 2)
Peptide linker 2 (GGSKL: SEQ ID NO: 4)
・ベクター調製用蛋白質３の構成（EGFP）：
MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT LVTTLTYGVQ CFSRYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSTQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI RRRR（配列番号１８）
-Composition of protein 3 for vector preparation (EGFP):
MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT LVTTLTYGVQ CFSRYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSTQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI RRRR (SEQ ID NO: 18)
上記遺伝子１〜３（配列番号１３〜１５に示す３種類の遺伝子）を各々PCRの手法で作製した。発現ベクター（pET28a(+)：Novagen社製）のマルチクローニングサイトを利用し、遺伝子１〜３の遺伝子を導入した。キャプシド構成蛋白質（Ａ）-HB150をコードする遺伝子は、慢性活動性B型肝炎患者の血清より作製したcDNAライブラリーを用いて、クローニングして得た遺伝子を用いた。 Each of the above genes 1 to 3 (three kinds of genes shown in SEQ ID NOs: 13 to 15) was prepared by PCR. Genes 1 to 3 were introduced using a multicloning site of an expression vector (pET28a (+): Novagen). As a gene encoding capsid component protein (A) -HB150, a gene obtained by cloning using a cDNA library prepared from the serum of a chronic active hepatitis B patient was used.
上記作製した融合蛋白質の発現用ベクターを大腸菌Arctic Express(DE3)RIL（Agilent Technologies社製）に組み込み、LB培地で培養し、発現させた。 The fusion protein expression vector prepared above was incorporated into Escherichia coli Arctic Express (DE3) RIL (manufactured by Agilent Technologies), cultured in LB medium, and expressed.
２．B型肝炎ウイルス様粒子の作製
60 mlの破砕用緩衝液（Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 200 mg/ml）で菌を懸濁し、超音波破砕した。さらに、20分間15,000rpmで遠心分離操作をして、細胞片を取り除いた。遠心分離操作後の上澄みに硫酸アンモニウムを濃度20%になるように加え、発現した融合蛋白質を沈殿させた。沈殿物（ペレット）を緩衝液20 mlの50 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.5,150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100）に再溶解させ、Sepharose CL-4B column（GE Healthcare社）による精製を行い、25%硫酸アンモニウム溶液で沈殿させ遠心分離することでEGFPを含むウイルス様粒子（virus-like particles：VLP）溶液を得た。その後、透析液（Tris塩酸緩衝液pH7.5, 300mM NaCl）を用いて透析し、これを蔗糖密度勾配遠心分離法（30〜5%）により分取した。分取した各画分に含まれる融合蛋白質の分子量をSDS-PAGEにより調べ、会合体を確認したところ分子量が約55kDaのウイルス様粒子であることが確認された（図４）。ウイルス様粒子の結晶化の前に、ウイルス様粒子溶液を5 mMTris-HCl 緩衝液（pH7.5, 150mM NaCl）を用いて透析して濃縮した。
2. Production of hepatitis B virus-like particles
Bacteria were suspended in 60 ml of disruption buffer (Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 200 mg / ml) and sonicated. Further, centrifugation was performed at 15,000 rpm for 20 minutes to remove cell debris. Ammonium sulfate was added to the supernatant after centrifugation to a concentration of 20% to precipitate the expressed fusion protein. The precipitate (pellet) is re-dissolved in 20 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100) and purified by Sepharose CL-4B column (GE Healthcare). And precipitated with a 25% ammonium sulfate solution and centrifuged to obtain a virus-like particles (VLP) solution containing EGFP. Then, it dialyzed using the dialysate (Tris hydrochloric acid buffer pH7.5, 300 mM NaCl), and this was fractionated by the sucrose density gradient centrifugation method (30-5%). The molecular weight of the fusion protein contained in each fraction was examined by SDS-PAGE, and the aggregate was confirmed to be virus-like particles having a molecular weight of about 55 kDa (FIG. 4). Prior to crystallization of virus-like particles, the virus-like particle solution was dialyzed and concentrated using 5 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5, 150 mM NaCl).
３．B型肝炎ウイルス様粒子結晶
上記作製したウイルス様粒子について、 S. A. Wynneら（非特許文献１）の方法に従って結晶化を行った。上記により得られた10mg/ml（50mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl）のウイルス様粒子溶液2μl を24ウェルのプレートに加え、500μlのリザーバー緩衝液（100mM NaHCO3 pH 9.5, 100mM NaCl, 250-350 mM KCl, 9.0-9.5% PEG-MME, 10% 2-propanol）を用いてハンギングドロップ蒸気拡散法により作製した。高品質結晶構造(約0.1×0.1×0.1 mm)は、0.5〜1% PEG20000, 1.0〜1.4 M 硫酸アンモニウム、0.1 M MES pH 6.5、2.4 mg/ml蛋白濃度の条件下で3ヶ月静置したときに析出した。
3. Hepatitis B virus-like particle crystals The virus-like particles produced above were crystallized according to the method of SA Wynne et al. Add 2 μl of the virus-like particle solution of 10 mg / ml (50 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl) obtained above to a 24-well plate and add 500 μl of reservoir buffer (100 mM NaHCO 3 pH 9.5, 100 mM NaCl, 250-350 It was prepared by hanging drop vapor diffusion method using mM KCl, 9.0-9.5% PEG-MME, 10% 2-propanol). High quality crystal structure (approx.0.1 x 0.1 x 0.1 mm) is 0.5-1% PEG 20000, 1.0-1.4 M ammonium sulfate, 0.1 M MES pH 6.5, when left standing for 3 months under 2.4 mg / ml protein concentration Precipitated.
（実験例１）ウイルス様粒子結晶の分析
実施例１により作製されたウイルス様粒子結晶について、リザーバー緩衝液で3回洗浄した後IX71蛍光顕微鏡（オリンパス製）を用いて観察した（図６）。ウイルス様粒子結晶をクライオループ（Hampton Research社）にマウントし、凍結保護溶液（22%(v/v) 2,3-ブタノールを含む結晶用緩衝液）に浸漬させ、100 K窒素ガスを吹き付けて凍結させた。高速イメージングプレートX線検出器（R-AXIS VIIR-AXIS VII、Rigaku社）によりウイルス様粒子結晶のX線回折能を確認した。その後、放射光科学研究施設（フォトンファクトリー：つくば）においてビームラインBL17AでX線データを収集した。データは、iMOSFLM （Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R. & Leslie, A. G.W.(2011) Acta Cryst. D67, 271-281）及び CCP4（Winn, M. D. et al. (2011) Acta Cryst. D67, 235-242）のプログラムを用いて処理した。最初の空間群予測はPOINTLESパッケージ（Evans, P. (2006) Acta Cryst. D62, 72-82）に従った。平均強度は、TRUNCATE（French, S. & Wilson, K. (1978) Acta Cryst. A34, 517-525）によってX線強度データを構造因子に変換し、MOLREPプログラム（Vagin, A. & Teplyakov, A. (2010) Acta Cryst. D66, 22-25）を用いて自己回転関数を解析した。
(Experimental Example 1) Analysis of virus-like particle crystal The virus-like particle crystal prepared in Example 1 was washed three times with a reservoir buffer and then observed using an IX71 fluorescence microscope (manufactured by Olympus) (Fig. 6). Virus-like particle crystals are mounted on cryoloop (Hampton Research), soaked in cryoprotective solution (crystal buffer containing 22% (v / v) 2,3-butanol) and sprayed with 100 K nitrogen gas. Frozen. The X-ray diffraction ability of the virus-like particle crystal was confirmed with a high-speed imaging plate X-ray detector (R-AXIS VIIR-AXIS VII, Rigaku). Thereafter, X-ray data was collected at the beamline BL17A at the Synchrotron Radiation Research Facility (Photon Factory: Tsukuba). Data are iMOSFLM (Battye, TGG, Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, HR & Leslie, AGW (2011) Acta Cryst. D67, 271-281) and CCP4 (Winn, MD et al. (2011) Acta Cryst. D67, 235-242). The first space group prediction followed the POINTLES package (Evans, P. (2006) Acta Cryst. D62, 72-82). The average intensity was calculated by converting X-ray intensity data into structure factors using TRUNCATE (French, S. & Wilson, K. (1978) Acta Cryst. A34, 517-525), and using the MOLREP program (Vagin, A. & Teplyakov, A (2010) Acta Cryst. D66, 22-25) was used to analyze the self-rotation function.
得られた結晶は、空間群F432、単位格子定数はa=b=c=219.7Åであった。全てのX線結晶解析データの収集統計は表１に示した。空間群F432において、単位格子中に96の非対称単位があり、それは24の回転と4の並進がある。非対称単位の24の回転は八面体の対称操作に対応している。さらに5-10Å分解能と100Åの積分半径を用いた自己回転関数マップから、2回軸、3回軸、4回軸のピークが見つかった。これは、その空間群に対して予想される八面体対称に存在する回転軸である。さらに正二十面体の特徴である5回軸のピークは見つからなかった。マシューの係数とソルベントコンテンツはそれぞれ2.01ÅDaと38.8%であった。従って、F432空間群の単位格子中に4つの八面体があることとなる。 The obtained crystal had space group F432 and a unit cell constant of a = b = c = 219.7%. The collection statistics of all X-ray crystallographic data are shown in Table 1. In space group F432, there are 96 asymmetric units in the unit cell, which have 24 rotations and 4 translations. A rotation of 24 asymmetric units corresponds to an octahedral symmetry operation. In addition, from the self-rotation function map using 5-10 mm resolution and an integral radius of 100 mm, two-, three-, and four-fold peaks were found. This is the rotation axis that exists in the octahedral symmetry expected for the space group. Furthermore, the peak of the 5-fold axis characteristic of the icosahedron was not found. Matthew's coefficient and solvent content were 2.01 Da and 38.8%, respectively. Therefore, there are four octahedrons in the unit cell of the F432 space group.
八面体構造を有するB型肝炎ウイルス様粒子結晶は、凍結保護溶液であるブタノールのような低分子によるソーキングに耐える安定性を有する。このことから目的蛋白質に対する低分子薬剤のソーキングにも耐えられる可能性がある。正二十面体での分解能が3.3Å（Wynne, S. A., Crowther, R. A. & Leslie, A. G. (1999) Mol. Cell, 3, 771-780）であるのに対して本発明の八面体構造を有するB型肝炎ウイルス様粒子結晶は2.15Å分解能であった。 Hepatitis B virus-like particle crystals with an octahedral structure have stability to withstand soaking with small molecules such as butanol, a cryoprotective solution. Therefore, it may be able to withstand soaking of low molecular weight drugs against the target protein. The resolution of the regular icosahedron is 3.3 mm (Wynne, SA, Crowther, RA & Leslie, AG (1999) Mol. Cell, 3, 771-780), while the B having the octahedral structure of the present invention is used. The hepatitis virus-like particle crystal was 2.15 mm resolution.
ウイルス粒子は、マテリアルサイエンスや生物医薬品の分野において幅広い応用が期待
されており、ナノプラットフォームとしてますます利用されてきている。この応用例の一つとして、ナノキャリアとしての応用が注目されている。ナノキャリアとしての応用を実現するために、B型肝炎ウイルス蛋白質が二量化すると自己集積によりキャプシドを構成する性質を利用して、ウイルス様粒子を作製し結晶化して、得られた結晶をナノプラットフォームとして応用する検討が行われている。
Virus particles are expected to be widely applied in the fields of material science and biopharmaceuticals, and are increasingly used as nanoplatforms. As one example of this application, application as a nanocarrier has attracted attention. In order to realize application as a nanocarrier, virus-like particles are produced and crystallized using the property that capsids are formed by self-assembly when hepatitis B virus protein is dimerized. As a result, it has been studied.
以上詳述したように、本発明の八面体構造を有するB型肝炎ウイルス様粒子結晶は、従来の二十面体構造からなる結晶に比べて非常に力学的、熱力学的に構造安定である。この安定性を活かして、本発明のB型肝炎ウイルス様粒子結晶は、マテリアルサイエンスや生物医薬品の分野において用いられる所望の蛋白質を含むナノプラットフォームとして使用することができる。また、従来結晶化が困難又は不可能であった蛋白質について、容易に結晶化を達成できるようになれば、疾患に関わる蛋白質の立体構造を明らかにすることができ、その触媒部位の特定が可能となる。そして、その立体構造情報をベースとした医薬品の開発が可能となり、産業上非常に有意である。 As described above in detail, the hepatitis B virus-like particle crystal having an octahedral structure of the present invention is very mechanically and thermodynamically structurally stable compared to a crystal having a conventional icosahedral structure. Taking advantage of this stability, the hepatitis B virus-like particle crystal of the present invention can be used as a nanoplatform containing a desired protein used in the fields of material science and biopharmaceuticals. In addition, if it is possible to easily achieve crystallization of proteins that were difficult or impossible to crystallize in the past, the three-dimensional structure of proteins involved in diseases can be clarified, and the catalytic site can be identified. It becomes. And it becomes possible to develop a medicine based on the three-dimensional structure information, which is very significant in industry.
１ キャプシド構成蛋白質（Ａ）
２ 目的蛋白質
３ ペプチドリンカー
３’ ペプチドリンカー
1 Capsid constituent protein (A)
2 Target protein 3 Peptide linker 3 'Peptide linker
Claims (12)
１）キャプシド構成蛋白質（Ａ）：
MDIDPYKEFG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHCSP HHTALRQAIL CWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISCLTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVV（配列番号１）
２）キャプシド構成蛋白質（Ａ）：
MDIDPYKVIG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHASP HHTALRQAIL AWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISALTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVVC（配列番号２） The hepatitis B virus-like particle according to any one of claims 1 to 3, wherein the capsid component protein (A) has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and / or 2.
1) Capsid constituent protein (A):
MDIDPYKEFG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHCSP HHTALRQAIL CWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISCLTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVV (sequence number 1)
2) Capsid constituent protein (A):
MDIDPYKVIG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHASP HHTALRQAIL AWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISALTF GRETVLEYLV SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVVC (sequence number 2)
１）ペプチドリンカー１：GGSEEE(GGS)7（配列番号３）
２）ペプチドリンカー２：GGSKL（配列番号４）
３）ペプチドリンカー３：(GGS)3KL（配列番号５）
４）ペプチドリンカー４：(GGS)3（配列番号６） The hepatitis B virus-like particle according to claim 8, wherein the peptide linker is selected from the peptide linkers shown in the following 1) to 4) and used in the same or different manner.
1) Peptide linker 1: GGSEEE (GGS) 7 (SEQ ID NO: 3)
2) Peptide linker 2: GGSKL (SEQ ID NO: 4)
3) Peptide linker 3: (GGS) 3 KL (SEQ ID NO: 5)
4) Peptide linker 4: (GGS) 3 (SEQ ID NO: 6)
１）ペプチドリンカー１：GGSEEE(GGS)7（配列番号３）
２）ペプチドリンカー２：GGSKL（配列番号４）
３）ペプチドリンカー３：(GGS)3KL（配列番号５）
４）ペプチドリンカー４：(GGS)3（配列番号６） The peptide linker used for preparation of hepatitis B virus-like particles according to any one of claims 7 to 9, which is selected from the peptide linkers shown in the following 1) to 4) and used in the same or different manner.
1) Peptide linker 1: GGSEEE (GGS) 7 (SEQ ID NO: 3)
2) Peptide linker 2: GGSKL (SEQ ID NO: 4)
3) Peptide linker 3: (GGS) 3 KL (SEQ ID NO: 5)
4) Peptide linker 4: (GGS) 3 (SEQ ID NO: 6)
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018163947A1 (en) * | 2017-03-07 | 2018-09-13 | 国立大学法人徳島大学 | Protein crystallization utilizing porous protein crystal |
| WO2023176206A1 (en) * | 2022-03-18 | 2023-09-21 | デンカ株式会社 | Virus-like particle containing capsid proteins connected by linker |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003514576A (en) * | 1999-11-24 | 2003-04-22 | カイロン コーポレイション | HBV / HCV virus-like particles |
| WO2011120994A1 (en) * | 2010-03-29 | 2011-10-06 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Pharmaceutical compositions comprising a polypeptide comprising at least one cxxc motif and heterologous antigens and uses thereof |
| JP2012523411A (en) * | 2009-04-10 | 2012-10-04 | インスティト ビオ ハイミ イ ビオフィスキ パン | Virus-like particle vectors for pharmaceutical delivery, methods for their production, use, and pharmaceutical compositions. |
-
2013
- 2013-04-24 JP JP2013091823A patent/JP2014212722A/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003514576A (en) * | 1999-11-24 | 2003-04-22 | カイロン コーポレイション | HBV / HCV virus-like particles |
| JP2012523411A (en) * | 2009-04-10 | 2012-10-04 | インスティト ビオ ハイミ イ ビオフィスキ パン | Virus-like particle vectors for pharmaceutical delivery, methods for their production, use, and pharmaceutical compositions. |
| WO2011120994A1 (en) * | 2010-03-29 | 2011-10-06 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Pharmaceutical compositions comprising a polypeptide comprising at least one cxxc motif and heterologous antigens and uses thereof |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018163947A1 (en) * | 2017-03-07 | 2018-09-13 | 国立大学法人徳島大学 | Protein crystallization utilizing porous protein crystal |
| JPWO2018163947A1 (en) * | 2017-03-07 | 2020-02-06 | 宣夫 真板 | Protein crystallization using porous protein crystals |
| WO2023176206A1 (en) * | 2022-03-18 | 2023-09-21 | デンカ株式会社 | Virus-like particle containing capsid proteins connected by linker |
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