JP2014167587A5 - - Google Patents
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Description
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の標本観察方法は、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、取得ステップは明視野観察の状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、該所定の状態では、少なくとも、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっており、合焦位置とは、標本の持つ空間周波数において、０次回折光における波面収差量と１次回折光における波面収差量が、共に０である位置のことであることを特徴とする。 In order to solve the above-described problems and achieve the object, the sample observation method of the present invention has an acquisition step of acquiring an electronic image of the sample, and a subtraction step of subtracting a direct current component from the signal of the electronic image. The acquisition step is performed in a bright field observation state, and the electronic image in the subtraction step is an image acquired in a predetermined state, and in the predetermined state, at least the position of the specimen and the imaging optical system are combined. are different and focus position, the focus position in the spatial frequency with the sample, 0 wavefront aberration on wavefront aberration and first-order diffracted light in order diffracted light, the der Rukoto that position both of them are 0 Features.
第６実施形態の標本観察方法によれば、電子画像の生成の際に、低い空間周波数から高い空間周波数までの各々の空間周波数でコントラストが高くなっている画像が使われる。よって、生成された電子画像では、どの空間周波数においてもコントラストが高くなっている。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。 According to the sample observation method of the sixth embodiment, when the generation of the digital image, the image contrast is higher in each of the spatial frequencies to high spatial frequencies from low spatial frequencies are used. Therefore, the generated electronic image has a high contrast at any spatial frequency. As a result, the sample S (image of the sample S) can be clearly observed.
第７実施形態の標本観察方法によれば、加算によって電子画像を生成する時に、各空間周波数でコントラストが最も高くなっている部分のみが使われている。よって、生成された電子画像では、どの空間周波数においてもコントラストが非常に高くなっている。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。 According to the sample observation method of the seventh embodiment, when an electronic image is generated by addition, only a portion having the highest contrast at each spatial frequency is used. Therefore, the generated electronic image has a very high contrast at any spatial frequency. As a result, the sample S (image of the sample S) can be observed more clearly.
照明部２０’は、光源２１’と照明光学系２２’とを有する。照明光学系２２’は、コンデンサレンズと開口絞りとを有する。ここで、照明光学系２２’では、顕微鏡対物レンズ３５を介して照明が行われる。よって、顕微鏡対物レンズ３５がコンデンサレンズに相当する。なお、開口絞りは図示を省略している。また、図１６に示すように、照明光学系２２’は、レンズ２５’と、ハーフミラーＨＭと、レンズ２７’とを備えていても良い。照明光学系２２’は、光源２１’からステージ１１までの間の光路中に配置されている。また、ハーフミラーＨＭと顕微鏡対物レンズ３５は、照明光学系２２’を構成すると共に、結像光学系３１を構成している。 The illumination unit 20 ′ includes a light source 21 ′ and an illumination optical system 22 ′. The illumination optical system 22 ′ has a condenser lens and an aperture stop. Here, in the illumination optical system 22 ′, illumination is performed via the microscope objective lens 35. Therefore, the microscope objective lens 35 corresponds to a condenser lens. The aperture stop is not shown. Further, as shown in FIG. 16, the illumination optical system 22 ′ may include a lens 25 ′, a half mirror HM, and a lens 27 ′. The illumination optical system 22 ′ is disposed in the optical path from the light source 21 ′ to the stage 11. The half mirror HM and the microscope objective lens 35, together constitute an illumination optical system 22 ', constitutes an imaging optical system 31.
撮像によって、標本Ｓの像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。電子画像は画像処理装置４０に送られる。画像処理装置４０では各種の処理が行われる。ここで、標本観察装置１’が表示装置５０を備えている場合、電子画像は表示装置５０に表示される。観察者は表示装置５０に表示された電子画像を見ることで、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。 By imaging, the image of the sample S is converted into an electronic image (digital data). The electronic image is sent to the image processing device 40. Various processes are performed in the image processing apparatus 40. Here, when the sample observation device 1 ′ includes the display device 50, the electronic image is displayed on the display device 50. By observing the electronic image displayed on the display device 50, the observer can clearly observe the sample S (image of the sample S).
まず、観察者は、照明光学系と結像光学系を、明視野観察の状態となるようにする。続いて、観察者は、合焦位置からずれた位置だと思われる位置まで、目測で挿入部１４１を移動させる。そして、画像処理装置２００を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。 First, the observer sets the illumination optical system and the imaging optical system to a bright field observation state. Subsequently, the observer moves the insertion unit 141 by eye measurement to a position that is considered to be a position shifted from the in-focus position. Then, the image processing apparatus 200 is operated. These operations may be performed in any order.
画像処理装置２００が作動することで、標本Ｓの像が撮像可能になるので、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０が実行されることで、電子画像の取得が行われる。取得ステップＳ１０で取得された電子画像は、画像処理装置２００内の一時記憶部（不図示）に保存される。 Since the image processing apparatus 200 is activated, an image of the specimen S can be taken, and thus the acquisition step S10 is executed. An electronic image is acquired by executing the acquisition step S10. The electronic image acquired in the acquisition step S10 is stored in a temporary storage unit (not shown) in the image processing apparatus 200 .
減算ステップＳ２０の終了後、増幅ステップＳ３０−２が実行される。増幅ステップＳ３０−２では、２Ａ1Ａ2cosψの値を大きくする（増幅する）。これにより、Ａ1 2＋Ａ2 2の値に対して２Ａ1Ａ2cosψの値が相対的により大きくなる。増幅ステップＳ３０−２の実行結果は、例えば、表示ユニット２０４に表示される。 After completion of the subtraction step S20, an amplification step S30-2 is executed. In the amplification step S30-2, the value of 2A 1 A 2 cos ψ is increased (amplified). As a result, the value of 2A 1 A 2 cos ψ becomes relatively larger than the value of A 1 2 + A 2 2 . The execution result of the amplification step S30-2 is displayed on the display unit 204 , for example.
挿入部１４１を移動させている間、撮像は常に行われている。よって、取得ステップＳ１０、減算ステップＳ２０及び増幅ステップＳ３０−２も、常に実行されている。そこで、観察者は、表示ユニット２０４で電子画像を見ながら挿入部１４１を移動させ、コントラストの良い電子画像が得られた時点で挿入部１４１の移動を終わる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。 Imaging is always performed while the insertion unit 141 is moved. Therefore, the acquisition step S10, the subtraction step S20, and the amplification step S30-2 are always executed. Therefore, the observer moves the insertion unit 141 while viewing the electronic image on the display unit 204 , and ends the movement of the insertion unit 141 when an electronic image with good contrast is obtained. As a result, the sample S (image of the sample S) can be clearly observed.
その結果、０次回折光Ｌ0の位相はπ／２遅れる。一方、＋１次回折光Ｌ+1の位相は、もともとの遅れπ／２に対して３π／２が更に加わるので、遅れは合計で２πになる。すると、ψ＝−π／２−（−２π）＝３π／２となる。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ＝０となるので、位相情報はコントラスト情報として得られない。一方、−１次回折光Ｌ -1 については、加わる波面収差量が０なので、−１次回折光Ｌ -1 の位相は、もともとの遅れπ／２だけになる。すると、ψ＝−λ／２−（−λ／２）＝０となる。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ≠０となるので、位相情報がコントラスト情報として得られる。また、コントラストは、いわゆるブライトコントラストになる。 As a result, the phase of the 0th-order diffracted light L 0 is delayed by π / 2. Meanwhile, the phase of the + 1-order diffracted light L +1, since the original 3 [pi] / 2 is further added relative delay [pi / 2, delay becomes 2π in total. Then, ψ = −π / 2 − (− 2π) = 3π / 2. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ = 0, phase information cannot be obtained as contrast information. On the other hand, for the −1st order diffracted light L −1 , since the amount of wavefront aberration applied is 0, the phase of the −1st order diffracted light L −1 is only the original delay π / 2. Then, ψ = −λ / 2 − (− λ / 2) = 0. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ ≠ 0, phase information is obtained as contrast information. Further, the contrast is a so-called bright contrast.
その結果、０次回折光Ｌ0の位相は３π／２遅れる。一方、−１次回折光Ｌ -1 の位相は、もともとの遅れπ／２に対して更にπ／２が加わるので、遅れは合計でπになる。すると、ψ＝−３π／２−（−π）＝−π／２となる。この場合、２Ａ1Ａ2cosψ＝０となるので、位相情報はコントラスト情報として得られない。 As a result, the phase of the 0th-order diffracted light L 0 is delayed by 3π / 2. On the other hand, the phase of the −1st-order diffracted light L −1 is further added with π / 2 with respect to the original delay π / 2, so that the total delay is π. Then, ψ = −3π / 2 − (− π) = − π / 2. In this case, since 2A 1 A 2 cos ψ = 0, phase information cannot be obtained as contrast information.
Claims (23)
前記電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、
前記取得ステップは明視野観察の状態で行われ、
前記減算ステップにおける前記電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、
該所定の状態では、少なくとも、前記標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっており、
前記合焦位置とは、前記標本の持つ空間周波数において、０次回折光における波面収差量と１次回折光における波面収差量が、共に０である位置のことであることを特徴とする標本観察方法。 An acquisition step of acquiring an electronic image of the specimen;
Subtracting a direct current component from the signal of the electronic image,
The acquisition step is performed in a bright field observation state,
The electronic image in the subtraction step is an image acquired in a predetermined state,
In the predetermined state, at least the position of the sample is different from the focusing position of the imaging optical system ,
Wherein the focus position in the spatial frequency possessed by the specimen, 0 wavefront aberration on wavefront aberration and first-order diffracted light in order diffracted light, the specimen observation method according to claim der Rukoto that position are both zero .
前記取得ステップを少なくとも３回行い、
先に取得した電子画像と後に取得した電子画像とを、前記比較ステップで比較し、
所定の条件を満足する電子画像が得られるまで、前記取得ステップから前記比較ステップまでを繰り返し行うことを特徴とする請求項１に記載の標本観察方法。 A comparison step after the subtraction step;
Performing the obtaining step at least three times;
The electronic image acquired earlier and the electronic image acquired later are compared in the comparison step,
The specimen observation method according to claim 1, wherein the steps from the acquisition step to the comparison step are repeated until an electronic image satisfying a predetermined condition is obtained.
前記増幅ステップでは、前記減算ステップ後の電子画像の信号を増幅することを特徴とする請求項１または２に記載の標本観察方法。 An amplification step after the subtraction step;
3. The specimen observation method according to claim 1, wherein in the amplification step, a signal of the electronic image after the subtraction step is amplified.
逆フーリエ変換を行う逆変換ステップと、を有し、
前記変換ステップは、前記減算ステップよりも前に行われ、
前記逆変換ステップは、少なくとも前記減算ステップよりも後に行われることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の標本観察方法。 A transforming step of Fourier transforming the signal of the electronic image;
An inverse transform step for performing an inverse Fourier transform,
The conversion step is performed before the subtraction step,
The specimen observation method according to any one of claims 1 to 3, wherein the inverse conversion step is performed at least after the subtraction step.
規格化ステップと、を有し、
前記事前取得ステップでは、前記標本が無い状態で電子画像を取得し、
前記規格化ステップでは、該電子画像で前記標本の電子画像を規格化し、
前記減算ステップの前に、前記規格化ステップを行うことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の標本観察方法。 A pre-acquisition step;
A normalization step, and
In the pre-acquisition step, an electronic image is acquired without the specimen,
In the normalization step, the electronic image of the specimen is normalized with the electronic image,
The specimen observation method according to claim 1, wherein the normalization step is performed before the subtraction step.
変化させた前記標本の位置で、前記取得ステップと前記減算ステップが行われ、
これにより、前記減算ステップを実行した後の電子画像を複数生成し、
生成した前記複数の電子画像を加算することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の標本観察方法。 Changing the position of the sample multiple times with respect to the in-focus position of the imaging optical system;
The acquisition step and the subtraction step are performed at the changed position of the sample,
Thereby, a plurality of electronic images after performing the subtraction step are generated,
The specimen observation method according to claim 1, wherein the plurality of generated electronic images are added.
前記抽出した部分を使って前記加算を行うことを特徴とする請求項６に記載の標本観察方法。 Before the addition, for each of the plurality of electronic images, extract the portion of the electronic image having the highest contrast,
The sample observation method according to claim 6, wherein the addition is performed using the extracted portion.
前記照明光学系は、前記光源からの照明光を標本に照射するように配置され、
前記結像光学系は、前記標本からの光が入射するように配置されると共に、前記標本の光学像を形成し、
前記撮像装置は前記光学像の位置に配置され、
前記画像処理装置は、請求項１から８のいずれか一項に記載の標本観察方法を行うことを特徴とする標本観察装置。 A light source, an illumination optical system, an imaging optical system, an imaging device, and an image processing device;
The illumination optical system is arranged to irradiate the specimen with illumination light from the light source,
The imaging optical system is arranged so that light from the specimen is incident thereon, and forms an optical image of the specimen.
The imaging device is disposed at the position of the optical image,
The specimen observation apparatus characterized by performing the specimen observation method according to any one of claims 1 to 8.
前記表示装置は、前記画像処理装置からの出力信号を表示することを特徴とする請求項９に記載の標本観察装置。 Having a display device;
The sample observation apparatus according to claim 9, wherein the display device displays an output signal from the image processing device.
０．０１＜ＮＡill／ＮＡob＜１ （１）
ここで、
ＮＡillは、前記照明光学系の前記標本側の開口数、
ＮＡobは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
である。 The sample observation apparatus according to claim 9 or 10, wherein the following conditional expression (1) is satisfied.
0.01 <NA ill / NA ob <1 (1)
here,
NA ill is the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system,
NA ob is the numerical aperture on the specimen side of the imaging optical system,
It is.
０．１μｍ＜ΔＺ×ＮＡob 2＜３０μｍ （２）
ここで、
ΔＺは、前記結像光学系の合焦位置と前記標本の位置との差、
ＮＡobは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
である。 The sample observation apparatus according to claim 9, wherein the following conditional expression (2) is satisfied.
0.1 μm <ΔZ × NA ob 2 <30 μm (2)
here,
ΔZ is the difference between the in-focus position of the imaging optical system and the position of the sample,
NA ob is the numerical aperture on the specimen side of the imaging optical system,
It is.
０．０５μｍ＜ΔＺ×ＮＡill＜１０μｍ （３）
ここで、
ΔＺは、前記結像光学系の合焦位置と前記標本の位置との差、
ＮＡillは、前記照明光学系の前記標本側の開口数、
である。 The sample observation apparatus according to claim 9, wherein the following conditional expression (3) is satisfied.
0.05 μm <ΔZ × NA ill <10 μm (3)
here,
ΔZ is the difference between the in-focus position of the imaging optical system and the position of the sample,
NA ill is the numerical aperture on the specimen side of the illumination optical system,
It is.
前記開口絞りは前記対物レンズに設けられていることを特徴とする請求項２０に記載の標本観察装置。 The imaging optical system has an objective lens,
21. The specimen observation apparatus according to claim 20, wherein the aperture stop is provided in the objective lens.
０．５＜λ／（Ｐ×ＮＡim）＜２０ （４）
ここで、
λは、前記撮像装置における撮像素子に入射する光の波長、
Ｐは、前記撮像装置における撮像素子の画素ピッチ、
ＮＡimは、前記結像光学系の前記撮像装置側の開口数、
である。 The sample observation device according to any one of claims 9 to 21, wherein the following conditional expression (4) is satisfied.
0.5 <λ / (P × NA im ) <20 (4)
here,
λ is the wavelength of light incident on the image sensor in the imaging device,
P is the pixel pitch of the image sensor in the imaging device,
NA im is the numerical aperture on the imaging device side of the imaging optical system,
It is.
前記駆動機構は、前記標本が載置される保持部材、前記撮像装置及び前記結像光学系の少なくとも１つを、光軸に沿って移動させることを特徴とする請求項９から２２のいずれか一項に記載の標本観察装置。 Having a drive mechanism,
The drive mechanism moves at least one of a holding member on which the specimen is placed , the imaging device, and the imaging optical system along an optical axis. The specimen observation apparatus according to one item.
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