JP2014159960A - Automatic measurement method for spontaneous pain action of chronic pain model animal - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、慢性疼痛モデル動物における自発痛の測定方法及びそれを用いる慢性疼痛治療薬のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring spontaneous pain in a chronic pain model animal and a screening method for a therapeutic agent for chronic pain using the same.
痛みとは、現存する組織損傷を伴った、あるいはそのような経験から表現された不快な感覚、あるいは情動経験である（世界疼痛会議1979年）と定義され、急性疼痛と慢性疼痛に分けられる。
急性疼痛は、生体の組織を侵害する侵害刺激が末梢侵害受容器へ入力され、活動電位に変換されインパルスとして脊髄に伝えられ、そこで下行性など種々の抑制系の影響を受け、感覚伝導系を上行し大脳皮質へ達することによって自覚される。すなわち、急性疼痛とは侵害刺激による生理学的な痛みであり、生体における警告反応として意義がある。急性疼痛は侵害刺激の解除や損傷の治癒によって消失する。
一方、慢性疼痛は、組織損傷が治癒したにもかかわらず訴えられる痛みや、明らかな組織損傷がないにもかかわらず訴えられる痛みのことである。すなわち、慢性疼痛とは、「疾患が通常治癒するのに必要な期間を超えているのにも関わらず訴えられる痛み、あるいは進行性の非がん性疾患に関する痛み」である。
慢性疼痛は急性疼痛のような生体警告系としての生理学的な意義がなく、しかも3〜6月以上持続し、患者の生活の質(quality of life)を大きく損なう。このように、慢性疼痛は独立した疾患であり、治療すなわち除痛が必要であるが、慢性疼痛の多くは難治性である。
Pain is defined as an unpleasant sensation or emotional experience with existing tissue damage or expressed from such experience (World Pain Conference 1979) and is divided into acute pain and chronic pain.
In acute pain, noxious stimuli that invade living tissues are input to peripheral nociceptors, converted into action potentials and transmitted as impulses to the spinal cord, where they are affected by various inhibitory systems such as descending, It is realized by ascending and reaching the cerebral cortex. That is, acute pain is physiological pain due to noxious stimulation and is significant as a warning reaction in a living body. Acute pain disappears by releasing noxious stimuli and healing wounds.
Chronic pain, on the other hand, refers to pain that is complained despite the healing of tissue damage or pain that is complained of without any apparent tissue damage. In other words, chronic pain is “pain that is complained in spite of the fact that the disease usually exceeds the period necessary for healing, or pain associated with progressive non-cancerous disease”.
Chronic pain has no physiological significance as a biological warning system like acute pain, and lasts for more than 3 to 6 months, greatly impairing the quality of life of the patient. Thus, chronic pain is an independent disease and requires treatment or pain relief, but many chronic pain is intractable.
慢性疼痛には様々な種類があるが、神経障害によりもたらされる神経障害性疼痛、および組織損傷によりもたらされる侵害受容性疼痛に大別される。
神経障害性疼痛は神経機能異常によって生じる痛みであり、有痛性糖尿病性神経障害、化学療法剤誘発神経障害、帯状疱疹後疼痛、中枢性疼痛症候群、神経根引き抜き損傷、慢性腰痛、外科手術後慢性疼痛、三叉神経痛、複合性局所疼痛症候群などがある。神経障害性疼痛患者は自発痛（外界から刺激を加えていないにもかかわらず感じる痛み）を主とする疼痛症状を主訴とするため(例えば、非特許文献１参照)、患者のquality of lifeの向上のためには、こうした自発痛を治療することが重要視されている。
神経障害性疼痛治療を適応とした薬剤として、プレガバリン、デュロキセチンなどがある。しかしながら、これらの薬剤の効果は限定的であり、神経障害性疼痛患者の自発痛を主体とする症状に十分に効果のある治療方法は未だにない。
従って、慢性疼痛の疼痛症状、特に神経障害性疼痛患者の自発痛を主体とする疼痛症状に効果が十分な、さらに優れた治療薬の開発が強く求められており、このような治療薬開発を目的として、慢性疼痛モデル動物における自発痛に伴う行動を、客観的かつ簡便に測定する技術が求められている。
There are various types of chronic pain, but they are roughly classified into neuropathic pain caused by neuropathy and nociceptive pain caused by tissue damage.
Neuropathic pain is pain caused by neurological dysfunction, painful diabetic neuropathy, chemotherapy-induced neuropathy, postherpetic pain, central pain syndrome, nerve root extraction injury, chronic low back pain, after surgery Examples include chronic pain, trigeminal neuralgia, and complex regional pain syndrome. Because patients with neuropathic pain have pain symptoms mainly due to spontaneous pain (pain felt despite no stimulation from the outside world) (see, for example, Non-Patent Document 1), the patient's quality of life For improvement, it is important to treat such spontaneous pain.
Examples of drugs for treating neuropathic pain include pregabalin and duloxetine. However, the effects of these drugs are limited, and there is still no treatment method that is sufficiently effective for symptoms mainly caused by spontaneous pain in patients with neuropathic pain.
Therefore, there is a strong demand for the development of an even better therapeutic agent that is sufficiently effective for pain symptoms of chronic pain, particularly pain symptoms mainly of spontaneous pain in patients with neuropathic pain. As a purpose, there is a demand for a technique for objectively and simply measuring behaviors associated with spontaneous pain in chronic pain model animals.
神経障害性疼痛の治療薬の開発のために、げっ歯類の神経障害性疼痛モデル動物が用いられており、神経の切断、結紮、絞扼など外科的処置により作成する方法や、化学物質やウィルスの暴露により神経に障害を与えて作成する方法が知られている。外科的処置により作成するモデルとしては、具体的には、坐骨神経絞扼（chronic constriction injury：CCI）モデル、坐骨神経部分損傷モデル（partial sciatic nerve injury model）、脊髄神経結紮モデル（spinal nerve ligation model）等が用いられている（例えば、非特許文献２〜５参照）。これらの動物実験モデルでは、足底部の機械的刺激、熱刺激、冷刺激、電気刺激といった刺激による誘発痛に伴う疼痛行動の測定が一般的である。しかし、神経障害性疼痛は刺激によらない自発痛を伴うため、誘発痛に伴う疼痛行動測定ではない評価方法が望ましい。神経障害性疼痛モデル動物では疼痛刺激を与えない条件において、障害側の肢に肢上げ（lifting/guarding）、肢振り（flinching/shaking）、肢舐め（licking）といった多様な疼痛行動が観察され、これらの行動が自発痛に伴う疼痛行動の指標となる。従来は、係る疼痛行動の計測は実験者の目視によって行われてきた。しかしながら、実験者の主観や技量に依存して測定結果が変動することや、長時間の観察が必要なために実験者の負担が大きいという欠点がある。 For the development of therapeutic drugs for neuropathic pain, rodent neuropathic pain model animals are used, and methods such as chemical methods and methods of creating by surgical procedures such as nerve cutting, ligation, strangulation, etc. There is known a method of making a nerve damaged by exposure to a virus. Specifically, models created by surgical procedures include a sciatic nerve constriction injury (CCI) model, a partial sciatic nerve injury model, and a spinal nerve ligation model. ) Etc. are used (for example, refer nonpatent literatures 2-5). In these animal experimental models, measurement of pain behavior associated with pain induced by stimulation such as mechanical stimulation of the sole, thermal stimulation, cold stimulation, and electrical stimulation is common. However, since neuropathic pain is accompanied by spontaneous pain not caused by stimulation, an evaluation method that is not measurement of pain behavior associated with induced pain is desirable. Various pain behaviors such as lifting / guarding, flinching / shaking, and licking of the limbs were observed on the limb on the impaired side under conditions where no pain stimulation was given in the neuropathic pain model animal. These behaviors are indicators of pain behavior associated with spontaneous pain. Conventionally, measurement of such pain behavior has been performed visually by an experimenter. However, there are drawbacks in that the measurement result varies depending on the subjectivity and skill of the experimenter, and the burden on the experimenter is heavy because long-time observation is required.
一方、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎などの痒みを症状とする疾患の治療薬の開発のために薬物投与などにより痒みを誘発したモデル動物が用いられている。係るモデル動物は、掻痒行動として後肢で体を強く引っ掻くことを繰り返す。このひっかき(scratching)行動を磁場変化検出により自動検出するための装置として、磁石を備えた動物を収容可能な空間を囲み、当該モデル動物のひっかき行動に応じた磁束の変化を電流の変化に変換する環状のコイルと、上記電流の変化を電圧の変化に変換する電流／電圧変換回路と、上記電圧の変化から所定の周波数成分を除去するフィルタ回路と、上記フィルタ回路の出力を動物のひっかき行動に対応した信号列に変換する変換回路と、上記信号列から疼痛行動の回数を計数する計数回路とを備えたことを特徴とする検出装置（?痒測定システム）が報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献６参照）。ひっかき行動は、マウスの場合、周波数約10〜20Hzの電圧で表され、歩行などの通常の自発運動はそれより低い周波数で表される。
ひっかき(scratching)行動を計測する装置としては、他に、金属リングを備えた動物を、銅製のコイルを備えたフェライトをはめ込んだ収容可能な空間を囲み、当該モデル動物のひっかき行動に応じたシグナルを計測することを特徴とする検出装置（pruritus detecting system）（例えば、非特許文献７）が報告されている。
On the other hand, a model animal in which itching is induced by drug administration or the like is used for the development of a therapeutic drug for diseases that are symptomatic such as atopic dermatitis and allergic dermatitis. Such a model animal repeatedly scratches the body with its hind limbs as an itching behavior. As a device for automatically detecting this scratching behavior by detecting a change in magnetic field, it surrounds a space that can accommodate an animal equipped with a magnet and converts the change in magnetic flux according to the scratching behavior of the model animal into a change in current. An annular coil, a current / voltage conversion circuit that converts the current change into a voltage change, a filter circuit that removes a predetermined frequency component from the voltage change, and an output of the filter circuit that scratches the animal. Has been reported (for example, a measurement system) comprising a conversion circuit for converting into a signal sequence corresponding to the above and a counting circuit for counting the number of pain behaviors from the signal sequence (for example, (See
Other devices for measuring scratching behavior include an animal equipped with a metal ring, surrounding a space that can be accommodated with a ferrite coil equipped with a copper coil, and a signal corresponding to the scratching behavior of the model animal. A detection device (pruritus detecting system) (for example, Non-Patent Document 7) characterized by measuring the above has been reported.
特許文献２には、発痛物質投与後のフリンチング（flinching）行動を磁場変化検出により自動計測する装置が記載されている。
フォルマリンモデルに代表される発痛物質投与モデル動物は、急性疼痛モデル動物であり、係るモデル動物は、投与後一定時間内に集中的に疼痛行動が観察され、１日以内に消失する。またフォルマリンモデルではフリンチング（flinching）など特定の単一行動が自発痛行動の指標として用いられ、当該モデルにおけるフリンチング（flinching）行動は8Hz付近の周波数で表わされる。
An analgesic substance-administered model animal typified by a formalin model is an acute pain model animal, and pain pain behavior is observed intensively within a certain time after administration, and the model animal disappears within one day. In the formalin model, a specific single behavior such as flinching is used as an index of spontaneous pain behavior, and the flinching behavior in the model is represented by a frequency around 8 Hz.
以上のように従来技術では、ひっかき行動や、急性疼痛モデル動物における発痛物質投与後短時間で消失するフリンチング（flinching）行動を検出可能であるが、これらの行動は痒みあるいは急性疼痛を反映するものであり、またいずれも単一なものであり、特定の周波数の範囲内で表わされる。一方、慢性疼痛である神経障害性疼痛の自発痛に伴う疼痛行動は少なくとも1日以上、通常は1週間以上持続し、肢上げ（lifting/guarding）、肢振り（flinching/shaking）、肢舐め（licking）といった多様な肢動作が観測され、その行動の種類に応じて動きの大きさや速度が異なるため、特定の周波数を用いた検出方法で表わされた計測結果はこれらを反映するものではない。従って、慢性疼痛動物モデル動物の自発痛計測や慢性疼痛治療薬のスクリーニングの用途に用いることはできない。 As described above, the conventional technology can detect scratching behavior and flinching behavior that disappears in a short time after the administration of a pain substance in an acute pain model animal, but these behaviors reflect itch or acute pain. Both of which are single and represented within a particular frequency range. On the other hand, the pain behavior associated with spontaneous pain of neuropathic pain, which is chronic pain, lasts for at least 1 day, usually 1 week or more, lifting / guarding, flinching / shaking, licking ( (Licking) is observed, and the magnitude and speed of movement vary depending on the type of action, so the measurement results expressed by the detection method using a specific frequency do not reflect these. . Therefore, it cannot be used for spontaneous pain measurement of chronic pain animal model animals or screening of chronic pain therapeutic drugs.
慢性疼痛モデル動物である神経障害性疼痛モデル動物においては、持続した疼痛行動が観察され、肢上げ（lifting/guarding）、肢振り（flinching/shaking）、肢舐め（licking）といった多様な行動を含む。そのため、慢性疼痛による疼痛症状の測定、慢性疼痛治療薬のスクリーニングには、これらの多様な行動を客観的かつ簡便に計測する方法の開発が必要であった。 In neuropathic pain model animals, which are chronic pain models, sustained pain behavior is observed, including various behaviors such as lifting / guarding, flinching / shaking, and licking . Therefore, it was necessary to develop an objective and simple method for measuring these various behaviors in measuring pain symptoms due to chronic pain and screening for therapeutic drugs for chronic pain.
本発明者らは、さらに優れた慢性疼痛による疼痛症状測定法、慢性疼痛治療薬のスクリーニング方法の開発を目的として、鋭意検討を行った。その結果、神経障害性疼痛モデル動物において磁場変化検出による行動測定装置を用い、測定環境や解析条件を最適化することにより、従来のひっかき行動やフリンチング（flinching）のような単一な特定行動のみならず、慢性疼痛時における肢上げ、肢振り、肢舐めといった多様な疼痛行動に伴う肢動作を自動計測できることを見出した。一方、これら、慢性疼痛に伴う多様な肢動作は、ラットの場合、周波数2.5〜20Hzの範囲に表されるので、歩行などの通常の自発行動に伴う肢動作の周波数と直ちに区別することはできない。そこで、神経障害性疼痛モデル動物の肢動作の回数、および偽手術動物の肢動作の回数を計測し、これらを比較することにより、神経障害性疼痛モデル動物において、肢上げ、肢振り、肢舐めといった慢性疼痛に伴う多様な肢動作の回数が増加することを見出した。更には、こうして計測される神経障害性疼痛モデル動物における肢動作の回数増加が安定して観測されること、および肢動作の回数増加が既存の鎮痛剤の投与により低減することを確認して発明を完成させた。 The present inventors have conducted intensive studies for the purpose of developing a more excellent pain symptom measurement method for chronic pain and a screening method for a therapeutic agent for chronic pain. As a result, in a neuropathic pain model animal, only a single specific behavior such as conventional scratching behavior or flinching is achieved by optimizing the measurement environment and analysis conditions using a behavior measurement device based on magnetic field change detection. In other words, it was found that limb movements associated with various pain behaviors such as limb raising, limb swinging and licking during chronic pain can be automatically measured. On the other hand, these various limb movements associated with chronic pain are expressed in the frequency range of 2.5 to 20 Hz in the case of rats, and thus cannot be immediately distinguished from the frequency of limb movements associated with normal spontaneous movement such as walking. . Therefore, by measuring the number of limb movements of a neuropathic pain model animal and the number of limb movements of a sham-operated animal, and comparing them, in a neuropathic pain model animal, limb raising, limb swinging, limb licking It has been found that the number of various limb movements associated with chronic pain increases. Furthermore, the invention was confirmed by confirming that the increase in the number of limb movements in the neuropathic pain model animal thus measured was stably observed, and that the increase in the number of limb movements was reduced by the administration of existing analgesics. Was completed.
すなわち、本発明は、
[1] 慢性疼痛モデル動物における自発痛の測定方法であって、
１）当該モデル動物に磁場変化を検出するための物質を装着する工程、
２）当該モデル動物の繰り返し行動を、当該繰り返し行動に応じた磁場変化を検出する手段を備えた装置によって、計測する工程、を含む方法。
[2] 正常動物の繰り返し行動回数を計測し、上記モデル動物で得られた回数と比較することにより、自発痛に伴う繰り返し行動回数増加を検出する工程をさらに含む、[1]に記載の方法。
[3] 動物の繰り返し行動によって生じる磁場変化を電圧に変換後、濾波処理により特定の周波数の範囲を選択する工程をさらに含む、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 動作持続時間の検出下限値を0.01秒以上0.1秒以下に設定する工程をさらに含む、請求項１乃至３に記載の方法。
[5] 前記慢性疼痛モデル動物または前記正常動物を収容可能な空間に囲み、繰り返し行動を測定する[1]乃至[4]に記載の方法。
[6] 慢性疼痛治療薬または予防薬のスクリーニング方法であって、
１）被検物質を慢性疼痛モデル動物に投与する工程、
２）前記モデル動物の繰り返し行動の回数を[1]乃至[5]に記載の方法で計測し、繰り返し行動の回数を低減させた被検物質を慢性疼痛治療薬または予防薬として選択する工程、
を含む方法。
[7] 前記慢性疼痛モデル動物が、神経障害性疼痛モデル動物である[1]乃至[6]に記載の方法
[8] 神経障害性疼痛モデル動物が外科的処置により作成されたモデル動物である[7]に記載の方法。
[9] 外科的処置により作成された神経障害性疼痛モデル動物が、坐骨神経絞扼モデル動物である[8]に記載の方法。
[10]前記繰り返し行動が、肢上げ、肢振り、肢舐め、ひっかき行動、及び移所行動から選択される１又は２以上の行動である[1]乃至[9]に記載の方法。
[11] 前記動物がラットである[1]乃至[10]に記載の方法。
[12] [6]乃至[11]に記載された方法で選択された化合物。
[13] [12]に記載された化合物を含む慢性疼痛治療薬または予防薬。
[14] [12]に記載された化合物を含む神経障害性疼痛治療薬または予防薬。
That is, the present invention
[1] A method for measuring spontaneous pain in an animal model of chronic pain,
1) A step of attaching a substance for detecting a magnetic field change to the model animal.
2) A method including a step of measuring a repetitive behavior of the model animal by an apparatus having means for detecting a magnetic field change corresponding to the repetitive behavior.
[2] The method according to [1], further comprising a step of detecting an increase in the number of repeated behaviors associated with spontaneous pain by measuring the number of repeated behaviors of a normal animal and comparing the number of times with the model animal. .
[3] The method according to [1] or [2], further comprising a step of selecting a specific frequency range by filtering after converting a magnetic field change caused by repeated behavior of an animal into a voltage.
[4] The method according to any one of [1] to [3], further comprising the step of setting the detection lower limit value of the operation duration to 0.01 seconds or more and 0.1 seconds or less.
[5] The method according to [1] to [4], wherein the chronic behavior model animal or the normal animal is enclosed in a space that can be accommodated, and repeated behavior is measured.
[6] A screening method for a therapeutic or prophylactic agent for chronic pain,
1) a step of administering a test substance to a chronic pain model animal;
2) measuring the number of repeated behaviors of the model animal by the method according to [1] to [5], and selecting a test substance having a reduced number of repeated behaviors as a chronic pain therapeutic agent or a preventive agent;
Including methods.
[7] The method according to [1] to [6], wherein the chronic pain model animal is a neuropathic pain model animal
[8] The method according to [7], wherein the neuropathic pain model animal is a model animal created by surgical treatment.
[9] The method according to [8], wherein the neuropathic pain model animal created by a surgical procedure is a sciatic nerve strangulation model animal.
[10] The method according to [1] to [9], wherein the repetitive behavior is one or more behaviors selected from limb raising, limb swinging, limb licking, scratching behavior, and transfer behavior.
[11] The method according to [1] to [10], wherein the animal is a rat.
[12] A compound selected by the method described in [6] to [11].
[13] A therapeutic or prophylactic agent for chronic pain comprising the compound described in [12].
[14] A therapeutic or prophylactic agent for neuropathic pain comprising the compound described in [12].
本発明の方法は、慢性疼痛モデル動物における、自発痛に伴う繰り返し行動の簡便かつ客観性の高い評価法を提供でき、優れた慢性疼痛治療薬を開発する手段として有用である。 The method of the present invention can provide a simple and highly objective evaluation method for repeated behavior associated with spontaneous pain in a chronic pain model animal, and is useful as a means for developing an excellent therapeutic agent for chronic pain.
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
本明細書において「繰り返し行動」とは、刺激が無いにもかかわらず自発的に呈される動作、特に肢を動かす動作（肢動作）をいう。具体的には、例えば、肢上げ（lifting/guarding）、肢振り（flinching/shaking）、肢舐め（licking）、ひっかき行動（scratching）、歩行（walking）などの移所行動（locomotion）、跳躍（jumping）などが挙げられる。
本明細書において「正常動物」とは、慢性疼痛モデル動物と同じ系統、性別、齢に属し疼痛を誘発させるような処置を施していない動物、慢性疼痛モデル動物と同じ系統、性別、齢に属し偽手術を施した動物をいう。
本明細書において「濾波処理」とは、特定の周波数成分を取り出すことをいう。
本明細書において「疼痛行動」とは、自発痛に伴う行動、特に、自発痛に伴う繰り返し行動をいう。
本明細書において「動作持続時間」とは、繰り返し行動が持続する時間をいう。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
In the present specification, “repetitive behavior” refers to an action that is presented spontaneously, in particular, an action to move a limb (limb action) in the absence of stimulation. Specifically, for example, lifting / guarding, flinching / shaking, licking, scratching, locomotion such as walking, locomotion, jumping ( jumping).
In this specification, the term “normal animal” refers to animals that belong to the same strain, sex, and age as chronic pain model animals and that have not been treated to induce pain, and belong to the same strain, sex, and age as chronic pain model animals. An animal that has undergone a sham operation.
In this specification, “filtering” refers to extracting a specific frequency component.
As used herein, “pain behavior” refers to behavior associated with spontaneous pain, in particular, repeated behavior associated with spontaneous pain.
In this specification, “operation duration” refers to a time during which a repetitive action lasts.
本発明に用いられる「動物」としては、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、小型哺乳動物が挙げられ、例えば、げっ歯類動物であるラット、マウス、スナネズミ、ウサギ、モルモット、ハムスター等が挙げられる。別の態様としては、イヌ、サルなどの大型哺乳動物が挙げられる。他の態様としては、ラット、マウス等が挙げられる。動物の性別、齢、体重、分娩の有無等については、目的とする病態モデル動物の作製および被検物質のスクリーニングに適用可能である限り特に限定されない。 The “animal” used in the present invention is preferably a mammal. Examples of mammals include small mammals, and examples include rodents such as rats, mice, gerbils, rabbits, guinea pigs, and hamsters. Another embodiment includes large mammals such as dogs and monkeys. Other embodiments include rats, mice and the like. The sex, age, weight, presence / absence of delivery, etc. of the animal are not particularly limited as long as it can be applied to the preparation of the target disease model animal and the screening of the test substance.
本発明に用いられる「慢性疼痛モデル動物」としては、神経障害性疼痛モデル、侵害受容性疼痛モデル等がある。慢性疼痛の誘発方法は自然発生であっても人工的に誘発させる方法であってもよいが、簡便なモデル動物としては人工的なものであることが望ましい。
本発明に用いられる「神経障害性疼痛モデル」としては、神経の切断、結紮、絞扼など外科的処置により作成するモデルや、化学物質やウィルスの暴露により神経に障害を与えて作成する方法が挙げられる。外科的処置により作成するモデルとしては、坐骨神経絞扼モデル、坐骨神経部分損傷モデル、及び、脊髄神経結紮モデルなどがあげられる。
Examples of the “chronic pain model animal” used in the present invention include a neuropathic pain model and a nociceptive pain model. The method for inducing chronic pain may be naturally occurring or artificially induced, but it is desirable that it be artificial as a simple model animal.
Examples of the “neuropathic pain model” used in the present invention include a model created by surgical procedures such as nerve cutting, ligation, and strangulation, and a method created by damaging nerves by exposure to chemical substances and viruses. Can be mentioned. Examples of models created by surgical treatment include a sciatic nerve strangulation model, a sciatic nerve partial injury model, and a spinal nerve ligation model.
本発明に用いられる「磁場変化を検出するための物質」としては、動物の行動を検出可能に装着できる形態であれば許容され、磁性体であれば特に制限されない。例えば、永久磁石、金属バンド、金属リングなどが挙げられる。金属バンドの金属としては、例えば、鉄、アルミニウムなどの金属が挙げられる。
本発明において、磁場変化を検出するための物質を動物に装着する態様としては、モデル動物の繰り返し行動が検出される態様であれば特に制限されないが、慢性疼痛モデルの場合には障害により痛覚閾値低下を生じている部分に装着することが好ましい。坐骨神経絞扼モデルの場合は、絞扼した部位側の後肢の甲に永久磁石を挿入する方法、が挙げられる。
The “substance for detecting a change in magnetic field” used in the present invention is acceptable as long as it can be worn so as to detect the behavior of an animal, and is not particularly limited as long as it is a magnetic substance. For example, a permanent magnet, a metal band, a metal ring, etc. are mentioned. Examples of the metal of the metal band include metals such as iron and aluminum.
In the present invention, the mode of attaching a substance for detecting a magnetic field change to an animal is not particularly limited as long as it is a mode in which the repetitive behavior of a model animal is detected. It is preferable to attach to the part where the reduction occurs. In the case of the sciatic nerve strangulation model, a method of inserting a permanent magnet into the back of the hind limb on the side of the strangulated site can be mentioned.
本発明に用いられる「磁場変化を検出する手段を備えた装置」としては、モデル動物の繰り返し行動を検出できる装置であれば特に制限されないが、永久磁石を動物にとりつけることにより動物の動きに応じて生じた磁束の変化を、収容ケージの周囲に配置した環状コイルによって電流に変換する装置、さらにこの電流の変化から動物の行動の回数を計数するための処理部を備えた装置（例えば、特開２００２−１３１３０７号公報を参照）などが挙げられる。また別の態様としては、金属を動物にとりつけ、磁場を生じさせる装置により金属を磁化し、動物の動きに応じて金属より発生した渦電流により電磁場変化を生じさせ、この変化を受信コイルを用いて検出する装置、さらにこの電磁場変化から動物の行動の回数を計数するための処理部を備えた装置（例えば、米国特許出願公開第２００３／０２３３０４１号明細書を参照）などが挙げられる。具体的には、MicroAct Scratching Test version 1.06(ニューロサイエンス（Neuroscience）社)、The Automated Formalin Test Device (カリフォルニア大学(University of California), サンディエゴ(San Diego))などが挙げられる。 The “device provided with means for detecting a change in magnetic field” used in the present invention is not particularly limited as long as it is a device that can detect the repetitive behavior of a model animal, but it can respond to the movement of the animal by attaching a permanent magnet to the animal. A device that converts a change in magnetic flux generated into an electric current by an annular coil arranged around the containment cage, and a device that includes a processing unit for counting the number of animal actions based on the change in the current (for example, a special feature) Open 2002-131307) and the like. In another embodiment, the metal is attached to the animal, magnetized by a device that generates a magnetic field, an electromagnetic field change is generated by an eddy current generated from the metal according to the movement of the animal, and this change is received using a receiving coil. And a device (for example, see US 2003/0233041) including a processing unit for counting the number of animal behaviors from the electromagnetic field change. Specific examples include MicroAct Scratching Test version 1.06 (Neuroscience), The Automated Formalin Test Device (University of California, San Diego).
本発明において、自発痛に伴う繰り返し行動回数増加を検出する場合、疼痛モデル動物と正常動物の繰り返し行動回数を、同一の条件下で同一の装置を用いて測定し、正常動物で得られた回数と比較し、疼痛モデル動物における繰り返し行動回数の増加量を検出することが挙げられる。あるいは、疼痛モデル動物作成の前および作成後において同一の条件下で同一の装置を用いて繰り返し行動を測定し、作成前の回数と比較し、モデル作成後における繰り返し行動の増加量を検出することが挙げられる。 In the present invention, when detecting an increase in the number of repeated behaviors associated with spontaneous pain, the number of repeated behaviors of a pain model animal and a normal animal was measured using the same device under the same conditions, and the number of times obtained in a normal animal And an increase in the number of repeated behaviors in a pain model animal. Alternatively, measure the repeated behavior using the same device under the same conditions before and after creating the pain model animal, and compare with the number before the creation, and detect the increase in the repeated behavior after creating the model. Is mentioned.
本発明において、濾波処理により特定の周波数の範囲を選択する場合、自発痛に伴う繰り返し行動が検出できる周波数の範囲であれば特に制限されない。慢性疼痛モデル動物における自発痛に伴う繰り返し行動は、広い範囲の周波数で表わされ、例えば、フリンチング（flinching）行動は約8Hzで表わされることが多く、ひっかき行動は約10k〜20Hzで表わされることが多い。慢性疼痛モデル動物において、多様な繰り返し行動を検出するためには、比較的広い範囲の周波数を選択することが好ましく、例えば、約2.5〜20Hzが挙げられる。 In the present invention, when a specific frequency range is selected by the filtering process, there is no particular limitation as long as it is a frequency range in which repeated behavior associated with spontaneous pain can be detected. Repetitive behavior associated with spontaneous pain in chronic pain model animals is expressed in a wide range of frequencies, for example, flinching behavior is often expressed at about 8 Hz, and scratching behavior is expressed at about 10 k to 20 Hz. There are many. In a chronic pain model animal, in order to detect various repeated behaviors, it is preferable to select a relatively wide range of frequencies, for example, about 2.5 to 20 Hz.
本発明において、動物の繰り返し行動を、繰り返し行動に応じた磁場変化を検出する手段を備えた装置によって計測する場合、特定範囲の動作持続時間（duration）を示す繰り返し行動を選択して計測することもできる。特定範囲の動作持続時間を示す繰り返し行動を選択する場合、例えば、動作持続時間の下限値を設定して行うことができる。動作持続時間の検出下限値は、モデル動物の自発痛に伴う繰り返し行動を感度よく検出できる時間であれば特に制限はされないが、少ないノイズでかつ多様な繰り返し行動を検出するためには例えば、動作持続時間の検出下限値を0.01秒以上0.1秒以下、別の態様としては、0.05秒以上0.1秒以下に設定することが挙げられ、さらに別の態様としては0.09秒に設定することが挙げられる。 In the present invention, when measuring a repetitive behavior of an animal by an apparatus having means for detecting a magnetic field change according to the repetitive behavior, selecting and measuring a repetitive behavior exhibiting a specific range of operation duration (duration). You can also. In the case of selecting a repetitive action indicating a specific range of operation duration, for example, a lower limit value of the operation duration can be set. The detection lower limit value of the movement duration is not particularly limited as long as it can detect the repetitive behavior associated with the spontaneous pain of the model animal with high sensitivity, but in order to detect various repetitive behavior with less noise, for example, the motion The lower limit of detection of the duration is set to 0.01 seconds or more and 0.1 seconds or less, and as another embodiment, it is set to 0.05 seconds or more and 0.1 seconds or less, and as another embodiment, it is set to 0.09 seconds.
本発明において、さらに繰り返し行動をより精度よく検出するために、特定の動作のみが過大評価されないよう、一定以下の動作途切れ時間は無視し、連続したひとつの動作として計数するよう(gap duration)設定することもできる。動作途切れ時間の設定範囲は、当該動作数を過大評価しないような範囲であれば特に制限されないが、例えば間隔の非常に短い複数の肢振り動作を連続した1回のスクラッチング動作として検出する場合、行動回数を過大評価しないよう、0.03秒以下の動作途切れ時間は無視し、連続したひとつの動作として計数するよう設定する方法が挙げられる。 In the present invention, in order to detect repeated behavior more accurately, setting is made so that only a specific operation is not overestimated, the operation interruption time below a certain value is ignored and counted as one continuous operation (gap duration). You can also The setting range of the movement interruption time is not particularly limited as long as the number of movements is not overestimated, but for example, when detecting a plurality of swinging movements with extremely short intervals as one continuous scratching movement In order not to overestimate the number of actions, there is a method of ignoring the operation interruption time of 0.03 seconds or less and setting to count as one continuous operation.
本発明で、動物の繰り返し行動を測定する場合、測定中の動物の適度な覚せいレベルを確保できる測定環境を設定し、一定の覚せいレベルであるが移所行動（歩行）は少ない状態を保つことが好ましい。測定環境は使用動物やモデルの種類に応じて適切な条件を選択する。例えば、実験室の照度を落とす、一定時間以上実験室や測定ケージに馴化させるといった条件設定が挙げられる。また、動物の疼痛行動への影響を最小化できる状態にするため、ケージの周囲は視野を遮断することが好ましい。正常動物の繰り返し行動を計測する場合には、疼痛モデル動物と同一の条件下で同一の装置を用いて測定する。 In the present invention, when measuring the repeated behavior of an animal, set a measurement environment that can ensure an appropriate level of wakefulness of the animal being measured, and maintain a low level of moving behavior (walking) at a certain level of wakefulness. Is preferred. Appropriate conditions are selected for the measurement environment according to the type of animal and model used. For example, condition settings such as reducing the illuminance in the laboratory or acclimatizing the laboratory or measurement cage for a certain period of time can be cited. In order to minimize the effect on the animal's pain behavior, it is preferable to block the visual field around the cage. When measuring the repeated behavior of a normal animal, it is measured using the same device under the same conditions as the pain model animal.
本発明で用いられる「収容可能な空間」としては、動物の繰り返し行動を妨げず、動物の動きに伴い生じる磁束が影響を受けないような非磁性の材質で形成されるものであれば特に制限されないが、例えばアクリル樹脂を用いた筒状のものなどが挙げられる。 The “accommodable space” used in the present invention is not particularly limited as long as it is formed of a non-magnetic material that does not interfere with the repetitive behavior of the animal and does not affect the magnetic flux generated by the movement of the animal. However, for example, a cylindrical one using an acrylic resin may be used.
本発明において、「被検物質」としては、例えば、医薬又は動物薬、およびそれらの候補化合物などが挙げられる。被検化合物としては、合成物の場合、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Tetrahedron, 51, 8135-8137 (1995)）等によって合成された化合物群、又はファージ・ディスプレイ法（J. Mol. Biol., 222, 301-310 (1991)）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、天然物の場合、例えば、微生物、植物、海洋生物、又は動物由来の成分（例えば、培養上清、組織抽出物等）を用いることもできる。 In the present invention, examples of the “test substance” include pharmaceuticals or animal drugs and candidate compounds thereof. As the test compound, in the case of a synthetic product, for example, it is synthesized by various known compounds (including peptides) registered in the chemical file, combinatorial chemistry technology (Tetrahedron, 51, 8135-8137 (1995)), etc. Or a random peptide group created by applying the phage display method (J. Mol. Biol., 222, 301-310 (1991)) or the like. In the case of natural products, for example, components derived from microorganisms, plants, marine organisms, or animals (for example, culture supernatants, tissue extracts, etc.) can also be used.
本発明において、被検物質を動物に投与する方法は、標的組織に十分量の被験化合物が到達するように、被験化合物を該動物に投与するものであれば特に制限はない。投与形態については、化合物に適した方法であればいずれの投与方法を選択することもできるが、例えば、被験化合物を固形、半固形、液状、エアロゾル等の形態で経口的もしくは非経口的（例：静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、皮下、皮内、気道内、脊髄腔内、脳室内等）に投与することができる。被験化合物の投与量は、化合物の種類、動物種、体重、投与形態などによって異なり、例えば、動物が生存し得る範囲で、標的組織が機能し得る最高濃度以下の被験化合物に一定時間以上曝露され得るのに必要な量などが挙げられる。
本発明の慢性疼痛治療薬または予防薬、神経障害性疼痛治療薬または予防薬は、当分野において通常用いられている薬剤用担体、賦形剤等を用いて通常使用されている方法によって調製することができる。投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
In the present invention, the method for administering a test substance to an animal is not particularly limited as long as the test compound is administered to the animal so that a sufficient amount of the test compound reaches the target tissue. As for the administration form, any administration method can be selected as long as it is suitable for the compound. For example, the test compound is orally or parenterally (eg, in the form of a solid, semi-solid, liquid, aerosol, etc.) : Intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, subcutaneous, intradermal, intratracheal, intrathecal, intraventricular, etc.). The dose of the test compound varies depending on the type of compound, animal species, body weight, dosage form, etc., for example, it is exposed to a test compound at a concentration not higher than the maximum concentration at which the target tissue can function within a range where the animal can survive for a certain period of time. The amount necessary to obtain is mentioned.
The chronic pain therapeutic agent or preventive agent, neuropathic pain therapeutic agent or preventive agent of the present invention is prepared by a commonly used method using a pharmaceutical carrier, excipient, or the like that is commonly used in this field. be able to. Administration is orally by tablets, pills, capsules, granules, powders, liquids, etc. Any form of parenteral administration such as an ointment, a transdermal patch, a transmucosal liquid, a transmucosal patch, and an inhalant may be used.
本発明のスクリーニング方法において、繰り返し行動の回数を低減させる被検物質を選択する場合、例えば、被検物質投与前のモデル動物の繰り返し行動の回数あるいは被検物質の代わりに溶媒を投与したモデル動物の繰り返し行動の回数と比較して、被検物質を投与したモデル動物の繰り返し行動の回数が低下した場合に、当該被検物質を慢性疼痛治療薬又は予防薬として選択することが挙げられる。 In the screening method of the present invention, when selecting a test substance that reduces the number of repeated actions, for example, the model animal that has been administered a solvent instead of the number of repeated actions of the model animal before administration of the test substance or the test substance When the number of repeated behaviors of a model animal to which a test substance is administered is reduced as compared with the number of repeated actions, the test substance is selected as a therapeutic agent or a preventive for chronic pain.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
実施例１
肢動作（肢上げ/肢振り、肢舐め行動）の目視による観測結果および磁場変化検出による行動解析装置を用いた自動計測結果の比較
動物は雄性Sprague_Dawleyラット（6週齢、Japan SLC、 Hamamatsu、 Japan）を用いた。既報（Pain. 33:87, 1988）に準じ、ペントバルビタール麻酔下で左後肢の坐骨神経を露出し、4/0クロミックガットを用いて4か所緩く絞扼することにより坐骨神経絞扼(CCI)モデルを作成した。偽手術(Sham)群には坐骨神経の露出操作のみを同様に施した。
坐骨神経絞扼を施してから４週間後に、イソフルラン麻酔下でラット左後肢甲部に磁場変化を検出するための磁石（直径1mm、長さ3mm）を留置針を用いて埋め込んだ。マグネット埋め込みより2日以上経過後、ラットを測定用のチャンバーに入れ、障害側肢である左後肢の動きを、目視による観測および磁場変化検出による行動解析装置を用いた自動計測によって計数した。
目視による観測では、歩行など通常の移所行動によって生じる肢上げを正常な肢上げ、一方、移所行動を伴わない、すなわち前後に反対側肢の移動を伴わない左後肢のみの肢上げを痛みに伴う異常な肢上げとみなし、それぞれの回数を計測した。なお、目視による計測では、肢上げ時に肢振り行動を発現するか否かにかかわらず、1回の肢上げとして計数した。また、肢舐め行動も疼痛行動の指標として汎用されることから、左後肢の肢舐め行動出現の有無も同時に観察した。
自動計測では、チャンバー周囲にあるコイルを通して、マグネットを装着した左後肢の動作数を、磁場変化検出機能を備えた行動解析装置（MicroAct Scratching Test version 1.06、ニューロサイエンス（Neuroscience）社、Tokyo、Japan)を用いて測定した。行動解析装置による自動計測時の解析パラメータは、周波数2.5-20Hz、検出閾値0.01V、動作持続時間（duration）0.09秒以上、動作途切れ時間（gap duration）0.03秒以下に設定した。目視による観測および自動計測は、ラットを測定用チャンバーに入れてから５分後より２５分間実施した。
Example 1
Comparison of visual observation results of limb movements (limb lifting / limb swinging, licking limbs) and automatic measurement results using a behavior analysis device based on detection of magnetic field changes. ) Was used. In accordance with the previous report (Pain. 33:87, 1988), the sciatic nerve of the left hind limb was exposed under pentobarbital anesthesia and sciatic nerve entrapment (CCI) was performed by gently squeezing 4 places using 4/0 chromic gut. ) Created a model. The sham operation (Sham) group was similarly subjected to only the operation of exposing the sciatic nerve.
Four weeks after the sciatic nerve strangulation, a magnet (
In visual observation, normal limb raising caused by normal movement behavior such as walking is normal limb lifting, while on the other hand, there is pain in limb lifting only the left hind limb without moving behavior, that is, without moving the opposite limb back and forth. It was regarded as an abnormal limb lift accompanying, and the number of each was measured. In addition, in the measurement by visual observation, it was counted as one limb raising regardless of whether or not the limb swinging behavior was expressed at the time of limb raising. In addition, limb licking behavior is widely used as an index of pain behavior, so the presence or absence of limb licking behavior in the left hind limb was also observed.
In the automatic measurement, the number of movements of the left hind limb with the magnet through the coil around the chamber is used to analyze the behavior of the magnetic field change (MicroAct Scratching Test version 1.06, Neuroscience, Tokyo, Japan) It measured using. The analysis parameters at the time of automatic measurement by the behavior analysis device were set to a frequency of 2.5-20 Hz, a detection threshold of 0.01 V, an operation duration (duration) of 0.09 seconds or more, and an operation interruption time (gap duration) of 0.03 seconds or less. Visual observation and automatic measurement were carried out for 25 minutes from 5 minutes after the rat was placed in the measurement chamber.
結果
目視による観測結果を表１に示した。偽手術群では殆どが正常、すなわち歩行など移所行動に伴うものであったが、坐骨神経絞扼群では異常な肢上げの回数の増大が認められた。また偽手術群では肢舐め行動が出現しなかったのに対し、坐骨神経絞扼群では４例中３例で肢舐め行動が出現した。目視による肢上げ回数計測結果および行動解析装置を用いた自動計測結果を図1 に示した。偽手術群では、いずれの方法による計測でも回数はほとんど変わらなかったが、坐骨神経絞扼群では、目視による観察と比べて行動解析装置を用いた自動計測において回数が増大する傾向が認められた。偽手術群および坐骨神経絞扼群において、目視による肢上げ回数計測結果に対し自動計測結果を個別にプロットした結果を、図２（A）および（B）にそれぞれ示した。肢舐め行動が出現しない個体では目視による肢上げ回数計測結果と自動計測結果はほぼ一致した。一方、肢舐め行動が出現した個体では、自動計測結果の方が目視による計数結果を上回っていた。すなわち、本発明による自動計測方法では、肢上げに加え、肢なめ行動によっても計測回数の増大が認められた。
これらの結果より、磁場変化検出機能を備えた行動解析装置により、正常、異常にかかわらず肢上げ回数が自動計測でき、加えて肢舐め行動による肢の動きも加算された計測結果が得られることから、肢動作数の増加を高感度に検出できることが明らかとなった。
なお、自動計測において動作持続時間を0.5秒以上に設定した場合、ひっかき行動以外の繰り返し行動は適切に評価できなかった。
Results Table 1 shows the visual observation results. Most of the sham-operated groups were normal, that is, accompanied by movement behavior such as walking, but the sciatic nerve strangulation group showed an abnormal increase in the number of limbs. In addition, limb licking behavior did not appear in the sham operation group, whereas limb licking behavior appeared in 3 out of 4 cases in the sciatic nerve strangulation group. Figure 1 shows the results of visual measurement of the number of limbs raised and the results of automatic measurement using a behavior analysis device. In the sham operation group, the number of measurements was almost the same for either method, but in the sciatic nerve strangulation group, there was a tendency for the number of times to increase in the automatic measurement using the behavior analysis device compared to visual observation. . In the sham operation group and the sciatic nerve strangulation group, the results of individual plotting of the automatic measurement results with respect to the results of visual observation of the number of raising the limbs are shown in FIGS. In individuals without limb licking behavior, the results of visual measurement of the number of limb raising and the automatic measurement results almost coincided. On the other hand, in the individual in which limb licking behavior appeared, the automatic measurement result exceeded the visual count result. That is, in the automatic measurement method according to the present invention, an increase in the number of measurements was recognized not only by limb raising but also by limb licking behavior.
From these results, the behavior analysis device equipped with a magnetic field change detection function can automatically measure the number of limb lifts regardless of normal or abnormal, and in addition, the measurement result can be obtained by adding limb movements due to licking behavior From this, it became clear that an increase in the number of limb movements can be detected with high sensitivity.
In addition, when the operation duration was set to 0.5 seconds or more in automatic measurement, repeated behaviors other than scratching behavior could not be properly evaluated.
実施例２
磁場変化検出機能を備えた行動解析装置を用いた、坐骨神経絞扼モデルにおける肢動作数の経時的測定
動物は雄性Sprague-Dawleyラット（6週齢、Japan SLC、 Hamamatsu、 Japan）を用いた。実施例１に示した同様の方法を用い坐骨神経絞扼モデル動物の作成を行い、同日に磁場変化を検出するための磁石を左後肢に埋め込んだ。
磁場変化検出による行動解析装置を用いて、坐骨神経絞扼1週間後から6週間後まで経時的に肢動作数を計測した。本実験においては、計測中の動物の状態をより安定化させるために、照度を20ルックス（lux）以下に落とした実験室で動物を20分以上馴化させた後、測定チャンバーに動物を入れ、5分後より30分間計測を行った。解析条件は実施例１と同様に設定した。全ての測定値は平均値±標準誤差として表記した。坐骨神経絞扼を施してから４週間後の、坐骨神経絞扼群と偽手術群間の測定値の統計学的有意差検定をstudentのt検定によって行った。危険率（P）5%未満を統計学的有意と判定した。
Example 2
Time-lapse measurement of the number of limb movements in the sciatic nerve strangulation model using a behavior analysis device equipped with a magnetic field change detection function Male Sprague-Dawley rats (6 weeks old, Japan SLC, Hamamatsu, Japan) were used as animals. A sciatic nerve strangulation model animal was prepared using the same method shown in Example 1, and a magnet for detecting a magnetic field change was embedded in the left hind limb on the same day.
The number of limb movements was measured over time from 1 week to 6 weeks after strangulation of the sciatic nerve using a behavior analysis device based on magnetic field change detection. In this experiment, in order to further stabilize the state of the animal being measured, after acclimating the animal for 20 minutes or more in the laboratory where the illuminance was reduced to 20 lux or less, the animal was placed in the measurement chamber, Measurement was performed for 30 minutes after 5 minutes. Analysis conditions were set in the same manner as in Example 1. All measured values were expressed as mean ± standard error. The statistical significance test of the measured values between the sciatic nerve strangulation group and the
結果
結果を図３に示す。神経絞扼手術6週間後までの観察期間中、肢動作数の増加が持続して観測された。４週間後において、偽手術群（sham）と比較し、坐骨神経絞扼群（CCI）では肢動作数が有意に増加していた。（P < 0.05）。この結果より、磁場変化検出による行動解析装置を用い、坐骨神経絞扼モデルにおける自発痛に伴う肢動作数の増加を安定的に評価できることが明らかとなった。
Results The results are shown in FIG. During the observation period up to 6 weeks after nerve strangulation, an increase in the number of limb movements was observed continuously. After 4 weeks, the number of limb movements was significantly increased in the sciatic nerve strangulation group (CCI) compared to the sham group (sham). (P <0.05). From this result, it became clear that an increase in the number of limb movements associated with spontaneous pain in the sciatic nerve strangulation model can be stably evaluated using a behavior analysis device based on magnetic field change detection.
実施例３
磁場変化検出機能を備えた行動解析装置を用いた、坐骨神経絞扼モデルにおける自発痛に伴う肢動作数の増加に対する鎮痛薬の効果の測定
実施例１に示した同様の方法を用い、坐骨神経絞扼モデル動物の作成を行い、4週間後に肢動作数を計測した。計測の3日前までに磁場変化を検出するための磁石を左後肢に埋め込んだ。予め、薬物評価の１日から2日前に肢動作数を30分間計測し、坐骨神経絞扼群で偽手術群と比べて有意な増加（危険率p<0.05）を示すことを確認した。また坐骨神経絞扼群の測定値平均が偏らないよう4群に群分けを行った。次に各種薬剤を経口投与した後、再び30分間計測を行い、薬剤の効果を調べた。各被験薬物の溶媒、投与用量、評価タイミングは表２に示した。
Example 3
Measurement of the effect of an analgesic on the increase in the number of limb movements associated with spontaneous pain in a sciatic nerve strangulation model using a behavioral analysis device equipped with a magnetic field change detection function Using the same method shown in Example 1, the sciatic nerve A strangulation model animal was prepared, and the number of limb movements was measured after 4 weeks. A magnet for detecting magnetic field changes was embedded in the left hind limb three days before the measurement. The number of limb movements was measured for 30 minutes one to two days before drug evaluation in advance, and it was confirmed that the sciatic nerve strangulation group showed a significant increase (risk rate p <0.05) compared to the sham operation group. In addition, the sciatic nerve strangulation group was divided into 4 groups so that the average of measured values would not be biased. Next, after various drugs were orally administered, measurement was again performed for 30 minutes to examine the effects of the drugs. Table 2 shows the solvent, administration dose, and evaluation timing of each test drug.
全ての測定値は平均値±標準誤差として表記した。坐骨神経絞扼群（sham）と偽手術群（CCI）における測定値の間の統計学的有意差検定はstudentのt検定によって行った。危険率（P）5%未満を統計学的有意と判定した（P < 0.05を*として図中に表記した）。また、溶媒投与群と薬物投与群における測定値の間の統計学的有意差検定は、一元配置分散分析実施後、Dunnettの多重比較検定によって行った（P < 0.05を#として図中に表記した）。 All measured values were expressed as mean ± standard error. Statistical significance test between measured values in sciatic nerve strangulation group (sham) and sham operation group (CCI) was performed by student's t test. A risk factor (P) of less than 5% was determined to be statistically significant (P <0.05 was shown in the figure as *). In addition, the statistical significance test between the measured values in the solvent-administered group and the drug-administered group was performed by Dunnett's multiple comparison test after performing one-way analysis of variance (P <0.05 is shown in the figure as #). ).
結果
結果を図４に示す。坐骨神経絞扼モデル動物の左後肢動作数増加に対し、プレガバリン(Pregabalin)は30 mg/kgで抑制傾向を示した。アミトリプチリン（Amitriptyline）、デュロキセチン(Duloxetine)は30 mg/kgで有意な抑制効果を示した。プレガバリンおよびデュロキセチンは、神経障害性疼痛治療薬として認可されており、また、アミトリプチリンは神経障害性疼痛患者での臨床試験において有効性が証明されている薬剤である。これらのことから、本結果は、神経障害性疼痛患者に対する有用な薬剤の鎮痛効果を、本評価方法を用いて検出できることを示した。
一方、ジクロフェナク（Diclofenac）は10 mg/kgまでの用量で抑制効果は示さなかった。この結果は非ステロイド性抗炎症薬であるジクロフェナクが神経障害性疼痛に対しては有効では無いとする臨床における知見と一致した。本結果は、本評価方法は鎮痛薬の効果を非特異的には検出しないことを示した。
これらの結果は、当該方法を用いて神経障害性疼痛をはじめとする慢性疼痛の除痛を目的とした医薬品のスクリーニング、評価が可能であり、かつ当該方法がこれらの疾患患者における治療薬の臨床効果について、高い予測性を有することを示した。
Results The results are shown in FIG. Pregabalin showed a tendency to be suppressed at 30 mg / kg against the increase in the number of left hindlimb movements in sciatic nerve strangulation model animals. Amitriptyline and duloxetine showed significant inhibitory effects at 30 mg / kg. Pregabalin and duloxetine have been approved as therapeutic agents for neuropathic pain, and amitriptyline is a drug that has proven effective in clinical trials in patients with neuropathic pain. From these results, the present results showed that the analgesic effect of a useful drug for patients with neuropathic pain can be detected using this evaluation method.
On the other hand, diclofenac showed no inhibitory effect at doses up to 10 mg / kg. This result was consistent with clinical findings that diclofenac, a nonsteroidal anti-inflammatory drug, was not effective against neuropathic pain. This result showed that this evaluation method did not detect the effect of analgesics non-specifically.
These results indicate that this method can be used to screen and evaluate pharmaceuticals for the purpose of removing chronic pain, including neuropathic pain. About the effect, it showed having high predictability.
本発明は、慢性疼痛モデル動物における自発痛の測定方法及びそれを用いる慢性疼痛治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明の方法は、慢性疼痛モデル動物における、自発痛に伴う繰り返し行動の簡便かつ客観性の高い評価法を提供でき、優れた慢性疼痛治療薬を開発する手段として有用である。 The present invention relates to a method for measuring spontaneous pain in a chronic pain model animal and a screening method for a therapeutic agent for chronic pain using the same. The method of the present invention can provide a simple and highly objective evaluation method for repeated behavior associated with spontaneous pain in a chronic pain model animal, and is useful as a means for developing an excellent therapeutic agent for chronic pain.
Claims (14)
１）当該モデル動物に磁場変化を検出するための物質を装着する工程、
２）当該モデル動物の繰り返し行動を、当該繰り返し行動に応じた磁場変化を検出する手段を備えた装置によって、計測する工程、
を含む方法。 A method for measuring spontaneous pain in a chronic pain model animal,
1) A step of attaching a substance for detecting a magnetic field change to the model animal.
2) a step of measuring the repetitive behavior of the model animal by an apparatus having means for detecting a magnetic field change according to the repetitive behavior;
Including methods.
１）被検物質を慢性疼痛モデル動物に投与する工程、
２）前記モデル動物の繰り返し行動の回数を請求項１乃至５に記載の方法で計測し、繰り返し行動の回数を低減させた被検物質を慢性疼痛治療薬または予防薬として選択する工程、
を含む方法。 A method for screening for a chronic pain treatment or prevention drug, comprising:
1) a step of administering a test substance to a chronic pain model animal;
2) a step of measuring the number of repeated behaviors of the model animal by the method according to claims 1 to 5 and selecting a test substance having a reduced number of repeated behaviors as a chronic pain therapeutic agent or a preventive agent;
Including methods.
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