JP2014136128A - Nerve fascicle for implantation and method of manufacturing the same - Google Patents
Nerve fascicle for implantation and method of manufacturing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014136128A JP2014136128A JP2013007798A JP2013007798A JP2014136128A JP 2014136128 A JP2014136128 A JP 2014136128A JP 2013007798 A JP2013007798 A JP 2013007798A JP 2013007798 A JP2013007798 A JP 2013007798A JP 2014136128 A JP2014136128 A JP 2014136128A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- neural stem
- microfiber
- microfibers
- stem cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Prostheses (AREA)
Abstract
Description
本発明は、２本以上の神経幹細胞等を含むマイクロゲルファイバを、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでバンドル化した移植用神経束に関する。 The present invention relates to a nerve bundle for transplantation in which microgel fibers containing two or more neural stem cells and the like are bundled with a biocompatible gel or a polyion complex.
神経変性疾患や物理的な原因で損傷を受けた神経の機能を回復するために、神経を移植する方法が開発されている。神経移植の方法としては、神経幹細胞を注射で患部に注入する方法が広く用いられてきた。しかしながら、この方法では、注入した神経幹細胞が体内で移動しやすく、脳や脊髄、複雑な末梢神経などの神経組織の損傷部位を選択的に修復するのは困難であった。 In order to restore the function of nerves damaged by neurodegenerative diseases or physical causes, methods for transplanting nerves have been developed. As a method of nerve transplantation, a method of injecting neural stem cells into an affected area by injection has been widely used. However, with this method, the injected neural stem cells are easy to move in the body, and it is difficult to selectively repair damaged sites of nerve tissues such as the brain, spinal cord, and complex peripheral nerves.
一方、生体適合性材料で作られたスキャフォールドに神経幹細胞を包埋して移植片を作製するアプローチも報告されている（例えば、非特許文献１）。また、本発明者らは、内部に細胞等を封入できる高強度ハイドロゲルファイバの作製方法を開発し（特許文献１）、この技術を用いて神経幹細胞を封入した移植用ハイドロゲルファイバを作製した（非特許文献２）。このような移植片を神経の損傷部位に配置すると、神経幹細胞の増殖及び分化に伴って損傷神経が修復され、機能が回復することが期待される。 On the other hand, an approach has also been reported in which neural stem cells are embedded in a scaffold made of a biocompatible material to produce a graft (for example, Non-Patent Document 1). In addition, the present inventors have developed a method for producing a high-strength hydrogel fiber that can encapsulate cells and the like (Patent Document 1), and produced a hydrogel fiber for transplantation in which neural stem cells are encapsulated using this technique. (Non-patent document 2). When such a graft is placed at a nerve injury site, it is expected that the damaged nerve is repaired and the function is restored with the proliferation and differentiation of neural stem cells.
神経移植に用いられる移植片には、神経組織が効率的かつ機能的に再生するよう、断裂した神経組織の２点を直接的につなぐことができ、ピンセット等で運んでも細胞がダメージを受けないような十分な柔軟性と強度を有すること、また、移植片において細胞が好適に増殖・分化できる環境であること、既存の移植用スキャフォールドよりも内部の細胞密度を高く保持できることなどが必要とされる。
かかる観点で、これまでの移植片よりもさらに優れたものが求められていた。
The graft used for nerve transplantation can directly connect two points of the torn nerve tissue so that the nerve tissue can be efficiently and functionally regenerated, and even if it is carried with tweezers, the cells are not damaged It is necessary to have sufficient flexibility and strength, to be able to grow and differentiate cells in a graft, and to maintain a higher internal cell density than existing scaffolds for transplantation. Is done.
From this point of view, there has been a demand for an even better one than conventional grafts.
本発明は、必要な柔軟性及び強度を備え、移植部位に効率よく神経を再生させることができる神経移植用の移植片を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a graft for nerve transplantation that has necessary flexibility and strength and can efficiently regenerate nerves at a transplant site.
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、神経幹細胞等を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロファイバを２本以上作製し、これらを束ねて生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによりバンドル化する移植用神経束の作製方法を見出した。
かかる方法で作製された移植用神経束は、十分な柔軟性及び強度を有し、内部の細胞に十分な栄養を供給できる構造であるとともに、高い細胞密度を維持できるので、移植時の取扱が容易で、患部において効率よく神経組織を再生することが可能である。
また、それぞれのマイクロファイバに異なる細胞を封入することや、異なる細胞を含むマイクロファイバを所望の位置に配置することも容易であることから、神経束の構造の自由度が高くなり、生体の神経束に近い構成を実現できる。
As a result of repeated studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors produced two or more microfibers in which microgel fibers containing neural stem cells and the like are coated with high-strength hydrogel, and bundle these to create a living body. A method for producing a nerve bundle for transplantation that is bundled by coating with a compatible gel or polyion complex was found.
The nerve bundle for transplantation produced by such a method has sufficient flexibility and strength, can supply sufficient nutrients to the cells inside, and can maintain a high cell density. It is easy and nerve tissue can be efficiently regenerated in the affected area.
In addition, since it is easy to enclose different cells in each microfiber and to place microfibers containing different cells at desired positions, the degree of freedom of the structure of the nerve bundle is increased, and the nerves of the living body are increased. A configuration close to a bundle can be realized.
すなわち本発明は、
〔１〕神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバが２本以上バンドル化された移植用神経束であって、
前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、
前記２本以上のマイクロゲルファイバは、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている、移植用神経束；
〔２〕前記コーティングが、ポリイオンコンプレックスを２層以上含む、上記〔１〕に記載の移植用神経束；
〔３〕前記ポリイオンコンプレックスの各層が、アルギン酸又はその塩とキトサンとを含む、上記〔２〕に記載の移植用神経束；
〔４〕神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞以外の少なくとも１種の細胞を含むマイクロファイバ、及び／又は細胞以外の物質を含むマイクロファイバをさらに含む、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の移植用神経束；
〔５〕束の中心部のマイクロファイバが神経細胞を含み、周囲のマイクロファイバが神経細胞以外の細胞、及び／又は細胞以外の物質を含む、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の移植用神経束；
〔６〕マイクロファイバを合計で３本から２００本含む、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の移植用神経束；
〔７〕少なくとも１本の前記マイクロファイバの少なくとも一方の端部から、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞が突出している、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の移植用神経束；
〔８〕生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングされた、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバであって、
前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものである、マイクロファイバ；
〔９〕前記コーティングが、ポリイオンコンプレックスを２層以上含む、上記〔８〕に記載の移植用神経束；
〔１０〕前記ポリイオンコンプレックスの各層が、アルギン酸又はその塩とキトサンとを含む、上記〔９〕に記載の移植用神経束；
〔１１〕移植用神経束の製造方法であって、
神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロファイバを、２本以上作製する工程と、
前記２本以上のマイクロファイバを束にして、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングする工程と、
を含む方法；
〔１２〕前記マイクロファイバを２本以上作製する工程の後、マイクロファイバを束にする前に、
マイクロファイバ内の神経幹細胞を所定の段階まで分化させる工程をさらに含む、上記〔１１〕に記載の方法；
〔１３〕前記神経幹細胞を分化させる工程において、少なくとも一部のマイクロファイバ内の神経幹細胞を神経細胞に分化させ、別の少なくとも一部のマイクロファイバ内の神経幹細胞をグリア細胞に分化させる、上記〔１２〕に記載の方法；
〔１４〕前記２本以上のマイクロファイバを束にする工程において、神経細胞を含むマイクロファイバを束の中心部に配置し、グリア細胞を含むマイクロファイバをその周囲に配置する、上記〔１３〕に記載の方法；
〔１５〕前記２本以上のマイクロファイバを束にする工程において、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞以外の少なくとも１種の細胞を含むマイクロファイバ、及び／又は細胞以外の物質を含むマイクロファイバを作製し、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバと共に束にする、上記〔１１〕から〔１４〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１６〕前記２本以上のマイクロファイバを束にする工程において、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバを束の中心部に配置し、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞以外の少なくとも１種の細胞を含むマイクロファイバ、及び／又は細胞以外の物質を含むマイクロファイバをその周囲に配置する、上記〔１５〕に記載の方法；
〔１７〕前記マイクロファイバを束にして、生体適合性ゲル材料でコーティングする工程は、
前記束を、ポリイオンコンプレックスを形成するカチオン性ポリマー溶液とアニオン性ポリマー溶液で順次コーティングする工程を１回以上繰り返す工程を含む、上記〔１１〕から〔１６〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１８〕コーティングする工程の後、移植部位の長さに併せて切断する工程と、
切断後、マイクロファイバの端部から細胞が突出するまで培養する工程と、をさらに含む、上記〔１１〕から〔１７〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１９〕 細胞を含むマイクロファイバが２本以上バンドル化された移植片であって、
前記マイクロファイバは、細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、
前記２本以上のマイクロゲルファイバは、ポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている、移植片；
〔２０〕前記コーティングが、ポリイオンコンプレックスを２層以上含む、上記〔１９〕に記載の移植片；及び
〔２１〕前記ポリイオンコンプレックスの各層が、アルギン酸又はその塩とキトサンとを含む、上記〔２１〕に記載の移植片、
に関する。
That is, the present invention
[1] A nerve bundle for transplantation in which two or more microfibers containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage are bundled,
The microfiber is a microgel fiber containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage and coated with a high-strength hydrogel,
The nerve bundle for transplantation, wherein the two or more microgel fibers are bundled by coating with a biocompatible gel or polyion complex;
[2] The nerve bundle for transplantation according to [1] above, wherein the coating contains two or more layers of polyion complexes;
[3] The nerve bundle for transplantation according to the above [2], wherein each layer of the polyion complex contains alginic acid or a salt thereof and chitosan;
[4] The above [1] to [1], further comprising a microfiber containing at least one kind of cell other than a neural stem cell or a cell obtained by differentiating a neural stem cell to a predetermined stage, and / or a microfiber containing a substance other than a cell. 3] The nerve bundle for transplantation according to any one of the above;
[5] Any one of [1] to [4] above, wherein the microfiber at the center of the bundle contains nerve cells, and the surrounding microfiber contains cells other than nerve cells and / or substances other than cells. A nerve bundle for transplantation according to claim 1;
[6] The nerve bundle for transplantation according to any one of [1] to [5] above, comprising a total of 3 to 200 microfibers;
[7] Any one of [1] to [6] above, wherein a neural stem cell or a cell obtained by differentiating the neural stem cell to a predetermined stage protrudes from at least one end of the at least one microfiber. A nerve bundle for transplantation according to claim 1;
[8] A microfiber containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage, coated with a biocompatible gel or polyion complex,
The microfiber is a microfiber in which a microgel fiber containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage is coated with a high-strength hydrogel;
[9] The nerve bundle for transplantation according to [8], wherein the coating contains two or more layers of polyion complexes;
[10] The nerve bundle for transplantation according to [9], wherein each layer of the polyion complex contains alginic acid or a salt thereof and chitosan;
[11] A method for producing a nerve bundle for transplantation,
A step of producing two or more microfibers in which a microgel fiber containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage is coated with a high-strength hydrogel;
Bundling the two or more microfibers and coating with a biocompatible gel or polyion complex;
A method comprising:
[12] After the step of producing two or more microfibers, before bundling the microfibers,
The method according to [11] above, further comprising the step of differentiating neural stem cells in the microfiber to a predetermined stage;
[13] In the step of differentiating the neural stem cells, the neural stem cells in at least some of the microfibers are differentiated into neural cells, and the neural stem cells in at least some other microfibers are differentiated into glial cells. 12];
[14] In the step of bundling the two or more microfibers, the microfiber containing nerve cells is arranged at the center of the bundle, and the microfiber containing glial cells is arranged around the microfiber. Described method;
[15] In the step of bundling the two or more microfibers, a microfiber containing at least one kind of cell other than a neural stem cell or a cell obtained by differentiating a neural stem cell to a predetermined stage, and / or a substance other than a cell The method according to any one of [11] to [14] above, wherein a microfiber containing is produced and bundled together with a microfiber containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage;
[16] In the step of bundling the two or more microfibers, a microfiber containing a neural stem cell or a cell obtained by differentiating the neural stem cell to a predetermined stage is arranged at the center of the bundle, and the neural stem cell or neural stem cell is The method according to [15] above, wherein a microfiber containing at least one type of cell other than cells differentiated to a predetermined stage and / or a microfiber containing a substance other than a cell are disposed around the microfiber.
[17] The step of coating the microfibers with a biocompatible gel material in a bundle,
The method according to any one of [11] to [16] above, comprising a step of repeating the step of coating the bundle sequentially with a cationic polymer solution and an anionic polymer solution forming a polyion complex one or more times;
[18] After the coating step, cutting according to the length of the transplant site;
The method according to any one of [11] to [17], further comprising a step of culturing until the cells protrude from the end of the microfiber after cutting;
[19] A graft in which two or more microfibers containing cells are bundled,
The microfiber is a microgel fiber containing cells coated with a high-strength hydrogel,
The two or more microgel fibers are bundled by coating with a polyion complex;
[20] The graft according to the above [19], wherein the coating contains two or more layers of polyion complexes; and [21] Each layer of the polyion complex contains alginic acid or a salt thereof and chitosan [21] An implant according to
About.
本発明に係る移植用神経束は、十分な柔軟性及び強度を有し、内部の細胞に十分な栄養を供給できるとともに、細胞を高密度に保持できる構造であるため、移植時の取扱が容易で、患部において効率よく神経組織を再生することが可能である。
また、本発明に係る移植用神経束は、各マイクロファイバに封入する細胞を自由に選択し、所望の位置に配置することができるので、神経束の構造の自由度が高く、神経組織の再生に好適な構造を実現することができる。
さらに、本発明に係る移植用神経束は、その側面から細胞が漏出することがなく、端部のみから細胞が外に延びていくため、断裂した神経と効率よく相互作用し、神経の損傷部を再生させることが可能である。
The nerve bundle for transplantation according to the present invention has sufficient flexibility and strength, can supply enough nutrients to the cells inside, and can hold the cells at a high density, so that handling at the time of transplantation is easy. Thus, it is possible to efficiently regenerate nerve tissue in the affected area.
In addition, the nerve bundle for transplantation according to the present invention can freely select cells to be encapsulated in each microfiber and arrange it at a desired position, so that the degree of freedom of the structure of the nerve bundle is high, and the regeneration of nerve tissue A suitable structure can be realized.
Furthermore, since the nerve bundle for transplantation according to the present invention does not leak out from the side surface and the cell extends outside only from the end portion, the nerve bundle efficiently interacts with the torn nerve, Can be played back.
（移植用神経束）
本発明に係る移植用神経束は、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバを２本以上含む。マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、２本以上のマイクロゲルファイバは、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている。
(Transplant nerve bundle)
The nerve bundle for transplantation according to the present invention includes two or more microfibers including neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage. A microfiber is obtained by coating a neural gel cell or a microgel fiber containing a cell obtained by differentiating a neural stem cell to a predetermined stage with a high-strength hydrogel, and two or more microgel fibers are biocompatible gels or It is bundled by coating with a polyion complex.
本明細書において、「神経幹細胞」とは、増殖することができ、継代を繰り返すことができる自己複製能を有し、かつ、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞などの中枢神経および末梢神経系を構成する細胞に分化する能力を有する細胞をいう。
神経幹細胞は、まず神経前駆細胞またはグリア前駆細胞に分化し、神経前駆細胞が神経細胞（ニューロン）に、グリア前駆細胞がグリア細胞（神経系を構成する神経細胞以外の細胞の総称。アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びシュワン細胞を含む。）に分化する。
As used herein, “neural stem cell” refers to a central nervous system such as a nerve cell, astrocyte, oligodendrocyte, Schwann cell that has the ability to proliferate and can be repeated for passage. And cells having the ability to differentiate into cells that constitute the peripheral nervous system.
A neural stem cell first differentiates into a neural progenitor cell or a glial progenitor cell, the neural progenitor cell becomes a neuron (neuron), and the glial progenitor cell becomes a glial cell (a general term for cells other than the nerve cells constituting the nervous system. Including oligodendrocytes and Schwann cells).
本明細書において、「神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞」とは、神経幹細胞から神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞までのいずれかの分化段階の細胞を意味し、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞を含むがこれらに限定されない。
以下、「神経幹細胞」と、「神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞」とを、併せて「神経幹細胞等」という。
In the present specification, “cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage” mean cells in any differentiation stage from neural stem cells to neural cells, astrocytes, oligodendrocytes, and Schwann cells. Including but not limited to cells, astrocytes, oligodendrocytes, Schwann cells, neural progenitor cells, glial progenitor cells.
Hereinafter, “neural stem cells” and “cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage” are collectively referred to as “neural stem cells and the like”.
本発明に用いられる神経幹細胞等は、生体から神経幹細胞を単離して調製したものでもよいし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞その他の細胞から分化・誘導したものであってもよい。また、神経幹細胞等は、移植対象の個体に由来する自家細胞であってもよいし、移植対象以外の個体に由来する他家細胞であってもよい。 Neural stem cells and the like used in the present invention may be prepared by isolating neural stem cells from a living body, or may be differentiated or induced from pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells and other cells. . In addition, the neural stem cell or the like may be an autologous cell derived from an individual to be transplanted, or an autologous cell derived from an individual other than the transplant target.
本明細書において、「神経幹細胞等を含むマイクロファイバ」は、神経幹細胞等を含むマイクロゲルファイバが、高強度ハイドロゲルで被覆されたものを意味し、後述する生体適合性ゲルやポリイオンコンプレックスによってバンドル化でき、生体に悪影響を及ぼすものでない限り、その材料や構造は特に限定されない。 In this specification, “microfiber containing neural stem cells” means a microgel fiber containing neural stem cells or the like coated with a high-strength hydrogel, and is bundled by a biocompatible gel or polyion complex described later. The material and structure thereof are not particularly limited as long as they can be changed and do not adversely affect the living body.
マイクロファイバとしては、例えば、特許文献１に記載されたコア・シェル構造のファイバを用いることができる。簡単に説明すると、マイクロファイバは、細胞を内包するマイクロゲルファイバと、マイクロゲルファイバを被覆する高強度ハイドロゲル層からなる。
マイクロゲルファイバは、ハイドロゲル層に比較して強度の弱いゲルで形成される。マイクロゲルファイバに用いられるゲルは、内包する細胞の増殖や分化に悪影響を与えない限り特に限定されないが、例えば、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、フィブリン、またはこれらの２種以上含む混合物を用いることができる。市販のゲル（例えば、マトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社））を用いてもよい。
その他、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリドンなどの水溶性ポリマーに紫外線等を照射して形成したハイドロゲル；
親水−疎水性ドメインを有する両親媒性ポリマー、例えばポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体、両親媒性ポリアミノ酸、架橋ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）、ポリオキシエチレンビニルエーテル系共重合体などを相転移温度以上にして形成したハイドロゲル；
（メタ）アクリル基や桂皮酸などを修飾した光硬化性基を有する水溶性ポリマーに紫外線を照射して形成したハイドロゲル；
チオール基を有する水溶性ポリマーを混合し、分子内及び分子間ジスルフィド結合を形成することにより形成されるハイドロゲル；
２液混合により結合を形成する官能基を有する水溶性ポリマーを混合することにより形成されるハイドロゲル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとアミン、チオールとエン、アルキンとアジドおよびこれらの複合体からなるハイドロゲル、
などを用いてもよい。
また、モノマー分子が自己集合した非共有結合性の超分子ハイドロゲル（例えば、Dojin News, 118, pp.1-17, 2006）を用いることもできる。
マイクロファイバの材料は、生体に悪影響を及ぼさない限り、生体分解性・生体吸収性であっても非分解性・非吸収性であってもよい。
As the microfiber, for example, a fiber having a core / shell structure described in Patent Document 1 can be used. Briefly, the microfiber is composed of a microgel fiber enclosing cells and a high-strength hydrogel layer covering the microgel fiber.
The microgel fiber is formed of a gel having a lower strength than the hydrogel layer. The gel used for the microgel fiber is not particularly limited as long as it does not adversely affect the proliferation and differentiation of the encapsulated cells. For example, chitosan gel, collagen gel, gelatin, peptide gel, fibrin, or a mixture containing two or more thereof. Can be used. A commercially available gel (for example, Matrigel (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.)) may be used.
Other hydrogels formed by irradiating water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, and polyvinylpyrrolidone with ultraviolet rays;
Phase transition temperature of amphiphilic polymers having hydrophilic-hydrophobic domains such as polyethylene oxide-polypropylene oxide copolymers, amphiphilic polyamino acids, crosslinked poly (N-isopropylacrylamide), polyoxyethylene vinyl ether copolymers, etc. Hydrogel formed as above;
A hydrogel formed by irradiating a water-soluble polymer having a photocurable group modified with (meth) acrylic group or cinnamic acid with ultraviolet rays;
A hydrogel formed by mixing a water-soluble polymer having a thiol group to form intramolecular and intermolecular disulfide bonds;
A hydrogel formed by mixing a water-soluble polymer having a functional group that forms a bond by mixing two liquids, for example, a hydrogel composed of N-hydroxysuccinimide ester and amine, thiol and ene, alkyne and azide, and a complex thereof. gel,
Etc. may be used.
In addition, a non-covalent supermolecular hydrogel in which monomer molecules are self-assembled (for example, Dojin News, 118, pp.1-17, 2006) can also be used.
The material of the microfiber may be biodegradable / bioabsorbable or non-degradable / non-absorbable as long as it does not adversely affect the living body.
高強度ハイドロゲルも、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングするために必要な性質を有する限り特に限定されず、マイクロゲルファイバより強度の高いものであればよい。ゲルの機械的強度は、当業者に周知の方法、例えば、引っ張り試験機を水中で用いて引っ張り強度や荷重強度を測定する方法で評価できる。高強度ハイドロゲルとしては、例えば、アガロースゲル、ＵＶ照射により硬化する光硬化性ゲルが挙げられる。
その他、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリドンなどの水溶性ポリマーに紫外線等を照射して形成したハイドロゲル；
親水−疎水性ドメインを有する両親媒性ポリマー、例えばポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体、両親媒性ポリアミノ酸、架橋ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）、ポリオキシエチレンビニルエーテル系共重合体などを相転移温度以上にして形成したハイドロゲル；
（メタ）アクリル基や桂皮酸などを修飾した光硬化性基を有する水溶性ポリマーに紫外線を照射して形成したハイドロゲル；
チオール基を有する水溶性ポリマーを混合し、分子内及び分子間ジスルフィド結合を形成することにより形成されるハイドロゲル；
２液混合により結合を形成する官能基を有する水溶性ポリマーを混合することにより形成されるハイドロゲル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとアミン、チオールとエン、アルキンとアジドおよびこれらの複合体からなるハイドロゲル；
カルシウムイオンなどの金属イオン存在下でゲル化する性質を有するアルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、ジェランガムゲル、ペクチンゲル、
などであって、マイクロゲルファイバに用いるものより高強度としたものを用いてもよい。
また、高強度ハイドロゲルは、生体に悪影響を及ぼさない限り、生体分解性・生体吸収性であっても非分解性・非吸収性であってもよい。
The high-strength hydrogel is not particularly limited as long as it has the properties necessary for coating with a biocompatible gel or polyion complex, and any high-strength hydrogel may be used as long as it has higher strength than a microgel fiber. The mechanical strength of the gel can be evaluated by a method well known to those skilled in the art, for example, a method of measuring tensile strength or load strength using a tensile tester in water. Examples of the high-strength hydrogel include an agarose gel and a photocurable gel that is cured by UV irradiation.
Other hydrogels formed by irradiating water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, and polyvinylpyrrolidone with ultraviolet rays;
Phase transition temperature of amphiphilic polymers having hydrophilic-hydrophobic domains such as polyethylene oxide-polypropylene oxide copolymers, amphiphilic polyamino acids, crosslinked poly (N-isopropylacrylamide), polyoxyethylene vinyl ether copolymers, etc. Hydrogel formed as above;
A hydrogel formed by irradiating a water-soluble polymer having a photocurable group modified with (meth) acrylic group or cinnamic acid with ultraviolet rays;
A hydrogel formed by mixing a water-soluble polymer having a thiol group to form intramolecular and intermolecular disulfide bonds;
A hydrogel formed by mixing a water-soluble polymer having a functional group that forms a bond by mixing two liquids, for example, a hydrogel composed of N-hydroxysuccinimide ester and amine, thiol and ene, alkyne and azide, and a complex thereof. gel;
Alginic acid gel, carrageenan gel, gellan gum gel, pectin gel having the property of gelling in the presence of metal ions such as calcium ions,
It is also possible to use a material having higher strength than that used for the microgel fiber.
The high-strength hydrogel may be biodegradable / bioabsorbable or non-degradable / non-absorbable as long as it does not adversely affect the living body.
マイクロファイバは、例えば図３に示すような二重同軸マイクロ流体装置（double coaxial microfluidic device）によって作製することができる。この装置は、マイクロゲルファイバの材料と高強度ハイドロゲルとを、マイクロゲルファイバ材料がコア部、高強度ハイドロゲルがシェル部となるように同軸方向に射出して、マイクロファイバを形成することができる。二重同軸マイクロ流体装置は、例えば、Lab Chip, 4, pp.576-580, 2004のFig. 1に説明されている。 The microfiber can be made, for example, by a double coaxial microfluidic device as shown in FIG. This device can form a microfiber by injecting a microgel fiber material and a high-strength hydrogel in a coaxial direction so that the microgel fiber material is a core and the high-strength hydrogel is a shell. it can. A double coaxial microfluidic device is illustrated, for example, in Fig. 1 of Lab Chip, 4, pp. 576-580, 2004.
マイクロファイバの内部において細胞が存在する領域の径は、特に限定されないが、例えば内径を５０μｍ〜２００μｍ以下、特に約１００μｍ程度とすると、細胞の増殖に好ましい環境となる。
マイクロファイバの外径も特に限定されないが、例えば１０μｍ〜１ｍｍとすることができる。内径（細胞が存在する領域）が１００μｍ程度の場合、外径が２００μｍ程度であるとよい。
マイクロファイバの長さは最終的な移植用神経束のサイズや、細胞への栄養の供給を考慮して、任意に決定することができる。
The diameter of the region where the cells are present inside the microfiber is not particularly limited. For example, if the inner diameter is 50 μm to 200 μm or less, particularly about 100 μm, a favorable environment for cell proliferation is obtained.
The outer diameter of the microfiber is not particularly limited, but may be, for example, 10 μm to 1 mm. When the inner diameter (area where cells are present) is about 100 μm, the outer diameter is preferably about 200 μm.
The length of the microfiber can be arbitrarily determined in consideration of the size of the final nerve bundle for transplantation and the supply of nutrients to the cells.
神経幹細胞等を含むマイクロファイバは、神経幹細胞等以外の成分を含んでいてもよい。かかる成分として、神経細胞の生存・増殖・分化を誘導もしくは保持する細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞など）、成長因子（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）や上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ））、栄養因子、成長ホルモンなどが挙げられるが、これらに限定されない。 The microfiber containing neural stem cells and the like may contain components other than neural stem cells and the like. Such components include cells that induce or maintain survival, proliferation, and differentiation of nerve cells (eg, smooth muscle cells, skeletal muscle cells, etc.), growth factors (eg, fibroblast growth factor (FGF), epithelial cell growth factor ( EGF)), trophic factors, growth hormones and the like, but are not limited to these.
本発明に係る移植用神経束は、マイクロファイバを２本以上含む。マイクロファイバの数は、移植用神経束のサイズ、マイクロファイバの径、生体適合性ゲルの種類等によって、適宜決定することができ、例えば、３本以上、５本以上、１０本以上、２００本以下、１５０本以下等とすることができる。 The nerve bundle for transplantation according to the present invention includes two or more microfibers. The number of microfibers can be appropriately determined depending on the size of the nerve bundle for transplantation, the diameter of the microfiber, the type of the biocompatible gel, and the like, for example, 3 or more, 5 or more, 10 or more, 200 Hereinafter, it may be 150 or less.
本発明に係る移植用神経束の複数のマイクロファイバは、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化される。
本明細書において、「バンドル化」とは、複数本のマイクロファイバを束ね、移植片として十分な柔軟性と強度を有する１本の移植用神経束を形成することを意味する。また、本明細書において「コーティング」とは、マイクロファイバがバンドル化されるように、マイクロファイバの束の少なくとも一部を生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスで覆うことを意味する。
The plurality of microfibers of the implantable nerve bundle according to the present invention are bundled by coating with a biocompatible gel or polyion complex.
In the present specification, “bundling” means that a plurality of microfibers are bundled to form a single nerve bundle for transplantation having sufficient flexibility and strength as a graft. In this specification, “coating” means that at least a part of a bundle of microfibers is covered with a biocompatible gel or polyion complex so that the microfibers are bundled.
本明細書において、生体適合性ゲルは、好適な柔軟性と強度を有するようにマイクロファイバをバンドル化できるものであれば特に限定されず、生体に問題となるような毒性を与えない限り、生体分解性・生体吸収性であっても非分解性・非吸収性であってもよい。
生体適合性ゲルとしては、例えば、コラーゲン、アガロース、ヒアルロン酸、キトサン、キチン、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリエチレングリコール、ポリジオキサン、アルブミン、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニン、デキストリン、デキストラン、アルギン酸、セルロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ポリアミノ酸、デンプン、及びこれらの誘導体又は塩からなる群より選択される少なくとも１つとすることができる。上述したマイクロゲルファイバ又は高強度ハイドロゲルに用いられる各種のゲルを使用してもよい。異なる種類の生体適合性ゲルを、層状に重ねてコーティングしてもよい。
誘導体としては、例えば、水酸基を酢酸、硝酸、硫酸、リン酸などと反応させたものや、カルボキシル基の一部をエチレングリコールやプロピレングリコールでエステル化したものなどが挙げられ、塩としては、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩が挙げられる）。
それぞれの材料は、当業者が周知技術を用いて適当な柔軟性及び強度を有するゲルとすることが可能である。
In this specification, the biocompatible gel is not particularly limited as long as microfibers can be bundled so as to have suitable flexibility and strength. It may be degradable / bioabsorbable or non-degradable / non-absorbable.
Examples of the biocompatible gel include collagen, agarose, hyaluronic acid, chitosan, chitin, gelatin, polylactic acid, polyglycolic acid, polylactic acid-polyglycolic acid copolymer, polyethylene glycol, polydioxane, albumin, fibrin, and fibronectin. , Laminin, dextrin, dextran, alginic acid, cellulose, heparin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, polyamino acid, starch, and derivatives or salts thereof. Various gels used for the above-described microgel fiber or high-strength hydrogel may be used. Different types of biocompatible gels may be coated in layers.
Examples of the derivatives include those obtained by reacting a hydroxyl group with acetic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like, and those obtained by esterifying a part of the carboxyl group with ethylene glycol or propylene glycol. And alkali metal salts such as salts).
Each material can be made into a gel having appropriate flexibility and strength by a person skilled in the art using well-known techniques.
本明細書において、ポリイオンコンプレックスは、ポリカチオン類とポリアニオン類を水の存在下で接触させると静電相互作用によって形成される。生体適合性に優れ、医薬品や医療機器等に広く利用されている。
ポリカチオン類及びポリアニオン類は、水の存在下で混合することによってポリイオンコンプレックスを形成するものであれば特に限定されず、当業者が適宜選択することができる。
ポリカチオン類としては、例えば、キトサン、アミノ化多糖類（セルロース、デキストラン、プルラン、カードラン、グルコマンナンなどの中性多糖類をアミノ化したもの）、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルギニン、リジン−アルギニン共重合体、及びこれらの誘導体又は塩からなる群より選択される１種以上を用いることができる。誘導体としては、アセチル化物など、塩としては、塩酸塩、酢酸塩などが挙げられる。
ポリアニオン類としては、例えば、アルギン酸、ペクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチル化又はサクシニル化した多糖類（セルロース、デキストラン、デンプン、キトサンなどをカルボキシメチル化又はサクシニル化したもの）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリマレイン酸、無機ポリリン酸、ポリホスマー、ポリスルフェート、及びこれらの誘導体又は塩からなる群より選択される１種以上を用いることができる。誘導体としては、例えば、水酸基を酢酸、硝酸、硫酸、リン酸などと反応させたものや、カルボキシル基の一部をエチレングリコールやプロピレングリコールでエステル化したものなどが挙げられ、塩としては、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩が挙げられる）。
In this specification, a polyion complex is formed by electrostatic interaction when polycations and polyanions are brought into contact in the presence of water. It has excellent biocompatibility and is widely used for pharmaceuticals and medical devices.
The polycations and polyanions are not particularly limited as long as they form a polyion complex by mixing in the presence of water, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
Examples of polycations include chitosan, aminated polysaccharide (cellulose, dextran, pullulan, curdlan, glucomannan aminated neutral polysaccharide), polyvinylamine, polyallylamine, polyethyleneimine, polyamine, One or more selected from the group consisting of polylysine, polyarginine, lysine-arginine copolymer, and derivatives or salts thereof can be used. Examples of the derivatives include acetylated substances, and examples of the salts include hydrochlorides and acetates.
Examples of polyanions include alginic acid, pectin, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dextran sulfate, carboxymethylated or succinylated polysaccharide (cellulose, dextran, starch, chitosan etc. carboxymethylated or succinylated), poly One or more selected from the group consisting of glutamic acid, polyaspartic acid, poly (meth) acrylic acid, polymaleic acid, inorganic polyphosphoric acid, polyphosmer, polysulfate, and derivatives or salts thereof can be used. Examples of the derivatives include those obtained by reacting a hydroxyl group with acetic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like, and those obtained by esterifying a part of the carboxyl group with ethylene glycol or propylene glycol. And alkali metal salts such as salts).
ポリイオンコンプレックスでコーティングする場合は、ポリイオンコンプレックスの層を２層以上重ねてもよい。ポリイオンコンプレックスの層は、例えば、束ねたマイクロファイバをポリカチオン類溶液とポリアニオン類溶液に交互に浸漬することによって形成することができる。例えば、アルギン酸とキトサンの層としてもよい。アルギン酸とキトサンの層は、生体内で徐々に解離するため特に好適である。
層の数は、移植用神経束に必要とされる柔軟性、強度や径に応じて、適宜決定すればよく、例えば、２層〜１５層、３層〜９層とすることができる。
また、ポリイオンコンプレックスによるコーティングと生体適合性ゲルによるコーティングを重ねてもよいし、その逆であってもよい。
When coating with a polyion complex, two or more layers of the polyion complex may be stacked. The layer of the polyion complex can be formed, for example, by immersing the bundled microfibers alternately in a polycation solution and a polyanion solution. For example, a layer of alginic acid and chitosan may be used. The layer of alginic acid and chitosan is particularly suitable because it gradually dissociates in vivo.
The number of layers may be appropriately determined according to the flexibility, strength, and diameter required for the nerve bundle for transplantation, and can be, for example, 2 to 15 layers or 3 to 9 layers.
Moreover, the coating by a polyion complex and the coating by a biocompatible gel may be piled up, and vice versa.
本発明に係る移植用神経束は、複数のマイクロファイバを一度に生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングしたものであってもよいし、少ない数のマイクロファイバを束ねて生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングしたものを２以上作製し、これらをさらに生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングしてバンドル化したものであってもよい。この場合、最初にマイクロファイバをコーティングする生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスと、一度コーティングされたマイクロファイバをさらに束ねる際に用いる生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスは、同じ種類であっても異なる種類であってもよい。
最初のコーティングに生体適合性ゲルを用い、次のコーティングにポリイオンコンプレックスを用いてもよいし、その逆であってもよい。
The nerve bundle for transplantation according to the present invention may be one in which a plurality of microfibers are coated with a biocompatible gel or polyion complex at one time, or a small number of microfibers are bundled to form a biocompatible gel or polyion complex. Two or more coated with the above may be prepared, and these may be further coated with a biocompatible gel or polyion complex to form a bundle. In this case, the biocompatible gel or polyion complex that is first coated with the microfibers and the biocompatible gel or polyion complex that is used to further bundle the microfibers once coated are the same or different types. May be.
A biocompatible gel may be used for the first coating and a polyion complex may be used for the next coating, or vice versa.
本発明に係る移植用神経束は、神経幹細胞等を含むマイクロファイバを少なくとも２本含んでいる限り、他の種類の細胞や細胞以外の物質を含むマイクロファイバを含んでいてもよい。他の細胞や細胞以外の物質は、神経の再生に悪影響を及ぼさない限り特に限定されず、各種幹細胞、分化した各種の細胞（筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞の生存・増殖・分化を誘導もしくは保持する細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞など）等）、タンパク質、脂質、糖類、核酸類、細胞外マトリクス等、成長因子、栄養因子、成長ホルモンなどが挙げられる。 As long as the nerve bundle for transplantation according to the present invention includes at least two microfibers including neural stem cells and the like, the nerve bundle may include other types of cells and microfibers including substances other than cells. Other cells and substances other than cells are not particularly limited as long as they do not adversely affect nerve regeneration, and various stem cells, various differentiated cells (muscle cells, fibroblasts, epithelial cells, nerve cell survival, proliferation, Examples include cells that induce or retain differentiation (for example, smooth muscle cells, skeletal muscle cells, etc.), proteins, lipids, saccharides, nucleic acids, extracellular matrix, growth factors, nutrient factors, growth hormones, and the like.
神経幹細胞等を含むマイクロファイバと種類の異なる細胞や物質を含むマイクロファイバは、任意の位置に配置することができる。
具体例として、以下が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
中心部に神経幹細胞等を含むマイクロファイバを配置し、その周囲に神経幹細胞等を機械的にサポートする細胞・物質を含むマイクロファイバを配置したもの；
中心部に神経幹細胞等を含むマイクロファイバを配置し、その周囲に神経幹細胞等に栄養を供給するための細胞・物質を含むマイクロファイバを配置したもの；
中心部に神経細胞を含むマイクロファイバを配置し、その周囲にグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、又はシュワン細胞）を含むマイクロファイバを配置したもの。
このように、複数種類のマイクロファイバを用いることにより、天然の神経束（図１右上参照）に似た構造を実現することが可能である。
A microfiber containing cells or substances of a different type from a microfiber containing a neural stem cell or the like can be placed at an arbitrary position.
Specific examples include, but are not limited to:
A microfiber containing neural stem cells, etc. is placed in the center, and a microfiber containing cells / materials that mechanically support neural stem cells, etc. is placed around it;
A microfiber containing a neural stem cell or the like placed in the center, and a microfiber containing a cell or substance for supplying nutrients to the neural stem cell or the like around the center;
A microfiber containing nerve cells is placed in the center, and a microfiber containing glial cells (astrocytes, oligodendrocytes, or Schwann cells) is placed around it.
Thus, by using a plurality of types of microfibers, it is possible to realize a structure similar to a natural nerve bundle (see the upper right in FIG. 1).
本発明に係る移植用神経束は、その長さを適宜切断して調節し、ピンセットなどで把持して患部に配置することができる。
なお、本発明に係る移植用神経束は、当然のことながら、移植のみならずin vitroの研究に使用されることもある。
The length of the nerve bundle for transplantation according to the present invention can be appropriately adjusted by cutting the length, and can be placed on the affected part by grasping with a tweezers.
The nerve bundle for transplantation according to the present invention may be used not only for transplantation but also for in vitro studies.
（コーティングされたマイクロファイバ）
本発明は、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングされた、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロファイバであって、
前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものである、マイクロファイバも包含する。
１本のマイクロファイバであっても、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによって、柔軟性及び強度が向上し、移植用又は研究用に好適に用いることができる。
コーティングされたマイクロファイバを説明するために用いられる用語のうち、上述した本発明に係る移植用神経束にも用いられた用語は、ここでも同義で用いられる。
(Coated microfiber)
The present invention is a microfiber containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage, coated with a biocompatible gel or polyion complex,
The microfiber also includes a microfiber in which a microgel fiber containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage is coated with a high-strength hydrogel.
Even a single microfiber is improved in flexibility and strength by being coated with a biocompatible gel or polyion complex, and can be suitably used for transplantation or research.
Of the terms used to describe the coated microfiber, the terms used in the above-described transplantation nerve bundle according to the present invention are used interchangeably here.
（移植用神経束の製造方法）
本発明に係る移植用神経束の製造方法は、神経幹細胞等を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロファイバを、２本以上作製する工程と、前記２本以上のマイクロファイバを束にして、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングする工程と、を含む。
(Method for producing nerve bundle for transplantation)
The method for producing a nerve bundle for transplantation according to the present invention comprises a step of producing two or more microfibers in which microgel fibers containing neural stem cells and the like are coated with a high-strength hydrogel, and the two or more microfibers. Bundling and coating with a biocompatible gel or polyion complex.
神経幹細胞等を内包するマイクロファイバを作製する工程は、上述のとおり、例えば、Lab Chip, 4, pp.576-580, 2004のFig. 1や特許文献１に記載された装置を用いて行うことができる。
マイクロファイバを作製する際、内部には神経幹細胞を入れてもよいし、所定の段階まで分化した神経幹細胞を入れてもよい。神経幹細胞を用いれば、マイクロファイバ内で効率よく増殖させることができ、細胞密度の高いマイクロファイバを作製することができる。神経幹細胞の増殖させる工程は、マイクロファイバごと公知の増殖培地やそれに順ずる培地（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）や上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）などの増殖因子を含む培地）に浸し、神経幹細胞が増殖できる条件で培養することによって行うことができる。
培養は、例えば、１日から１５日とすることができる。
As described above, the process for producing a microfiber containing neural stem cells or the like is performed using, for example, the apparatus described in Fig. 1 of Lab Chip, 4, pp. 576-580, 2004 or Patent Document 1. Can do.
When producing a microfiber, a neural stem cell may be put inside, and a neural stem cell differentiated to a predetermined stage may be put therein. If neural stem cells are used, they can be efficiently propagated in the microfiber, and a microfiber having a high cell density can be produced. The step of proliferating neural stem cells is immersed in a well-known growth medium and a medium corresponding thereto (for example, a medium containing growth factors such as fibroblast growth factor (FGF) and epidermal growth factor (EGF)) together with the microfiber, It can be performed by culturing under conditions that allow neural stem cells to proliferate.
The culture can be performed for 1 to 15 days, for example.
神経幹細胞を入れた場合、マイクロファイバを束にする前に、マイクロファイバ内で神経幹細胞を所定の段階まで分化させてもよい。神経幹細胞を分化させる工程は、例えば、分化用培地にマイクロファイバごと浸漬させることによって行うことができる。分化用の培地は、当業者が適宜調製することができる。
例えば、神経幹細胞を増殖させる間は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）や上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）などの増殖因子を含む培地を用い、これらの増殖因子を培地から除いて、ウシ胎児血清を加えることによって、神経幹細胞を分化させることが可能である。
When neural stem cells are inserted, the neural stem cells may be differentiated to a predetermined stage in the microfiber before the microfiber is bundled. The step of differentiating neural stem cells can be performed, for example, by immersing the microfibers together in a differentiation medium. A culture medium for differentiation can be appropriately prepared by those skilled in the art.
For example, during the growth of neural stem cells, a medium containing growth factors such as fibroblast growth factor (FGF) and epidermal growth factor (EGF) is used, these growth factors are removed from the medium, and fetal bovine serum is removed. In addition, neural stem cells can be differentiated.
神経幹細胞が、神経細胞、アストロサイト、又はオリゴデンドロサイト、シュワン細胞に選択的に分化するように制御することもできる。分化の制御は公知の方法等に従って当業者が適宜行うことができるが、例えば、培地に白血病抑制因子（ＬＩＦ）やＢＭＰ２を加えることによりアストロサイトへの分化が誘導される一方、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）は神経細胞への分化を抑制すること、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＶＰＡ）は神経細胞への分化を促進することなどが知られている。市販の分化用培地を使用してもよい。
２以上のマイクロファイバのうち、少なくとも一部のマイクロファイバ内の神経幹細胞を他のマイクロファイバ内の細胞とは異なる細胞に分化させてもよい。例えば一部を神経細胞に、一部をグリア細胞に分化させることができる。
It is also possible to control neural stem cells to selectively differentiate into neural cells, astrocytes, or oligodendrocytes, Schwann cells. Differentiation can be controlled appropriately by those skilled in the art according to known methods. For example, differentiation to astrocytes is induced by adding leukemia inhibitory factor (LIF) or BMP2 to the medium, while osteogenic protein 2 It is known that (BMP2) suppresses differentiation into nerve cells, and a histone deacetylase inhibitor (VPA) promotes differentiation into nerve cells. A commercially available differentiation medium may be used.
Of two or more microfibers, at least some of the neural stem cells in the microfibers may be differentiated into cells different from the cells in other microfibers. For example, a part can be differentiated into a nerve cell and a part can be differentiated into a glial cell.
２本以上のマイクロファイバを束にする工程では、神経幹細胞等を含むマイクロファイバに加えて、神経幹細胞等以外の細胞を含むマイクロファイバや、細胞以外の物質を含むマイクロファイバを、共に束ねてもよい。神経幹細胞等以外の細胞や、細胞以外の物質を含むマイクロファイバも、神経幹細胞等を含むマイクロファイバと同様の方法で作製することができるが、別の方法で作製してもよい。
神経幹細胞以外の幹細胞を含むマイクロファイバを用いる場合、同様に公知の方法に従って所定の細胞に分化させることができる。
In the step of bundling two or more microfibers, in addition to microfibers containing neural stem cells and the like, microfibers containing cells other than neural stem cells and microfibers containing substances other than cells may be bundled together. Good. Cells other than neural stem cells and microfibers containing substances other than cells can be produced by the same method as microfibers containing neural stem cells and the like, but they may be produced by other methods.
When using microfibers containing stem cells other than neural stem cells, they can be differentiated into predetermined cells according to a known method.
２本以上のマイクロファイバを束にする工程は、どのように行ってもよいが、例えば実施例に示すように、長いマイクロファイバを作製し、２本のピラー（杭）に巻きつけていく方法や、長いマイクロファイバを溶液中に浸し、その一点をガラス管等で持ち上げて２本に折り畳み、さらに一点を持ち上げて４本に折り畳み…という作業を繰り返して、折りたたんでいく方法を用いることが可能である。 The step of bundling two or more microfibers may be performed in any way. For example, as shown in the embodiment, a method of producing a long microfiber and winding it around two pillars (stakes) Alternatively, it is possible to use a method in which a long microfiber is immersed in a solution, one point is lifted with a glass tube, etc., folded into two, and then another point is lifted and folded into four ... It is.
種類の異なるマイクロファイバを束にする場合、各マイクロファイバの配置は自由に決定することができる。例えば、神経幹細胞等を含むマイクロファイバを中心に配置し、その周囲に他の細胞や細胞以外の物質を含むマイクロファイバを配置してもよいし、神経幹細胞等を含むマイクロファイバと他の細胞や細胞以外の物質を含むマイクロファイバが交じり合うように配置してもよい。 When different types of microfibers are bundled, the arrangement of each microfiber can be freely determined. For example, a microfiber containing neural stem cells or the like may be arranged in the center, and a microfiber containing other cells or substances other than cells may be arranged around the microfiber. You may arrange | position so that the microfiber containing substances other than a cell may cross.
例えば、神経細胞を含むマイクロファイバを中心に配置し、グリア細胞を含むマイクロファイバをその周囲に配置して束ねてもよい。このようなバンドルを作製する方法の一例を説明する。
まず、神経幹細胞を含む２本の長いマイクロファイバを作製し、１本の神経幹細胞を神経細胞に、もう１本の神経幹細胞をグリア細胞に分化させる。
その後上記のとおりそれぞれのマイクロファイバから適当な束を作り、神経細胞を含むマイクロファイバの束の周りを、グリア細胞を含むマイクロファイバの束が囲むように配置する。
このように、本発明に係る移植用神経束の製造方法によれば、神経細胞等に加え、任意の種類の細胞や細胞以外の物質を含むマイクロファイバを、任意の位置に配して束にすることが可能である。
For example, a microfiber containing a nerve cell may be arranged at the center, and a microfiber containing a glial cell may be arranged around and bundled. An example of a method for producing such a bundle will be described.
First, two long microfibers containing neural stem cells are prepared, and one neural stem cell is differentiated into a nerve cell, and the other neural stem cell is differentiated into a glial cell.
Thereafter, as described above, an appropriate bundle is formed from each microfiber, and the bundle of microfibers including nerve cells is disposed around the bundle of microfibers including nerve cells.
As described above, according to the method for manufacturing a nerve bundle for transplantation according to the present invention, in addition to nerve cells and the like, microfibers containing any kind of cells and substances other than cells are arranged at any position into a bundle. Is possible.
束にしたマイクロファイバを生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングする工程は、当業者が公知の方法に従って行うことができる。例えば、アテロコラーゲンゲルは温度によって流動性が変化するので、流動性の高い低温のアテロコラーゲン溶液にマイクロファイバの束を浸漬し、温度を上昇させてインキュベートすることでコラーゲンをゲル化し、マイクロファイバをコーティングすることができる。 The step of coating the bundled microfibers with a biocompatible gel or polyion complex can be performed according to methods known to those skilled in the art. For example, the flowability of atelocollagen gel changes depending on the temperature, so that the collagen is gelled by immersing the bundle of microfibers in a low temperature atelocollagen solution with high fluidity, raising the temperature, and coating the microfibers. be able to.
束にしたマイクロファイバを、１層以上のポリイオンコンプレックスでコーティングする場合、ポリカチオン溶液とポリアニオン溶液を用意する。まずいずれかの溶液にマイクロファイバの束を浸漬し、必要に応じて生理食塩水等で洗浄後、もう一方の溶液にマイクロファイバを浸漬する方法によって１層のポリイオンコンプレックスが形成される。必要に応じて洗浄工程を入れながら、これらの工程を繰り返すことによって複数層のポリイオンコンプレックスでコーティングすることができる。
マイクロファイバの束をポリカチオン溶液又はポリアニオン溶液に浸漬するのではなく、マイクロファイバの束の両端を保持して、ピペットなどで溶液を上から注いでコーティングしてもよい。
When coating the bundled microfibers with one or more polyion complexes, a polycation solution and a polyanion solution are prepared. First, a single layer of polyion complex is formed by dipping a bundle of microfibers in one of the solutions, washing with physiological saline if necessary, and then dipping the microfibers in the other solution. It is possible to coat with a plurality of layers of polyion complex by repeating these steps with a washing step if necessary.
Instead of immersing the microfiber bundle in the polycation solution or polyanion solution, the both ends of the microfiber bundle may be held and the solution may be poured from above with a pipette or the like for coating.
生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでバンドル化された移植用神経束は、培養液中で保存することが可能である。移植時に、移植部位にあわせて適当な長さに切断して用いることができる。実施例に示されるとおり、本発明に係る移植用神経束は、内部で細胞が増殖してもその側面から細胞が漏出することがなく、端部のみから細胞が外に延びていくため、断裂した神経と効率よく相互作用し、神経の損傷部を再生させることが可能である。従って、適当な長さに切断した後、一定期間培養し、移植用神経束のマイクロファイバの端部から増殖した細胞が突出するようになってから移植してもよい。このように、マイクロファイバの端部から増殖した神経細胞等が突出した移植用神経束も、本発明に包含される。 Transplanted nerve bundles bundled with biocompatible gels or polyion complexes can be stored in culture. At the time of transplantation, it can be cut into an appropriate length according to the transplant site. As shown in the examples, the nerve bundle for transplantation according to the present invention does not leak from the side surface even if the cells proliferate inside, and the cells extend outside only from the end portion. It is possible to efficiently interact with the damaged nerve and regenerate the damaged part of the nerve. Therefore, after cutting to a suitable length, the cells may be cultured for a certain period of time, and transplanted after the proliferated cells protrude from the end of the microfiber of the nerve bundle for transplantation. Thus, a nerve bundle for transplantation in which nerve cells and the like proliferated from the end portion of the microfiber are also included in the present invention.
本発明に係る移植用神経束の製造方法の一例の概略を図１に示す。
神経幹細胞（NCSs）を含むマイクロファイバを作製し、マイクロファイバ内の神経幹細胞をグリア細胞に分化させたものと、神経細胞に分化させたものと用意する。
神経細胞を含むマイクロファイバを中心に、グリア細胞を含むマイクロファイバを周囲に配置することにより、右上に示されるような生体内の神経束と同様の構成の神経束を得ることができる。
An outline of an example of a method for producing a nerve bundle for transplantation according to the present invention is shown in FIG.
Microfibers containing neural stem cells (NCSs) are prepared, and neural stem cells in the microfiber are differentiated into glial cells, and those differentiated into neural cells are prepared.
By placing microfibers including glial cells around a microfiber including nerve cells, a nerve bundle having the same configuration as the nerve bundle in the living body as shown in the upper right can be obtained.
（移植片）
本発明は、細胞を含むマイクロファイバが２本以上バンドル化された移植片も包含する。ここで、マイクロファイバは、細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものを意味し、２本以上のマイクロゲルファイバは、ポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている。
本発明に係る移植片を説明するために用いられる用語のうち、上述した本発明に係る移植用神経束にも用いられた用語は、ここでも同義で用いられる。
本発明に移植片に含まれる細胞はあらゆる細胞とすることができる。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞等の各種幹細胞や、骨格筋細胞、心筋細胞などの筋細胞、大脳皮質細胞などの神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、肝細胞、膵β細胞、皮膚細胞等の各種の分化した細胞が挙げられるが、これらに限定されない。１種以上の細胞を組み合わせてもよい。
本発明に係る移植片は、本発明に係る移植用神経束のうち、ポリイオンコンプレックスでコーティングしたものと同様の方法で作製することができる。
(Graft)
The present invention also includes a graft in which two or more microfibers containing cells are bundled. Here, the microfiber means a microgel fiber containing cells coated with a high-strength hydrogel, and two or more microgel fibers are bundled by coating with a polyion complex.
Of the terms used to describe the graft according to the present invention, the terms used in the above-described nerve bundle for transplantation according to the present invention are used interchangeably herein.
The cells included in the graft according to the present invention can be any cells. For example, various stem cells such as ES cells, iPS cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, reproductive stem cells, muscle cells such as skeletal muscle cells and cardiomyocytes, neuronal cells such as cerebral cortex cells, fibroblasts, Examples include, but are not limited to, various types of differentiated cells such as epithelial cells, hepatocytes, pancreatic β cells, and skin cells. One or more types of cells may be combined.
The graft according to the present invention can be produced by the same method as that of the nerve bundle for transplant according to the present invention coated with a polyion complex.
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。 The disclosures of all patent and non-patent documents cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, this invention is not limited to this at all. Those skilled in the art can change the present invention into various modes without departing from the meaning of the present invention, and such changes are also included in the scope of the present invention.
材料と方法
［材料］
塩化カルシウム、DMSO、塩化カリウム、及びグルコースはKanto Chemicals社から、水酸化ナトリウム、HEPES、塩化ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム（Na−alginate、80−120cP）はWako Pure Chemical Industries社から、スクロースはNacalai tesque社から、ポリエチレンイミン及びDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水（PBS（−）、D1408）はSigma-Aldrich Japan社から、それぞれ購入し、精製せずに使用した。水はミリポア精製システムにより、18MΩまで脱イオン化した。
細胞培養実験に用いた市販の材料は以下のとおりである。Neurobasal-A（10888、GIBCO）、B27 neuronal supplement（12587010、GIBCO）、及びTrypLE Select（12563）はInvitrogen社から、ウシ胎児血清（FBS、S1650）と、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（antibiotics, AB, P4333又はP4458）は、それぞれJapan Bioserum社とSigma-Aldrich Japan社から購入した。塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、AF-100-18B）とヒト上皮細胞増殖因子（hEGF）は、Peprotech社から購入した。
Materials and methods [Materials]
Calcium chloride, DMSO, potassium chloride, and glucose are from Kanto Chemicals, sodium hydroxide, HEPES, sodium chloride, and sodium alginate (Na-alginate, 80-120 cP) are from Wako Pure Chemical Industries, and sucrose is Nacalai tesque. Polyethyleneimine and Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS (−), D1408) were purchased from Sigma-Aldrich Japan and used without purification. Water was deionized to 18 MΩ by Millipore purification system.
Commercially available materials used for cell culture experiments are as follows. Neurobasal-A (10888, GIBCO), B27 neuronal supplement (12587010, GIBCO), and TrypLE Select (12563) were obtained from Invitrogen, fetal bovine serum (FBS, S1650) and penicillin-streptomycin solution (antibiotics, AB, P4333 or P4458) was purchased from Japan Bioserum and Sigma-Aldrich Japan, respectively. Basic fibroblast growth factor (bFGF, AF-100-18B) and human epidermal growth factor (hEGF) were purchased from Peprotech.
［二重同軸マイクロ流体装置によるマイクロファイバの作製］
二重同軸マイクロ流体装置（図１１参照）によるマイクロファイバの作製は、Onoeらの方法（22nd IEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS), 2010, pp.248-251.；Fourteenth International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Science (microTAS), 2010, pp.629-631.）に従った。
内側のマイクロチャネル用に、ガラスキャピラリチューブ（外径1mm、内径0.6mm、G-1、Narishige社）を、puller（PC-10、Narishige社）で引き伸ばし、直径約230μmとして用いた。外側の流路用に、長方形のガラスチューブ（外径1.4mm、内径1mm、Vitrocom社）を使用した。これらのガラスキャピラリチューブは、ステレオリソグラフィー法で作製されたコネクター（Perfactory、envisionTEC、Marl社）で取り付けた。注入口と流出口は、テフロン(登録商標)チューブ（内径0.5mm）を用いてガスタイトシリンジに接続した。
[Fabrication of microfibers using a double coaxial microfluidic device]
Fabrication of microfibers using a double coaxial microfluidic device (see Fig. 11) is based on the method of Onoe et al. (22nd IEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS), 2010, pp.248-251 .; Fourteenth International Conference on Miniaturized). Systems for Chemistry and Life Science (microTAS), 2010, pp.629-631.).
For the inner microchannel, a glass capillary tube (outer diameter 1 mm, inner diameter 0.6 mm, G-1, Narishige) was stretched with puller (PC-10, Narishige) and used as a diameter of about 230 μm. A rectangular glass tube (outer diameter 1.4 mm, inner diameter 1 mm, Vitrocom) was used for the outer flow path. These glass capillary tubes were attached with connectors (Perfactory, envisionTEC, Marl) made by stereolithography. The inlet and outlet were connected to a gas tight syringe using a Teflon (registered trademark) tube (inner diameter 0.5 mm).
［マウス神経幹細胞の培養］
解剖顕微鏡下で、ICRマウス（Sankyo Labo Service Corporation社）の脳から線条体組織を切り出した（胎生期14.5日目）。Raynoldsらの方法（J. Neurosci., vol. 12, pp.4565-4574, 1992）に従って、線条体組織から、神経幹細胞のシングルセルの懸濁液を調製した。血球計とトリパンブルーを使用して、全細胞数と生存率を測定した。細胞懸濁液は、増殖培地（Neurobasal-A/B27/bFGF/hEGF）で適当な濃度に調節し、37℃の水蒸気飽和5％CO2環境で培養した。実験には、第二〜三代の継代培養の神経幹細胞を用いた。
[Culture of mouse neural stem cells]
Under the dissecting microscope, the striatum tissue was excised from the brain of an ICR mouse (Sankyo Labo Service Corporation) (embryonic day 14.5). A single cell suspension of neural stem cells was prepared from striatal tissue according to the method of Raynolds et al. (J. Neurosci., Vol. 12, pp. 4565-4574, 1992). Total cell count and viability were measured using a hemacytometer and trypan blue. The cell suspension was adjusted to an appropriate concentration with a growth medium (Neurobasal-A / B27 / bFGF / hEGF) and cultured in a steam saturated 5% CO 2 environment at 37 ° C. In the experiment, neural stem cells of the second to third passages were used.
［神経幹細胞を含むマイクロファイバの作製］
コア・シェル構造のマイクロファイバを作製するために、以下の3種類の溶液を調製した（図１１参照）。
(1) アテロコラーゲンに神経幹細胞を1-2×108 cells/ml懸濁した溶液（core stream用）
(2) アルギン酸ナトリウム溶液（shell stream用）
(3) 塩化カルシウム溶液（sheath stream用）
(1)のアテロコラーゲンは、0.2％のウシ皮膚ペプシン可溶化I型アテロコラーゲン（AtelCell（商標）、DME-02、アテロコラーゲン、KOKEN社）を用いた。
組み立てた二重同軸マイクロ流体装置は、流速を精確に制御するためにシリンジポンプ（KDS210、KD Scientific社）に接続した。作られたマイクロファイバが絡まるのを防ぐため、装置を垂直な壁に取り付け、流れの方向が重力方向となるように設定した。装置は、汚染を防ぐためクリーンフード内に置いた。殺菌のため、装置に溶液をローディングする前に、装置とすべてのチューブを70％エタノールで満たした。
作られたコア・シェル構造のマイクロファイバは、直ちに培養液で満たした培養ディッシュに移した。37℃で15分以上インキュベートし、アテロコラーゲンゾルをゲル化した。得られたマイクロファイバ（以下、「NSCマイクロファイバ」と呼ぶ）は、37℃の水蒸気飽和5％CO2環境で培養した。
神経幹細胞が増殖し、マイクロファイバ中の空間が満たされるまで、3−10日培養した。
[Production of microfibers containing neural stem cells]
In order to produce a core-shell microfiber, the following three types of solutions were prepared (see FIG. 11).
(1) A solution of neural stem cells suspended at 1-2 × 10 8 cells / ml in atelocollagen (for core stream)
(2) Sodium alginate solution (for shell stream)
(3) Calcium chloride solution (for heath stream)
As the atelocollagen of (1), 0.2% bovine skin pepsin-solubilized type I atelocollagen (AtelCell ™, DME-02, atelocollagen, KOKEN) was used.
The assembled dual coaxial microfluidic device was connected to a syringe pump (KDS210, KD Scientific) to precisely control the flow rate. In order to prevent entanglement of the produced microfiber, the device was attached to a vertical wall, and the flow direction was set to be the direction of gravity. The device was placed in a clean hood to prevent contamination. For sterilization, the device and all tubes were filled with 70% ethanol before loading the solution into the device.
The produced core / shell microfiber was immediately transferred to a culture dish filled with a culture solution. Incubated at 37 ° C for 15 minutes or longer to gel the atelocollagen sol. The obtained microfiber (hereinafter referred to as “NSC microfiber”) was cultured in a steam saturated 5% CO 2 environment at 37 ° C.
The cells were cultured for 3-10 days until neural stem cells proliferated and the space in the microfiber was filled.
［NSCマイクロファイバの分化］
神経幹細胞が十分に増殖した後、NSCマイクロファイバを、bFGF、hEGF及びB27を含まない増殖培地に15分浸してリンスした。
続いて、NSCマイクロファイバを、分化培地に浸漬し、37℃の水蒸気飽和5％CO2環境で培養して、神経幹細胞を神経細胞とグリア細胞に分化させた。神経細胞への分化には（Neurobasal A/B27（+）、1％FBS（+）、bFGF（-）、及びhEGF（-））培地を、グリア細胞への分化には（Neurobasal A/10％FBS（+）、bFGF（-）、及びhEGF（-））培地を用いた。
[NSC microfiber differentiation]
After neural stem cells were sufficiently grown, NSC microfibers were rinsed by immersing in a growth medium containing no bFGF, hEGF and B27 for 15 minutes.
Subsequently, NSC microfibers were immersed in a differentiation medium and cultured in a steam saturated 5% CO 2 environment at 37 ° C. to differentiate neural stem cells into neurons and glial cells. For neuronal differentiation (Neurobasal A / B27 (+), 1% FBS (+), bFGF (-), and hEGF (-)) medium, for differentiation into glial cells (Neurobasal A / 10% FBS (+), bFGF (-), and hEGF (-)) media were used.
［免疫組織化学染色］
NSCマイクロファイバを、4％のパラホルムアルデヒド（Muto Pure Chemicals社）で1時間固定し、PBS（-）中の0.1%のTriton-X（A16046、Alfa Aesar社）で細胞膜を透過性にした後、非特異的結合を除くために、PBS（-）中の1％のウシ血清アルブミン（BSA、A7906、Sigma-Aldrich社）で90分ブロッキングした。この段階では、NSCマイクロファイバのアルギン酸シェルは、アルギン酸カルシウムとPBS（-）間のイオン交換により完全に溶解した。
続いて、NSCマイクロファイバを、β−tubulin（神経細胞マーカー、1：500、T8578、Sigma-Aldrich社）、又はnestin（神経幹細胞マーカー、1：200、mab353、Millipore社）に対するマウスモノクローナル抗体と、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP、グリア細胞マーカー）に対するウサギモノクローナル抗体と、4℃で一晩反応させた。
PBS（-）で2回リンスした後、NSCマイクロファイバを、抗マウスIgG−AlexaFluor488（A11001、Invitrogen社）と、抗ウサギIgG−AlexaFluor568（A11011、Invitrogen社）と共に4℃で一晩処理した。
続いて、DPBS（-）で2回リンスし、Hoechst 33342（1：1000、H3570、Invitrogen社）で処理して核を染色した。その後、NSCマイクロファイバを蛍光顕微鏡（Axio Observer、Zeiss社）と共焦点レーザ走査顕微鏡（LSM710、Zeiss社）で観察した。
[Immunohistochemical staining]
NSC microfibers were fixed with 4% paraformaldehyde (Muto Pure Chemicals) for 1 hour, and the cell membrane was permeable with 0.1% Triton-X (A16046, Alfa Aesar) in PBS (-). To remove non-specific binding, blocking was performed with 1% bovine serum albumin (BSA, A7906, Sigma-Aldrich) in PBS (-) for 90 minutes. At this stage, the NSC microfiber alginate shell was completely dissolved by ion exchange between calcium alginate and PBS (-).
Subsequently, NSC microfibers, mouse monoclonal antibody against β-tubulin (neural cell marker, 1: 500, T8578, Sigma-Aldrich), or nestin (neural stem cell marker, 1: 200, mab353, Millipore), The mixture was reacted with a rabbit monoclonal antibody against glial fibrillary acidic protein (GFAP, glial cell marker) at 4 ° C. overnight.
After rinsing twice with PBS (−), NSC microfibers were treated overnight at 4 ° C. with anti-mouse IgG-AlexaFluor488 (A11001, Invitrogen) and anti-rabbit IgG-AlexaFluor568 (A11011, Invitrogen).
Subsequently, it was rinsed twice with DPBS (−) and treated with Hoechst 33342 (1: 1000, H3570, Invitrogen) to stain the nucleus. Thereafter, the NSC microfiber was observed with a fluorescence microscope (Axio Observer, Zeiss) and a confocal laser scanning microscope (LSM710, Zeiss).
［マイクロファイバのバンドル化（１）］
マイクロファイバを、図２（ａ）に示すようにターンテーブル上に2本のピラー（杭）を立てたディッシュを置き、ターンテーブルを回転させて２本のピラー（杭）に巻きつけるようにして束にした。
種類の違うマイクロファイバを、ピラー上の異なる位置に巻きつけることにより、束におけるそれぞれのマイクロファイバの位置を任意に制御することができる（図２（ｂ））。
得られた束をコラーゲンでコーティングしてバンドル化した。バンドル化の方法は、束にしたマイクロファイバをシャーレ上に移動し、アテロコラーゲン（0.2％のウシ皮膚ペプシン可溶化I型アテロコラーゲン（AtelCell（商標）、DME-02、アテロコラーゲン、KOKEN社））で、ピペットなどを用いて束全体を覆うように滴下した。37度CO2インキュベータで3〜5分ほど保温し、その後培地を加え培養した。
[Microfiber bundling (1)]
Place a dish with two pillars (stakes) on the turntable as shown in Fig. 2 (a), rotate the turntable and wind it around the two pillars (stakes). I made a bunch.
By winding different types of microfibers at different positions on the pillar, the position of each microfiber in the bundle can be arbitrarily controlled (FIG. 2B).
The obtained bundle was coated with collagen to form a bundle. To bundle, move the bundled microfibers onto a petri dish and pipette with atelocollagen (0.2% bovine skin pepsin solubilized type I atelocollagen (AtelCell ™, DME-02, atelocollagen, KOKEN)) It was dripped so that the whole bundle might be covered using etc. It was kept warm in a 37 ° C. CO 2 incubator for about 3 to 5 minutes, and then the medium was added and cultured.
［マイクロファイバのバンドル化（２）］
ポリカチオン溶液として、2％酢酸0.3%キトサンを、ポリアニオン溶液として、生理食塩水中の0.3%アルギン酸を用意した。
マイクロファイバを培地中に浸し、ガラス管を用いて一点をすくい上げて2本の束にし、2本の束の一点をすくいあげて4本の束にし…という作業を繰り返し、2〜48本程度の束を作った。
得られたマイクロファイバの束の両端をガラス管2本で保持し、ピペットマンでファイバ上にポリカチオン溶液→生理食塩水→ポリアニオン溶液→生理食塩水を注いで1ターン（1層）とし、3〜9層のコーティングを行ってバンドル化した。
また、12本程度の束を作製してバンドル化した後、バンドル化された神経束を複数本含む束をさらに作製し、キトサンとアルギン酸でコーティングし、より本数の多いバンドルも作製した。
[Microfiber bundling (2)]
2% acetic acid 0.3% chitosan was prepared as a polycation solution, and 0.3% alginic acid in physiological saline was prepared as a polyanion solution.
Immerse the microfibers in the medium, scoop up one point using a glass tube into two bundles, scoop up one point from the two bundles into four bundles, and so on. made.
Hold both ends of the resulting microfiber bundle with two glass tubes, and use Pipetman to pour polycation solution → saline solution → polyanion solution → saline solution into one turn (1 layer). Nine layers of coating were applied to form a bundle.
In addition, about 12 bundles were produced and bundled, and then a bundle containing a plurality of bundled nerve bundles was further produced and coated with chitosan and alginic acid to produce more bundles.
結果
［マイクロファイバのバンドル化］
ピラーに巻きつける方法で、2種類のマイクロファイバの配置を変えて束にし、コラーゲンゲルでバンドル化した移植用神経束を図２（ｃ）に示す。
図２（ｃ）上段の例では、それぞれ複数本の第1のファイバと第2のファイバを、平行に隣接するように配置した。得られた神経束の蛍光画像の結果を図３左に示す。2種類のマイクロファイバを示す蛍光強度から、それぞれ複数本の第1のファイバと第2のファイバが、隣接するようにバンドル化されたことが確認された。
図２（ｃ）中段の例では、複数本の第1のファイバの周囲を、より数の多い第2のファイバが囲むように配置した。得られた神経束の蛍光画像の結果を図３右に示す。2種類のマイクロファイバを示す蛍光強度から、第1のファイバが中心に配置され、第2のファイバがその周囲を囲むように配置されていることが確認された。
Result [bundle microfiber]
FIG. 2 (c) shows a nerve bundle for transplantation in which the arrangement of two types of microfibers is changed into a bundle by wrapping around a pillar and bundled with a collagen gel.
In the example in the upper part of FIG. 2C, a plurality of first fibers and second fibers are arranged so as to be adjacent in parallel. The result of the fluorescence image of the obtained nerve bundle is shown on the left of FIG. From the fluorescence intensities indicating two types of microfibers, it was confirmed that a plurality of first fibers and second fibers were bundled so as to be adjacent to each other.
In the middle example of FIG. 2C, the plurality of first fibers are arranged so as to surround the second fibers having a larger number. The result of the fluorescence image of the obtained nerve bundle is shown on the right side of FIG. From the fluorescence intensities indicating two types of microfibers, it was confirmed that the first fiber was arranged at the center and the second fiber was arranged so as to surround the periphery.
［マイクロファイバ内での神経幹細胞の増殖］
神経幹細胞を含むマイクロファイバを、bFGF及びhEGFを含む増殖培地で培養した結果を図４に示す。
図４（ａ）及び（ｂ）に示されるとおり、6日間の培養で、生きた神経幹細胞によってファイバ内が満たされた。図４（ｃ）に、このようなマイクロファイバで作製した神経束を示す。細胞密度が十分に高いこと確認された。
図４（ｄ）右には、左に示すＡ−Ｂ線に沿った断面における蛍光強度の変化を示す。
[Proliferation of neural stem cells in microfiber]
The results of culturing microfibers containing neural stem cells in a growth medium containing bFGF and hEGF are shown in FIG.
As shown in FIGS. 4A and 4B, the fiber was filled with living neural stem cells after 6 days of culture. FIG. 4C shows a nerve bundle made of such a microfiber. It was confirmed that the cell density was sufficiently high.
The right side of FIG. 4 (d) shows a change in fluorescence intensity in a cross section along the line AB shown on the left.
［マイクロファイバ内での神経幹細胞の分化］
マイクロファイバ内で、神経幹細胞を神経細胞又はグリア細胞に分化させた8日目の共焦点レーザ走査顕微鏡による位相差像を図５（ａ）、（ｂ）に、免疫細胞化学染色像を（ｃ）、（ｄ）に示す。
それぞれ神経細胞とグリア細胞細胞に分化していることが確認された。
[Neural stem cell differentiation in microfiber]
Phase contrast images obtained by confocal laser scanning microscopy on day 8 in which neural stem cells are differentiated into nerve cells or glial cells in a microfiber are shown in FIGS. 5 (a) and 5 (b), and immunocytochemical staining images are shown in (c). ) And (d).
It was confirmed that the cells differentiated into nerve cells and glial cells, respectively.
［マイクロファイバのバンドル化］
マイクロファイバ内の神経幹細胞を、神経細胞とグリア細胞に分化させ、神経細胞を含むマイクロファイバを中心に配置し、グリア細胞を含むマイクロファイバをその周囲に配置してバンドル化した例を図６に示す。
図６（ａ）、（ｂ）は顕微鏡による位相差画像、（ｃ）はCell Tracker（商標）による、解析結果を示す。神経細胞を含むマイクロファイバが、表面を、グリア細胞を含むマイクロファイバに覆われているのが確認された。
[Microfiber bundling]
FIG. 6 shows an example in which neural stem cells in microfibers are differentiated into nerve cells and glial cells, and microfibers containing nerve cells are arranged at the center, and microfibers containing glial cells are arranged around them to form a bundle. Show.
6 (a) and 6 (b) show a phase difference image obtained by a microscope, and FIG. 6 (c) shows an analysis result obtained by Cell Tracker (trademark). It was confirmed that the surface of the microfiber containing nerve cells was covered with the microfiber containing glial cells.
［コーティングの層の数の検討］
図７〜９に、コーティング方法を変えて作製した移植用神経束を観察した結果を示す。
図７左は、12本のマイクロファイバを、アルギン酸とキトサンの層3層でコーティングしたもの、右は、左のバンドルを4本束ねてさらにアルギン酸とキトサンの層3層でコーティングしたものである（計48本のマイクロファイバ）。
図８左は、12本のマイクロファイバを、アルギン酸とキトサンの層6層でコーティングしたもの、右は、左のバンドルを4本束ねてさらにアルギン酸とキトサンの層6層でコーティングしたものである（計48本のマイクロファイバ）。
図９左は、12本のマイクロファイバを、アルギン酸とキトサンの層9層でコーティングしたもの、右は、左のバンドルを4本束ねてさらにアルギン酸とキトサンの層9層でコーティングしたものである（計48本のマイクロファイバ）。
いずれも移植に適した柔軟性と強度を有するバンドルが得られた。
各図の下2つは、コーティング後3日目に観察した様子である。いずれもマイクロファイバが平行に並んでバンドル化されており、好適な柔軟性と強度を有していた。このうち上段は、コーティング後0日にバンドルの一部をピンセットで把持したものである。ピンセットで把持したときに内部の細胞に若干のダメージを受けるものも見られたが、特に12本のマイクロファイバを9層コーティングしたものはほとんど細胞へのダメージがなかった。
[Examination of the number of coating layers]
The result of having observed the nerve bundle for transplant produced by changing a coating method in FIGS. 7-9 is shown.
The left side of FIG. 7 shows 12 microfibers coated with 3 layers of alginic acid and chitosan, and the right side shows 4 bundles of the left bundle and further coated with 3 layers of alginic acid and chitosan. 48 microfibers in total).
The left side of FIG. 8 shows 12 microfibers coated with 6 layers of alginic acid and chitosan, and the right side shows 4 left bundles bundled with 6 layers of alginic acid and chitosan. 48 microfibers in total).
The left side of FIG. 9 shows 12 microfibers coated with 9 layers of alginic acid and chitosan, and the right side shows 4 bundles of the left bundle and further coated with 9 layers of alginic acid and chitosan. 48 microfibers in total).
In all cases, bundles having flexibility and strength suitable for transplantation were obtained.
The bottom two of each figure show the observation on the third day after coating. In both cases, microfibers were bundled in parallel, and had suitable flexibility and strength. Of these, the upper row is one in which a part of the bundle is gripped with tweezers on the 0th day after coating. Although some cells were slightly damaged when grasped with tweezers, the cells coated with 9 layers of 12 microfibers were hardly damaged.
［バンドル化後の培養］
図１０に、バンドル化後の培養による細胞増殖を示す。
12本のNSCマイクロファイバをアルギン酸とキトサンの層3層でコーティングし、さらにこのバンドルを4本まとめてアルギン酸とキトサンの層3層でコーティングし、計48本のマイクロファイバをバンドル化した（上段）。
バンドル化後、培地にEGFとFGFを添加して培養した。1日後の様子を下段に示す。増殖した神経幹細胞が増殖し、マイクロファイバの端部から出てきているのが観察された。神経幹細胞がバンドル側面から漏出せず、端部からのみ延びていくことで、移植部の断裂した神経と効率よく相互作用し、神経の再生を促すものと考えられる。
[Culture after bundling]
FIG. 10 shows cell proliferation by culture after bundling.
12 NSC microfibers were coated with 3 layers of alginic acid and chitosan, and 4 bundles were coated with 3 layers of alginic acid and chitosan to bundle a total of 48 microfibers (top) .
After bundling, EGF and FGF were added to the medium and cultured. The state after one day is shown below. It was observed that the proliferated neural stem cells proliferated and emerged from the end of the microfiber. It is considered that neural stem cells do not leak from the side of the bundle and extend only from the end portion, thereby efficiently interacting with the torn nerve in the transplanted portion and promoting nerve regeneration.
Claims (21)
前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、
前記２本以上のマイクロゲルファイバは、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている、移植用神経束。 A nerve bundle for transplantation in which two or more microfibers containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage are bundled,
The microfiber is a microgel fiber containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage and coated with a high-strength hydrogel,
The nerve bundle for transplantation, wherein the two or more microgel fibers are bundled by coating with a biocompatible gel or polyion complex.
前記マイクロファイバは、神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものである、マイクロファイバ。 A microfiber containing neural stem cells or cells differentiated to a predetermined stage, coated with a biocompatible gel or polyion complex,
The microfiber is a microfiber in which a microgel fiber containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage is coated with a high-strength hydrogel.
神経幹細胞又は神経幹細胞を所定の段階まで分化させた細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロファイバを、２本以上作製する工程と、
前記２本以上のマイクロファイバを束にして、生体適合性ゲル又はポリイオンコンプレックスでコーティングする工程と、
を含む方法。 A method for producing a nerve bundle for transplantation, comprising:
A step of producing two or more microfibers in which a microgel fiber containing neural stem cells or cells obtained by differentiating neural stem cells to a predetermined stage is coated with a high-strength hydrogel;
Bundling the two or more microfibers and coating with a biocompatible gel or polyion complex;
Including methods.
マイクロファイバ内の神経幹細胞を所定の段階まで分化させる工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。 After the step of producing two or more of the microfibers, before bundling the microfibers,
12. The method of claim 11, further comprising the step of differentiating neural stem cells in the microfiber to a predetermined stage.
前記束を、ポリイオンコンプレックスを形成するカチオン性ポリマー溶液とアニオン性ポリマー溶液で順次コーティングする工程を１回以上繰り返す工程を含む、請求項１１から１６のいずれか１項に記載の方法。 The step of bundling the microfibers and coating with a biocompatible gel material comprises:
The method according to any one of claims 11 to 16, comprising a step of repeating the step of sequentially coating the bundle with a cationic polymer solution and a anionic polymer solution forming a polyion complex one or more times.
切断後、マイクロファイバの端部から細胞が突出するまで培養する工程と、をさらに含む、請求項１１から１７のいずれか１項に記載の方法。 After the coating step, cutting according to the length of the transplant site;
The method according to any one of claims 11 to 17, further comprising a step of culturing the cells until the cells protrude from the ends of the microfibers after cutting.
前記マイクロファイバは、細胞を含むマイクロゲルファイバが高強度ハイドロゲルで被覆されたものであり、
前記２本以上のマイクロゲルファイバは、ポリイオンコンプレックスでコーティングすることによってバンドル化されている、移植片。 A graft in which two or more microfibers containing cells are bundled,
The microfiber is a microgel fiber containing cells coated with a high-strength hydrogel,
The implant, wherein the two or more microgel fibers are bundled by coating with a polyion complex.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013007798A JP6074765B2 (en) | 2013-01-18 | 2013-01-18 | Nerve bundle for transplantation and method for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013007798A JP6074765B2 (en) | 2013-01-18 | 2013-01-18 | Nerve bundle for transplantation and method for producing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2014136128A true JP2014136128A (en) | 2014-07-28 |
| JP6074765B2 JP6074765B2 (en) | 2017-02-08 |
Family
ID=51413980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013007798A Expired - Fee Related JP6074765B2 (en) | 2013-01-18 | 2013-01-18 | Nerve bundle for transplantation and method for producing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6074765B2 (en) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109395167A (en) * | 2018-12-10 | 2019-03-01 | 重庆市畜牧科学院 | Degradable silk artificial neuron |
| WO2019123886A1 (en) * | 2017-12-23 | 2019-06-27 | 国立大学法人東京大学 | Array and use thereof |
| WO2020021878A1 (en) * | 2018-07-26 | 2020-01-30 | 株式会社カネカ | In vivo indwelling object and indwelling system therefor |
| WO2020095974A1 (en) * | 2018-11-09 | 2020-05-14 | 国立大学法人東京大学 | Transplant and use thereof |
| WO2020261828A1 (en) * | 2019-06-27 | 2020-12-30 | 株式会社カネカ | In vivo indwelling object |
| CN113318273A (en) * | 2021-06-25 | 2021-08-31 | 温州医科大学慈溪生物医药研究院 | ECM gradient microfiber tube and preparation method thereof |
| WO2022145420A1 (en) | 2020-12-28 | 2022-07-07 | 持田製薬株式会社 | Novel multilayer polymer-coated crosslinked alginate gel fiber |
| WO2022270549A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | 持田製薬株式会社 | Novel polymer-coated crosslinked alginate gel fiber |
| WO2023037544A1 (en) * | 2021-09-13 | 2023-03-16 | 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 | Method for producing pluripotent stem cells |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05237139A (en) * | 1992-02-27 | 1993-09-17 | Nippon Ham Kk | Neuranagenesis assisting material and its production |
| JP2005143979A (en) * | 2003-11-18 | 2005-06-09 | Gunze Ltd | Tube for neuroregeneration |
| WO2011046105A1 (en) * | 2009-10-14 | 2011-04-21 | 国立大学法人 東京大学 | Coated micro gel fibers |
-
2013
- 2013-01-18 JP JP2013007798A patent/JP6074765B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05237139A (en) * | 1992-02-27 | 1993-09-17 | Nippon Ham Kk | Neuranagenesis assisting material and its production |
| JP2005143979A (en) * | 2003-11-18 | 2005-06-09 | Gunze Ltd | Tube for neuroregeneration |
| WO2011046105A1 (en) * | 2009-10-14 | 2011-04-21 | 国立大学法人 東京大学 | Coated micro gel fibers |
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7261481B2 (en) | 2017-12-23 | 2023-04-20 | 国立大学法人 東京大学 | Arrays and their uses |
| WO2019123886A1 (en) * | 2017-12-23 | 2019-06-27 | 国立大学法人東京大学 | Array and use thereof |
| JPWO2019123886A1 (en) * | 2017-12-23 | 2021-01-14 | 国立大学法人 東京大学 | Array and its use |
| WO2020021878A1 (en) * | 2018-07-26 | 2020-01-30 | 株式会社カネカ | In vivo indwelling object and indwelling system therefor |
| JPWO2020021878A1 (en) * | 2018-07-26 | 2021-08-02 | 株式会社カネカ | In-vivo indwelling and its indwelling system |
| JP7370981B2 (en) | 2018-07-26 | 2023-10-30 | 株式会社カネカ | In-vivo indwelling device manufacturing method and indwelling system |
| WO2020095974A1 (en) * | 2018-11-09 | 2020-05-14 | 国立大学法人東京大学 | Transplant and use thereof |
| JP2020075895A (en) * | 2018-11-09 | 2020-05-21 | 国立大学法人 東京大学 | Implant and use of the same |
| JP7306647B2 (en) | 2018-11-09 | 2023-07-11 | 国立大学法人 東京大学 | Grafts and their uses |
| CN109395167A (en) * | 2018-12-10 | 2019-03-01 | 重庆市畜牧科学院 | Degradable silk artificial neuron |
| CN109395167B (en) * | 2018-12-10 | 2021-04-23 | 重庆市畜牧科学院 | Degradable silk artificial nerve |
| WO2020261828A1 (en) * | 2019-06-27 | 2020-12-30 | 株式会社カネカ | In vivo indwelling object |
| JP7514830B2 (en) | 2019-06-27 | 2024-07-11 | 株式会社カネカ | In vivo indwelling |
| WO2022145420A1 (en) | 2020-12-28 | 2022-07-07 | 持田製薬株式会社 | Novel multilayer polymer-coated crosslinked alginate gel fiber |
| KR20230127997A (en) | 2020-12-28 | 2023-09-01 | 모찌다 세이야쿠 가부시끼가이샤 | Novel multi-layer polymer-coated cross-linked alginate gel fibers |
| WO2022270549A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | 持田製薬株式会社 | Novel polymer-coated crosslinked alginate gel fiber |
| KR20240024839A (en) | 2021-06-23 | 2024-02-26 | 모찌다 세이야쿠 가부시끼가이샤 | Novel polymer-coated cross-linked alginate gel fiber |
| CN113318273B (en) * | 2021-06-25 | 2022-11-25 | 温州医科大学慈溪生物医药研究院 | ECM gradient microfiber tube and preparation method thereof |
| CN113318273A (en) * | 2021-06-25 | 2021-08-31 | 温州医科大学慈溪生物医药研究院 | ECM gradient microfiber tube and preparation method thereof |
| WO2023037544A1 (en) * | 2021-09-13 | 2023-03-16 | 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 | Method for producing pluripotent stem cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6074765B2 (en) | 2017-02-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6074765B2 (en) | Nerve bundle for transplantation and method for producing the same | |
| Wu et al. | Aligned fibrous PVDF-TrFE scaffolds with Schwann cells support neurite extension and myelination in vitro | |
| Qu et al. | Electrospun silk fibroin nanofibers in different diameters support neurite outgrowth and promote astrocyte migration | |
| Xue et al. | Differentiation of bone marrow stem cells into Schwann cells for the promotion of neurite outgrowth on electrospun fibers | |
| Onoe et al. | Cell-laden microfibers for bottom-up tissue engineering | |
| Gionet-Gonzales et al. | Engineering principles for guiding spheroid function in the regeneration of bone, cartilage, and skin | |
| Frampton et al. | Fabrication and optimization of alginate hydrogel constructs for use in 3D neural cell culture | |
| Picart et al. | Layer-by-layer films for biomedical applications | |
| Boudou et al. | Multiple functionalities of polyelectrolyte multilayer films: new biomedical applications | |
| JP6710000B2 (en) | Micro fiber | |
| Chen et al. | Promoting neurite growth and schwann cell migration by the harnessing decellularized nerve matrix onto nanofibrous guidance | |
| Palazzolo et al. | Ultrasoft alginate hydrogels support long-term three-dimensional functional neuronal networks | |
| Kriebel et al. | Three‐dimensional configuration of orientated fibers as guidance structures for cell migration and axonal growth | |
| EP3190176A1 (en) | Method for tissue culture development on scaffold and differentiated tissue culture | |
| Ouyang et al. | Facile biofabrication of heterogeneous multilayer tubular hydrogels by fast diffusion-induced gelation | |
| Hsu et al. | Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds | |
| CN111655269A (en) | Cell systems using spheroids and methods of making and using them | |
| Katiyar et al. | Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration | |
| US10465165B2 (en) | Growth matrices for stem cell propagation in vitro and in tissue regeneration | |
| Ortega et al. | Characterisation and evaluation of the impact of microfabricated pockets on the performance of limbal epithelial stem cells in biodegradable PLGA membranes for corneal regeneration | |
| Rubi‐Sans et al. | Engineering Cell‐Derived Matrices: From 3D Models to Advanced Personalized Therapies | |
| Choi et al. | Vascular endothelial growth factor incorporated multilayer film induces preangiogenesis in endothelial cells | |
| Filippova et al. | Neurothreads: development of supportive carriers for mature dopaminergic neuron differentiation and implantation | |
| Unal et al. | Engineering biomaterial microenvironments to promote myelination in the central nervous system | |
| Mu et al. | Chitosan tubes inoculated with dental pulp stem cells and stem cell factor enhance facial nerve-vascularized regeneration in rabbits |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20151028 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160113 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161124 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20161125 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161220 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6074765 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |