JP2014091719A - Antibody specific to polypeptide corresponding to 3 to 32 of human b-type natriuretic peptide and measuring method using it - Google Patents
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本発明は、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、ｈＢＮＰとする）の３−３２位に相当するポリペプチド（以下、ｈＢＮＰ（３−３２）とする）と反応し、ｈＢＮＰ及びヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、ｈｐｒｏＢＮＰとする）とは反応しないｈＢＮＰ（３−３２）特異抗体、及びそれを用いたｈＢＮＰ（３−３２）の測定法に関するものである。 The present invention reacts with a polypeptide corresponding to position 3-32 of a human B-type natriuretic peptide (hereinafter referred to as hBNP) (hereinafter referred to as hBNP (3-32)), and thereby reacts with hBNP and human pro-B-type natriuretic The present invention relates to a hBNP (3-32) specific antibody that does not react with a peptide (hereinafter referred to as hproBNP), and a method for measuring hBNP (3-32) using the same.
ＢＮＰはブタの脳から最初に単離された（非特許文献１）ことから、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｂｒａｉｎ Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＢＮＰ）と命名された。しかし、ヒトにおいて、ＢＮＰは心臓で合成・分泌されることが示唆され、（非特許文献２）、心臓より単離・同定された（非特許文献３）。従って、脳（ｂｒａｉｎ）という単語はＢ型に変更され、現在ではＢＮＰはＢ型ナトリウム利尿ペプチドを意味する。 Since BNP was first isolated from porcine brain (Non-Patent Document 1), it was named Brain Natriuretic Peptide (BNP). However, in humans, BNP is suggested to be synthesized and secreted in the heart (Non-patent document 2), and isolated and identified from the heart (Non-patent document 3). Thus, the word brain has been changed to type B, and now BNP means type B natriuretic peptide.
ＢＮＰは血中を循環し、強力な心血管性および腎性作用を発揮する。ｈＢＮＰは３２アミノ酸残基からなり、ｈＢＮＰの前駆体であるｈｐｒｏＢＮＰのアミノ酸配列７７−１０８位に相当する。ｈＢＮＰは、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって閉じている１７アミノ酸からなる環状部、９アミノ酸からなるＮ末端尾部および６アミノ酸からなるＣ末端尾部からなる。また、血中でｈＢＮＰをインキュベートすると、Ｎ末端の２アミノ酸残基が脱離し、ｈＢＮＰ（３−３２）が生じることが知られている（非特許文献４）。ｈＢＮＰ（３−３２）は、ｈＢＮＰのアミノ酸配列３−３２位に相当し、ｈｐｒｏＢＮＰのアミノ酸配列の７９−１０８位に相当する。 BNP circulates in the blood and exerts strong cardiovascular and renal effects. hBNP consists of 32 amino acid residues and corresponds to amino acid sequence 77-108 of hproBNP, which is a precursor of hBNP. hBNP consists of a 17-amino acid cyclic moiety closed by a disulfide bond between two cysteine residues, a 9-amino acid N-terminal tail, and a 6-amino acid C-terminal tail. In addition, it is known that when hBNP is incubated in blood, the N-terminal two amino acid residues are eliminated and hBNP (3-32) is generated (Non-patent Document 4). hBNP (3-32) corresponds to the amino acid sequence of positions 32-32 of hBNP and corresponds to positions 79-108 of the amino acid sequence of hproBNP.
血中のｈＢＮＰの濃度は、鬱血性心不全、虚血性心疾患、心房細動および腎機能障害心臓疾患を反映することが認められている。例えば、急性心筋梗塞および無症状または無症候の心室機能障害において、ヒト血漿中のｈＢＮＰレベルの上昇が報告されている（非特許文献５、６）。そのため血中のｈＢＮＰの測定は心機能・腎機能の診断などｈＢＮＰの増減を指標とする疾病の診断に役立つものである。これまでに、ｈＢＮＰのイムノアッセイなどのリガンド結合アッセイは当業界で公知であり、そのアッセイ用試薬が市販されている。
It has been observed that the concentration of hBNP in the blood reflects congestive heart failure, ischemic heart disease, atrial fibrillation and renal dysfunction heart disease. For example, an increase in hBNP level in human plasma has been reported in acute myocardial infarction and asymptomatic or asymptomatic ventricular dysfunction (Non-patent
また、心室負荷症例と心房負荷症例において、血中のｈＢＮＰとｈｐｒｏＢＮＰの総量に対するｈＢＮＰの割合を比較したときに、心房負荷症例のほうが心室負荷症例よりも高値であることが見いだされた（非特許文献７）。このように、ｈＢＮＰ、ｈｐｒｏＢＮＰのそれぞれを個別に測定することにより、より詳細な病態情報が得られる可能性が示唆されている。しかし、血中のｈＢＮＰのほとんどはｈＢＮＰ（３−３２）に分解された状態にあるという報告（非特許文献４）がなされており、ｈＢＮＰ（３−３２）のみを測定することも重要だと考えられている。従来、液体クロマトグラフ質量分析の手法を用いて、血中のｈＢＮＰ（３−３２）、ｈＢＮＰ、ｈｐｒｏＢＮＰのそれぞれを定量測定することは可能であったが、該手法は操作が煩雑でかつ多検体処理に不向きであった。 Moreover, when comparing the ratio of hBNP to the total amount of hBNP and hproBNP in the blood in the ventricular load case and the atrial load case, it was found that the atrial load case was higher than the ventricular load case (non-patented). Reference 7). Thus, the possibility that more detailed pathological information can be obtained by individually measuring hBNP and hproBNP has been suggested. However, it has been reported that most of hBNP in blood is in a state of being decomposed into hBNP (3-32) (non-patent document 4), and it is also important to measure only hBNP (3-32). It is considered. Conventionally, it has been possible to quantitatively measure each of hBNP (3-32), hBNP, and hproBNP in blood using a liquid chromatographic mass spectrometry technique. It was unsuitable for processing.
このような状況下、特にｈＢＮＰ（３−３２）の血中濃度の臨床的重要性が理解されるようになるにつれて、ｈＢＮＰ（３−３２）のみを定量するリガンド結合アッセイが必要とされるようになってきた。しかしながら、現在、リガンド結合アッセイで用いられている抗ｈＢＮＰ抗体の認識部位は、ｈＢＮＰの環状部またはＣ末端尾部である。そのため、このようなリガンド結合アッセイを用いて血中のｈＢＮＰ（３−３２）を測定しようとすると、ｈＢＮＰ（３−３２）と同じ環状部およびＣ末端尾部を有するｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰも測定されてしまい、血中のｈＢＮＰ（３−３２）のみを測定することは不可能であった。 Under these circumstances, a ligand binding assay that quantifies only hBNP (3-32) may be required, especially as the clinical significance of blood levels of hBNP (3-32) becomes understood. It has become. However, the recognition site for anti-hBNP antibodies currently used in ligand binding assays is the cyclic or C-terminal tail of hBNP. Therefore, when trying to measure hBNP (3-32) in blood using such a ligand binding assay, hBNP and hproBNP having the same cyclic part and C-terminal tail as hBNP (3-32) are also measured. It was impossible to measure only hBNP (3-32) in blood.
本発明は、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体を提供し、かつそれを用いてｈＢＮＰ（３−３２）を特異的に測定する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an antibody specific for hBNP (3-32) and to provide a method for specifically measuring hBNP (3-32) using the same.
本発明者は上記の課題に関し鋭意研究を行なった結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）ｈＢＮＰ（３−３２）と反応し、ｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰとは反応しないことを特徴とする、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体。
（２）上述の（１）に記載の抗体において、認識部位に少なくともｈＢＮＰの３−６位に相当するアミノ酸残基を含む抗体。
（３）上述の（１）または（２）に記載の抗体において、認識部位に少なくともｈＢＮＰの３−８位に相当するアミノ酸残基を含む抗体。
（４）上述の（１）〜（３）いずれかに記載の抗体において、認識部位がｈＢＮＰの３−８位に相当するアミノ酸残基である抗体。
（５）上述の（１）〜（４）いずれかに記載の抗体（Ａ）と、ｈＢＮＰ（３−３２）の認識部位が抗体（Ａ）とは異なる抗体（Ｂ）とを用いて、ｈＢＮＰ（３−３２）をサンドイッチ法により測定することを特徴とする、ｈＢＮＰ（３−３２）の測定法。
As a result of intensive studies on the above problems, the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
(1) An antibody specific to hBNP (3-32), which reacts with hBNP (3-32) and does not react with hBNP and hproBNP.
(2) The antibody according to (1) above, wherein the recognition site contains at least an amino acid residue corresponding to positions 3-6 of hBNP.
(3) The antibody according to (1) or (2) above, wherein the recognition site contains at least an amino acid residue corresponding to position 3-8 of hBNP.
(4) The antibody according to any one of (1) to (3) above, wherein the recognition site is an amino acid residue corresponding to position 3-8 of hBNP.
(5) hBNP using the antibody (A) according to any one of (1) to (4) above and an antibody (B) in which the recognition site of hBNP (3-32) is different from that of the antibody (A) A method for measuring hBNP (3-32), wherein (3-32) is measured by a sandwich method.
以下に本発明を詳細に説明する。本発明のｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またキメラ抗体や免疫学的特性を保持する抗体断片であってもよい。中でも、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマから得ることができ、そのハイブリドーマは例えば次のようにして作製される。まずｈＢＮＰ（３−３２）のＮ末端、好ましくはｈＢＮＰの３−１０位のアミノ酸残基に相当するペプチド（以下、ｈＢＮＰ（３−１０）とする）を合成し、免疫原性を高めるために牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡとする）、オブアルブミン（以下、ＯＶＡとする）、またはキーホールリンペットヘモシアニン（以下、ＫＬＨとする）などと結合させる。得られたコンジュゲートをフロイントの完全アジュバント等の適当なアジュバントに乳濁し、マウスの免疫に用いる。免疫は上記乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔等に数回繰り返し接種することにより行なう。最終免疫の３日ないし５日後に脾臓を取り出し、抗体産生細胞として使用する。一方、抗体産生細胞と融合させてハイブリドーマを得るための親細胞としてミエローマ細胞株を用意し、これと抗体産生細胞を融合させてハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマ作製における培地として、Ｅ−ＲＤＦ培地、ＧＩＴ培地などの通常良く使用されているものを用いることができる。融合にあたってはまず、親細胞であるミエローマと脾臓細胞を適当な割合で、例えば個数比で１：５の割合で用意し融合に用いる。白金電極による電気的細胞融合を用いる方法が、融合効率が高いとされている。融合株はＨＡＴ選択法により選択することが好ましい。生じたハイブリドーマのスクリーニングは、培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法などの既知の方法により行ない、目的の免疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマのクローンを選択する。ハイブリドーマの単一性を確保するため、細胞培養プレートにハイブリドーマを１ウェルに１個より多くならないように蒔き、生育してくるクローンについて再びスクリーニングを行なう。このサブクローニングを繰り返すことにより、単一のハイブリドーマを得ることができる。 The present invention is described in detail below. The antibody specific for hBNP (3-32) of the present invention may be any of antisera, polyclonal antibodies, and monoclonal antibodies, and may be a chimeric antibody or an antibody fragment that retains immunological properties. Of these, monoclonal antibodies are preferred. A monoclonal antibody can be obtained from, for example, a hybridoma, and the hybridoma is produced, for example, as follows. First, in order to enhance the immunogenicity by synthesizing a peptide corresponding to the N-terminal of hBNP (3-32), preferably the amino acid residue at position 3-10 of hBNP (hereinafter referred to as hBNP (3-10)) It is combined with bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA), ovalbumin (hereinafter referred to as OVA), keyhole limpet hemocyanin (hereinafter referred to as KLH) or the like. The resulting conjugate is emulsified in a suitable adjuvant such as Freund's complete adjuvant and used for immunization of mice. Immunization is performed by repeatedly inoculating the above-mentioned emulsion several times into the abdominal cavity of mice every several weeks. Three to five days after the final immunization, the spleen is removed and used as antibody-producing cells. On the other hand, a myeloma cell line is prepared as a parent cell for obtaining a hybridoma by fusing with an antibody-producing cell, and this and this antibody-producing cell are fused to produce a hybridoma. As a medium for producing a hybridoma, a commonly used medium such as an E-RDF medium or a GIT medium can be used. In the fusion, first, the parent cells, myeloma and spleen cells, are prepared at an appropriate ratio, for example, a ratio of 1: 5 and used for the fusion. A method using electrical cell fusion with a platinum electrode is said to have high fusion efficiency. The fused strain is preferably selected by a HAT selection method. The resulting hybridoma is screened using a culture supernatant by a known method such as ELISA, and a hybridoma clone secreting the desired immunoglobulin is selected. In order to ensure the uniformity of the hybridoma, the cell culture plate is sowed that no more than one hybridoma per well, and the growing clone is screened again. By repeating this subcloning, a single hybridoma can be obtained.
このようにして得られたハイブリド−マを培地中で培養し、培地からモノクロ−ナル抗体を採取することにより、モノクロ−ナル抗体を製造することができる。例えば、まず、上記で得られたハイブリド−マを培養容器中で培養する。培地は先に述べた通常の培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加したものでよく、この培地で３日から５日培養の後、培養上清からモノクロ−ナル抗体を得る。 A monoclonal antibody can be produced by culturing the thus obtained hybridoma in a medium and collecting the monoclonal antibody from the medium. For example, first, the hybridoma obtained above is cultured in a culture vessel. The medium may be a medium obtained by adding fetal calf serum (FCS) to the above-mentioned normal medium. After culturing for 3 to 5 days in this medium, a monoclonal antibody is obtained from the culture supernatant.
このようにして本発明では、モノクロ−ナル抗体９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａを得た。この抗体は、後述の実施例に示される通り、ｈＢＮＰ（３−３２）と反応するが、ｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰとは反応しないことから、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体である。また一般に、抗ペプチド抗体のエピトープは、連続する４つのアミノ酸残基が最小のエピトープとなる場合がある（特開２０１１−１４０４８３号公報）が、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体の最小のエピトープは、ｈＢＮＰ（３−３２）の１−６位のアミノ酸残基であり、これは即ちｈＢＮＰの３−８位のアミノ酸残基に相当するペプチドｈＢＮＰ（３−８）であった。 Thus, in the present invention, the monoclonal antibody 9-21O-3P-11A was obtained. This antibody reacts with hBNP (3-32) but does not react with hBNP and hproBNP, as shown in the Examples described later, and is an antibody specific for hBNP (3-32). In general, the epitope of an anti-peptide antibody sometimes has a minimum of four consecutive amino acid residues (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-140483), but the minimum epitope of a 9-21O-3P-11A antibody is HBNP (3-32) is the amino acid residue at position 1-6, that is, peptide hBNP (3-8) corresponding to the amino acid residue at position 3-8 of hBNP.
本発明はさらに、このようなｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体（Ａ）と、ｈＢＮＰ（３−３２）の認識部位が抗体（Ａ）とは異なる抗体（Ｂ）を用いて、ｈＢＮＰ（３−３２）をサンドイッチすることを特徴とするｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な免疫測定法を提供する。抗体（Ｂ）としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またキメラ抗体や免疫学的特性を保持する抗体断片でもよい。中でもモノクロ−ナル抗体が好ましく、例えばｈＢＮＰの環状部を認識するモノクロ−ナル抗体またはｈＢＮＰのＣ末端尾部を認識するモノクローナル抗体［ＢＣ２３−１１（特開２０１１−１２２９５７号公報）等］が挙げられる。 The present invention further uses such an antibody (A) specific to hBNP (3-32) and an antibody (B) in which the recognition site of hBNP (3-32) is different from that of antibody (A). Provided is an immunoassay specific for hBNP (3-32), characterized by sandwiching (3-32). The antibody (B) may be an antiserum, a polyclonal antibody, or a monoclonal antibody, or may be a chimeric antibody or an antibody fragment that retains immunological properties. Among them, a monoclonal antibody is preferable, and examples thereof include a monoclonal antibody that recognizes the cyclic part of hBNP or a monoclonal antibody that recognizes the C-terminal tail of hBNP [BC23-11 (JP 2011-122957 A) and the like].
以下に、本発明のサンドイッチ測定法について説明する。 Hereinafter, the sandwich measurement method of the present invention will be described.
（１）標識抗体の調製
サンドイッチ法を行う場合、一方の抗体を標識化することが好ましい。標識としては特に限定されないが、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光物質等があげられる。例えば酵素としては、アルカリ性ホスファタ−ゼ（以下、ＡＬＰとする）、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ、ペルオキシダ−ゼ、グルコ−スオキシダ−ゼなどが利用可能である。これらの標識酵素と抗体との結合は、既知の方法に従って行なえばよい。標識する抗体は、Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ−Ａｇａｒｏｓｅカラムなどにより精製されたものを用いる。本発明においては、特にＡＬＰが好ましく用いられる。なお、標識する抗体は、前述の抗体（Ａ）または（Ｂ）のどちらであってもよい。
(1) Preparation of labeled antibody When performing the sandwich method, it is preferable to label one antibody. Although it does not specifically limit as a label | marker, For example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance etc. are mention | raise | lifted. For example, alkaline phosphatase (hereinafter referred to as ALP), β-D-galactosidase, peroxidase, glucose oxidase, etc. can be used as the enzyme. The labeling enzyme and the antibody may be bound according to a known method. As the antibody to be labeled, one purified by an Anti-mouse-IgG-Agarose column or the like is used. In the present invention, ALP is particularly preferably used. The antibody to be labeled may be any of the aforementioned antibodies (A) or (B).
（２）固相化抗体の作製
サンドイッチ法を行う場合、他方の抗体を固相化することが好ましい。この抗体は、標識した抗体（（Ａ）または（Ｂ））ではないもう一方の抗体（（Ｂ）または（Ａ））である。固相化する抗体は、Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ−Ａｇａｒｏｓｅカラムなどにより精製されたものを用いる。該抗体を抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状物（ビ−ズ）あるいは球状物（ボ−ル）、チュ−ブ、プレ−トなどに吸着又は結合させればよい。
(2) Preparation of immobilized antibody When the sandwich method is performed, the other antibody is preferably immobilized. This antibody is the other antibody ((B) or (A)) that is not a labeled antibody ((A) or (B)). As the antibody to be immobilized, an antibody purified with an Anti-mouse-IgG-Agarose column or the like is used. The antibody may be adsorbed or bound to a carrier for antigen-antibody reaction, such as glass or synthetic resin granules (beads) or spheres (balls), tubes, plates and the like.
（３）ｈＢＮＰ（３−３２）の測定
試料、上記（１）で調製した標識抗体、上記（２）で作製した固相化抗体を接触させ、試料中のｈＢＮＰ（３−３２）を標識抗体及び固相化抗体と反応させる。このとき、接触の順序には特に限定はなく、順次接触させてもよく、また同時に接触させてもよい。反応後、上清を除去して洗浄し、サンドイッチ構造を形成した反応生成物中の標識を検出すればよい。例えば、標識がＡＬＰの場合は、ＡＬＰの基質として例えば４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）などを加えて反応させ、ＡＬＰ活性を測定する。
(3) Measurement of hBNP (3-32) The sample, the labeled antibody prepared in (1) above, and the solid-phased antibody prepared in (2) above are contacted, and hBNP (3-32) in the sample is labeled antibody And react with the immobilized antibody. At this time, the order of contact is not particularly limited, and may be contacted sequentially or simultaneously. After the reaction, the supernatant is removed and washed, and the label in the reaction product forming a sandwich structure may be detected. For example, when the label is ALP, for example, 4-methylumbelliferyl phosphate (4-MUP) or the like is added as a substrate for ALP, and the ALP activity is measured.
本発明の抗体は、ｈＢＮＰ（３−３２）と反応するが、ｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰとは反応しないという特徴を有する、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体である。このような抗体を用いた本発明のｈＢＮＰ（３−３２）の測定法は、ｈＢＮＰ及び／又はｈｐｒｏＢＮＰの共存下であっても、ｈＢＮＰ（３−３２）を特異的に測定することができる。従って本方法は高血圧や心機能・腎機能の診断など、ｈＢＮＰ（３−３２）の増減を指標とする疾病の診断に有用であることが期待される。 The antibody of the present invention is an antibody specific to hBNP (3-32), which is characterized by reacting with hBNP (3-32) but not reacting with hBNP or hproBNP. The method for measuring hBNP (3-32) of the present invention using such an antibody can specifically measure hBNP (3-32) even in the presence of hBNP and / or hproBNP. Therefore, this method is expected to be useful for diagnosing diseases using the increase / decrease in hBNP (3-32) as an index, such as diagnosis of hypertension, cardiac function and renal function.
［実施例１］
Ｉ．抗ｈＢＮＰ（３−３２）モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マの作製と抗体の産生
（１）免疫用コンジュゲ−ト液の作製
ｈＢＮＰ（３−１０）は、業者にペプチド合成を依頼して得た。該ペプチドフラグメント溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解したもの）と、マレイミド活性化ＫＬＨ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで溶解したもの）を、体積比で１：１で混和し、室温で２時間撹拌して反応させた。その後、反応液をＰＢＳに対して２日間４℃で透析することにより、免疫用コンジュゲート液を得た。
[Example 1]
I. Production of anti-hBNP (3-32) monoclonal antibody-producing hybridoma and production of antibody (1) Production of conjugate solution for immunization hBNP (3-10) was obtained by requesting peptide synthesis from a vendor. . The peptide fragment solution (10 mg / ml, dissolved in phosphate buffered saline (PBS)) and maleimide-activated KLH solution (10 mg / ml, dissolved in PBS) at a volume ratio of 1: 1. The mixture was mixed and stirred at room temperature for 2 hours to react. Then, the conjugate solution for immunization was obtained by dialyzing the reaction solution against PBS for 2 days at 4 ° C.
（２）免疫
上述の免疫用コンジュゲート液（１ｍｇ／ｍｌ）とフロイントの完全アジュバントを等量ずつ混合して乳濁液とし、これをマウス（雌、６週令）の腹腔内に０．１ｍｌずつ１週間間隔で計４回注射した。マウス１匹１回当たりのコンジュゲ−ト投与量は５０μｇであった。更に最終免疫の１週間後に、ブ−スタ−として免疫用コンジュゲート液をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈したもの（０．１ｍｌ）を腹腔内に投与した。
(2) Immunization The above-described immunization conjugate solution (1 mg / ml) and Freund's complete adjuvant are mixed in equal amounts to form an emulsion, which is 0.1 ml in the abdominal cavity of a mouse (female, 6 weeks old). Injections were made 4 times at weekly intervals. The dose of conjugate per mouse was 50 μg. Further, one week after the final immunization, a immunization conjugate solution diluted to 0.5 mg / ml with PBS (0.1 ml) was administered intraperitoneally as a booster.
（３）細胞融合
ブ−スタ−免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、その細胞を赤血球溶解バッファーにて赤血球を破壊した。残った細胞をＥ−ＲＤＦ培地に懸濁して細胞融合に用いる脾リンパ球とした。次に同じくＥ−ＲＤＦ培地に懸濁したミエローマ細胞０．４×１０７個を脾リンパ球１．６×１０７個と混合し、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）後、上清を除去した。細胞沈殿物をマンニトール緩衝液（２５０ｍＭ マンニトール、１００ｍＭ 塩化カルシウム、１００ｍＭ 塩化マグネシウム）に懸濁し、電気的細胞融合を行なった。電気的細胞融合を行なった細胞懸濁液をＨＡＴ培地（１００μＭ ヒポキサンチン、０．４μＭ アミノプテリン、１６μＭ チミジンを含むＧＩＴ培地）２００ｍｌに懸濁し、３８４ウエル細胞培養プレ−ト１０枚の各ウエルに０．０５ｍｌずつ分注した。約７日後にはハイブリド−マの増殖が認められた。
(3) Cell fusion Three days after the booster immunization, the spleen of the mouse was removed, and the cells were destroyed with erythrocyte lysis buffer. The remaining cells were suspended in E-RDF medium and used as spleen lymphocytes used for cell fusion. Next, 0.4 × 10 7 myeloma cells similarly suspended in E-RDF medium were mixed with 1.6 × 10 7 splenic lymphocytes, centrifuged (1000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed. The cell precipitate was suspended in mannitol buffer (250 mM mannitol, 100 mM calcium chloride, 100 mM magnesium chloride), and electric cell fusion was performed. The cell suspension subjected to the electric cell fusion is suspended in 200 ml of HAT medium (GIT medium containing 100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, 16 μM thymidine), and is suspended in each well of 10 384-well cell culture plates. A 0.05 ml aliquot was dispensed. Hybridoma growth was observed after about 7 days.
（４）ハイブリド−マの選択
ハイブリド−マが増殖してきたウエルについて、培養上清を用いて抗ｈＢＮＰ（３−３２）抗体産生の有無をＥＬＩＳＡ法で検定した。まず、ｈＢＮＰ（３−１０）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで希釈したもの）とマレイミド活性化ＯＶＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで希釈したもの）を混和し、室温で２時間撹拌して反応させることにより得たｈＢＮＰ（３−１０）−ＯＶＡコンジュゲート液を、該コンジュゲートが１μｇ／ｍｌとなるように固相化用緩衝液（１２ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを１時間室温でインキュベートし、該コンジュゲートをＥＬＩＳＡプレートに固相化した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（２０ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを添加し、１時間室温でインキュベートすることで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。
(4) Selection of hybridoma About the well which the hybridoma grew, the presence or absence of anti-hBNP (3-32) antibody production was tested by ELISA method using the culture supernatant. First, hBNP (3-10) solution (10 mg / ml, diluted with PBS) and maleimide-activated OVA solution (10 mg / ml, diluted with PBS) are mixed and allowed to react by stirring at room temperature for 2 hours. The hBNP (3-10) -OVA conjugate solution thus obtained was immobilized with a solid phase buffer solution (12 mM Na 2 CO 3 , 38 mM NaHCO 3 , pH 9.6) so that the conjugate was 1 μg / ml. Dilute and add to ELISA plate. This was incubated for 1 hour at room temperature and the conjugate was immobilized on an ELISA plate. The ELISA plate was washed 3 times with washing buffer (20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane, 150 mM sodium chloride, 0.1% Tween 20), PBS containing 1% skim milk was added, and incubated at room temperature for 1 hour This blocked the ELISA plate.
該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で１回洗浄した後、市販の抗マウスＩｇＧ抗体−ＡＬＰコンジュゲートを含むアッセイ緩衝液（１５％ ＦＣＳ、５％ ＢＳＡ、１００ｍＭ ２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸、１００ｍＭ スクロース、５０ｍＭ 塩化マグネシウム）を添加した。さらに特開２００８−７９５１７号公報に記載の多穴プレート用レプリケータを用いてハイブリドーマの培養上清を添加し、１時間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、４−ＭＵＰ溶液（１Ｍ ジエタノールアミン、０．５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ４−ＭＵＰ）を添加し、３０分間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度をプレートリーダーで測定した（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４６５ｎｍ）。陰性対照としてハイブリドーマの培養上清の代わりに培地を添加したものを用い、陰性対照の５倍以上の蛍光強度を示したものを抗体陽性とした。全部で２３個のハイブリドーマが抗体陽性と判定された。
After washing the ELISA plate once with a washing buffer, an assay buffer containing a commercially available anti-mouse IgG antibody-ALP conjugate (15% FCS, 5% BSA, 100 mM 2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid) , 100 mM sucrose, 50 mM magnesium chloride). Furthermore, the culture supernatant of the hybridoma was added using the multi-well plate replicator described in JP-A-2008-79517, and incubated at room temperature for 1 hour. The ELISA plate was washed three times with a washing buffer, and then a 4-MUP solution (1M diethanolamine, 0.5 mM magnesium chloride, 1 mM 4-MUP) was added and incubated at room temperature for 30 minutes. The fluorescence intensity of the ELISA plate was measured with a plate reader (excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 465 nm). As a negative control, a medium to which a medium was added instead of the hybridoma culture supernatant was used, and an antibody positive having a
（５）モノクロ−ン化
上記（４）によって抗体陽性と判定されたハイブリド−マのうち、蛍光強度が高いほうから１０個を選択し、限界希釈法でクロ−ニングした。即ち、３８４ウエル細胞培養プレ−トにハイブリド−マを１個／５０μｌ／ウエルの濃度で培養し、ハイブリド−マが増殖してきたウエルの培養上清について、（４）のＥＬＩＳＡを行なった。抗体陽性と判定され、かつ顕微鏡観察でモノクローンに見えるハイブリド−マを選択した。この操作を２〜３回繰り返し、最終的に、ｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰとの反応性が最も低い抗体を産生する抗体産生細胞株９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ株を確立した。またこの株が産生するモノクローナル抗体を９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体とした。
(5) Monoclonalization Among the hybridomas determined to be antibody positive according to the above (4), 10 hybridomas with the highest fluorescence intensity were selected and cloned by limiting dilution. That is, the hybridoma was cultured in a 384-well cell culture plate at a concentration of 1 cell / 50 μl / well, and the culture supernatant of the well in which the hybridoma had grown was subjected to the ELISA of (4). A hybridoma that was determined to be antibody positive and that appeared to be a monoclone by microscopic observation was selected. This operation was repeated 2 to 3 times, and finally, an antibody producing cell line 9-21O-3P-11A strain producing an antibody having the lowest reactivity with hBNP and hproBNP was established. The monoclonal antibody produced by this strain was designated 9-21O-3P-11A antibody.
ＩＩ．モノクロ−ナル抗体のクラス・サブクラスの決定
９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体のクラス・サブクラスの決定は、マウスイムノグロブリン各クラス・サブクラスに特異的な抗体（Ｒｏｃｈｅ社、ＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡｎｔｉＢｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ）を用いて行なった。その結果、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体は、抗ＩｇＧ２ｂ抗体との間のみ沈降線が認められ、ＩｇＧ２ｂに属することがわかった。
II. Determination of Class / Subclass of Monoclonal Antibody Determination of class / subclass of 9-21O-3P-11A antibody is carried out by using antibodies specific for each class / subclass of mouse immunoglobulin (Roche, IsoStripe Mouse Monobody Isotyping Kit). Performed. As a result, the 9-21O-3P-11A antibody was found to have a sedimentation line only with the anti-IgG2b antibody, and was found to belong to IgG2b.
ＩＩＩ．モノクローナル抗体のエピトープ分析
９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体と反応するｈＢＮＰ（３−３２）のエピトープを、下記のＥＬＩＳＡにより決定した。該抗体が１μｇ／ｍｌとなるように固相化用緩衝液で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを１時間室温でインキュベートし、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体をＥＬＩＳＡプレートに固相化した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを添加し、１時間室温でインキュベートすることで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で１回洗浄した後、ｈＢＮＰ（３−３２）、ｈＢＮＰペプチドフラグメント、及びＡＬＰ標識したＢＣ２３−１１を含むアッセイ緩衝液を添加し、１時間室温でインキュベートした。このとき、ｈＢＮＰ（３−３２）は５００ｐＭとなるように添加した。またｈＢＮＰペプチドフラグメントは、ｈＢＮＰの１−１０位，３−６位，３−７位，３−８位，３−９位又は３−１０位のアミノ酸残基に相当するペプチド（以下、それぞれｈＢＮＰ（１−１０）、ｈＢＮＰ（３−６）、ｈＢＮＰ（３−７）、ｈＢＮＰ（３−８）、ｈＢＮＰ（３−９）又はｈＢＮＰ（３−１０）とする）の６種類を用い、５０または５００ｎＭとなるように添加した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、４−ＭＵＰ溶液を添加し、３０分間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度をプレートリーダーで測定した。
III. Epitope analysis of monoclonal antibody The epitope of hBNP (3-32) that reacts with 9-21O-3P-11A antibody was determined by the following ELISA. The antibody was diluted with an immobilization buffer so as to be 1 μg / ml and added to an ELISA plate. This was incubated for 1 hour at room temperature, and the 9-21O-3P-11A antibody was immobilized on an ELISA plate. The ELISA plate was washed three times with a washing buffer, PBS containing 1% skim milk was added, and the ELISA plate was blocked by incubating at room temperature for 1 hour. The ELISA plate was washed once with washing buffer, then assay buffer containing hBNP (3-32), hBNP peptide fragment, and ALP-labeled BC23-11 was added and incubated for 1 hour at room temperature. At this time, hBNP (3-32) was added so as to be 500 pM. HBNP peptide fragments are peptides corresponding to amino acid residues at positions 1-10, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9 or 3-10 of hBNP (hereinafter, hBNP, respectively). (1-10), hBNP (3-6), hBNP (3-7), hBNP (3-8), hBNP (3-9) or hBNP (3-10)) Or it added so that it might become 500 nM. After washing the ELISA plate 3 times with washing buffer, 4-MUP solution was added and incubated for 30 minutes at room temperature. The fluorescence intensity of the ELISA plate was measured with a plate reader.
結果を図１に示す。図１のとおり、ｈＢＮＰ（１−１０）、ｈＢＮＰ（３−６）またはｈＢＮＰ（３−７）を添加したときは、蛍光強度の減少はごくわずかしか観察されなかった。一方、ｈＢＮＰ（３−８）、ｈＢＮＰ（３−９）、ｈＢＮＰ（３−１０）を添加したときは、濃度依存的に蛍光強度が減少した。この測定系では、蛍光強度は、固相化した９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体に結合したｈＢＮＰの量に依存する。つまり、ｈＢＮＰペプチドフラグメントの添加により蛍光強度が減少するということは、該ｈＢＮＰペプチドフラグメントが、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体とｈＢＮＰの結合を阻害することを示している。阻害を生じる最小のｈＢＮＰペプチドフラグメントはｈＢＮＰ（３−８）であったため、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体が認識する最小のエピトープはｈＢＮＰ（３−８）であることが明らかとなった。 The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, when hBNP (1-10), hBNP (3-6) or hBNP (3-7) was added, only a slight decrease in fluorescence intensity was observed. On the other hand, when hBNP (3-8), hBNP (3-9), and hBNP (3-10) were added, the fluorescence intensity decreased in a concentration-dependent manner. In this measurement system, the fluorescence intensity depends on the amount of hBNP bound to the immobilized 9-21O-3P-11A antibody. That is, the fact that the fluorescence intensity is decreased by the addition of the hBNP peptide fragment indicates that the hBNP peptide fragment inhibits the binding of the 9-21O-3P-11A antibody and hBNP. Since the smallest hBNP peptide fragment that caused inhibition was hBNP (3-8), it was revealed that the smallest epitope recognized by the 9-21O-3P-11A antibody was hBNP (3-8).
ＩＶ．モノクロ−ナル抗体を用いたｈＢＮＰ（３−３２）、ｈＢＮＰおよびｈｐｒｏＢＮＰのサンドイッチＥＬＩＳＡ
ＩＩＩに記載の方法で９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体を固相化し、スキムミルクでブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに、ｈＢＮＰ（３−３２）とＡＬＰ標識したＢＣ２３−１１を含むアッセイ緩衝液を添加し、１時間室温でインキュベートした。このとき、ｈＢＮＰ（３−３２）は５００ｐＭとなるように添加した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、４−ＭＵＰ溶液を添加し、３０分間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度をプレートリーダーで測定した。ｈＢＮＰ及びｈｐｒｏＢＮＰのサンドイッチＥＬＩＳＡは、上記のｈＢＮＰ（３−３２）の代わりにｈＢＮＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｂｒａｉｎ Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−３２ ｈｕｍａｎ）またはｈｐｒｏＢＮＰ（ＨｙＴｅｓｔ社、Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏＢＮＰ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）を用いて測定した。陰性対照として、ＡＬＰ標識したＢＣ２３−１１を含むアッセイ緩衝液のみを添加し、同様に測定した。結果を図２に示す。図２のとおり、ｈＢＮＰ（３−３２）を添加した場合は陰性対照の５５倍程度の蛍光強度を示したが、ｈＢＮＰおよびｈｐｒｏＢＮＰを添加した場合は陰性対照と同等の蛍光強度を示した。これは、固相化した９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体はｈＢＮＰ（３−３２）と結合するが、ｈＢＮＰおよびｈｐｒｏＢＮＰと結合しないことを示している。すなわち、９−２１Ｏ−３Ｐ−１１Ａ抗体は、ｈＢＮＰ（３−３２）に特異的な抗体であることが明らかとなった。
IV. HBNP (3-32), hBNP and hproBNP sandwich ELISA using monoclonal antibody
An assay buffer containing BC23-11 and hBNP (3-32) and ALP-labeled BC23-11 was added to an ELISA plate on which the 9-21O-3P-11A antibody was immobilized by the method described in III and blocked with skim milk. Incubated at room temperature for hours. At this time, hBNP (3-32) was added so as to be 500 pM. After washing the ELISA plate 3 times with washing buffer, 4-MUP solution was added and incubated for 30 minutes at room temperature. The fluorescence intensity of the ELISA plate was measured with a plate reader. hBNP and hproBNP sandwich ELISA was performed using hBNP (Sigma-Aldrich, Brain Native Peptide-32 human) or hproBNP (HyTest, Human recombinBinP) instead of hBNP (3-32). As a negative control, assay buffer containing only ALP-labeled BC23-11 was added, and measurement was performed in the same manner. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 2, when hBNP (3-32) was added, the fluorescence intensity was about 55 times that of the negative control, but when hBNP and hproBNP were added, the fluorescence intensity was the same as that of the negative control. This indicates that the immobilized 9-21O-3P-11A antibody binds to hBNP (3-32), but not to hBNP and hproBNP. That is, it was revealed that the 9-21O-3P-11A antibody is an antibody specific for hBNP (3-32).
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