JP2014077733A - 分析用チップ、分析装置及び分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】培養法に準ずる方法により、培養法の利点を生かしつつ迅速性にも優れた分析用チップ等を提供する。
【解決手段】分析用流路（液滴保持部）２５は、分析対象の微小個体が同時に１つだけ通過可能な内径が設定された流路である。ノズル部（液滴生成部）２４は、微小個体と該微小個体の培養液とが混合したサンプル液を分析用流路２５に注入するとともに、注入されるサンプル液を挟み込むようにして分離液を微小流路に注入することにより、微小個体が１つ含まれるか又は全く含まれていないサンプル液の複数の液滴を分析用流路２５内に生成する。
【選択図】図２

Description

本発明は、分析用チップ、分析装置及び分析方法に関する。

微生物の同定、活性度合い、成長度合いを評価する方法、例えば、食材や飲料水などに含まれる生菌の計数方法として、培養法及びＡＴＰ（アデノシン三リン酸）法が多用されている。

培養法は、対象とする細菌に適合する培地に試料を播き、対象細菌の存在によって形成されるコロニーを計数することで、生菌数を的確に知ることができる。また、培養法は、菌の活性度合いや、培地の選定により菌種を同定することも可能である（例えば、特許文献１参照）。

ＡＴＰ法は、試料中に含まれる細菌を溶解させたのち、総ＡＴＰ量を蛍光測定などで計測する方法である（例えば、特許文献２参照）。

さらに、フローサイトメータを用いて、対象とする細菌に固有の抗体を用いて蛍光染色し、フローセルにて観測する方法もある。

特開２００６−１９１８１７号公報 特開２００９−１３９１１５号公報

培養法は、生きている菌のみを判別可能であり、さらに培地の選定により菌の種別までも同定可能である。しかしながら、培養法は、目視で判断可能になるまで１〜３日程度必要である。このため、培養法は、迅速性に欠けるうえ、操作が面倒である。また、培養法は、菌数測定等に希釈倍率の事前設定が必要になるなどのスキルを必要とする。

一方、ＡＴＰ法は、迅速性に優れている。しかしながら、ＡＴＰ法は、細菌の活性度によって内部に含まれているＡＴＰ量に差異があり、細菌数の正確な同定が困難である。

また、フローサイトメータを用いる方法も、２時間程度で計測が可能になるなど迅速性には優れている。しかしながら、この方法にも、生菌・死菌の判別が困難、活性度合い、成長度合いの評価が困難等の問題がある。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、培養法に準ずる方法により、培養法の利点を生かしつつ迅速性にも優れた分析用チップ、分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明の第１の観点に係る分析用チップは、
分析対象の微小個体が同時に１つだけ通過可能な内径が設定された微小流路である液滴保持部と、
前記微小個体と、該微小個体の培養液とが混合したサンプル液を前記微小流路に注入するとともに、注入される前記サンプル液を挟み込むようにして分離液を前記微小流路に注入することにより、前記微小個体が１つ含まれるか又は全く含まれていない前記サンプル液の複数の液滴を前記微小流路内に生成する液滴生成部と、
を備える。

この場合、前記液滴保持部では、
前記微小流路が、矩形に折り曲げられて形成されている、
こととしてもよい。

また、前記液滴保持部では、
前記微小流路が、渦巻き状に形成されている、
こととしてもよい。

前記液滴保持部では、
前記微小流路が、複数に枝分かれしている、
こととしてもよい。

本発明の第２の観点に係る分析装置は、
本発明の分析用チップと、
前記分析用チップに、微小個体と、該微小個体の培養液と、該培養液及び前記微小個体が混合したサンプル液を複数の液滴に分離するための分離液とを供給する供給部と、
前記分析用チップから排出された廃液を回収する廃液部と、
前記分析用チップに保持された複数の液滴に対して、前記微小個体の特性を計測する計測部と、
を備える。

この場合、前記計測部で計測された前記微小個体の特性に基づく分析結果を表示する表示部をさらに備える、
こととしてもよい。

本発明の第３の観点に係る分析方法は、
分析対象の微小個体が同時に１つだけ通過可能な内径が設定された微小流路に、前記微小個体と、該微小個体の培養液とが混合したサンプル液を注入するとともに、注入される前記サンプル液を挟み込むようにして分離液を前記微小流路に注入することにより、前記微小個体が１つ含まれるか又は全く含まれていない前記サンプル液の複数の液滴を前記微小流路内に生成する第１の工程と、
前記微小流路内に注入された直後の複数の液滴に対して前記微小個体の特性を計測する第２の工程と、
前記微小流路内で、前記液滴を一定期間保持する第３の工程と、
一定期間保持された複数の液滴に対して前記微小個体の特性を計測する第４の工程と、
前記第２の工程で計測された特性と、前記第４の工程で計測された特性の変化を求める第５の工程と、
を含む。

本発明によれば、微小個体が１つ含まれるか、又は全く含まれていないサンプル液の複数の液滴を生成することができる。この液滴に含まれる微小個体の数は、最大でも１つであるから、培養等に伴う特性の変化（液滴内の物性変化等）が鋭敏になるため、培養等の初期の段階で細菌を検出することができる。この結果、培養法に準ずる方法により、培養法の利点を生かしつつ迅速性にも優れた分析が可能となる。

本発明の実施の形態１に係る分析装置の構成を示すブロック図である。 図１の分析用チップの上面図である。 図２の分析用チップのノズル構造の部分の拡大図である。 分析方法のフローチャートである。 図５（ａ）乃至図５（ｄ）は、大腸菌が分裂する前後の様子を示す図である。 分析用チップの構成の他の例を示す図である。 分析装置の構成の他の例を示す図である。

この発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

図１には、本実施の形態１に係る分析装置１００の構成が示されている。分析装置１００は、特定の微生物、細菌、細胞などの微小固体に対する分析を行う装置である。すなわち、本実施の形態では、この微小固体が分析対象である。以下では、微小個体をサンプルともいう。

図１に示すように、分析装置１００は、分析モジュール１と、表示部２とを備える。分析モジュール１は、分析対象の分析を行ってその分析結果を出力する。表示部２は、その分析結果を表示する。

分析モジュール１は、分析用チップ１０と、サンプル供給部１１と、培養液供給部１２と、分離液供給部１３と、廃液部１４と、流体制御部１５と、計測部１６と、信号処理部１７とを備える。

分析用チップ１０には、分析対象を含む複数の液滴が封止され保持される流路（液滴保持部）が設けられている。流路の詳細については後述する。

サンプル供給部１１は、分析用チップ１０に分析対象の微小個体（サンプル）を供給する。培養液供給部１２は、分析用チップ１０に培養液を供給する。サンプルと培養液とが混合して、サンプル液となる。

分離液供給部１３は、分析用チップ１０に分離液を供給する。分離液は、サンプルや培養液と混合することのない、界面活性を有する油状の液体である。廃液部１４は、分析用チップ１０から排出される廃液を回収する。

流体制御部１５は、サンプル供給部１１からの分析用チップ１０へのサンプルの供給状態を制御する。また、流体制御部１５は、培養液供給部１２から分析用チップ１０への培養液の供給状態を制御する。また、流体制御部１５は、分離液供給部１３から分析用チップ１０への分離液の供給状態を制御する。また、流体制御部１５は、分析用チップ１０からの廃液の排出状態を制御する。これらの制御は、例えば、分析用チップ１０と、サンプル供給部１１、培養液供給部１２、分離液供給部１３、廃液部１４との間に設けられたバルブを開閉することにより行われる。

流体制御部１５の制御により、サンプル液（サンプル及び培養液）と分離液とは、分析用チップ１０に供給される。流体制御部１５は、サンプル及び培養液のサンプル液の混合比率と、サンプル液と分離液との流速比とを所定の比率に調整する。分析用チップ１０の流路内にサンプル、培養液、分離液が満たされた状態で、流体制御部１５が、分析用チップ１０と、廃液部１４との間のバルブを閉じることにより、分析用チップ１０の流路内にサンプル液の複数の液滴及び分離液が封入され、保持される。

計測部１６は、分析用チップ１０に封入され保持されたサンプル液の液滴に対する各種計測を行う。このような計測には、画像計測、散乱光、蛍光、光吸収スペクトル等のスカラー光の情報の計測、ｐＨ、電気伝導度、粘性等の液滴の物性の計測などがある。

信号処理部１７は、計測部１６の計測データに対する信号処理を行う。信号処理部１７による信号処理の結果は、表示部２に出力される。表示部２は、その信号処理の結果を表示する。

図２には、本実施形態に係る分析用チップ１０の上面図が示されている。分析用チップ１０は、１個の分析対象の微小固体を含むか、又は微小固体を含んでいない微小液滴を多数形成するためのものである。図２に示すように、分析用チップ１０には、分離液供給ポート２０と、分離液供給流路２１と、サンプル液供給ポート２２と、サンプル液供給流路２３と、ノズル部２４と、分析用流路２５と、廃液ポート２６と、が設けられている。

分離液供給ポート２０には、分離液供給部１３から分離液が供給される。分離液供給ポート２０は、分離液供給流路２１に連通している。分離液供給ポート２０から供給された分離液は、分離液供給流路２１に流れ込む。

サンプル液供給ポート２２には、サンプル供給部１１から供給されるサンプルと、培養液供給部１２から供給された培養液とが混合したサンプル液が供給される。サンプル液供給ポート２２は、サンプル液供給流路２３に連通している。サンプル液供給ポート２２に供給されたサンプル液は、サンプル液供給流路２３に流れ込む。

ノズル部２４は、分離液供給流路２１と、サンプル液供給流路２３と、分析用流路２５とを連通している。図３に示すように、ノズル部２４では、サンプル液供給流路２３から供給されるサンプル液（微小個体と、微小個体の培養液とが混合したサンプル液）を分析用流路２５に注入するとともに、注入されるサンプル液を挟み込むようにして、分離液供給流路２１から分離液を分析用流路２５に注入する。これにより、図３に示すように、分離液に包まれた液滴３０が形成される。この液滴は、サンプルを１つ含むか、全く含んでいない。各液滴３０は、分析用流路２５を流れる。分析終了後、各液滴３０は、分離液とともに廃液ポート２６から廃液される。

すなわち、分析用チップ１０には、分析対象となる微小固体を含む液滴３０を形成するために、微小固体を含んだサンプル液の両脇から油性の液体を挟みこむノズル構造が設けられている。

このように、分析用チップ１０には、大量の液滴３０を保持し培養するために、分析用流路２５が設けられている。この分析用流路２５が、液滴保持部である。分析用流路２５は、分析対象の微小個体が同時に１つだけ通過可能な内径が設定された微小流路である。分析用流路２５を長くするために、分析用流路２５は矩形状に折り曲げられて形成されている。例えば、サンプルを大腸菌とすると、流路の長さは、３００ｍｍ程度となり、断面は理想的には小さい方がよく、例えば５０μｍ×５０μｍ程度を用いる。

（分析方法）
次に、分析装置１００を用いた分析方法について説明する。

まず、液滴を形成する（ステップＳ１）。具体的には、分析用流路２５の前後のバルブを開け、分析対象の微小個体が同時に１つだけ通過可能な内径が設定された分析用チップ１０の分析用流路２５に、ポンプを用いて、微小個体を含むサンプル液を注入する。また、これと同時に、ポンプを用いて、注入されるサンプル液を挟み込むようにして分離液を分析用流路２５に注入することにより、微小個体が１つ含まれるか又は全く含まれていないサンプル液の複数の液滴を分析用流路２５内に生成する。これにより、少なくとも１個以下の微小個体をその内部に含んだ液滴３０が、分析用流路２５内に連続的に形成される。各液滴３０の中には、微小個体が含まれているものがある。そして、流体制御部１５により、分析用流路２５の前後のバルブが閉じられる。

続いて、微小流路内に注入された直後の複数の液滴に対して微小個体の特性を計測する（ステップＳ２）。この計測が、前計測である。

続いて、微小流路内で、液滴を一定期間保持する（ステップＳ３）。例えば、液滴３０内の微小個体を一定時間（１時間程度）培養する。この結果、培養液により細菌が培養される。細菌が生きていれば、液滴内の細菌は分裂して増殖する。

続いて、一定期間保持された複数の液滴に対して微小個体の特性を計測する。すなわち、後計測を行う（ステップＳ４）。

続いて、前計測の計測結果と、後計測の計測結果との差分を抽出する（ステップＳ５）。さらに、抽出された差分を表示部２に表示する（ステップＳ６）。ここでは、例えば、差異のあった、すなわち特性に変化のあった液滴の数を計測することで生菌数を同定することができるし、差異の大きさ、すなわち特性の変化量そのもので細菌の活性度等を見ることも可能である。

続いて、流体制御部１５により、分析用流路２５の前後のバルブを開いて、廃液部１４への廃液を行う（ステップＳ７）。

以上詳細に説明したように、本実施の形態によれば、微小個体が１つ含まれるか、又は全く含まれていないサンプル液の複数の液滴３０を生成することができる。この液滴３０に含まれる微小個体の数は、最大でも１つであるから、培養等に伴う変化（液滴内の物性変化等）が鋭敏になるため、培養等の初期の段階で微小個体を検出することができる。この結果、培養法に準ずる方法により、培養法の利点を生かしつつ迅速性にも優れたものとすることができる。

（実施例）
作製した分析用チップ１０を用いて各液滴３０の形成と保持条件を検討した。

分析用チップ１０の分析用流路２５等の流路は、例えば、厚膜レジスト（ＳＵ−８）を用いて、流路パターンをシリコン樹脂ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）に転写成形することで作製した。その後、型成形されたＰＤＭＳの表面をプラズマ（５ｍＡ、４５秒間）で活性化させ、スライドガラスと貼り合わせることにより、流路を有する分析用チップ１０を作製した。最後にサンプル液が壁面を汚さないようにするために、流路の内壁をＨＭＤＳ（Hexamethyldisilazane）を用いて表面処理を行い、疎水性とした。

実験に用いる菌としては、大腸菌（Escherichia coli K-12株）を用いた。この大腸菌を液体培地であるＢＬ培地に懸濁させたものをサンプル液とした。分離液としては、フロリナートとサラダ油を検討した結果、クライトックスを０．１％含んだフロリナートが良好であることがわかった。クライトックスは、界面活性剤の性質を有しているので、界面の状態を安定させることができるうえ、液滴３０同士が合体することなく、ほぼ等間隔に流路内を流れることを確認した。液滴３０を形成するために、フロリナートを相対的に多く流す必要があるので、フロリナートの流量を１０μｌ／ｍｉｎとしサンプル液の流量を１μｌ／ｍｉｎとした。これにより、分析用流路２５内に直径約１００μｍの液滴３０が形成された。

この分析用チップ１０を用いて大腸菌の培養を行った。ここでは、大腸菌が培養液下で分裂する、いわゆる世代時間は早いもので２０分程度であるが、数世代の変化を記録することを目的に観測時間を６時間に設定した。

実験手順として、まず、分析用流路２５内で、液滴を形成して廃液ポート２６まで液滴が流れたことを確認して、廃液部との間のバルブを閉じるなどして、フロリナートとサンプル液の流動を停止する。そして、大腸菌が存在する液滴を探索し、そこにフォーカスして自動撮影を行った。

図５（ａ）乃至図５（ｄ）には、大腸菌が分裂する前後の様子が示されている。図５（ａ）は、液滴３０全体の画像である。図５（ｂ）は、大腸菌が分裂する直前の画像であり、希釈後３０分経過したときの画像である。図５（ｃ）は、分裂した直後の画像であり、図５（ｄ）はその後の画像である。このように、液滴３０内で大腸菌が分裂したことを確認することができた。

このように、分析用チップ１０を用いて、大腸菌を含んだ液滴３０を形成し、微小流路内に液滴３０を長時間保持することが可能であることを確認した。また、液滴３０内で大腸菌を培養し、液滴形成後、３０分後に２つに分離する様子を確認した。

なお、分析用チップ１０の構成は、図２に示すものには限られない。例えば、図６には、分析用チップ１０の構成の他の例が示されている。図６に示すように、マイクロ液滴３０を生成できるのであれば、ノズル部２４に分離液供給流路２１が１つだけ連通していてもよい。

また、図６に示すように、検出部２７、２８が設けられていてもよい。この場合には、検出部２７、２８に送られた微小液滴３０について計測部１６による計測が行われることになる。

また、液滴保持部（微小流路）は、渦巻き状に形成されていてもよいし、複数に枝分かれしていてもよい。

図１に示す分析装置１００は、分析モジュール１と表示部２とが分離されたものであった。しかしながら、分析装置１００は、図７に示すように、分析モジュール１と表示部２とが一体となっていてもよい。

図１に示す構成を有する分析装置１００は、いわゆるオンサイト型の装置として利用することができる。オンサイト型の装置では、分析モジュール１が表示部２と離隔した遠隔地に設置されるのを考慮して、計測方法をできるだけ簡便な方法を１つだけ採用するのが望ましい。

一方、図７に示す構成を有する分析装置１００は、分析モジュール１と表示部２とが一体となっている。このような分析装置１００は、いわゆるスタンドアロン型の装置として利用することができる。スタンドアロン型の装置は、遠隔地に置いて計測を行うのには向いていないが、その反面、計測部１６で、複数種類の方法を同時に用いるようにしてもよい。このようにすれば、計測結果をより高精度なものとすることができる。

また、サンプル液に薬剤を混入しておき、細菌に対する薬剤の反応を見るようにしてもよい。

また、上記実施の形態では、主に、細菌を分析対象としたが、本発明はこれには限られない。例えば、分析対象を細胞とし、例えば、その細胞の活性度又は薬剤応答性を分析するのにも、本発明は有用である。また、細菌以外の微生物を分析対象とすることができる。

また、分析チップ１０は、細菌を単離するのにも用いることができる。例えば硝酸などを分解する細菌を含むサンプルに硝酸を混ぜたものを、分析用チップ１０を用いて液滴化し、硝酸濃度の低くなった液滴３０を、排出して取り出すようにすればよい。

また、上記実施の形態では、サンプルと培養液を混合したサンプル液を分析用チップ１０に注入したが、サンプルと培養液とを別々に分析用チップ１０に注入し、分析用チップ１０内でそれらを混合するようにしてもよい。

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本発明は、微生物、細菌又は細胞の同定、活性度合い、成長度合いを評価するのに好適である。特に、大腸菌などの生細菌の種類の判別や、その活性度を評価するための培養法に代わる迅速な分析・観測法として好適である。

１ 分析モジュール
２ 表示部
１０ 分析用チップ
１１ サンプル供給部
１２ 培養液供給部
１３ 分離液供給部
１４ 廃液部
１５ 流体制御部
１６ 計測部
１７ 信号処理部
２０ 分離液供給ポート
２１ 分離液供給流路
２２ サンプル液供給ポート
２３ サンプル液供給流路
２４ ノズル部（液滴形成部）
２５ 分析用流路（液滴保持部）
２６ 廃液ポート
２７、２８ 検出部
３０ 液滴
１００ 分析装置

Claims (7)

1. 分析対象の微小個体が同時に１つだけ通過可能な内径が設定された微小流路である液滴保持部と、
   前記微小個体と、該微小個体の培養液とが混合したサンプル液を前記微小流路に注入するとともに、注入される前記サンプル液を挟み込むようにして分離液を前記微小流路に注入することにより、前記微小個体が１つ含まれるか又は全く含まれていない前記サンプル液の複数の液滴を前記微小流路内に生成する液滴生成部と、
   を備える分析用チップ。
2. 前記液滴保持部では、
   前記微小流路が、矩形に折り曲げられて形成されている、
   請求項１に記載の分析用チップ。
3. 前記液滴保持部では、
   前記微小流路が、渦巻き状に形成されている。
   請求項１に記載の分析用チップ。
4. 前記液滴保持部では、
   前記微小流路が、複数に枝分かれしている、
   請求項１に記載の分析用チップ。
5. 請求項１乃至４のいずれか一項に記載の分析用チップと、
   前記分析用チップに、微小個体と、該微小個体の培養液と、該培養液及び前記微小個体が混合したサンプル液を複数の液滴に分離するための分離液とを供給する供給部と、
   前記分析用チップから排出された廃液を回収する廃液部と、
   前記分析用チップに保持された複数の液滴に対して、前記微小個体の特性を計測する計測部と、
   を備える分析装置。
6. 前記計測部で計測された前記微小個体の特性に基づく分析結果を表示する表示部をさらに備える、
   請求項５に記載の分析装置。
7. 分析対象の微小個体が同時に１つだけ通過可能な内径が設定された微小流路に、前記微小個体と、該微小個体の培養液とが混合したサンプル液を注入するとともに、注入される前記サンプル液を挟み込むようにして分離液を前記微小流路に注入することにより、前記微小個体が１つ含まれるか又は全く含まれていない前記サンプル液の複数の液滴を前記微小流路内に生成する第１の工程と、
   前記微小流路内に注入された直後の複数の液滴に対して前記微小個体の特性を計測する第２の工程と、
   前記微小流路内で、前記液滴を一定期間保持する第３の工程と、
   一定期間保持された複数の液滴に対して前記微小個体の特性を計測する第４の工程と、
   前記第２の工程で計測された特性と、前記第４の工程で計測された特性の変化を求める第５の工程と、
   を含む分析方法。