JP2014019658A - Anti-s977 phosphorylated per2 specific antibody - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新たに見出したリン酸化PER2タンパク質に対するモノクローナル抗体（抗−Ｓ９７７リン酸化ＰＥＲ２特異的抗体）とこの抗体を用いた抗気分障害治療薬の候補化合物のスクリーニング方法に関し、更には、該抗体を産生するハイブリドーマ、ならびに、変異PER2タンパク質を発現するノックインマウスに関する。 The present invention relates to a newly discovered monoclonal antibody against phosphorylated PER2 protein (anti-S977 phosphorylated PER2-specific antibody) and a screening method for candidate compounds for anti-mood disorders using this antibody, and further to the antibody And a knock-in mouse expressing a mutant PER2 protein.
うつ病のような気分障害は、抑うつ気分、気力の損失、食欲の低下、睡眠障害、精神機能制止などを含む特異的な症状を示す複雑な精神疾患である。ヒトゲノムがマッピングされ、最近は多くの最先端の技術が開発されているにもかかわらず、気分障害を含む精神病と関連する分子および細胞レベルの機構はほとんどわかっていない。 Mood disorders such as depression are complex mental illnesses that exhibit specific symptoms including depressed mood, loss of power, loss of appetite, sleep disorders, and mental function arrest. Despite the mapping of the human genome and the development of many state-of-the-art technologies, the molecular and cellular mechanisms associated with psychosis, including mood disorders, are largely unknown.
ほぼ24時間の周期を有する概日リズムは、ほぼすべての生物がその生理機能を24時間の自転周期を有する地球の環境に適合させることにおいて重要である。過去10年間にわたる概日時計の分子機構に関する多くの研究により、Per2およびBmal1のような時計遺伝子の連動したフィードバック・ループが明らかにされている。例えば、Per突然変異はショウジョウバエにおいて概日リズムの異常を誘導し、PER2のリン酸化部位の点突然変異は睡眠相前進症候群(ASPS)と呼ばれる睡眠障害を誘導する。これらの知見は、遺伝子と行動とがこの生物系において密接にリンクしているという明確な証拠を提供している。哺乳動物の概日時計の一次入力刺激は光であるが、哺乳動物における摂食および温度ならびにヒトにおける社会的なきっかけも誘引要素になり得る。哺乳動物の概日中心は視床下部前部の視交叉上核（SCN）に位置し、視床下部と脳の残りの部分との間には直接的および間接的な両方の解剖学的な連結が存在する。視床下部の解剖学的なアウトプットは、就寝−起床の周期およびホルモン分泌を含む多様な現象に関連している。生物時計または時計遺伝子の機能不全はジェットラグおよび交代勤務の問題のみならず、肥満および癌にも寄与している。 A circadian rhythm with a period of approximately 24 hours is important in adapting the physiology of almost all living organisms to the Earth's environment with a 24-hour rotation period. Many studies on the molecular mechanism of circadian clocks over the past decade have revealed feedback loops linked to clock genes such as Per2 and Bmal1. For example, the Per mutation induces circadian rhythm abnormalities in Drosophila, and the point mutation at the phosphorylation site of PER2 induces a sleep disorder called sleep phase advance syndrome (ASPS). These findings provide clear evidence that genes and behavior are closely linked in this biological system. The primary input stimulus of a mammalian circadian clock is light, but feeding and temperature in mammals and social triggers in humans can also be attractive factors. The circadian center of mammals is located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the anterior hypothalamus, and there are both direct and indirect anatomical connections between the hypothalamus and the rest of the brain. Exists. Hypothalamic anatomical output is associated with a variety of phenomena including bedtime-wake-up cycles and hormone secretion. Biological clock or clock gene dysfunction contributes not only to jet lag and shift work but also to obesity and cancer.
幾つかの系統の間接事実は、気分障害と概日時間における機能不全との間に関係が存在することを示唆している。例えば、睡眠障害のような概日リズムの異常が気分障害患者において観察される場合がある。事実、光療法は季節性気分障害および他の気分障害に有効である場合がある。さらに、患者を規則正しい睡眠および社会スケジュールに維持する対人関係・社会リズム療法も、双極性障害の軽減に有効である。気分障害のヒトに共通する概日リズムを含む一定範囲の恒常性の兆候を評価に取り込むことは、動物モデルへ有用な対象を加えることとなり得る。 Indirect facts of several strains suggest that a relationship exists between mood disorders and dysfunction at circadian time. For example, circadian rhythm abnormalities such as sleep disorders may be observed in mood disorder patients. In fact, light therapy may be effective for seasonal mood disorders and other mood disorders. In addition, interpersonal / social rhythm therapy that maintains patients on regular sleep and social schedules is also effective in reducing bipolar disorder. Incorporating a range of homeostatic signs, including circadian rhythms common to people with mood disorders, into the assessment can add useful subjects to animal models.
以前、本発明者は、重篤な生体ストレスは概日リズムに影響しないことを示した。現在の研究においては、より多くの時計遺伝子が同定され、概日リズムの定量的アッセイも改良されているため、本発明者は、気分の分裂が概日時計にリンクしているのか、またどのようにリンクしているのかをさらに評価した。初期の実験において、本発明者は、気分障害の動物モデルであるLH（学習性無力）ラットが概日活動リズムの周期短縮と関連していることを見出した。また、気分安定薬であるリチウムは、イン・ビトロ(in vitro)およびイン・ビボ(in vivo)の両方においてLHラットの概日リズム周期を延長することによって概日リズムを回復した。本発明者は、GSK3βに対するリチウムの作用、ならびにリン酸化したGSK3βがLHラットにおいては減少していることを示した。また、生化学、細胞生物学および行動の一連の解析により、GSK3βの下流エフェクターとしてPer2を同定した。 Previously, the inventor has shown that severe biological stress does not affect circadian rhythm. In the current study, more clock genes have been identified and quantitative assays for circadian rhythms have been improved so that the inventor can determine whether and how mood division is linked to the circadian clock. It was further evaluated how to link. In early experiments, the inventor found that LH (learning helpless) rats, an animal model of mood disorders, are associated with circadian activity rhythm shortening. Lithium, a mood stabilizer, also restored circadian rhythm by prolonging the circadian rhythm cycle of LH rats both in vitro and in vivo. The inventor has shown that the effect of lithium on GSK3β, as well as phosphorylated GSK3β is reduced in LH rats. Per2 was identified as a downstream effector of GSK3β through a series of biochemical, cell biology and behavioral analyses.
本発明者は、先に、概日活動リズムの周期を末梢細胞の概日リズム遺伝子のプロモーター活性をモニターすることによりイン・ビトロ(in vitro)で示し得ることを見出し、その知見に基づいて、生物時計調節遺伝子のプロモーターを利用したプロモーターアッセイ系を確立している（特許文献１）。 The present inventor previously found that the circadian activity rhythm cycle can be shown in vitro by monitoring the promoter activity of circadian rhythm genes in peripheral cells, and based on that finding, A promoter assay system using a biological clock regulatory gene promoter has been established (Patent Document 1).
かかる発明においては、気分障害のモデル動物である学習性無力（LH）ラットの概日リズムが正常ラットよりも短く、またそのイン・ビボ(in vivo)における現象を、生物時計調節遺伝子プロモーターに連結したレポーター遺伝子で形質転換した末梢細胞レベルでもモニターできることが開示されている。また、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βタンパク質（GSK3β）が生物時計調節遺伝子の発現活性に作用して、概日リズムに関与することが示唆されている。
しかしながら、GSK3βタンパク質は生体における多様な細胞機能の制御に関与していることから、GSK3βタンパク質レベルのモニターでは概日リズムに対する影響を正確にアッセイすることができないという課題があった。
また、一般的に、対象とする遺伝子の機能を解析する手段としてノックアウト動物が利用され、それを詳細に解析することにより対象としている遺伝子の生体内での機能を明らかにすることができる。しかしながら、破壊した遺伝子の産物の機能は、しばしばノックアウト動物の別の遺伝子産物によって代替される場合があるため、ノックアウト動物自体に目的とする表現型が現れてこない場合がある。また、破壊した遺伝子の産物が動物の発生／成育上必須であるために致死となり、目的とする遺伝子の機能の詳細な解析が事実上不可能な場合があるという課題もあった。
In this invention, the circadian rhythm of the learned helplessness (LH) rat, which is a model animal of mood disorder, is shorter than that of the normal rat, and the in vivo phenomenon is linked to the biological clock regulatory gene promoter. It is disclosed that it can be monitored even at the level of peripheral cells transformed with a reporter gene. In addition, it has been suggested that glycogen synthase kinase 3β protein (GSK3β) is involved in circadian rhythm by acting on the expression activity of biological clock regulatory genes.
However, since GSK3β protein is involved in the control of various cellular functions in the living body, there has been a problem that the influence on circadian rhythm cannot be accurately assayed by monitoring GSK3β protein level.
In general, a knockout animal is used as a means for analyzing the function of a target gene, and the function of the target gene in vivo can be clarified by analyzing it in detail. However, because the function of the product of the disrupted gene is often replaced by another gene product of the knockout animal, the desired phenotype may not appear in the knockout animal itself. In addition, there is a problem that the product of the disrupted gene is fatal because it is essential for the development / growth of animals, and detailed analysis of the function of the target gene may be virtually impossible.
本発明者は、かかる課題に鑑みて鋭意検討した結果、抗気分障害治療薬または気分障害改善物質が概日リズムに影響して発揮される抗気分障害または気分障害改善作用には、GSK3βの不活性化（リン酸化）増大によるPER2の特定のセリン残基のリン酸化の抑制が関与することを見出し、本発明を解決するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］抗気分障害治療薬の候補化合物（以下、候補薬剤ということがある。）をスクリーニングする方法であって、
（１）試験化合物と学習性無力（learned helplessness、LH）動物の細胞とを培地中でインキュベートし、その後、該細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；
（２）試験化合物不存在下でインキュベートしたLH動物細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；ついで
（３）試験化合物不存在下でインキュベートしたLH動物細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量と比較して、試験化合物とインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量が少ない場合に、該試験化合物を抗気分障害治療薬の候補化合物と判定することを含む該方法；
［２］該LH動物がLHラットまたはLHマウスである前記［１］記載の方法；
［３］該PER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションが、アミノ酸配列ポジション977である前記［１］または［２］記載の方法；
［４］該細胞が線維芽細胞または神経細胞である前記［１］ないし［３］いずれか１に記載の方法；
［５］配列番号：1のアミノ酸配列においてポジション977のセリンがリン酸化されたマウスPER2タンパク質；
［６］前記［５］記載のリン酸化マウスPER2タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体；
［７］配列番号：1のアミノ酸配列のポジション968−986のエピトープを認識する前記［６］記載のモノクローナル抗体；
［８］前記［７］記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ；
［９］PER2タンパク質のセリン残基のリン酸化量を前記［６］または［７］記載のモノクローナル抗体を用いて測定する前記［３］記載の方法；
［１０］配列番号：1のアミノ酸配列のポジション977のセリンが他のアミノ酸残基に置換された変異PER2を発現するノックインマウス；
［１１］該他のアミノ酸残基がトレオニンおよびチロシン以外のアミノ酸残基である前記［９］記載のノックインマウス；
［１２］該他のアミノ酸残基がアラニンである前記［９］または［１０］記載のノックインマウス
を提供する。
As a result of intensive studies in view of such problems, the present inventor has found that GSK3β is not effective for anti-mood disorders or mood disorder-improving actions exhibited by anti-mood disorder therapeutic agents or mood disorder-improving substances affecting circadian rhythm. It has been found that suppression of phosphorylation of a specific serine residue of PER2 by increased activation (phosphorylation) is involved, and the present invention has been solved.
That is, the present invention
[1] A method for screening a candidate compound (hereinafter sometimes referred to as a candidate drug) for an anti-mood disorder drug,
(1) Incubate test compounds and learned helplessness (LH) animal cells in a medium, and then measure the phosphorylation amount of serine residues at specific amino acid sequence positions of PER2 protein in the cells And
(2) The amount of serine residue phosphorylation at a specific amino acid sequence position of PER2 protein in LH animal cells incubated in the absence of the test compound was measured; and (3) LH animals incubated in the absence of the test compound. When the amount of phosphorylation of PER2 protein in cells incubated with the test compound is small compared to the amount of phosphorylation of PER2 protein in the cell, the test compound is determined to be a candidate compound for anti-mood disorder treatment The method comprising;
[2] The method according to [1] above, wherein the LH animal is an LH rat or an LH mouse;
[3] The method according to [1] or [2] above, wherein the specific amino acid sequence position of the PER2 protein is amino acid sequence position 977;
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the cell is a fibroblast or a nerve cell;
[5] Mouse PER2 protein in which serine at position 977 is phosphorylated in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
[6] A monoclonal antibody that specifically recognizes the phosphorylated mouse PER2 protein of [5] above;
[7] The monoclonal antibody according to the above [6], which recognizes an epitope at positions 968 to 986 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
[8] A hybridoma producing the monoclonal antibody according to [7] above;
[9] The method according to [3] above, wherein the amount of phosphorylation of the serine residue of PER2 protein is measured using the monoclonal antibody according to [6] or [7] above;
[10] A knock-in mouse expressing a mutant PER2 in which the serine at position 977 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid residue;
[11] The knock-in mouse according to [9], wherein the other amino acid residue is an amino acid residue other than threonine and tyrosine;
[12] The knockin mouse according to [9] or [10], wherein the other amino acid residue is alanine.
本発明は、第１の実施態様において、抗気分障害治療薬の候補化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法には、
（１）試験化合物と学習性無力（learned helplessness、LH）動物の細胞とを培地中でインキュベートし、その後、該細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；
（２）試験化合物不存在下でインキュベートしたLHマウス細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；ついで
（３）試験化合物不存在下でインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量と比較して、試験化合物とインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量が少ない場合に、該試験化合物を抗気分障害治療薬の候補化合物と判定することが含まれる。
１の形態において、本発明のスクリーニング方法に用いるLH動物の細胞は、例えば、LHラットまたはLHマウスの線維芽細胞または神経細胞が挙げられる。
また、１の形態において、本発明のスクリーニング方法においてリン酸化量を測定するセリン残基は、配列番号：1に示すマウスPER2タンパク質のアミノ酸配列ポジジョン977のセリン残基である。
１の形態において、試験化合物不存在下でインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量が、試験化合物とインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量の好ましくは１.１倍以上、より好ましくは１.３倍以上、さらに好ましくは１.４倍以上、最も好ましくは１.５倍以上である場合に、該試験化合物を抗気分障害治療薬の候補化合物と判定することができる。ここで、本発明で言うところの試験化合物とは、本発明の発明のスクリーニング方法に供する化合物を意味し、抗気分障害治療薬の候補化合物とは、このスクリーニングによって、試験に供した多数の試験化合物の中から抗気分障害治療薬になる可能性の高いと思われる選別された化合物を意味し、該候補化合物はうつ病等の気分障害を抑制できる抗気分障害の作用を有する化合物、あるいはその逆の作用を有する化合物の両者を含めた一群の化合物を意味する。このような化合物は気分障害の病状を改善する治療薬を研究開発する上で有用な化合物となり得る。
PER2タンパク質のリン酸化量の定量は、例えば、イン・ビトロ(in vitro)キナーゼ・アッセイを用いてオートラジオグラフィーによるデンシトメトリーにより行うことができる。
In a first embodiment, the present invention provides a method for screening a candidate compound for a therapeutic drug for anti-mood disorder,
(1) Incubate test compounds and learned helplessness (LH) animal cells in a medium, and then measure the phosphorylation amount of serine residues at specific amino acid sequence positions of PER2 protein in the cells And
(2) Measure the amount of phosphorylation of serine residue at a specific amino acid sequence position of PER2 protein in LH mouse cells incubated in the absence of test compound; then (3) in cells incubated in the absence of test compound This includes determining the test compound as a candidate compound for the treatment of anti-mood disorders when the amount of phosphorylation of the PER2 protein in the cells incubated with the test compound is small compared to the amount of phosphorylation of the PER2 protein .
In one embodiment, the LH animal cells used in the screening method of the present invention include, for example, LH rat or LH mouse fibroblasts or neurons.
In one embodiment, the serine residue whose phosphorylation level is measured in the screening method of the present invention is the serine residue of amino acid sequence position 977 of mouse PER2 protein shown in SEQ ID NO: 1.
In one embodiment, the phosphorylation amount of PER2 protein in cells incubated in the absence of the test compound is preferably 1.1 times or more, more preferably, the phosphorylation amount of PER2 protein in cells incubated with the test compound. When the ratio is 1.3 times or more, more preferably 1.4 times or more, and most preferably 1.5 times or more, the test compound can be determined as a candidate compound for an anti-mood disorder drug. Here, the test compound referred to in the present invention means a compound to be used in the screening method of the present invention, and a candidate compound for an anti-mood disorder therapeutic agent is a number of tests used in the test by this screening. It means a selected compound that is likely to be an anti-mood disorder therapeutic agent among the compounds, and the candidate compound is a compound having an anti-mood disorder action capable of suppressing mood disorders such as depression, or the like It means a group of compounds including both compounds having the opposite action. Such compounds can be useful compounds for research and development of therapeutic agents that improve the mood of mood disorders.
Quantification of the amount of phosphorylation of PER2 protein can be performed, for example, by densitometry by autoradiography using an in vitro kinase assay.
本発明は、第２の実施態様において、リン酸化PER2タンパク質およびその抗気分障害治療薬の候補化合物をスクリーニングするための使用も包含する。１の形態において、リン酸化PER2タンパク質はリン酸化ラットPER2タンパク質またはリン酸化マウスPER2タンパク質であり、PER2タンパク質のアミノ酸配列のポジション977がリン酸化されている。リン酸化PER2タンパク質は、哺乳動物由来のリン酸化PER2タンパク質が好ましく、マウスまたはラット由来のリン酸化PER2タンパク質がより好ましい。あるいは、遺伝子工学技術を用いてPER2タンパク質を作製した後に、公知の方法に従ってその特定部位にリン酸基を付加して作製することもできる。
リン酸化PER2タンパク質は、好ましくは配列番号：1のアミノ酸配列においてポジション977のセリンがリン酸化されたタンパク質であり、配列番号：1において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつPER2と同様の作用／活性を有するタンパク質も包含される。
配列番号：1のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号：2で示されるポリヌクレオチドである。
In the second embodiment, the present invention also includes the use of the phosphorylated PER2 protein and its anti-mood disorder therapeutic drug for screening candidate compounds. In one form, the phosphorylated PER2 protein is phosphorylated rat PER2 protein or phosphorylated mouse PER2 protein, and position 977 of the amino acid sequence of the PER2 protein is phosphorylated. The phosphorylated PER2 protein is preferably a mammal-derived phosphorylated PER2 protein, and more preferably a mouse or rat-derived phosphorylated PER2 protein. Alternatively, a PER2 protein can be prepared using genetic engineering techniques, and then a phosphate group can be added to the specific site according to a known method.
The phosphorylated PER2 protein is preferably a protein in which the serine at position 977 is phosphorylated in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 1. A protein having a sequence and having the same action / activity as PER2 is also included.
The polynucleotide encoding the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2.
本発明は、第３の実施態様において、リン酸化PER2タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体は、公知の方法に従って生成することができ、好ましくは、配列番号：1のアミノ酸ポジション968−986のエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体である。また、本発明は、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマにも関する。 In the third embodiment, the present invention provides a monoclonal antibody that specifically recognizes phosphorylated PER2 protein. The monoclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method, and is preferably a monoclonal antibody that specifically recognizes the epitope at amino acid positions 968 to 986 of SEQ ID NO: 1. The present invention also relates to a hybridoma that produces the monoclonal antibody.
本発明は、第４の実施形態において、配列番号：1のアミノ酸配列のポジション977のセリン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異PER2タンパク質を発現するノックインマウスを提供する。他のアミノ酸残基としては、好ましくはアミノ酸のリン酸化を生じ得るトレオニンおよびチロシン以外のアラニン等のアミノ酸残基である。
本発明のノックインマウスにおいては、マウスPER2のアミノ酸配列のポジション977のセリンが、リン酸化を生じないアミノ酸残基に置換されているため、学習性無力（LH）表現型を示さない。
In the fourth embodiment, the present invention provides a knock-in mouse that expresses a mutant PER2 protein in which the serine residue at position 977 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid residue. The other amino acid residues are preferably amino acid residues such as alanine other than threonine and tyrosine that can cause phosphorylation of the amino acid.
In the knock-in mouse of the present invention, since the serine at position 977 in the amino acid sequence of mouse PER2 is substituted with an amino acid residue that does not cause phosphorylation, it does not exhibit a learning helplessness (LH) phenotype.
動物
オスの3週齢Sprague−Dawleyラット（体重120−150g）をSLC（浜松）から購入した。ラットは、明所12時間/暗所12時間のサイクル（LD）下、1ケージ当たり3匹を飼育し、その間は自由に飼料および水を与えた。
Cry1-/-マウスおよびCry2-/-マウスは大阪大学の藤堂博士から分譲を受けた。mPer2Brdm1マウス（C57BL/6−TyrC−Brd）はJackson研究所から購入した。Bmal1−ELucマウスは以前報告しているように作製した（Nakajimaら，2010）。この実験において動物を用いるすべてのプロトコルは、財団法人 大阪バイオサイエンス研究所および国立大学法人 広島大学の動物研究委員会によって承認されている。
Animals Male 3 week old Sprague-Dawley rats (body weight 120-150 g) were purchased from SLC (Hamamatsu). Rats were housed three per cage under a 12 hour light / dark 12 hour cycle (LD), with free access to food and water.
Cry1-/-mice and Cry2-/-mice were purchased from Dr. Todo of Osaka University. mPer2 Brdm1 mice (C57BL / 6-TyrC-Brd) were purchased from Jackson Laboratories. Bmal1-ELuc mice were generated as previously reported (Nakajima et al., 2010). All protocols using animals in this experiment have been approved by the Animal Research Committee of Osaka Bioscience Institute and Hiroshima University.
行動解析
活動リズムは以前報告したように測定した。LD拘束後に、赤外線活動記録装置（Biotex社、京都）を備えた個々のケージに入れ、LD下の活動リズムをモニターした。2週間後に、ラットを恒暗条件（DD）下で飼育し、その活動を1分間の活動を記録することによってモニターし続けた。ダブルプロット・アクトグラムはClockLab社（Actimetrics，IL）で作製した。ここではχ2ペリオドグラムを用いて、自発運動時間を推定した。
Behavioral analysis Activity rhythm was measured as previously reported. After LD restraint, each cage equipped with an infrared activity recording device (Biotex, Kyoto) was placed and the activity rhythm under the LD was monitored. Two weeks later, rats were housed under constant dark conditions (DD) and their activity continued to be monitored by recording 1 minute activity. Double plot actograms were generated by ClockLab (Actimetrics, IL). Here, χ 2 periodogram was used to estimate the spontaneous exercise time.
学習性無力
学習性無力（LH）は不可避ショック（IS）によって誘導し、逃避試験（ET）試行によって評価した。1および2日目に、ラットをステンレス鋼バーからなる格子床を備えたPlexiglasチャンバー（横460mm×深さ200mm×高さ180mm）に入れてIS条件付け（0.5mA、時間10秒、180試行）に付した。各々の試行は1−5秒の間隔で行った。つぎに、7および8日目に、これらのラットを再度ISに付した。対照ラットは45分間同じチャンバーに入れたが、ISには付さなかった。9日目にET（0.5mA、時間3秒、15試行）を行って、すべてのラットを評価した。各試行は30秒の間隔で行った。すべての処理は、恒暗条件下で行った。このETにおいては、ラットには2のチャンバーのうちの1のみにフット電気ショックを与えた。すなわち、もう1のチャンバーに飛び移れば、ラットは電気ショックを回避することができる。条件付けしたラットは、それらの逃避の遅延に基づいて2の群に分かれた。逃避しなかったことを、LHの測定としてカウントした。5回以下しか逃避しなかったラットはLHラットとして分類した。一方、6回以上逃避したラットは非学習性無力（NLH）ラットに分類した。すべてのラットの自発運動活性は4週間モニターした。4週間後に、すべてのラットをさらなるETに付した。ラットはこの実験の後に殺し、脳を取り出し、解剖して特定の脳領域を単離し、分析するまで直ちに−80℃で保存した。
Learning helplessness Learning helplessness (LH) was induced by inevitable shock (IS) and evaluated by escape test (ET) trial. On days 1 and 2, rats were placed in a Plexiglas chamber (460mm wide x 200mm deep x 180mm high) with a stainless steel bar grid floor for IS conditioning (0.5mA, time 10 seconds, 180 trials) It was attached. Each trial was performed at 1-5 second intervals. The rats were then subjected to IS again on days 7 and 8. Control rats were placed in the same chamber for 45 minutes but were not subjected to IS. On day 9, ET (0.5 mA, time 3 seconds, 15 trials) was performed to evaluate all rats. Each trial was performed at 30 second intervals. All treatments were performed under constant dark conditions. In this ET, rats received a foot electric shock in only one of the two chambers. That is, if jumping to the other chamber, the rat can avoid the electric shock. Conditioned rats were divided into two groups based on their escape delay. The inability to escape was counted as a measurement of LH. Rats that escaped 5 times or less were classified as LH rats. On the other hand, rats that escaped 6 times or more were classified as non-learning helpless (NLH) rats. The locomotor activity of all rats was monitored for 4 weeks. After 4 weeks, all rats were subjected to further ET. Rats were sacrificed after this experiment, brains were removed, dissected and specific brain regions were isolated and stored immediately at -80 ° C until analysis.
Bertonおよび共同研究者の方法に従ってマウスを用いてLH試験を行った。簡単には、1日目および2日目に、野生型およびPer2Brdm1マウスをPlexiglasチャンバー（横140mm×深さ100mm×高さ150mm）に入れ、不可避フット電気ショック（IS；格子状の床を通す120回の不可避フット電気ショック、0.4mA、時間5秒間）に付した。ISは25−30秒の間隔をおいてほぼ1時間にわたってランダムに付した。「不可避フット電気ショックに付さなかった」動物は、同じ装置に1時間置いた。3日目に、マウスを逃避試験用のシャトルボックスに入れた。ETには15の連続する逃避試行を含めた。マウスを入れた1のコンパートメントに電気ショックを与え、もう1のコンパートメントには電気ショックを与えなかった。マウスが反対側のコンパートメントに逃避した場合は電気ショックを止め、逃避の遅延を記録した。電気ショックを与えていないコンパートメントにマウスが25秒以内に逃避しない場合は、試行を終了し、「逃避しなかった」とした。LH（5回未満の非逃避）および非LH（その他）の状態に分類し、各状態の発生比率を計算した。 LH tests were performed using mice according to Berton and collaborators' methods. Briefly, on day 1 and 2, wild-type and Per 2Brdm1 mice are placed in a Plexiglas chamber (140 mm wide x 100 mm deep x 150 mm high) and passed through an unavoidable foot electric shock (IS; latticed floor) 120 inevitable foot electric shocks, 0.4 mA, time 5 seconds). IS was randomly applied for approximately 1 hour at intervals of 25-30 seconds. Animals "not subject to inevitable foot electric shock" were placed on the same device for 1 hour. On the third day, mice were placed in an escape test shuttle box. The ET included 15 consecutive escape attempts. An electric shock was given to one compartment containing the mouse, and no electric shock was given to the other compartment. If the mouse escaped to the opposite compartment, the electric shock was stopped and the escape delay was recorded. If the mouse did not escape within 25 seconds in a compartment that did not receive an electric shock, the trial was terminated and “not escaped”. It was classified into LH (less than 5 non-escapes) and non-LH (others) states, and the incidence of each state was calculated.
長期リチウム療法
LHラットを2の群にランダムに分けた。対照群には水を与え（対照）、試験群にはその飲料水中に20mMのLiClまたはその飼料ペレット上に20mMのLi2CO3を4週間与えた。すべてのラットの運動活性を4週間モニターした。4週間後に、すべてのラットをさらなるETに付した。
Long-term lithium therapy
LH rats were randomly divided into 2 groups. The control group received water (control) and the test group received 20 mM LiCl in its drinking water or 20 mM Li 2 CO 3 on its feed pellet for 4 weeks. The motor activity of all rats was monitored for 4 weeks. After 4 weeks, all rats were subjected to further ET.
フィーダー細胞（MEF）はE16.5の胎芽を収穫することによって収集した。頭部およびすべての赤色器官を取り除いた後に、残りの組織を手術用メスで細片に切断した。これらの細片をトリプシン処理し、3%CO2中、10%ダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）を用いて培養した。 Feeder cells (MEF) were harvested by harvesting E16.5 embryos. After removing the head and all red organs, the remaining tissue was cut into strips with a scalpel. These strips were trypsinized, in 3% CO 2, were cultured using 10% Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM).
Rev−erbα-/-およびGSK3β-/-のMEFは各々、Schibler博士およびWoodgett博士から分譲を受けた。対照およびLHラットの線維芽細胞は鼠径部真皮の切片から収集した。この切片はトリプシン処理し、3%CO2中、10%のDMEMを用いて培養した。 Rev-erbα-/-and GSK3β-/-MEFs were ordered from Dr. Schibler and Dr. Woodgett, respectively. Control and LH rat fibroblasts were collected from inguinal dermal sections. The sections were trypsinized in 3% CO 2, and incubated with 10% DMEM.
イン・ビトロ(in vitro)キナーゼ・アッセイ
組換えGSK3βをイン・ビトロ(in vitro)キナーゼ・アッセイに使用した。完全長タンパク質をコードするcDNAをpGEX6P-1（Qiagen社，Venlo，Netherland）のベクターにサブクローニングした。この発現ベクターをBL21（DE3）E．coli発現系（Invitrogen社，CA）に形質転換した。グルタチオンSepharose 4B（GE Healthcare，UK）を用いて、製造業者プロトコルに従ってGST−GSK3βを精製した。GST−GSK3βはPre Scissionプロテアーゼによって切断した。PER2、BMAL1、CLOCK、NPAS2、REV−ERBα、CRY1およびCRY2のGST融合タンパク質をキナーゼ・アッセイ用の基質として使用した。これらのGST−融合タンパク質は、GST−GSK3βについての記載と同様にして作製した。
キナーゼ反応は、50mM Tris−HCl、pH7.4、10mM MgCl2、1mM β−メルカプトエタノールおよび50μM ATPを含む緩衝液中、30℃にて60分間行った。SDS−PAGEサンプル緩衝液を添加することによって反応を終了させ、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。また、これらの試料はクーマシーブリリアントブルー（CBB）染色に付して、基質の分子量を確認した。
In Vitro Kinase Assay Recombinant GSK3β was used in an in vitro kinase assay. The cDNA encoding the full-length protein was subcloned into the vector of pGEX6P-1 (Qiagen, Venlo, Netherlands). This expression vector was designated as BL21 (DE3) E. E. coli expression system (Invitrogen, CA) was transformed. GST-GSK3β was purified using glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare, UK) according to the manufacturer's protocol. GST-GSK3β was cleaved by Pre Scission protease. PER2, BMAL1, CLOCK, NPAS2, REV-ERBα, CRY1 and CRY2 GST fusion proteins were used as substrates for kinase assays. These GST-fusion proteins were made as described for GST-GSK3β.
The kinase reaction was performed at 30 ° C. for 60 minutes in a buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl 2 , 1 mM β-mercaptoethanol and 50 μM ATP. The reaction was terminated by adding SDS-PAGE sample buffer and subjected to 10% polyacrylamide gel electrophoresis. These samples were subjected to Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining to confirm the molecular weight of the substrate.
イン・ビトロ（in vitro）プルダウン・アッセイ
GSK3β、PER2、BMAL1、CLOCK、NPAS2、REV−ERBα、CRY1およびCRY2のGST融合タンパク質は、イン・ビトロ(in vitro)キナーゼ・アッセイについて記載したのと同様にして作製した。GST−GSK3βタンパク質はPre Scissionプロテアーゼを用いて切断した。GST融合タンパク質をグルタチオンSepharose 4B（GE Healthcare社）に結合させ、GSK3βタンパク質と混合した。ついで、その混合物を20mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM EDTA、150mM NaCl、1% Nonidet P-40、5% グリセリン、5mM β-メルカプトエタノール、10mg/ml アプロチニン、10mg/ml ロイペプチンおよび1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含むTNE緩衝液で3回洗浄し、SDSサンプル緩衝液に再懸濁した。その試料をイムノブロット・アッセイによって分析した。
In vitro pull-down assay
GST fusion proteins of GSK3β, PER2, BMAL1, CLOCK, NPAS2, REV-ERBα, CRY1 and CRY2 were made as described for the in vitro kinase assay. GST-GSK3β protein was cleaved using Pre Scission protease. GST fusion protein was conjugated to glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare) and mixed with GSK3β protein. The mixture was then mixed with 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 5% glycerin, 5 mM β-mercaptoethanol, 10 mg / ml aprotinin, 10 mg / ml leupeptin and 1 mM phenyl. Washed 3 times with TNE buffer containing methylsulfonyl fluoride (PMSF) and resuspended in SDS sample buffer. The sample was analyzed by immunoblot assay.
イムノブロット分析
COS−7細胞は10% ウシ胎児血清を補充したDMEM中に維持した。細胞を、製造業者プロトコルに従ってLipofectAmine 2000（Invitrogen社）を用いてmPer1-3、mGSK3β、mBmal1、mClock、mNpas2、mRev-erbα、mCry1およびmCry2配列を含む発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトしたCOS−7細胞はTNE緩衝液中で溶解した。免疫沈降のために、そのライセートを、プロテインA−Sepharoseビーズ（GE Healthcare社，WI）に結合した抗−HA抗体（Invitrogen社）、抗−Flag抗体（Sigma−Aldrich社，MO）または抗−GSK3β抗体（Cell signaling technology社，MA）と一緒に、4℃にて2時間インキュベートした。ラットの器官を切除し、液体窒素中で瞬間冷凍した。組織は10倍量のTNE緩衝液中でホモジナイズし、そのホモジネートを4℃、15,000×gにて20分間遠心した。上清（sup）画分のタンパク質濃度をBradford法により測定した。免疫沈降のため、組織または細胞から調製したsup画分を、プロテインA−Sepharoseビーズに結合した抗−CRY1抗体（ABNOVA社，台北市、台湾）、抗−CRY2抗体（Alpha Diagnostic社，TX）、抗−PER2抗体、抗−BMAL1抗体、抗−REV−ERBα抗体（Cell signaling technology社）または抗−NPAS2抗体と一緒に4℃にて2時間インキュベートした。ついで、沈澱物をTNE緩衝液で3回洗浄し、SDSサンプル緩衝液に再懸濁した。試料は8%ポリアクリルアミドゲル上のSDS−PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に電気転写した。ニトロセルロース膜は、抗−GSK3β抗体（1：5,000）または抗−HA抗体（1：2,000）とインキュベートした後に、二次抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗−ウサギIgG（1：5,000）またはマウスIgG（1：2,000）抗血清（Cell signaling technology社）とインキュベートした。Odysseyシステム（LI−COR社，NE）を用いて、免疫反応性のバンドを視覚化した。
Immunoblot analysis
COS-7 cells were maintained in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum. Cells were transfected with expression vectors containing mPer1-3, mGSK3β, mBmal1, mClock, mNpas2, mRev-erbα, mCry1 and mCry2 sequences using LipofectAmine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. Transfected COS-7 cells were lysed in TNE buffer. For immunoprecipitation, the lysate was conjugated to protein A-Sepharose beads (GE Healthcare, WI), anti-HA antibody (Invitrogen), anti-Flag antibody (Sigma-Aldrich, MO) or anti-GSK3β. The cells were incubated with the antibody (Cell signaling technology, MA) at 4 ° C. for 2 hours. Rat organs were excised and snap frozen in liquid nitrogen. The tissue was homogenized in 10 volumes of TNE buffer, and the homogenate was centrifuged at 15,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. The protein concentration of the supernatant (sup) fraction was measured by the Bradford method. For immunoprecipitation, sup fractions prepared from tissues or cells were combined with anti-CRY1 antibody (ABNOVA, Taipei, Taiwan) bound to protein A-Sepharose beads, anti-CRY2 antibody (Alpha Diagnostic, TX), The cells were incubated with anti-PER2 antibody, anti-BMAL1 antibody, anti-REV-ERBα antibody (Cell signaling technology) or anti-NPAS2 antibody at 4 ° C. for 2 hours. The precipitate was then washed 3 times with TNE buffer and resuspended in SDS sample buffer. Samples were separated by SDS-PAGE on 8% polyacrylamide gels and electrotransferred to nitrocellulose membranes. Nitrocellulose membranes were incubated with anti-GSK3β antibody (1: 5,000) or anti-HA antibody (1: 2,000), followed by horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (1: 5,000) or mouse IgG as a secondary antibody. Incubated with (1: 2,000) antiserum (Cell signaling technology). Immunoreactive bands were visualized using the Odyssey system (LI-COR, NE).
抗体
ウサギPER2ポリクローナル抗体は、PER2のアミノ末端（アミノ酸1−99）に融合したグルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）に対して生起した。抗血清はGSTおよびGST−PER2カラムを通して精製した。
Antibody Rabbit PER2 polyclonal antibody was raised against glutathione S-transferase (GST) fused to the amino terminus of PER2 (amino acids 1-99). Antisera was purified through GST and GST-PER2 columns.
モノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体は、マウスPER2タンパク質のアミノ酸配列のポジション968−986のエピトープ部分に対する特異性を有し、ポジション977のセリン残基のリン酸化を特異的に認識する。
Monoclonal Antibody The monoclonal antibody of the present invention has specificity for the epitope part of positions 968-986 of the amino acid sequence of mouse PER2 protein, and specifically recognizes phosphorylation of the serine residue at position 977.
部位特異的突然変異
部位特異的突然変異の導入は、特定のmPER2のセリン残基をアラニンまたはグリシンに置換するポリメラーゼ連鎖反応を用いてワンステップで行った。突然変異DNAはヘミメチル化DNAについてのDpnI選抜によって同定し、配列を確認した。使用したオリゴヌクレオチド・プライマーを配列番号：3−11に示す。
Site-directed mutagenesis Site-directed mutagenesis was performed in one step using the polymerase chain reaction in which the serine residue of a specific mPER2 was replaced with alanine or glycine. Mutant DNA was identified by DpnI selection for hemimethylated DNA and the sequence was confirmed. The oligonucleotide primers used are shown in SEQ ID NOs: 3-11.
In vitro real-time oscillation monitoring system（IV−ROMS）
ルシフェラーゼ活性をモニターするシステムは以前に報告している（特許文献１）。NIH3T3細胞をhBmal1−lucでトランスフェクトし、24時間インキュベートした。培地を血清リッチな培地（50% 新生仔ウシ血清を補充したDMEM）に交換した。2時間後に、この培地を通常の培地（1%ウシ胎児血清を補充したDMEM）に置き換えた。0.1mM ルシフェリン存在下の発光を測定し、微弱発光計数装置（浜松ホトニクス，浜松市）の光増倍管を用いて1分間の発光を15分間隔で積算した。相および周期の測定は以前の実験と同様にして計算した。一連のデータは、生データから24時間の運動の平均を差し引くことによってトレンド除去した。各サイクルについて、滑らかにした曲線間の最大の差（ピークと谷）を用いて各サイクルの増幅を計算した。
In vitro real-time oscillation monitoring system (IV-ROMS)
A system for monitoring luciferase activity has been reported previously (Patent Document 1). NIH3T3 cells were transfected with hBmal1-luc and incubated for 24 hours. The medium was replaced with serum rich medium (DMEM supplemented with 50% newborn calf serum). After 2 hours, this medium was replaced with normal medium (DMEM supplemented with 1% fetal calf serum). Luminescence in the presence of 0.1 mM luciferin was measured, and 1-minute luminescence was accumulated at 15-minute intervals using a photomultiplier tube of a weak luminescence counter (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City). Phase and period measurements were calculated as in previous experiments. The series of data was detrended by subtracting the average of 24-hour exercise from the raw data. For each cycle, the maximum difference between the smoothed curves (peak and valley) was used to calculate the amplification for each cycle.
Per2プロモーター−Per2野生型または突然変異プラスミドの構築
mPer2プロモーター領域（-661）は、以前の実験と同様にしてpGL3−Basicベクターにクローニングした。pGL3 Per2−プロモーターベクターのルシフェラーゼ遺伝子部位（NcoI−XbaI）を、Per2野生型または突然変異ORFフラグメントのN−末端c−mycタグ形に置き換えた。
Construction of Per2 promoter-Per2 wild type or mutant plasmid
The mPer2 promoter region (-661) was cloned into the pGL3-Basic vector as in the previous experiment. The luciferase gene site (NcoI-XbaI) of the pGL3 Per2-promoter vector was replaced with the N-terminal c-myc tag form of the Per2 wild type or mutant ORF fragment.
学習性無力（LH）状態を作り出すために、図1に示すスケジュールでラットを不可避フット電気ショック（IS）に4回付した。片側半分の床を通電可能にしたケージ内にラットを拘束し、以下に示すスケジュールで不可避フット電気ショック（IS）に4回付した。10日後、逃避試験（ET）でラットを評価し、LHを獲得しているかまたは非LH（NLH）表現型であるかを判定した（図1A）。15試行のうち5未満しか逃避を試みなかったラットをLHラットと定義した。72.6±3.4%のラットしかLHを獲得していなかった（図1B）。繰り返して不可避フット電気ショックに付することにより、その運動活動リズムを測定するのに十分に長期間（少なくとも4週間）にわたってラットをLHに維持することが可能であることが示された。すなわち、条件付けを受けたラットの62.3±4.2%が4週間後にもなおLHを示した（図1B）。
この実験結果により、LHラットの活動リズムを非学習性無力（NLH）および対照ラットのものと比較できることが示された。ここで、驚くべきことには、LHラットは、NLHまたは対照ラットと比較してより短時間の自発運動を示した（図2−1A）。図2−1Aにおいて、横軸は2日間（48時間）のスケールを、縦軸は日付を示す。黒色部分はラットが活動している時間を表し、白色部分はラットが静止している時間を表す。通常、ラットの体内時計周期は24時間よりも長いため、恒暗（DD）条件下の活動時間は日々後退している（グラフにおいては、活動時間（黒色部分）が徐々に右にシフトする）。
In order to create a learned helplessness (LH) state, rats were subjected to four inevitable foot electric shocks (IS) on the schedule shown in FIG. Rats were restrained in a cage in which the floor on one half was energized, and subjected to inevitable foot electric shock (IS) 4 times according to the schedule shown below. Ten days later, the rats were evaluated in an escape test (ET) to determine if they acquired LH or have a non-LH (NLH) phenotype (FIG. 1A). Rats that attempted to escape less than 5 out of 15 trials were defined as LH rats. Only 72.6 ± 3.4% of the rats acquired LH (FIG. 1B). It has been shown that repeated repeated inevitable foot electric shocks can keep rats in LH for a long enough period (at least 4 weeks) to measure their motor activity rhythm. That is, 62.3 ± 4.2% of the conditioned rats still showed LH after 4 weeks (FIG. 1B).
The results of this experiment show that the activity rhythm of LH rats can be compared with that of non-learning helplessness (NLH) and control rats. Here, surprisingly, LH rats showed shorter duration of locomotor activity compared to NLH or control rats (Figure 2-1A). In FIG. 2-1A, the horizontal axis shows a scale of 2 days (48 hours), and the vertical axis shows the date. The black part represents the time during which the rat is active, and the white part represents the time during which the rat is stationary. Usually, the body clock cycle of rats is longer than 24 hours, so the activity time under constant darkness (DD) condition is regressed every day (in the graph, the activity time (black part) gradually shifts to the right) .
不可避電気ショックが概日リズムに影響することを調べるために、12時間/12時間（暗所／明所）サイクルで2週間拘束（LD）した後に、暗所に常時拘束（DD）した際の内因性の活動リズムを測定した。
不可避フット電気ショックを施した後は、NLHラットよりもLHラットにおいて活動リズムの概日周期が短縮し、NLHラットの周期は対照ラットと区別できなくなった（図2−1A）。LHラットにおける電気ショック処理の前後の概日周期の差の平均は-0.16±0.02時間であり、NLHラット（+0.06±0.03時間；p<0.01）および対照ラット（+0.09±0.02時間；p<0.01）よりも有意に短くなることを示した（図2−1B）。すなわち、LHラットの平均概日周期は24.03±0.01時間となり、これはNLHラット（24.30±0.02時間）または対照ラットの平均概日周期（24.40±0.03時間）よりも有意に短くなった（p<0.01）（図2−1C）。
In order to investigate the influence of unavoidable electric shock on circadian rhythm, after being restrained (LD) for 2 weeks in a 12 hour / 12 hour (dark place / light place) cycle, it was always restrained in the dark place (DD) Endogenous activity rhythm was measured.
After the inevitable foot electric shock, the circadian cycle of activity rhythm was shorter in the LH rat than in the NLH rat, and the cycle of the NLH rat became indistinguishable from the control rat (FIG. 2-1A). The average difference in circadian period before and after electroshock treatment in LH rats was -0.16 ± 0.02 hours, with NLH rats (+ 0.06 ± 0.03 hours; p <0.01) and control rats (+ 0.09 ± 0.02 hours; p < 0.01), which was significantly shorter (Fig. 2-1B). That is, the average circadian cycle of LH rats was 24.03 ± 0.01 hours, which was significantly shorter than that of NLH rats (24.30 ± 0.02 hours) or control rats (24.40 ± 0.03 hours) (p < 0.01) (Figure 2-1C).
リチウムは双極性障害における気分障害を治療するために広く使用されている気分安定剤である。リチウムを用いた長期療法はLHを予防する。また、リチウムは概日時計に影響することも知られている。これらの知見に基づいて、リチウムがLHラットの行動および活動リズムに影響するかを調べた。
LHラットには、飲料水に混ぜて20mMの塩化リチウム（LiCl）を4週間経口投与し、逃避行動を上記した逃避試験で評価した。
その結果、リチウムを投与したLHラットは、対照として水のみを与えたLHラットと比較して逃避試行回数が顕著に増加した（図2−2D）。また、リチウム投与LHラットは水のみを与えたLHラットと比較してより長い活動周期を示した（図2−2EおよびF）。リチウム処理後のLHラットの活動周期は、対照ラットおよびNLHラットのレベル近くまで延長した（処理前：24.00±0.01時間；処理後：24.22±0.06時間、p=0.047）。一方、水処理ではLHラットの周期は顕著に変化しなかった（処理前：24.02±0.03時間；処理後：24.05±0.07時間；p=0.26）（図2−2G）。
これらの結果を総合すると、リチウムはLHを有効に低下し、活動リズムの概日周期を回復することが示された。
Lithium is a mood stabilizer that is widely used to treat mood disorders in bipolar disorder. Long-term therapy with lithium prevents LH. Lithium is also known to affect the circadian clock. Based on these findings, we investigated whether lithium affects the behavior and activity rhythm of LH rats.
LH rats were orally administered with 20 mM lithium chloride (LiCl) in drinking water for 4 weeks, and escape behavior was evaluated by the escape test described above.
As a result, LH rats administered with lithium significantly increased the number of escape trials compared to LH rats given only water as a control (FIGS. 2-2D). In addition, lithium-treated LH rats showed a longer activity cycle compared to LH rats given water only (FIGS. 2-2E and F). The activity cycle of LH rats after lithium treatment was extended to near that of control and NLH rats (before treatment: 24.00 ± 0.01 hours; after treatment: 24.22 ± 0.06 hours, p = 0.047). On the other hand, the cycle of LH rats did not change significantly with water treatment (before treatment: 24.02 ± 0.03 hours; after treatment: 24.05 ± 0.07 hours; p = 0.26) (FIG. 2-2G).
Taken together, these results indicate that lithium effectively lowers LH and restores the circadian cycle of activity rhythm.
GSK3βのオーソログであるshaggy（sgg）はショウジョウバエ（Drosophila）における活動リズムの概日周期を短縮することが報告されている。リチウムはGSK3βのインヒビターであるため、GSK3β、および不活性型キナーゼであるそのリン酸化アイソフォーム（Stambolicら，1996）の発現レベルを調べた。その結果、対照ラットにおいては、SCNおよび前頭前皮質（PFC）の両方において概日様式でGSK3βはリン酸化されていた。一方、LHラットはSCNまたはPFCのいずれにおいてもリン酸化GSK3β（pGSK3β）の概日発現はなく、その発現レベルは調べた全期間において対照ラットよりも低かった（図3）。 Shaggy (sgg), an ortholog of GSK3β, has been reported to shorten the circadian cycle of activity rhythm in Drosophila. Since lithium is an inhibitor of GSK3β, the expression levels of GSK3β and its phosphorylated isoform (Stambolic et al., 1996), an inactive kinase, were examined. As a result, GSK3β was phosphorylated in a circadian manner in both SCN and prefrontal cortex (PFC) in control rats. On the other hand, LH rats did not have circadian expression of phosphorylated GSK3β (pGSK3β) in either SCN or PFC, and their expression levels were lower than control rats in the entire period examined (FIG. 3).
本発明者らは、ルシフェラーゼ・レポーターと測光技術IV-ROMS（in vitro real-time oscillation monitoring system）を組み合わせることにより、連続して細胞の概日リズムをモニターすることができる系を開発している。そこで、LHまたは対照ラット由来の線維芽細胞中のBmal1の概日周期を比較した。LHラット線維芽細胞の概日周期は対照ラット線維芽細胞のものよりも短い傾向があり（図4AおよびB）、その効果は特定の群において特に顕著であった（図5−1）。SCNおよびPFCに見られるように、リン酸化GSK3βは対照と比較してLH線維芽細胞において減少していた（図4CおよびD）。したがって、線維芽細胞におけるGSK3βのリン酸化は、特定のイン・ビボ(in vivo)表現型と相関しているように考えられた。 The present inventors have developed a system that can continuously monitor the circadian rhythm of cells by combining a luciferase reporter and photometric technology IV-ROMS (in vitro real-time oscillation monitoring system). . Therefore, the circadian cycle of Bmal1 in fibroblasts derived from LH or control rats was compared. The circadian cycle of LH rat fibroblasts tended to be shorter than that of control rat fibroblasts (FIGS. 4A and B), and the effect was particularly pronounced in certain groups (FIGS. 5-1). As seen in SCN and PFC, phosphorylated GSK3β was decreased in LH fibroblasts compared to controls (FIGS. 4C and D). Thus, phosphorylation of GSK3β in fibroblasts appeared to correlate with a specific in vivo phenotype.
GSK3βが細胞の概日リズムに対するリチウムの効果に実際に関与しているかを調べるために、GSK3β欠損マウス由来の線維芽細胞の細胞リズムに対するリチウムの効果を調べた。リチウムは、リチウムで処理していない線維芽細胞と比較して、野生型（WT）線維芽細胞の概日周期を延長した。一方、リチウムは、GSK3β欠損ラットからの線維芽細胞の概日周期には影響しなかった（図5−1AおよびB）。野生型ラットからの線維芽細胞の概日周期は、リチウム処理前の25.55±0.43時間と比較して、リチウム処理後は27.26±0.73時間であった（図5−1C）。一方、リチウム処理後のGSK3β欠損細胞における平均周期は23.89±0.34時間で、リチウム処理前の23.70±0.31と変化がなかった。また、PKC（BIS−1）、MEK（U0126）およびPI3キナーゼ（LY294002）などのGSK3βシグナル伝達経路に沿った鍵分子のインヒビターは、周期を延長するリチウムの効果を変化させなかった。しかしながら、GSK3βのインヒビターであるSB212676はこれらの周期を延長した（図5−2）。このことは、リチウムはGSK3βを不活性化することによって概日周期を直接的に延長することを示している。これらの結果は、GSK3βがリチウムのシグナル伝達経路の直接的なターゲットであることを示している。 To examine whether GSK3β is actually involved in the effect of lithium on the circadian rhythm of cells, the effect of lithium on the cellular rhythm of fibroblasts from GSK3β-deficient mice was examined. Lithium prolonged the circadian cycle of wild type (WT) fibroblasts compared to fibroblasts not treated with lithium. On the other hand, lithium did not affect the circadian cycle of fibroblasts from GSK3β-deficient rats (FIGS. 5-1A and B). The circadian cycle of fibroblasts from wild type rats was 27.26 ± 0.73 hours after lithium treatment compared to 25.55 ± 0.43 hours before lithium treatment (FIG. 5-1C). On the other hand, the average period in GSK3β-deficient cells after lithium treatment was 23.89 ± 0.34 hours, which was unchanged from 23.70 ± 0.31 before lithium treatment. In addition, inhibitors of key molecules along the GSK3β signaling pathway such as PKC (BIS-1), MEK (U0126) and PI3 kinase (LY294002) did not alter the effect of lithium prolonging the cycle. However, SB212676, an inhibitor of GSK3β, prolonged these cycles (Figure 5-2). This indicates that lithium directly extends the circadian cycle by inactivating GSK3β. These results indicate that GSK3β is a direct target of the lithium signaling pathway.
GSK3βは概日リズムと気分障害のような気分状態との間をつなぐ分子のようである。本発明者の研究の経緯より、GSK3βはLHラットの短縮された概日周期に寄与している可能性が示された。そこで、ターゲット時計タンパク質やGSK3βの下流にあるタンパク質ターゲットが何であるかを調べた。この問題を取り扱うために、一連の標準的な時計タンパク質を用いて生化学的分析を体系的に行った。
イン・ビトロ(in vitro)キナーゼ・アッセイの結果は、PER2、BMAL1、REV−ERBα、CRY1およびCRY2タンパク質はGSK3βによってリン酸化されるが、CLOCKまたはNPAS2タンパク質はリン酸化バンドが認められず、GSK3βによってリン酸化されないことを示した（図6A）。
また、GST融合時計タンパク質を用いたイン・ビトロ(in vitro)プルダウン・アッセイの結果は、PER2、BMAL1、CRY1およびCRY2タンパク質はGSK3βと結合するが、CLOCK、NPAS2およびREV−ERBαタンパク質はGSK3βバンドを示さなかった（図6B）。
時計遺伝子とGSK3βの両方をマウスNIH3T3線維芽細胞に同時トランスフェクトした場合、PER1、PER2、CRY1、CRY2およびBMAL1はGSK3β存在下でリン酸化したが、PER3、CLOCK、NPAS2およびREV−ERBαについてリン酸化バンドは見られなかった（図6C）。
さらに、GSK3βによって免疫沈降したマウス脳抽出物がPER2、CRY1およびCRY2抗体で検出され（図6D）、このことは、実際の脳においてはこれら3の時計タンパク質がGSK3βと結合していることを示している。
これらの生化学的分析は、PER2、CRY1およびCRY2がGSK3βのターゲット時計タンパク質の有力な候補であることを示している。
GSK3β appears to be a molecule that connects circadian rhythms with mood states such as mood disorders. The history of the inventor's research indicates that GSK3β may contribute to a shortened circadian cycle in LH rats. Therefore, the target clock protein and the protein target downstream of GSK3β were investigated. To address this issue, biochemical analyzes were systematically performed using a series of standard clock proteins.
In vitro kinase assay results show that PER2, BMAL1, REV-ERBα, CRY1 and CRY2 proteins are phosphorylated by GSK3β, but CLOCK or NPAS2 proteins do not have a phosphorylated band and GSK3β It was shown that it was not phosphorylated (FIG. 6A).
The results of in vitro pull-down assay using GST fusion clock protein show that PER2, BMAL1, CRY1 and CRY2 proteins bind to GSK3β, while CLOCK, NPAS2 and REV-ERBα proteins show GSK3β band. Not shown (Figure 6B).
When both the clock gene and GSK3β were cotransfected into mouse NIH3T3 fibroblasts, PER1, PER2, CRY1, CRY2, and BMAL1 were phosphorylated in the presence of GSK3β, but phosphorylated for PER3, CLOCK, NPAS2, and REV-ERBα No band was seen (Figure 6C).
In addition, mouse brain extracts immunoprecipitated with GSK3β were detected with PER2, CRY1 and CRY2 antibodies (Figure 6D), indicating that these three clock proteins are bound to GSK3β in the actual brain. ing.
These biochemical analyzes indicate that PER2, CRY1 and CRY2 are potential candidates for the target clock protein of GSK3β.
これらの候補タンパク質がリチウムシグナル伝達経路に実際に関与しているかを確認するために、各時計遺伝子についてのノックアウトマウスおよびその細胞を調べた。活動リズム実験においては、リチウムは野生型マウスで認められたようにCry1ノックアウトマウスおよびCry2ノックアウトマウスの両方の周期を延長した（図7−1A）。詳細には、Cry1ノックアウトマウスおよびCry2ノックアウトマウスの活動の周期は、各々22.35±0.32時間および24.51±0.15時間であり、これらは以前に報告されているデータと一致した。リチウム処理後は、Cry1ノックアウトマウスおよびCry2ノックアウトマウスの周期は、各々23.58±0.02時間および24.95±0.17時間まで延長した（図7−1BおよびC）。イン・ビボ(in vivo)のデータと同様に、リチウムはCry1欠損線維芽細胞およびCry2欠損線維芽細胞の両方の周期も延長した（図7−2D）。また、リチウムを添加した場合は、Rev−erbα−欠損線維芽細胞の概日周期も延長した（図7−2D）。
これらの結果は、CRY1、CRY2およびREV−ERBαはリチウムシグナル伝達経路のGSK3βのターゲットではなさそうなことを示している。Cry1、Cry2およびRev−erbα−欠損線維芽細胞の概日周期は、各々23.39±0.49時間、24.14±0.64時間および23.57±0.53時間であり、リチウム処理はそれらの周期を各々28.40±0.70時間、28.55±0.98時間および26.55±0.92時間まで延長した（図7−2E）。
In order to confirm whether these candidate proteins are actually involved in the lithium signaling pathway, the knockout mice and their cells for each clock gene were examined. In activity rhythm experiments, lithium prolonged the cycle of both Cry1 and Cry2 knockout mice as observed in wild type mice (FIG. 7-1A). Specifically, the cycle of activity of Cry1 and Cry2 knockout mice was 22.35 ± 0.32 hours and 24.51 ± 0.15 hours, respectively, which were consistent with previously reported data. After lithium treatment, the cycles of Cry1 and Cry2 knockout mice were extended to 23.58 ± 0.02 hours and 24.95 ± 0.17 hours, respectively (FIGS. 7-1B and C). Similar to in vivo data, lithium also prolonged the cycle of both Cry1-deficient and Cry2-deficient fibroblasts (FIGS. 7-2D). In addition, when lithium was added, the circadian cycle of Rev-erbα-deficient fibroblasts was also extended (FIG. 7-2D).
These results indicate that CRY1, CRY2 and REV-ERBα are unlikely to be targets for GSK3β in the lithium signaling pathway. The circadian cycles of Cry1, Cry2 and Rev-erbα-deficient fibroblasts are 23.39 ± 0.49 hours, 24.14 ± 0.64 hours and 23.57 ± 0.53 hours, respectively, and lithium treatment causes those cycles to be 28.40 ± 0.70 hours and 28.55 respectively. It was extended to ± 0.98 hours and 26.55 ± 0.92 hours (FIG. 7-2E).
それに対して、リチウムは、PASドメイン中の87アミノ酸が欠損しているPer2欠損マウス（mPer2Brdm1）の活動リズムの周期には影響しなかった（Zhengら，1999）。これらのアミノ酸はGSK3βの結合部位に含まれ（Iitakaら，2005）、したがって、それらを除去するとGSK3βによるリン酸化が妨害される（BiondiおよびNebreda，2003）。これらの条件下におけるリチウムを考慮すると、PER2がGSK3βの合理的な機能候補ターゲットである。リチウムは野生型マウスにおける活動の概日リズムを顕著に延長したが、mPerBrdm1マウスにおいては顕著な差は認められなかった。（図8−1AおよびB）。 In contrast, lithium did not affect the cycle of activity rhythms in Per2-deficient mice (mPer2 Brdm1 ) lacking 87 amino acids in the PAS domain (Zheng et al., 1999). These amino acids are contained in the binding site of GSK3β (Iitaka et al., 2005) and therefore removal of them prevents GSK3β phosphorylation (Biondi and Nebreda, 2003). Considering lithium under these conditions, PER2 is a reasonable functional candidate target for GSK3β. Lithium significantly prolonged the circadian rhythm of activity in wild-type mice, but no significant difference was observed in mPer Brdm1 mice. (Figures 8-1A and B).
GSK3βによるリン酸化部位を確認するために、一連のPER2フラグメント（F1−F5、図9A）を用いて実験を行った。
イン・ビトロ(in vitro)キナーゼ・アッセイでは、PER2のF2およびF5フラグメントならびに完全長PER2はGSK3βによってリン酸化されるが、F1、F3およびF4フラグメントはリン酸化されないことが示された（図9B）。
さらにリン酸化部位を詳細に同定するために、GSK3βリン酸化についての潜在的な共通配列のサーチを行った。潜在的なリン酸化部位の突然変異体を用いたイン・ビトロ(in vitro)キナーゼ・アッセイにより、PER2ポジション478、977および1107のセリン残基がGSK3βによってリン酸化される部位である可能性が示された（図9C）。
In order to confirm the phosphorylation site by GSK3β, an experiment was performed using a series of PER2 fragments (F1-F5, FIG. 9A).
In vitro kinase assay showed that F2 and F5 fragments of PER2 and full-length PER2 were phosphorylated by GSK3β, but F1, F3 and F4 fragments were not phosphorylated (FIG. 9B) .
In order to further identify phosphorylation sites in detail, potential consensus sequences for GSK3β phosphorylation were searched. In vitro kinase assay with potential phosphorylation site mutants suggests that the serine residues at PER2 positions 478, 977 and 1107 may be sites phosphorylated by GSK3β (Figure 9C).
これらのリン酸化部位が機能的であるかを調べるために、野生型または突然変異PER2を導入したBmal1−ELucマウス（Nakajimaら，2010）由来のマウス胎児線維芽細胞（MEF）の細胞概日リズムを調べた。
その結果、リチウムにより、野生型、S478AおよびS1107Aの突然変異PER2ならびに対照線維芽細胞の細胞リズムの周期は延長されたが、S977A突然変異PER2においては概日周期の顕著な変化は認められなかった（図8−1C）。
To investigate whether these phosphorylation sites are functional, cell circadian rhythms of mouse embryonic fibroblasts (MEF) derived from Bmal1-ELuc mice (Nakajima et al., 2010) introduced with wild-type or mutant PER2 I investigated.
As a result, the period of cell rhythm of wild type, S478A and S1107A mutant PER2 and control fibroblasts was prolonged by lithium, but no significant change in circadian cycle was observed in S977A mutant PER2. (Figure 8-1C).
これらの結果は、PER2がGSK3βの下流分子ターゲットであることを示し、PER2のポジション977のセリン残基は、GSK3βがリチウムシグナル伝達経路を変化させる機能的なリン酸化部位であることを示している。 These results indicate that PER2 is a downstream molecular target of GSK3β, and the serine residue at position 977 in PER2 indicates that GSK3β is a functional phosphorylation site that alters the lithium signaling pathway .
上記したように、LHはPER2のリン酸化を阻止することによって概日リズムに影響することが示された。そこで、PER2のリン酸化がLHに影響するかを、LH試験にmPer2Brdm1マウスを用いて、その逆の現象が生じるかを確認した。
以前の研究結果と同様に、野生型マウスの個体反応はIS群の中で非常に変動が大きい：野生型LH群は逃避時間の遅延によって示される逃避欠陥を示し、またこれは全ての試行で持続し、野生型非LH群は、区別できない逃避時間の遅延によって定量化されるように、不可避フット電気ショックに付していない野生型群と同様に中程度の逃避挙動を示した（図8−2DおよびE）。
一方、興味深いことに、不可避フット電気ショックに付したmPer2Brdm1群は、不可避フット電気ショックに付していないmPer2Brdm1群、不可避フット電気ショックに付していない野生型群および非学習性無力野生型群と同じように、変動が小さい中程度の逃避挙動を示した。ここで、mPer2Brdm1マウスにLHが存在しないことは非常に重要であり（図8−2F）、このことはPER2が気分状態の少なくとも1のモデルであるLHに影響することを意味している。
これらの結果から、PER2のポジション977のセリン残基のリン酸化が気分および概日リズムの両方に機能的に関与していることが示された。
As mentioned above, LH was shown to affect circadian rhythm by blocking PER2 phosphorylation. Therefore, it was confirmed whether PER2 phosphorylation affects LH or not by using mPer2 Brdm1 mice in the LH test.
As in previous studies, the individual response of wild-type mice is highly variable within the IS group: the wild-type LH group shows an escape defect indicated by a delay in escape time, and this is The persistent, wild-type non-LH group showed moderate escape behavior similar to the wild-type group not subjected to inevitable foot electric shocks, as quantified by indistinguishable escape time delays (Figure 8). −2D and E).
On the other hand, interestingly, mPer2 Brdm1 group subjected to inevitable foot electric shock is mPer2 Brdm1 group not subjected to inevitable foot electric shock, wild type group not subjected to inevitable foot electric shock, and non-learning helpless wild type Similar to the group, it showed moderate escape behavior with little variation. Here, the absence of LH in mPer2 Brdm1 mice is very important (FIGS. 8-2F), which means that PER2 affects LH, which is at least one model of mood state.
These results indicated that the phosphorylation of the serine residue at position 977 in PER2 is functionally involved in both mood and circadian rhythm.
本発明は、気分障害をはじめとする精神疾患のイン・ビトロ(in vitro)のスクリーニング系およびスクリーニング方法を提供し、気分障害患者の治療薬や、軽微な気分障害症状を発症している患者を改善する物質や、気分障害の発症を予防するための予防薬をスクリーニングすることができる。また、本発明によりスクリーニングされる治療薬、予防薬または改善物質は、様々な程度の気分障害の治療、予防または改善のために仕様することができ、医薬品のほか食品、サプリメントなど簡便に摂取できる形態とすることができる。 The present invention provides an in vitro screening system and screening method for mental disorders including mood disorders, and therapeutic drugs for patients with mood disorders and patients who develop minor mood disorders. It is possible to screen for substances to be improved and preventive drugs for preventing the onset of mood disorders. In addition, the therapeutic agent, prophylactic agent or substance to be screened according to the present invention can be specified for the treatment, prevention or amelioration of various degrees of mood disorders, and can be easily ingested in addition to pharmaceuticals such as foods and supplements. It can be in the form.
参考文献
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SEQ ID NO: 1
Amino acid sequence of PER2 protein.
SEQ ID NO: 2
Polynucleotide sequence of per2 gene.
SEQ ID NO: 3
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 4
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 5
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 6
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 7
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 8
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 9
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 10
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 11
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 1
Amino acid sequence of PER2 protein.
SEQ ID NO: 2
Polynucleotide sequence of per2 gene.
SEQ ID NO: 3
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 4
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
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Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 6
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 7
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 8
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 9
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
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Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
SEQ ID NO: 11
Primer for site-directed mutagenesis using a polymerase chain reaction for specific mPer2 serine residues.
Claims (12)
（１）試験化合物と学習性無力（learned helplessness、LH）動物の細胞とを培地中でインキュベートし、その後、該細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；
（２）試験化合物不存在下でインキュベートしたLH動物細胞中のPER2タンパク質の特定のアミノ酸配列ポジションのセリン残基のリン酸化量を測定し；ついで
（３）試験化合物不存在下でインキュベートしたLH動物細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量と比較して、試験化合物とインキュベートした細胞中のPER2タンパク質のリン酸化量が少ない場合に、該試験化合物を抗気分障害治療薬の候補化合物と判定することを含む該方法。 A method for screening candidate compounds for anti-mood disorder treatments,
(1) Incubate test compounds and learned helplessness (LH) animal cells in a medium, and then measure the phosphorylation amount of serine residues at specific amino acid sequence positions of PER2 protein in the cells And
(2) The amount of serine residue phosphorylation at a specific amino acid sequence position of PER2 protein in LH animal cells incubated in the absence of the test compound was measured; and (3) LH animals incubated in the absence of the test compound. When the amount of phosphorylation of PER2 protein in cells incubated with the test compound is small compared to the amount of phosphorylation of PER2 protein in the cell, the test compound is determined to be a candidate compound for anti-mood disorder treatment The method comprising.
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| WO2015199247A1 (en) * | 2014-06-27 | 2015-12-30 | 日本たばこ産業株式会社 | Method for diagnosing, treating, or preventing mood disorder |
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-
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- 2012-07-13 JP JP2012157812A patent/JP2014019658A/en active Pending
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