JP2014014355A - Lactobacillus, composition containing lactobacillus, culture method for lactobacillus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、乳酸菌、乳酸菌を含有する組成物および乳酸菌の培養方法に関する。 The present invention relates to a lactic acid bacterium, a composition containing the lactic acid bacterium, and a method for culturing the lactic acid bacterium.
これまで、各種の乳酸菌は免疫を向上させる効果を有することが明らかとなっている。この中で、アルコールを含む食品の中でワイン醪、漬け物、日本酒の生もとから分離された乳酸菌は免疫調整作用を有していることが知られている。特許文献１には、アルコール発酵にて副生の残渣に生育するラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌が免疫増強作用を有することが記載されている。
Until now, it has been revealed that various lactic acid bacteria have an effect of improving immunity. Among these, it is known that lactic acid bacteria isolated from wine lees, pickles and Japanese sake in foods containing alcohol have an immunomodulating action.
上記のように、アルコール耐性を有する乳酸菌は免疫増強作用を有することが知られている。発明者は、さらに優れた免疫増強作用を有する乳酸菌が得られないか鋭意検討した結果、アルコール耐性を有する乳酸菌を、アルコールを含有する培地で培養することによって、ＩＬ−１２の産生誘導能を有する乳酸菌が得られることに想到した。 As described above, lactic acid bacteria having alcohol resistance are known to have an immune enhancing effect. As a result of earnestly examining whether or not a lactic acid bacterium having a further excellent immune enhancing action can be obtained, the inventor has an ability to induce IL-12 production by culturing an lactic acid bacterium having alcohol resistance in a medium containing alcohol. It was conceived that lactic acid bacteria were obtained.
すなわち、本発明は、優れた免疫増強作用を有する乳酸菌、その組成物および乳酸菌の培養方法を提供することを目的とする。 That is, an object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium having an excellent immune enhancing action, a composition thereof, and a method for culturing the lactic acid bacterium.
上記目的を達成するため、本発明の乳酸菌は次の構成を備える。すなわち本発明は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）に属する乳酸菌であって、アルコール含有培地にて培養され、ＩＬ−１２の産生誘導能を有することを特徴とする。この構成によれば、アルコール耐性を有する乳酸菌をアルコール含有培地で培養して得られた、ＩＬ−１２の産生誘導能を有し、優れた免疫増強作用を持つ乳酸菌である。 In order to achieve the above object, the lactic acid bacterium of the present invention has the following constitution. That is, the present invention is a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus fructivorans having alcohol resistance, and is characterized in that it is cultured in an alcohol-containing medium and has an ability to induce IL-12 production. According to this structure, it is a lactic acid bacterium which has an ability to induce IL-12 production and has an excellent immune enhancing effect, which is obtained by culturing an alcohol-resistant lactic acid bacterium in an alcohol-containing medium.
また、本発明の乳酸菌はＩＦＮ−γの産生誘導能をさらに有する。これによれば、ＮＫ細胞活性化能を有する乳酸菌である。
また、本発明の乳酸菌はＴＮＦ−αの産生誘導能をさらに有する。これによれば、腫瘍細胞壊死作用を有する乳酸菌である。
また、本発明において、前記アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）に属する乳酸菌がＮＩＴＥ Ｐ−１３００もしくはＮＩＴＥ Ｐ−１３０１である。
The lactic acid bacterium of the present invention further has an ability to induce IFN-γ production. According to this, it is a lactic acid bacterium having NK cell activation ability.
In addition, the lactic acid bacterium of the present invention further has an ability to induce TNF-α production. According to this, it is a lactic acid bacterium having tumor cell necrosis.
Moreover, in this invention, the lactic acid bacteria which belong to the Lactobacillus fructivorans (Lactobacillus fructivorans) which have the said alcohol tolerance are NITE P-1300 or NITE P-1301.
本発明の組成物は、前記アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌を含有し、免疫増強作用を有する。これによれば、優れた免疫増強作用を持つ乳酸菌を利用した組成物である。 The composition of this invention contains the lactic acid bacteria which belong to the said Lactobacillus fructibolans which have the said alcohol tolerance, and has an immunopotentiating effect | action. According to this, it is a composition using lactic acid bacteria having an excellent immune enhancing action.
また、本発明の組成物は食品であることが好ましい。これによれば、優れた免疫増強作用を有する乳酸菌を食品に含有させることができ、摂取して免疫を増強させることができる。
また、本発明の組成物は医薬品であることが好ましい。これによれば、乳酸菌の優れた免疫増強作用を利用した医薬品である。
また、本発明の組成物は飼料であることが好ましい。これによれば、飼育動物の餌に利用して、飼育動物の免疫を増強させることができる。
Moreover, it is preferable that the composition of this invention is a foodstuff. According to this, the lactic acid bacteria which have the outstanding immune enhancement effect can be contained in a foodstuff, and it can ingest and can enhance immunity.
Moreover, it is preferable that the composition of this invention is a pharmaceutical. According to this, it is a pharmaceutical utilizing the excellent immune enhancing action of lactic acid bacteria.
Moreover, it is preferable that the composition of this invention is a feed. According to this, it is possible to enhance the immunity of the domestic animal by using it as a food for the domestic animal.
上記目的を達成するため、本発明の乳酸菌の培養方法は次の構成を備える。すなわち本発明は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）に属する乳酸菌を、アルコールを５〜１０ｖｏｌ％含有する培地にて培養することによって、ＩＬ−１２の産生誘導能を有する乳酸菌を製造することを特徴とする。この構成によれば、ＩＬ−１２の産生誘導能を向上させることができる。 In order to achieve the above object, the method for culturing lactic acid bacteria of the present invention comprises the following constitution. That is, the present invention produces a lactic acid bacterium having IL-12 production-inducing ability by culturing a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus fructivorans having alcohol resistance in a medium containing 5 to 10 vol% of alcohol. It is characterized by doing. According to this configuration, IL-12 production inducing ability can be improved.
また、本発明の乳酸菌の培養方法によれば、ＩＦＮ−γの産生誘導能をさらに有する乳酸菌を製造することができる。
また、本発明の乳酸菌の培養方法によれば、ＴＮＦ−αの産生誘導能をさらに有する乳酸菌を製造することができる。
また、本発明において、前記アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）に属する乳酸菌がＮＩＴＥ Ｐ−１３００もしくはＮＩＴＥ Ｐ−１３０１である。
In addition, according to the method for culturing lactic acid bacteria of the present invention, a lactic acid bacterium further having an ability to induce production of IFN-γ can be produced.
In addition, according to the method for culturing lactic acid bacteria of the present invention, lactic acid bacteria further having the ability to induce TNF-α production can be produced.
Moreover, in this invention, the lactic acid bacteria which belong to the Lactobacillus fructivorans (Lactobacillus fructivorans) which have the said alcohol tolerance are NITE P-1300 or NITE P-1301.
本発明によれば、優れた免疫増強作用を有する乳酸菌、その組成物、およびその乳酸菌の培養方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the lactic acid bacteria which have the outstanding immune enhancement effect, its composition, and the cultivation method of the lactic acid bacteria can be provided.
以下、本発明の好適な実施形態を詳細に説明する。
本実施形態に係る乳酸菌は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌であって、アルコール含有培地にて培養され、ＩＬ−１２の産生誘導能を有することを特徴とする。さらに、ＩＦＮ−γの産生誘導能、ＴＮＦ−αの産生誘導能を有することを特徴とする。
また、本実施形態に係る乳酸菌の培養方法は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌を、アルコールを５〜１０ｖｏｌ％含有する培地にて培養することによって、ＩＬ−１２の産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。さらに、ＩＦＮ−γの産生誘導能、ＴＮＦ−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail.
The lactic acid bacterium according to this embodiment is a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus fructivorans having alcohol resistance, and is characterized in that it is cultured in an alcohol-containing medium and has an IL-12 production inducing ability. Furthermore, it has the ability to induce IFN-γ production and the ability to induce TNF-α production.
Further, the method for culturing lactic acid bacteria according to the present embodiment has the ability to induce IL-12 production by culturing lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus fructivorans having alcohol resistance in a medium containing 5 to 10 vol% of alcohol. Lactic acid bacteria can be produced. Furthermore, lactic acid bacteria having the ability to induce IFN-γ production and the ability to induce TNF-α production can be produced.
アルコール耐性を有する乳酸菌としては、酒類の製造や漬け物製造等のアルコールを含む食品の製造に関連する乳酸菌が挙げられる。 Examples of the lactic acid bacteria having alcohol resistance include lactic acid bacteria related to the production of foods containing alcohol such as the production of alcoholic beverages and pickles.
本実施形態で用いるアルコール耐性を有する乳酸菌は、ラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌であり、アルコールを含む食品から分離されたものである。本実施形態の乳酸菌は、アルコールを含む食品から分離された乳酸菌を、アルコールを含む培地を用いて培養して免疫増強作用を向上させたものである。 The alcohol-resistant lactic acid bacterium used in the present embodiment is a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus fructivorans, which is isolated from a food containing alcohol. The lactic acid bacteria of this embodiment are obtained by culturing lactic acid bacteria isolated from foods containing alcohol using a medium containing alcohol to improve the immune enhancing action.
培養ではアルコール濃度５〜１０ｖｏｌ％の培地を用いて菌を増殖させることが好ましい。培地のアルコール濃度が５ｖｏｌ％より高くなると、アルコールを添加しないで単に培養したものと比べてＩＬ−１２の産生誘導能は向上して、免疫増強作用は高まる。また、培地のアルコール濃度が１０ｖｏｌ％よりも高いと、乳酸菌の増殖速度が低下し始めて得られる菌体量が少なくなる。さらに、培地のアルコール濃度が１５ｖｏｌ％よりも高いと乳酸菌が増殖し難くなり、効率的に菌体を得ることが困難となる。 In the culture, it is preferable to grow the bacteria using a medium having an alcohol concentration of 5 to 10 vol%. When the alcohol concentration of the medium is higher than 5 vol%, the ability to induce IL-12 production is improved and the immune enhancing action is enhanced as compared with the case where the alcohol is not added and the culture is simply performed. On the other hand, when the alcohol concentration of the medium is higher than 10 vol%, the amount of microbial cells obtained when the growth rate of lactic acid bacteria begins to decrease decreases. Furthermore, when the alcohol concentration of the medium is higher than 15 vol%, lactic acid bacteria are difficult to grow, and it is difficult to efficiently obtain bacterial cells.
培養用の培地は特に限定されないが、後記するみりん粕抽出液を用いて調製した培地を好適に用いることができる。培養温度は２５〜３０℃程度が好ましく、培養時間は、菌株や培地のアルコール濃度によっても相違するが、６０〜１００時間程度が好ましい。 The culture medium is not particularly limited, but a medium prepared using a mirin extract, which will be described later, can be suitably used. The culture temperature is preferably about 25 to 30 ° C., and the culture time is preferably about 60 to 100 hours, although it varies depending on the strain and the alcohol concentration of the medium.
これら乳酸菌を、上記のように、アルコールを５〜１０ｖｏｌ％含有する培地を用いて培養することによって、ＩＬ−１２の産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。さらにＩＬ−１２に加えて、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。 By culturing these lactic acid bacteria using a medium containing 5 to 10 vol% of alcohol as described above, lactic acid bacteria having IL-12 production inducing ability can be produced. Furthermore, in addition to IL-12, lactic acid bacteria having the ability to induce production of IFN-γ and TNF-α can be produced.
特に発明者等は、みりん製造時の醪中から次の乳酸菌を分離し、この乳酸菌をアルコール含有培地にて培養した結果、優れた免疫増強作用を有することがわかった。すなわち、この乳酸菌は、真性火落菌であるラクトバチルス・フルクチボランスに属するＮＩＴＥ Ｐ−１３００、ＮＩＴＥ Ｐ−１３０１であり、ＩＬ−１２の産生誘導能を有し、優れた免疫増強作用を有する。
これらみりん醪中から分離されたアルコール耐性を有する乳酸菌は、酒類製造時に常在する乳酸菌で、これら乳酸菌の増殖によって酒類としては風味を損なうことから、「火入れ」と呼ばれる低温殺菌工程を経て流通されることが多い。しかし、「火入れ」法が用いられる以前は、これら乳酸菌およびその代謝物を含有した酒類を飲用していたと考えられることから、人に対して安全性は問題ない。
In particular, the inventors have isolated the following lactic acid bacteria from the cocoon during the production of mirin, and cultivated the lactic acid bacteria in an alcohol-containing medium. That is, these lactic acid bacteria are NITE P-1300 and NITE P-1301 belonging to Lactobacillus fructivorans, which are true fire bacterium, have IL-12 production induction ability, and have an excellent immune enhancing action.
Alcohol-resistant lactic acid bacteria isolated from these mirinpox are lactic acid bacteria that are permanently present during the production of alcoholic beverages, and because the growth of these lactic acid bacteria impairs the flavor of alcoholic beverages, they are distributed through a pasteurization process called “burning”. Often. However, before the “fired” method is used, it is considered that alcoholic beverages containing these lactic acid bacteria and their metabolites were consumed, so there is no problem with safety for humans.
また、これら乳酸菌の少なくとも１種類を食品、飼料、医薬品、医薬部外品等に混入させることによって、免疫増強作用を有する組成物を提供することができる。例えば、ヨーグルト、パンなどの食品や乳酸菌飲料、アルコール飲料などの飲料、飼料には、乳酸菌をそのまま、あるいはカプセルなどに封入して所要量混入させるようにすればよい。また、医薬品、医薬部外品に用いる場合には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶解補助剤、コーティング剤等の製剤に用いる公知の補助剤を用いて製剤する。剤形としては、錠剤、カプセル剤、加硫剤等、任意である。さらに、食品製造過程で積極的に本件乳酸菌を培養してそのまま利用する方法もある。免疫増強作用を有する組成物を提供するためにこれら乳酸菌の少なくとも１種類を混入させる場合、これら乳酸菌は生菌、死菌、さらには磨砕や破砕等により処理物としてもかまわない。 Moreover, the composition which has an immunopotentiating effect | action can be provided by mixing at least 1 sort (s) of these lactic acid bacteria with a foodstuff, feed, a pharmaceutical, a quasi-drug, etc. For example, foods such as yogurt and bread, beverages such as lactic acid bacteria beverages and alcoholic beverages, and feeds may be mixed with the lactic acid bacteria as they are or encapsulated in a capsule or the like. Moreover, when using for a pharmaceutical and a quasi-drug, it formulates using well-known adjuvants used for formulation, such as an excipient | filler, binder, a disintegrating agent, a solubilizing agent, and a coating agent. As the dosage form, tablets, capsules, vulcanizing agents and the like are arbitrary. Furthermore, there is a method in which the lactic acid bacteria are actively cultured and used as they are in the food production process. When at least one of these lactic acid bacteria is mixed in order to provide a composition having an immunopotentiating action, these lactic acid bacteria may be treated as live bacteria, dead bacteria, and further by grinding or crushing.
［実施例１］
みりん醪中に生息する乳酸菌を分離し、アルコール含有培地で培養して得られた乳酸菌の免疫増強作用を調査した。
[Example 1]
The immunity enhancing effect of lactic acid bacteria obtained by isolating lactic acid bacteria inhabiting mirinpox and culturing them in alcohol-containing medium was investigated.
１．分離方法
みりん醪の希釈懸濁液を火落菌検出培地（日本醸造協会製、ＳＩ培地、アルコール濃度５〜１０ｖｏｌ％、ｐＨ５．０）に添加して２５〜３０℃で混釈培養し、生育してきたコロニーを釣菌した。さらにこれを寒天平板培地で培養を繰り返して純粋分離を行い、アルコール耐性を有する乳酸菌２２４株を得た。
1. Separation method A diluted suspension of mirinpo is added to a fire-absorbing fungus detection medium (manufactured by Japan Brewing Association, SI medium,
２．同定試験
得られた菌株は生理的手法と分子生物学的手法によって火落性乳酸菌と真性火落菌の２タイプに類別した。さらに、同じ性状を持つ株が複数分離されていたことから、それぞれのタイプに特徴的な菌株を選定した。すなわち、真性火落菌の中から２株（ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株）、火落性乳酸菌の中から５株（ＹＭ−２０１株、ＹＭ−２０３株、ＹＭ−２０４株、ＹＭ−２０７株、ＹＭ−２０８株）を選定し、同定試験を行った。
2. Identification test The obtained strains were classified into two types, deciduous lactic acid bacteria and true deciduous bacteria, by physiological and molecular biological techniques. Furthermore, since a plurality of strains having the same properties were isolated, a strain characteristic for each type was selected. That is, 2 strains (AP-1300 strain, AP-1301 strain) from true fallen fungi, and 5 strains (YM-201 strain, YM-203 strain, YM-204 strain, YM-207) from fallen lactic acid bacteria. Strain, YM-208 strain) was selected and an identification test was conducted.
（１）生理的諸性質
乳酸菌実験マニュアルに従って、生理的諸性質を調べた結果を表１、表２に示す。ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株ついて、いずれもグラム染色は陽性、カタラーゼ反応は陰性、乳酸の生成は陽性であり、メバロン酸要求性は陽性であった。また、発酵形式を調べた結果、ガスの生産が認められ、ヘテロ発酵型であることが確認された。
ＹＭ−２０１株、ＹＭ−２０３株、ＹＭ−２０４株、ＹＭ−２０７株、ＹＭ−２０８株について、いずれもグラム染色は陽性、カタラーゼ反応は陰性、乳酸の生成は陽性であり、メバロン酸要求性は陰性であった。また、発酵形式を調べた結果、ガスの生産は認められず、ホモ発酵型であることが確認された。
(1) Physiological properties Tables 1 and 2 show the results of examining the physiological properties according to the lactic acid bacteria experiment manual. Regarding AP-1300 strain and AP-1301 strain, Gram staining was positive, catalase reaction was negative, lactic acid production was positive, and mevalonic acid requirement was positive. Moreover, as a result of examining the fermentation format, production of gas was recognized and it was confirmed that it was a heterofermentation type.
YM-201 strain, YM-203 strain, YM-204 strain, YM-207 strain, YM-208 strain are all positive for Gram staining, negative for catalase reaction, positive for lactic acid production, and require mevalonic acid Was negative. Moreover, as a result of examining the fermentation format, production of gas was not recognized and it was confirmed that it was a homofermentation type.
（２）１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の解析
アルコール耐性を有する上記の菌株のうち、真性火落菌であるＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、基準株のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＮＢＲＣ１４７４７株と相同率９９．８％であった。これらのことから、２菌株はラクトバチルス・フルクチボランスと同定された。この２菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託し、受託番号はそれぞれＮＩＴＥ Ｐ−１３００、ＮＩＴＥ Ｐ−１３０１である。
さらに、上記菌株のうち、火落性乳酸菌であるＹＭ−２０１株など５株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、基準株のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＮＢＲＣ１５８８９株と相同率９９．９％であった。このことから、ＹＭ−２０１株など５株は、ラクトバチルス・パラカゼイと同定された。
(2) Analysis of base sequence of 16S rDNA Among the above strains having alcohol resistance, the 16S rDNA base sequences of AP-1300 and AP-1301 strains, which are true fire retardants, are homologous to the reference strain Lactobacillus flutivorans NBRC14747. The rate was 99.8%. From these, two strains were identified as Lactobacillus fructivorans. These two strains are deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Technology and Evaluation, and the accession numbers are NITE P-1300 and NITE P-1301, respectively.
Furthermore, among the above-mentioned strains, 5 strains of 16S rDNA base sequence such as YM-201 strain, which is a deciduous lactic acid bacterium, were obtained from Lactobacillus paracasei subsp. The homology rate was 99.9% with paracasei NBRC15889 strain. From this, five strains such as YM-201 strain were identified as Lactobacillus paracasei.
３．菌体の調製方法
（１）菌
みりん醪から分離・同定した上記菌株を用いた。
（２）乳酸菌の調製
［培地］
みりん粕４ｋｇに５倍量の水を加え、６０℃で１時間加熱・溶解した後に放冷し、濾過してみりん粕抽出液１５Ｌを得た。このみりん粕抽出液８５０ｍＬに、酵母エキス２０ｇ（オリエンタル酵母工業製）、メバロン酸０．００５ｇ（シグマ製）を加え、６Ｎ塩酸を用いてｐＨ５．０に調製した後、オートクレーブ殺菌した。アルコールとしてエタノールを用いた。オートクレーブ殺菌後のみりん粕抽出液に、培地中の最終エタノール濃度が０（エタノール無添加）、５、１０ｖｏｌ％、加えてＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株用については７、１５ｖｏｌ％となるようにエタノールを加えて１Ｌとしたものを培地（以下ＭＫＹ培地と記す）として用いた。
［培養］
各菌株をエタノール濃度０、５、７、１０、１５ｖｏｌ％の火落菌検出培地（日本醸造協会製、ＳＩ培地）に植菌し、３０℃で５〜７日間前培養を行った。次いで各エタノール濃度の火落菌検出培地で前培養した菌株の培養液を、火落菌検出培地と同じエタノール濃度となるエタノール濃度０、５、７、１０、１５ｖｏｌ％の各ＭＫＹ培地１Ｌに、ＯＤ６６０ｎｍ＝０．０１となるように添加した。３０℃で培養し、定常期初期の増殖段階まで培養した。なお、ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株の各条件での増殖状況は図１、図２に示した通りである。
［集菌、洗浄、殺菌、凍結乾燥］
ＭＫＹ培地で培養後の各培養液を４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を捨て集菌した。さらに、蒸留水を用いて２回洗浄し、最後に１０ｍＬの蒸留水に菌体を懸濁した後、常法通りオートクレーブ殺菌し、室温まで放冷後、凍結乾燥した。なお、得られた乾燥菌体重量は表３、表４に示した通りである。
3. Preparation method of bacterial cells (1) The above strains isolated and identified from the fungus Mirinpotsu were used.
(2) Preparation of lactic acid bacteria [medium]
5 kg of water was added to 4 kg of mirin koji, heated and dissolved at 60 ° C. for 1 hour, allowed to cool, and filtered to obtain 15 l of mirin koji extract. To 850 mL of this mirin koji extract, 20 g of yeast extract (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) and 0.005 g of mevalonic acid (manufactured by Sigma) were added, adjusted to pH 5.0 with 6N hydrochloric acid, and then autoclaved. Ethanol was used as the alcohol. Only after autoclave sterilization, the final ethanol concentration in the medium is 0 (no ethanol added), 5 and 10 vol%, and in addition, the AP-1300 strain and AP-1301 strain are 7 and 15 vol%. Ethanol was added to make 1 L as a medium (hereinafter referred to as MKY medium).
[culture]
Each strain was inoculated into a fire-fung bacteria detection medium (SI medium, manufactured by Japan Brewing Association) having an ethanol concentration of 0, 5, 7, 10, and 15 vol%, and precultured at 30 ° C. for 5 to 7 days. Subsequently, the culture solution of the strain pre-cultured with the falling fungus detection medium at each ethanol concentration was added to 1 L of each of the MKY mediums having ethanol concentrations of 0, 5, 7, 10, and 15 vol% that had the same ethanol concentration as that of the falling fungus detection medium. It added so that it might become 0.01. The cells were cultured at 30 ° C. until the growth stage in the early stationary phase. In addition, the proliferation condition on each condition of AP-1300 strain and AP-1301 strain is as shown in FIG. 1 and FIG.
[Bacteria collection, washing, sterilization, lyophilization]
Each culture solution after culturing in the MKY medium was centrifuged at 4 ° C. and 8000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was discarded and collected. Furthermore, after washing twice with distilled water and finally suspending the cells in 10 mL of distilled water, the cells were sterilized by autoclave as usual, allowed to cool to room temperature, and then lyophilized. The obtained dry cell weight is as shown in Tables 3 and 4.
表３より、火落性乳酸菌のラクトバチルス・パラカゼイであるＹＭ−２０１株、ＹＭ−２０３株、ＹＭ−２０４株、ＹＭ−２０７株、ＹＭ−２０８株については、アルコール濃度０ｖｏｌ％で培養した方が５ｖｏｌ％で培養したものよりも乾燥菌体重量は多かった。また、アルコール濃度１０ｖｏｌ％では十分な菌体量を得ることができなかった。
火落性乳酸菌よりもアルコール耐性の強い真性火落菌のラクトバチルス・フルクチボランスであるＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株は、アルコール濃度１０ｖｏｌ％で培養して得られた菌体量が他のアルコール濃度で得られたものよりも多かった。また、図１、図２から明らかなように、培地のアルコール濃度が１５ｖｏｌ％では増殖し難いため、培養時間をアルコール濃度１０ｖｏｌ％の２〜３倍（２００〜３００時間）に延長して試験に供するための菌体を確保した。
From Table 3, YM-201 strain, YM-203 strain, YM-204 strain, YM-207 strain, YM-208 strain, which is a Lactobacillus paracasei of a prickly lactic acid bacterium, is cultured at an alcohol concentration of 0 vol% However, the dry cell weight was higher than that cultured at 5 vol%. Moreover, when the alcohol concentration was 10 vol%, a sufficient amount of cells could not be obtained.
AP-1300 and AP-1301 strains, which are true fire bacterium Lactobacillus fructivorans that are more resistant to alcohol than fire lactic acid bacteria, are cultured at an alcohol concentration of 10 vol%. It was more than what was obtained in. As is clear from FIG. 1 and FIG. 2, since it is difficult to grow when the alcohol concentration of the medium is 15 vol%, the culture time is extended to 2 to 3 times (200 to 300 hours) of the alcohol concentration of 10 vol%. Bacteria for serving were secured.
なお、ＭＫＹ培地はｐＨなどの影響により多少の沈殿物が生じる。この培地成分由来沈殿物の免疫活性への影響を確認するため、菌体を接種しない培地を同条件に置いて生じる沈殿物を、同様に洗浄して培地成分由来沈殿物（以下ＭＰと記す）として調製した。 Note that some deposits occur in the MKY medium due to the influence of pH and the like. In order to confirm the influence of the medium component-derived precipitate on the immune activity, the precipitate produced by placing the medium not inoculated with the cells under the same conditions was washed in the same manner and the medium component-derived precipitate (hereinafter referred to as MP). As prepared.
４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験方法
（１）マウス脾臓細胞による各種サイトカイン遺伝子発現に及ぼす影響
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（６週齢、メス）より無菌的に脾臓を採取した。採取した脾臓は、常法に従い脾臓細胞浮遊液とした。この脾臓細胞浮遊液に上記の凍結乾燥した乳酸菌を終濃度１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で６時間培養した。ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量はリアルタイムＰＣＲ法により測定し、コントロールを１とした場合の相対発現量として活性の比較を行った。ここで、コントロールとは、凍結乾燥した乳酸菌を添加しないで、乳酸菌を添加した場合と同様に、脾臓細胞浮遊液を３７℃、６時間で処理したもののｍＲＮＡ発現量である。
4). In Vitro Test Method (1) Effect on Expression of Various Cytokine Genes by Mouse Spleen Cells Spleens were aseptically collected from C3H / HeN mice (6 weeks old, female). The collected spleen was used as a spleen cell suspension according to a conventional method. The lyophilized lactic acid bacteria were added to the spleen cell suspension so as to have a final concentration of 100 μg / mL, and cultured at 37 ° C. for 6 hours. The mRNA expression levels of IL-12, IFN-γ, and TNF-α were measured by a real-time PCR method, and the activities were compared as relative expression levels when the control was 1. Here, the control refers to the mRNA expression level of the spleen cell suspension treated at 37 ° C. for 6 hours as in the case of adding lactic acid bacteria without adding freeze-dried lactic acid bacteria.
［ＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量］
図３より、ラクトバチルス・フルクチボランスに属するＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株に関して、アルコール濃度０ｖｏｌ％、５ｖｏｌ％の培地よりアルコール濃度１０ｖｏｌ％の培地で培養して得られた菌体の方が、ＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量は増大した。さらに、ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株のＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量は、いずれのアルコール濃度に対するラクトバチルス・パラカゼイに属するＹＭ−２０１株、ＹＭ−２０３株、ＹＭ−２０４株、ＹＭ−２０７株、ＹＭ−２０８株の発現量より多かった。
なお、培地成分由来沈殿物では、ｍＲＮＡ発現量の増大は認められなかった。
図４から明らかなように、ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株については、ＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量はアルコール濃度による違いが認められた。アルコール濃度５〜１０ｖｏｌ％で培養して得られた菌体によるＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現量はコントロールに対して１．７倍〜３．０倍と有意に増加した。しかし、アルコール濃度０ｖｏｌ％および１５ｖｏｌ％で培養して得られたものはコントロールとの違いは認められなかった。
[IL-12 mRNA expression level]
From FIG. 3, regarding the AP-1300 strain and AP-1301 strain belonging to Lactobacillus fructivorans, the cells obtained by culturing in the
In the medium component-derived precipitate, no increase in mRNA expression level was observed.
As is clear from FIG. 4, regarding the AP-1300 strain and AP-1301 strain, the IL-12 mRNA expression level was different depending on the alcohol concentration. IL-12 mRNA expression level by cells obtained by culturing at an alcohol concentration of 5 to 10 vol% significantly increased from 1.7 times to 3.0 times that of the control. However, those obtained by culturing at alcohol concentrations of 0 vol% and 15 vol% did not differ from the control.
［ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量］
図５、図６より、アルコール濃度０〜１５ｖｏｌ％で培養して得られた菌体によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量を検討した結果、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現量はアルコール濃度による違いは認められず、コントロールに対して４０倍〜１４０倍と著しく増加した。同様にＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量も１０倍〜２０倍と著しく増加した。
[IFN-γ and TNF-α mRNA expression levels]
From FIG. 5 and FIG. 6, as a result of examining the mRNA expression level of IFN-γ and TNF-α by the cells obtained by culturing at an alcohol concentration of 0 to 15 vol%, the mRNA expression level of IFN-γ depends on the alcohol concentration. There was no difference, and it increased significantly from 40 times to 140 times compared to the control. Similarly, the expression level of TNF-α mRNA was remarkably increased to 10 to 20 times.
この結果、ラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌（ＡＰ−１３００株、ＡＰ−１３０１株）は、アルコール含有培地にて培養されることによって、免疫作用が増強された乳酸菌となった。 As a result, lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus fructivorans (AP-1300 strain, AP-1301 strain) became lactic acid bacteria with enhanced immunity by being cultured in an alcohol-containing medium.
５．Ｉｎ ｖｉｖｏ試験方法
（１）動物試験方法
Ｂａｌｂ／ｃ マウス（５週令，オス）を粉末飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業製）で
１週間の予備飼育後、ＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与える群、粉末飼料にアルコール濃度０ｖｏｌ％で培養したＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える群、および粉末飼料にアルコール濃度１０ｖｏｌ％で培養したＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える群の３群に分け、それぞれ２週間飼育した。なお、ＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える２群については、菌体摂取量が１．０×１０９ｃｆｕ／マウス／日となるようにそれぞれ菌体を配合した。各群のマウスは５匹とし、飼料と飲料水は自由摂取とした。また、飼育環境の条件は、室温２３℃、１２時間の明暗周期とした。
5. In vivo test method (1) Animal test method Balb / c mice (5-week-old, male) are preliminarily raised for 1 week in powdered diet MF (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) and do not contain AP-1300 strain freeze-dried cells A group giving a feed, a group giving a feed obtained by adding lyophilized AP-1300 strain cultured at an alcohol concentration of 0 vol% to a powdered feed, and an AP-1300 strain lyophilized cell cultured at an alcohol concentration of 10 vol% on a powdered feed It was divided into 3 groups, which were fed the feed supplemented with, and each was bred for 2 weeks. In addition, about 2 groups which give the feed which added AP-1300 stock | strain freeze-dried microbial cell, each microbial cell was mix | blended so that microbial cell intake might be 1.0 * 10 < 9 > cfu / mouse / day. There were 5 mice in each group, and food and drinking water were ad libitum. Moreover, the conditions of the breeding environment were a room temperature of 23 ° C. and a light / dark cycle of 12 hours.
（２）ＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体の経口摂取が脾臓細胞に及ぼす影響
ＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与えた動物およびＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与えた動物よりそれぞれ無菌的に脾臓細胞を採取した。採取した脾臓細胞は、ビオチン標識抗マウスＣＤ４９ｂモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＤＸ５，Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ）、ビオチン標識抗マウスＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ Ｍ１／７０，Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ）、およびストレプトアビジン−ＰＥ／Ｃｙ５ （Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ）を用いて標識した。細胞をビオチン標識した後、ＰＥ標識抗マウスＩＬ−１２モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ Ｃ１５．６、Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＸＭＧ１．２，Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ＭＰ６−ＸＴ２２，Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ）を用いて脾臓細胞内に産生されたサイトカインを標識した。ビオチン標識された細胞数およびＰＥ標識されたサイトカインを含む細胞数は、フローサイトメーターＧｕａｖａ ＰＣＡ（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定し、脾臓細胞に占めるサイトカイン生産細胞割合を算出した。
(2) Effect of oral ingestion of AP-1300 strain freeze-dried cells on spleen cells Animals fed with a feed that does not contain AP-1300 strain freeze-dried cells and feed supplemented with AP-1300 strain freeze-dried cells Spleen cells were aseptically collected from each given animal. The collected spleen cells were treated with biotin-labeled anti-mouse CD49b monoclonal antibody (clone DX5, Bio Legend), biotin-labeled anti-mouse CD11b monoclonal antibody (clone M1 / 70, Bio Legend), and streptavidin-PE / Cy5 (Bio Legend). Labeled. After the cells were labeled with biotin, PE-labeled anti-mouse IL-12 monoclonal antibody (clone C15.6, Bio Legend), PE-labeled anti-mouse IFN-γ monoclonal antibody (clone XMG1.2, Bio Legend), PE-labeled anti-mouse TNF Cytokine produced in spleen cells was labeled using -α monoclonal antibody (clone MP6-XT22, Bio Legend). The number of biotin-labeled cells and the number of cells containing PE-labeled cytokine were measured using a flow cytometer Guava PCA (Guava Technologies), and the ratio of cytokine-producing cells in the spleen cells was calculated.
（３）Ｙａｃ−１細胞に対する傷害試験（ＮＫ活性試験）
東北大学加齢医学研究所より譲渡されたＹａｃ−１細胞（２×１０７ｃｅｌｌ）を、ＰＫＨ−２６ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）用いて標識した。遠心分離により標識されたＹａｃ−１細胞を回収し、標識したＹａｃ−１浮遊液（５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ）と脾臓細胞浮遊液を、脾臓細胞：Ｙａｃ−１細胞＝２：１になるよう２４穴プレートに入れ、６時間培養した。細胞を回収し、７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ溶液を加えて死細胞を標識した。標識されたＹａｃ−１細胞数および二重染色されたＹａｃ−１死細胞数を、フローサイトメーターＧｕａｖａ ＰＣＡ（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定し、標的細胞に占める死細胞の割合を算出した。
(3) Injury test on Yac-1 cells (NK activity test)
Yac-1 cells (2 × 10 7 cells) transferred from Tohoku University Institute of Aging Medicine were labeled using PKH-26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma). The labeled Yac-1 cells are collected by centrifugation, and the labeled Yac-1 suspension (5 × 10 4 cells / mL) and the spleen cell suspension become spleen cells: Yac-1 cells = 2: 1. It was put in a 24-well plate and cultured for 6 hours. Cells were harvested and dead cells were labeled by adding 7-aminoactinomycin D solution. The number of labeled Yac-1 cells and double-stained Yac-1 dead cells were measured using a flow cytometer Guava PCA (Guava Technologies), and the proportion of dead cells in the target cells was calculated.
（４）Ｉｎ ｖｉｖｏ試験結果
（ａ）脾臓細胞に占めるサイトカイン産生細胞割合
図７、８、９より、アルコール濃度１０ｖｏｌ％で培養したＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を投与した動物より採取したＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＬ−１２産生細胞割合は、ＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与えた動物より採取したＣＤ１１ｂ＋細胞のＩＬ−１２産生細胞割合よりも有意に増加した。同様にＣＤ４９ｂ＋細胞のＩＦＮ−γ産生細胞割合は増加傾向を示し、ＴＮＦ−α産生細胞割合は有意に増加した。
(4) In vivo test results (a) Cytokine-producing cell ratio in spleen cells From FIGS. 7, 8 and 9, CD11b + cells collected from animals administered with AP-1300 strain lyophilized cells cultured at an alcohol concentration of 10 vol% The IL-12 producing cell ratio of the CD11b + cells collected from the animals fed with the feed containing no AP-1300 strain lyophilized cells was significantly higher than the IL-12 producing cell ratio. Similarly, the proportion of IFN-γ producing cells in CD49b + cells showed an increasing tendency, and the proportion of TNF-α producing cells was significantly increased.
（ｂ）ＮＫ細胞活性
Ｙａｃ−１死細胞割合は、マウス脾臓細胞のＹａｃ−１に対する細胞傷害性を表している。図１０より、アルコール濃度１０ｖｏｌ％で培養したＡＰ−１３００株凍結乾燥菌体を添加した飼料を投与した動物より採取した脾臓細胞のＮＫ活性は有意に上昇した。
(B) NK cell activity The Yac-1 dead cell ratio represents the cytotoxicity of mouse spleen cells to Yac-1. From FIG. 10, the NK activity of the spleen cells collected from the animals to which the diet supplemented with AP-1300 strain lyophilized cells cultured at an alcohol concentration of 10 vol% was significantly increased.
（５）まとめ
動物試験に於けるサイトカイン産生細胞割合とＮＫ活性の結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で認められた結果を裏付けるように、アルコール含有培地で培養したラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌において優れた免疫増強作用が認められた。
(5) Summary The results of the ratio of cytokine-producing cells and NK activity in animal tests are excellent immunity in lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus fructivorans cultured in an alcohol-containing medium so as to support the results observed in in vitro tests. A potentiating effect was observed.
［実施例２］乳酸菌含有組成物の製造
以下に示す製造例に基づいて乳酸菌含有組成物を製造した。
[Example 2] Production of lactic acid bacteria-containing composition A lactic acid bacteria-containing composition was produced based on the production examples shown below.
製造例１：乳酸菌を含有する医薬品
錠剤：
以下に示す方法により、乳酸菌を含有する医薬品（錠剤）を製造した。
ＡＰ−１３００株菌体末１００ｇを、乳糖２００ｇおよびステアリン酸マグネシウム２ｇと共に混合し、単発式打錠機にて打錠することにより、直径１０ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を製造した。
顆粒剤：
ＡＰ−１３００株菌体末１００ｇに、ステアリン酸マグネシウム２ｇを加え、圧縮、粉砕、製粒し、篩分して２０〜５０メッシュの顆粒剤を得た。
Production Example 1: Pharmaceutical products containing lactic acid bacteria Tablets:
A pharmaceutical product (tablet) containing lactic acid bacteria was produced by the method shown below.
AP-1300 strain powder 100 g was mixed with 200 g of lactose and 2 g of magnesium stearate, and tableted with a single tableting machine to produce tablets with a diameter of 10 mm and a weight of 300 mg.
Granules:
2 g of magnesium stearate was added to 100 g of AP-1300 bacterial cell powder, compressed, pulverized, granulated, and sieved to obtain 20-50 mesh granules.
製造例２：乳酸菌を含有する各種飲食物
表５に示す組成にて、乳酸菌入りの、各種飲食品を製造した。なお、乾燥菌体を配合するものについては、「乳酸菌菌体末」と表記した。
Production Example 2: Various foods and drinks containing lactic acid bacteria With the composition shown in Table 5, various foods and drinks containing lactic acid bacteria were produced. In addition, what mix | blends a dry microbial cell was described with the "lactic acid microbial cell powder".
製造例３：乳酸菌を含有する飲食物
表６に示す組成で蒸米に米麹、温水を加え、６０℃で５時間保温して甘酒を造り、これに１５容量％エタノールを加え、さらに、酸にてｐＨ５．５に調整した後、ＡＰ−１３００株をアルコール濃度１０ｖｏｌ％のＭＫＹ培地で３０℃、５日間培養した乳酸菌培養物を加え、他の微生物汚染を受けないように５日間熟成することにより、すっきりとした酸味を有するマッコリ風アルコール飲料を製造した。
Production Example 3: Food and Beverage Containing Lactic Acid Bacteria Add rice bran and warm water to the steamed rice with the composition shown in Table 6, and keep it at 60 ° C for 5 hours to make amazake. After adjusting the pH to 5.5, add a lactic acid bacteria culture obtained by culturing AP-1300 strain in an MKY medium with an alcohol concentration of 10 vol% at 30 ° C. for 5 days, and ripen for 5 days so as not to be contaminated with other microorganisms. A makgeolli-style alcoholic beverage having a clean acidity was produced.
製造例４：乳酸菌を含有する飼料
表７に示す組成にて、乳酸菌入りの飼料を製造した。
Production Example 4: Feed Containing Lactic Acid Bacteria Feed containing lactic acid bacteria was produced with the composition shown in Table 7.
なお、いずれの製造例においても、ＡＰ−１３００株の代わりにＡＰ−１３０１株を用いてもよく、乳酸菌含有組成物の製造が可能である。 In any of the production examples, the AP-1301 strain may be used instead of the AP-1300 strain, and a lactic acid bacteria-containing composition can be produced.
上記目的を達成するため、本発明の乳酸菌は次の構成を備える。すなわち本発明は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）に属する乳酸菌、ＮＩＴＥ Ｐ−１３００もしくはＮＩＴＥ Ｐ−１３０１であって、アルコール含有培地にて培養され、ＩＬ−１２の産生誘導能、ＩＦＮ−γの産生誘導能、およびＴＮＦ−αの産生誘導能を有することを特徴とする。
この構成によれば、アルコール耐性を有する乳酸菌をアルコール含有培地で培養して得られた、ＩＬ−１２の産生誘導能を有し、優れた免疫増強作用を持つ乳酸菌である。
In order to achieve the above object, the lactic acid bacterium of the present invention has the following constitution. That is, the present invention is a lactic acid bacterium , NITE P-1300 or NITE P-1301 belonging to Lactobacillus fructivorans having alcohol resistance, cultured in an alcohol-containing medium, and capable of inducing IL-12 production. It has the ability to induce IFN-γ production and the ability to induce TNF-α production .
According to this structure, it is a lactic acid bacterium which has an ability to induce IL-12 production and has an excellent immune enhancing effect, which is obtained by culturing an alcohol-resistant lactic acid bacterium in an alcohol-containing medium.
上記目的を達成するため、本発明の乳酸菌の培養方法は次の構成を備える。すなわち本発明は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）に属する乳酸菌、ＮＩＴＥ Ｐ−１３００もしくはＮＩＴＥ Ｐ−１３０１を、アルコールを５〜１０ｖｏｌ％含有する培地にて培養することによって、ＩＬ−１２の産生誘導能、ＩＦＮ−γの産生誘導能およびＴＮＦ−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することを特徴とする。 In order to achieve the above object, the method for culturing lactic acid bacteria of the present invention comprises the following constitution. That is, the present invention is a method of cultivating a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus fructivorans having resistance to alcohol , NITE P-1300 or NITE P-1301 in a medium containing 5 to 10 vol% alcohol. It is characterized by producing a lactic acid bacterium having 12 production-inducing ability , IFN-γ production-inducing ability, and TNF-α production-inducing ability .
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