JP2014012650A - Method and agent for enhancing epithelium barrier function - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、主に上皮バリア機能の増強方法及び増強剤に関する。 The present invention mainly relates to a method and agent for enhancing epithelial barrier function.
上皮細胞は、その頂端（アピカル）面と基底（べーサル）面との境界を形成し、物質が双方向へ移動することを制限するバリアを形成する役割を果たしている。上皮バリア機能が破綻すると、気管支喘息、急性肺障害、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、炎症性腸疾患、タンパク漏出性胃腸症、腎障害、ネフローゼ症候群、脳浮腫、角膜炎、角膜潰瘍、リンパ浮腫等の疾患の発症あるいは症状の増悪が引き起こされる。これらの疾患の患者において、上皮バリア機能の修復を促進し、上皮バリア機能を増強することによって、疾患の治癒又は改善を図ることが可能になると考えられる。しかしながら、臨床的に応用可能な上皮バリア機能を増強するための手段は、一切知られていないのが現状である。 Epithelial cells form a boundary between the apical (apical) surface and the basal (basal) surface, and form a barrier that restricts the movement of substances in both directions. When epithelial barrier function breaks down, bronchial asthma, acute lung injury, atopic dermatitis, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, inflammatory bowel disease, protein leaking gastroenteropathy, nephropathy, nephrotic syndrome, brain edema, keratitis, The onset or exacerbation of symptoms such as corneal ulcer and lymphedema is caused. In patients with these diseases, it is considered that by repairing epithelial barrier function and enhancing the epithelial barrier function, it is possible to cure or improve the disease. However, at present, no means for enhancing the clinically applicable epithelial barrier function is known.
また、非メチル化CpG配列を含む核酸は、免疫活性を賦活化することが知られており、自然免疫を刺激する組成物、癌免疫療法や感染症に対する効率的なワクチンとして利用できる可能性が提案され、その有用性が確認されている（特許文献１〜５；非特許文献１〜３）。しかしながら、非メチル化CpG配列を含む核酸と、上皮バリア形成との関連は一切知られていない。 In addition, nucleic acids containing unmethylated CpG sequences are known to stimulate immune activity and may be used as compositions that stimulate innate immunity, efficient vaccines against cancer immunotherapy and infectious diseases. It has been proposed and its usefulness has been confirmed (Patent Documents 1 to 5; Non-Patent Documents 1 to 3). However, there is no known relationship between nucleic acids containing unmethylated CpG sequences and epithelial barrier formation.
本発明は、上皮バリア機能の増強剤及び増強方法を提供することを主な目的とする。また、上皮バリア機能の増強によって、上皮バリア機能が低下する疾患等を治癒又は改善するための医薬組成物、外用剤等を提供することをも目的とする。 The main object of the present invention is to provide an agent and method for enhancing epithelial barrier function. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition, an external preparation and the like for curing or improving a disease or the like in which the epithelial barrier function is reduced by enhancing the epithelial barrier function.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、上皮バリア機能を増強できることを見出した。本発明は、斯かる知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。 The present inventor conducted intensive studies to solve the above problems, and surprisingly found that an epithelial barrier function can be enhanced by using an oligonucleotide containing an unmethylated CpG sequence. The present invention has been completed by further studies based on such findings.
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を包含する。 That is, this invention includes the invention of the aspect hung up below.
項1、上皮細胞に、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドを接触させる工程を含む、上皮バリア機能の増強方法。 Item 1. A method for enhancing an epithelial barrier function, comprising a step of contacting an epithelial cell with an oligonucleotide containing an unmethylated CpG sequence.
項２、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、上皮バリア機能の増強剤。 Item 2. An epithelial barrier function enhancer comprising an oligonucleotide comprising an unmethylated CpG sequence.
項３、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、上皮バリアの機能低下に起因する疾患の治療薬。 Item 3. A therapeutic agent for a disease caused by reduced function of the epithelial barrier, comprising an oligonucleotide containing an unmethylated CpG sequence.
項４、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、上皮バリアの機能低下に起因する障害の改善剤。 Item 4. An agent for improving a disorder caused by reduced function of an epithelial barrier, comprising an oligonucleotide containing an unmethylated CpG sequence.
本願発明により、簡便に上皮バリア機能の増強が達成される。また、上皮バリア機能の機能低下に起因する疾患、障害を改善する方法も提供される。非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドは生体への害が小さく、有用性が高い。 According to the present invention, enhancement of the epithelial barrier function can be easily achieved. In addition, a method for ameliorating a disease or disorder caused by a reduced function of the epithelial barrier function is also provided. Oligonucleotides containing unmethylated CpG sequences are less useful to living organisms and are highly useful.
なお、図中*は、対照に対して有意差あり（P < 0.05）を示す。 In the figure, * indicates a significant difference from the control (P <0.05).
１．上皮バリア機能の増強方法
本発明は、上皮バリア機能の増強方法に関する。
1. Enhancing method invention of epithelial barrier function, to a method enhancing epithelial barrier function.
ここで、「上皮バリア機能」とは、上皮を形成する上皮細胞の頂端（アピカル）面と基底（べーサル）面との境界において、物質が双方向へ移動することを制限する機能を指す。異動が制限される物質は、イオン、分子（例えば、水溶性分子）、水などが挙げられる。 Here, the “epithelial barrier function” refers to a function that restricts the movement of a substance in both directions at the boundary between the apical (apical) plane and the basal (basal) plane of epithelial cells forming the epithelium. Examples of substances whose movement is restricted include ions, molecules (for example, water-soluble molecules), water, and the like.
上皮バリアは、上皮細胞同士の間に形成される細胞同士を結合する構造が主として関与する。細胞間に形成される接着構造として、タイトジャンクション（密着結合、tight junction）、アドへレンスジャンクション（接着結合、adherens junction）、ギャップジャンクション(ギャップ結合、gap junction)が挙げられる。中でも、タイトジャンクションの寄与が重要である。タイトジャンクションは、ＺＯ−１タンパク質、オクルーディンタンパク質、クローディンタンパク質等が構成するタンパク質複合体である。また、アドへレンスジャンクションは、E-cadherinタンパク質などのカドヘリンスーパーファミリーに属するタンパク質等が構成するタンパク質複合体である。 The epithelial barrier mainly involves a structure that connects cells formed between epithelial cells. Examples of the adhesion structure formed between cells include tight junction (tight junction, tight junction), adherence junction (adherence junction), and gap junction (gap junction, gap junction). Above all, the contribution of tight junctions is important. Tight junction is a protein complex composed of ZO-1 protein, occludin protein, claudin protein and the like. Adherence junction is a protein complex composed of proteins belonging to the cadherin superfamily such as E-cadherin protein.
細胞の上皮バリア機能の増強は、公知の手法により検証、評価することができる。このような手法として、例えば、単離された上皮細胞においては、経上皮電気抵抗の測定、デキストラン等の水溶性分子の透過性（傍細胞透過率）の測定、タイトジャンクションやアドヘレンスジャンクションを構成するタンパク質の検出などが例示されるが、これに限定されるものではない。経上皮電気抵抗を測定する場合、電気抵抗値、静電容量（electric capacitance、Ccl）またはインピーダンスの上昇を、上皮バリア機能の増強と評価することができる。デキストラン、エバンスブルー染色液、フルオロセイン等の水溶性分子の透過性を測定する場合、上皮を透過する水溶性分子の物質量の低下を、上皮バリア機能の増強と評価することができる。タイトジャンクションを構成するタンパク質（例えば、タイトジャンクションは、ＺＯ−１タンパク質、オクルーディンタンパク質、クローディンタンパク質）を検出する場合、タイトジャンクションを構成するタンパク質の検出量の増加、または、細胞間接着面への集積を、上皮バリア機能の増強と評価することができる。なお、タイトジャンクションを構成するタンパク質の検出は、例えば免疫染色により行うことができる。生体内においては、貯留体液量の測定、漏出した体液の成分分析、粘膜上皮水分蒸散量（transepithelialwater loss, TEWL）の測定、標識(例えば、テクネチウム-99ｍ（99mTc）等の放射性同位元素、蛍光物質等を用いた標識など)したアルブミンなどのタンパク質の漏出量の算出により評価することができる。 The enhancement of the epithelial barrier function of the cells can be verified and evaluated by a known method. For example, in isolated epithelial cells, transepithelial electrical resistance measurement, permeability measurement of water-soluble molecules such as dextran (paracellular permeability), tight junction and adherence junction can be performed. Although detection of the protein which comprises is illustrated, it is not limited to this. When measuring transepithelial electrical resistance, an increase in electrical resistance, capacitance (Ccl) or impedance can be assessed as enhancement of epithelial barrier function. When measuring the permeability of water-soluble molecules such as dextran, Evans blue staining solution, and fluorescein, a decrease in the amount of water-soluble molecules that permeate the epithelium can be evaluated as enhancement of the epithelial barrier function. When detecting a protein constituting a tight junction (for example, a tight junction is a ZO-1 protein, an occludin protein, or a claudin protein), an increase in the detection amount of the protein constituting the tight junction, or an intercellular adhesion surface Can be evaluated as enhancement of epithelial barrier function. The protein constituting the tight junction can be detected by immunostaining, for example. In vivo, measurement of fluid volume in the reservoir, component analysis of leaked fluid, measurement of transepithelial water loss (TEWL), radiolabels such as technetium- 99m ( 99m Tc), fluorescence It can be evaluated by calculating the amount of leakage of protein such as albumin (labeled with a substance or the like).
本発明の方法が対象とする上皮細胞は、特に限定されるものではない。上皮細胞としては、表皮細胞（顆粒層）、呼吸器（鼻腔、咽頭、気道、肺）の上皮細胞、消化管（食道、胃、小腸、大腸）の上皮細胞、角膜上皮細胞等が例示される。上皮細胞の由来は特に限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳類由来の上皮細胞が好適である。上皮細胞は、生体の上皮細胞であっても、単離された上皮細胞であってもよい。単離された上皮細胞は、公知の手法によって維持及び培養をすることができる。 The epithelial cells targeted by the method of the present invention are not particularly limited. Examples of epithelial cells include epidermal cells (granular layers), respiratory epithelial cells (nasal cavity, pharynx, airways, lungs), epithelial cells of the digestive tract (esophagus, stomach, small intestine, large intestine), corneal epithelial cells, and the like. . The origin of the epithelial cells is not particularly limited, but epithelial cells derived from mammals such as humans, mice, rats, hamsters, rabbits, dogs and cats are preferred. The epithelial cell may be a living epithelial cell or an isolated epithelial cell. Isolated epithelial cells can be maintained and cultured by known techniques.
本発明の方法は、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（以下、CpG ODN（cytosine-phosphodiester-guanine oligodeoxynucleotide）と記載する場合がある。）を用いる。 The method of the present invention, oligonucleotides containing unmethylated CpG sequence (hereinafter, may be described as CpG ODN (c ytosine- p hosphodiester- g uanine o ligo d eoxy n ucleotide).) Is used.
本発明のオリゴヌクレオチドは、デオキシヌクレオシド（デオキシアデノシン（塩基部分は、アデニン（A））、デオキシグアノシン（塩基部分は、グアニン（G））、チミジン（塩基部分は、チミン（T））、デオキシシチジン（塩基部分は、シトシン（C）））が、リン酸を介在したホスホジエステル結合によって多量体化した化合物（オリゴデオキシヌクレオチド）を指す。オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の部分は、その全部または一部が、酸素原子が硫黄原子に置換されたホスホロチオエート修飾されたものであってもよい。ホスホロチオエート修飾されたホスホジエステル結合を、ホスホロチオエート結合と換言することもできる。オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合及び／又はホスホロチオエート結合部位を、オリゴヌクレオチドの骨格ということもある。 The oligonucleotide of the present invention comprises deoxynucleoside (deoxyadenosine (base part is adenine (A)), deoxyguanosine (base part is guanine (G)), thymidine (base part is thymine (T)), deoxycytidine (Base portion is cytosine (C))) refers to a compound (oligodeoxynucleotide) that is multimerized by a phosphodiester bond mediated by phosphoric acid. The part of the phosphodiester bond of the oligonucleotide may be phosphorothioate-modified in which all or a part of the oligonucleotide is substituted with a sulfur atom. A phosphorothioate-modified phosphodiester bond can also be referred to as a phosphorothioate bond. The phosphodiester bond and / or phosphorothioate bond site of an oligonucleotide is sometimes referred to as the backbone of the oligonucleotide.
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基長は特に限定されるものではない。例えば8〜100塩基程度のものを用いることができ、好ましくは12〜50塩基程度のもの、より好ましくは15〜35塩基程度のものを用いることができる。 The base length of the oligonucleotide of the present invention is not particularly limited. For example, about 8 to 100 bases can be used, preferably about 12 to 50 bases, more preferably about 15 to 35 bases.
非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG ODN）とは、非メチル化CpG配列を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドを指す。ここで、非メチル化CpG配列とは、シトシン（C）−グアニン（G）（5’-CpG-3’）ジヌクレオチド配列であって、当該のシトシンの5位がメチル化されていないジヌクレオチド配列をいう（非メチル化CpGモチーフ、あるいは単にCpGモチーフともいう。）一般に、真核生物においては5’-CpG-3’配列はCGメチラーゼによってシトシンがメチル化されているため、メチル化されていない5’-CpG-3’配列のゲノム中での出現頻度は小さい。 An oligonucleotide comprising an unmethylated CpG sequence (CpG ODN) refers to an oligonucleotide comprising at least one unmethylated CpG sequence. Here, the unmethylated CpG sequence is a cytosine (C) -guanine (G) (5′-CpG-3 ′) dinucleotide sequence, and the dinucleotide in which the 5-position of the cytosine is not methylated In general, in eukaryotes, the 5'-CpG-3 'sequence is methylated because cytosine is methylated by CG methylase. The frequency of occurrence of no 5'-CpG-3 'sequences in the genome is small.
本発明のCpG ODNの１つの態様として、免疫賦活活性を有するCpG ODNが挙げられる。該オリゴヌクレオチドは、主にToll-like receptor 9（TLR9）タンパク質に認識されることで、免疫賦活活性を発揮すると考えられている。 One embodiment of the CpG ODN of the present invention includes CpG ODN having immunostimulatory activity. The oligonucleotide is considered to exhibit immunostimulatory activity by being recognized mainly by Toll-like receptor 9 (TLR9) protein.
免疫賦活活性を有するCpG ODNとしては、クラスＡ（Class A；タイプD（type D）ともいう）、クラスＢ（Class B；タイプＫ（type K）ともいう）及びクラスＣ（Class C）のCpG ODNが例示される。 CpG ODN having immunostimulatory activity includes class A (Class A; also referred to as type D), class B (also referred to as Type B) and class C (Class C) CpG. ODN is exemplified.
クラスＡのCpG ODNは、配列が１以上の非メチル化CpG配列を含むパリンドローム配列であって、骨格がホスホジエステル結合である部分と、該パリンドローム配列の5’側及び／又は3’側に結合したポリＧ配列（poly(G)、デオキシグアノシンが２個以上連結した配列）であって骨格がホスホロチオエート結合である部分とからなるCpG ODNを指す。なお、パリンドローム配列とは、配列と相補鎖の配列とが一致する回文構造を有する配列を指す。 A class A CpG ODN is a palindromic sequence containing one or more unmethylated CpG sequences, a portion having a phosphodiester bond in the backbone, and a 5 ′ side and / or a 3 ′ side of the palindromic sequence. This is a CpG ODN consisting of a poly G sequence (poly (G), a sequence in which two or more deoxyguanosines are linked) bound to, and a skeleton having a phosphorothioate bond. The palindromic sequence refers to a sequence having a palindromic structure in which the sequence and the complementary strand sequence match.
クラスＡのCpG ODNの具体例として、ODN2216、ODN2336、ODN1585が例示される。ODN2216、ODN2336は、ヒトにおいて顕著に免疫賦活活性が認められる。ODN1585は、マウスにおいて顕著に免疫賦活活性が認められる。上記クラスAのCpG ODN配列及び構造を下記に示す。
ODN2216：5’- ggGGGACGATCGTCgggggg -3’ （配列番号１）
ODN2336：5’- gggGACGACGTCGTCgggggg -3’ （配列番号２）
ODN1585：5’- gggGGTCAACGTTGAgggggg -3’ （配列番号３）
（配列中、大文字はホスホジエステル結合、小文字はホスホロチオエート結合をそれぞれ示す。下線部は、パリンドローム配列を示す。）
Specific examples of class A CpG ODNs include ODN2216, ODN2336, and ODN1585. ODN2216 and ODN2336 are remarkably immunostimulatory in humans. ODN1585 has markedly immunostimulatory activity in mice. The class A CpG ODN sequence and structure are shown below.
ODN2216: 5'-ggGG GACGATCGTC gggggg-3 '(SEQ ID NO: 1)
ODN2336: 5'-ggg GACGACGTCGTC gggggg-3 '(SEQ ID NO: 2)
ODN1585: 5'-gggGG TCAACGTTGA gggggg-3 '(SEQ ID NO: 3)
(In the sequences, capital letters indicate phosphodiester bonds, and small letters indicate phosphorothioate bonds. Underlined parts indicate palindromic sequences.)
クラスＢのCpG ODNは、配列中に１以上の非メチル化CpG配列を含み、かつ、骨格がオリゴヌクレオチド全長にわたりホスホロチオエート結合であるCpG ODNを指す。クラスＢのCpG ODNの具体例として、ODN2006、ODN1668、ODN1826が例示される。ODN2006は、ヒトにおいて顕著に免疫賦活活性が認められる。ODN1668、ODN1826は、マウスにおいて顕著に免疫賦活活性が認められる。上記クラスＢのCpG ODNの配列及び構造を下記に示す。
ODN2006：5’- tcgtcgttttgtcgttttctcgtt -3’ （配列番号４）
ODN1668：5'- tccatgacgttcctgatgct -3' （配列番号５）
ODN1826：5’- tccatgacgttcctgacgtt -3’ （配列番号６）
（配列中、小文字はホスホロチオエート結合を示す。）
Class B CpG ODN refers to a CpG ODN that contains one or more unmethylated CpG sequences in the sequence and whose backbone is a phosphorothioate linkage over the entire length of the oligonucleotide. Specific examples of class B CpG ODNs include ODN2006, ODN1668, and ODN1826. ODN2006 has markedly immunostimulatory activity in humans. ODN1668 and ODN1826 are remarkably immunostimulatory in mice. The sequence and structure of the class B CpG ODN are shown below.
ODN2006: 5'-tcgtcgttttgtcgttttctcgtt-3 '(SEQ ID NO: 4)
ODN1668: 5'-tccatgacgttcctgatgct-3 '(SEQ ID NO: 5)
ODN1826: 5'-tccatgacgttcctgacgtt-3 '(SEQ ID NO: 6)
(In the sequence, lower case letters indicate phosphorothioate bonds.)
タイプCのCpG ODNは、配列中に１以上の非メチル化CpG配列含む5’側部分、及び非メチル化CpG配列を含むパリンドローム配列を含む3’側部分からなり、骨格がオリゴヌクレオチド全長にわたりホスホロチオエート結合であるCpG ODNを指す。クラスCのCpG ODNの具体例として、ODN2395、ODN M362が例示される。ODN2395、ODN M362は、ヒト及びマウスにおいて顕著に免疫賦活活性が認められる。上記クラスCのCpG ODNの配列及び構造を下記に示す。
ODN2395：5’- tcgtcgttttcggcgcgcgccg -3’ （配列番号７）
ODN M362：5’-tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat-3’ （配列番号８）
（配列中、小文字はホスホロチオエート結合を示す。下線部は、パリンドローム配列を示す。）
Type C CpG ODN consists of a 5 ′ part containing one or more unmethylated CpG sequences and a 3 ′ part containing a palindromic sequence containing unmethylated CpG sequences in the sequence, and the backbone spans the entire length of the oligonucleotide. Refers to CpG ODN which is a phosphorothioate bond. Specific examples of class C CpG ODNs include ODN2395 and ODN M362. ODN2395 and ODN M362 have significant immunostimulatory activity in humans and mice. The sequence and structure of the class C CpG ODN are shown below.
ODN2395: 5'-tcgtcgtttt cggcgcgcgccg- 3 '(SEQ ID NO: 7)
ODN M362: 5'-tcgt cgtcgttcgaacgacg ttgat-3 '(SEQ ID NO: 8)
(In the sequences, lower case letters indicate phosphorothioate bonds. Underlined portions indicate palindromic sequences.)
なお、免疫賦活活性においては、クラスＡのCpG OD及びクラスCのCpG ODNは、形質細胞様樹上細胞のIFN-αの産生を誘導すること、ならびに、クラスBのCpG ODN及びクラスCのCpG ODNは、B細胞を活性化及び増殖の誘導をすることが知られている。 In the immunostimulatory activity, class A CpG OD and class C CpG ODN induce IFN-α production of plasmacytoid tree cells, class B CpG ODN and class C CpG. ODN is known to activate B cells and induce proliferation.
上記CpG ODNは、公知の手法により合成することができる。簡便のために、市販のものを用いることもできる。 The CpG ODN can be synthesized by a known method. For convenience, a commercially available product can also be used.
本発明の方法は、上皮細胞に、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドを接触させる工程を含む。上皮細胞に、CpG ODNを接触させる手段は特に限定されるものではない。例えば、上皮細胞が単離された上皮細胞である場合、CpG ODN若しくはCpG ODNを含む溶液（例えば、水溶液）を、上皮細胞が維持される培地に添加することで、上皮細胞と、CpG ODNとを接触させることができる。 The method of the invention comprises contacting an epithelial cell with an oligonucleotide comprising an unmethylated CpG sequence. The means for contacting the epithelial cells with CpG ODN is not particularly limited. For example, when the epithelial cell is an isolated epithelial cell, CpG ODN or a solution containing CpG ODN (for example, an aqueous solution) is added to a medium in which the epithelial cell is maintained, so that the epithelial cell, CpG ODN and Can be contacted.
上皮細胞に接触させる非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドの物質量は、上皮バリア機能の増強が達成される範囲内で特に限定されるものではない。好ましくは、上皮細胞1.0x105個あたり、約１０ｎM〜１ｍM程度、好ましくは約１００ｎＭ〜１００μＭ程度、より好ましくは約０．５μM〜５０μMとすることができる。 The amount of the oligonucleotide containing the non-methylated CpG sequence that is brought into contact with the epithelial cells is not particularly limited as long as the enhancement of the epithelial barrier function is achieved. Preferably, it is about 10 nM to 1 mM, preferably about 100 nM to 100 μM, more preferably about 0.5 μM to 50 μM per 1.0 × 10 5 epithelial cells.
かくして、上皮バリア機能の増強が達成される。必要に応じて、前述の手法により、上皮バリア機能の増強を、検証、評価することができる。 Thus, enhancement of epithelial barrier function is achieved. If necessary, the enhancement of epithelial barrier function can be verified and evaluated by the above-described method.
２．上皮バリア機能の増強剤
前述の通り、上皮細胞に、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドを接触させることで、上皮バリア機能の増強をすることができる。すなわち、本発明は非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、幹細胞の細胞老化抑制剤をも提供する。また、本発明は、上皮バリア機能の増強をするための、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドをも提供する。
2. Enhancer described above epithelial barrier function, epithelial cells, by contacting an oligonucleotide containing an unmethylated CpG sequence, can be enhanced epithelial barrier function. That is, the present invention also provides a stem cell anti-senescence agent comprising an oligonucleotide containing an unmethylated CpG sequence. The present invention also provides an oligonucleotide comprising an unmethylated CpG sequence for enhancing epithelial barrier function.
本発明の増強剤は、有効成分として非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG ODN）を含む。CpG ODNとしては、前述の上記「１．」欄に記載のものを用いる。 The enhancer of the present invention includes an oligonucleotide (CpG ODN) containing an unmethylated CpG sequence as an active ingredient. As the CpG ODN, the one described in the above “1.” column is used.
本発明の増強剤におけるCpG ODNの含有量は、効果を奏する範囲内で、当業者が適宜設定することができる。好ましい含有量として、約１０ｎM〜１ｍM程度、好ましくは約１００ｎＭ〜１００μＭ程度、より好ましくは約０．５μM〜５０μMとすることができるが、これに限定されるものではない。 The content of CpG ODN in the enhancer of the present invention can be appropriately set by those skilled in the art within the range where the effect is exhibited. A preferable content is about 10 nM to 1 mM, preferably about 100 nM to 100 μM, more preferably about 0.5 μM to 50 μM, but is not limited thereto.
本発明の増強剤が提供される形態は、特に限定されるものではない。具体的な形態としては、例えば、上記の含有量でCpG ODNを含む液体、上記の含有量以上の量でCpG ODNを含む液体（濃縮液体）、CpG ODNを含む固形剤等が挙げられる。適切な溶媒（水、緩衝液、生理食塩水など）にCpG ODNを溶解した、液状形態であることが好ましいが、これに限定されるものではない。 The form in which the enhancer of the present invention is provided is not particularly limited. Specific examples include a liquid containing CpG ODN at the above content, a liquid containing CpG ODN at an amount higher than the above content (concentrated liquid), and a solid agent containing CpG ODN. The liquid form is preferably, but not limited to, CpG ODN dissolved in an appropriate solvent (water, buffer, physiological saline, etc.).
本発明の増強剤は、提供される形態に応じて、CpG ODNの効果を阻害しない範囲で、通常の溶媒、基材を含むものであってもよい。 The enhancer of the present invention may contain a normal solvent and a substrate as long as the effect of CpG ODN is not inhibited depending on the provided form.
本発明の増強剤の具体的用途は、上皮バリア機能の増強が必要とされる用途であれば特に限定されるものではないが、好適な例として上皮バリアの機能低下に起因する疾患の治療薬、上皮バリアの機能低下に起因する障害の改善剤が挙げられる。 The specific use of the enhancer of the present invention is not particularly limited as long as the enhancement of the epithelial barrier function is required, but as a suitable example, a therapeutic agent for a disease caused by a decrease in the function of the epithelial barrier. And an agent for improving a disorder caused by a decrease in function of the epithelial barrier.
３．治療薬
本発明の治療薬は、有効成分として非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG ODN）を含む、上皮バリアの機能低下に起因する疾患の治療薬である。CpG ODNとしては、前述の上記「１．」欄に記載のものを用いる。本発明の治療薬は、医薬組成物として提供されるものであってもよい。
3. Therapeutic Agent The therapeutic agent of the present invention is a therapeutic agent for a disease caused by reduced function of the epithelial barrier, which contains an oligonucleotide (CpG ODN) containing an unmethylated CpG sequence as an active ingredient. As the CpG ODN, the one described in the above “1.” column is used. The therapeutic agent of the present invention may be provided as a pharmaceutical composition.
本発明は、上皮バリアの機能低下に起因する疾患を治療するための、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドをも提供する。さらに、本発明は、上皮バリアの機能低下に起因する疾患の治療薬を製造するための、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドの使用をも提供する。 The present invention also provides an oligonucleotide comprising an unmethylated CpG sequence for treating a disease caused by reduced epithelial barrier function. Furthermore, the present invention also provides the use of an oligonucleotide comprising an unmethylated CpG sequence for the manufacture of a therapeutic agent for a disease caused by reduced function of the epithelial barrier.
本発明の治療薬は、有効成分としてCpG ODNのみを含むものであっても、有効成分として非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG ODN）と他の薬理効果を奏する成分とを併用するものであってもよい。なお、ここでいう「有効成分」には、後述の通常使用される基剤又は担体等は含まれない。 Even if the therapeutic agent of the present invention contains only CpG ODN as an active ingredient, it uses an oligonucleotide containing an unmethylated CpG sequence as an active ingredient (CpG ODN) and an ingredient having other pharmacological effects. It may be. In addition, the “active ingredient” referred to here does not include a commonly used base or carrier described later.
CpG ODNとしては、前述の上記「１．」欄に記載のものを用いる。本発明の治療薬におけるCpG ODNの含有量は、効果を奏する範囲内で、当業者が適宜設定することができる。好ましい含有量として、約１０ｎM〜１ｍM程度、好ましくは約１００ｎＭ〜１００μＭ程度、より好ましくは約０．５μM〜５０μMとすることができるが、これに限定されるものではない。 As the CpG ODN, the one described in the above “1.” column is used. The content of CpG ODN in the therapeutic agent of the present invention can be appropriately set by those skilled in the art within the range where the effect is exhibited. A preferable content is about 10 nM to 1 mM, preferably about 100 nM to 100 μM, more preferably about 0.5 μM to 50 μM, but is not limited thereto.
本発明の治療薬は、CpG ODNを含有することで、上皮バリアの機能低下に起因する疾患に対して治療効果を奏する。上皮バリアの機能低下に起因する疾患としては、気管支喘息、急性肺障害、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、炎症性腸疾患、タンパク漏出性胃腸症、腎障害、ネフローゼ症候群、脳浮腫、角膜炎、角膜潰瘍、リンパ浮腫等が挙げられるが、これに限定されるものではない。 By containing CpG ODN, the therapeutic agent of the present invention has a therapeutic effect on a disease caused by reduced function of the epithelial barrier. Diseases caused by reduced epithelial barrier function include bronchial asthma, acute lung injury, atopic dermatitis, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, inflammatory bowel disease, protein-losing gastroenteropathy, nephropathy, nephrotic syndrome, brain Examples include, but are not limited to, edema, keratitis, corneal ulcer, and lymphedema.
本発明の治療薬は、上記CpG ODN以外に、通常使用される基剤又は担体等を含むものであることが好ましい。基剤又は担体等は、治療薬が提供される剤形に応じて当業者が適宜選択することができる。 The therapeutic agent of the present invention preferably contains a commonly used base or carrier in addition to the above CpG ODN. The base or carrier can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the dosage form for which the therapeutic agent is provided.
本発明の治療薬が提供される剤形は特に限定されるものではなく、湿布剤、テープ剤、パッチ剤などの貼付剤；液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤などの塗布剤、吸引剤等が挙げられる。 The dosage form provided with the therapeutic agent of the present invention is not particularly limited; patches such as poultices, tapes, patches; liquids, suspensions, emulsions, creams, ointments, gels, Examples thereof include coating agents such as liniments and lotions, and suction agents.
本発明の治療薬は、これを1日1〜数回、疾患部位及び剤形に応じた適切な投与方法で投与すればよい。CpG ODNを成人1日あたり例えば0.01〜1000ng、好ましくは0.1〜100ng程度となるように投与すればよい。 The therapeutic agent of the present invention may be administered one to several times a day by an appropriate administration method according to the disease site and dosage form. CpG ODN may be administered at an adult daily dose of, for example, 0.01 to 1000 ng, preferably about 0.1 to 100 ng.
４．改善剤
本発明の治療薬は、有効成分として非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG ODN）を含む、上皮バリアの機能低下に起因する障害の改善剤である。CpG ODNとしては、前述の上記「１．」欄に記載のものを用いる。
4). Improving Agent The therapeutic agent of the present invention is an agent for improving a disorder caused by a decrease in the function of the epithelial barrier, comprising an oligonucleotide containing an unmethylated CpG sequence (CpG ODN) as an active ingredient. As the CpG ODN, the one described in the above “1.” column is used.
本発明は、上皮バリアの機能低下に起因する障害を改善するための、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドをも提供する。さらに、本発明は、上皮バリアの機能低下に起因する障害の改善剤を製造するための、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドの使用をも提供する。 The present invention also provides an oligonucleotide comprising an unmethylated CpG sequence for ameliorating a disorder caused by reduced function of the epithelial barrier. Furthermore, the present invention also provides the use of an oligonucleotide comprising an unmethylated CpG sequence for the manufacture of an agent for ameliorating disorders caused by reduced function of the epithelial barrier.
本発明の改善剤は、有効成分としてCpG ODNのみを含むものであっても、有効成分として非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG ODN）と他の障害の改善効果を奏する成分とを併用するものであってもよい。なお、ここでいう「有効成分」には、後述の通常使用される基剤又は担体等は含まれない。 Even if the improving agent of the present invention contains only CpG ODN as an active ingredient, an oligonucleotide containing an unmethylated CpG sequence (CpG ODN) as an active ingredient is used in combination with a component that has an effect of improving other disorders You may do. In addition, the “active ingredient” referred to here does not include a commonly used base or carrier described later.
CpG ODNとしては、前述の上記「１．」欄に記載のものを用いる。本発明の改善剤におけるCpG ODNの含有量は、効果を奏する範囲内で、当業者が適宜設定することができる。好ましい含有量として、約１０ｎM〜１ｍM程度、好ましくは約１００ｎＭ〜１００μＭ程度、より好ましくは約０．５μM〜５０μMとすることができるが、これに限定されるものではない。 As the CpG ODN, the one described in the above “1.” column is used. The content of CpG ODN in the improving agent of the present invention can be appropriately set by those skilled in the art within the range where the effect is exhibited. A preferable content is about 10 nM to 1 mM, preferably about 100 nM to 100 μM, more preferably about 0.5 μM to 50 μM, but is not limited thereto.
本発明の改善剤は、CpG ODNを含有することで、上皮バリアの機能低下に起因する障害に対して改善効果を発揮する。障害の具体例としては皮膚障害が挙げられる。皮膚障害とは、皮膚疾患とは診断されないものの、乾燥、かさつき、肌荒れ、ハリの欠如、しわ、脱毛、刺激へ過敏になるなどを伴う皮膚の異常状態を指す。 By containing CpG ODN, the improving agent of the present invention exhibits an improving effect on a disorder caused by a decrease in the function of the epithelial barrier. A skin disorder is mentioned as a specific example of the disorder. Skin disorders refer to abnormal skin conditions that are not diagnosed as skin diseases but involve dryness, roughness, rough skin, lack of firmness, wrinkles, hair loss, and irritation.
本発明の改善剤は、上記CpG ODN以外に、通常使用される基剤又は担体等を含むものであることが好ましい。基剤又は担体等は、改善剤が提供される剤形に応じて当業者が適宜選択することができる。上記障害が皮膚障害である場合、本発明の改善剤を、例えば化粧品組成物（メーキャップ化粧料、基礎化粧料、化粧品）として提供される、皮膚外用組成物とすることもできる。 The improving agent of the present invention preferably contains a commonly used base or carrier in addition to the CpG ODN. The base or carrier can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the dosage form for which the improving agent is provided. When the said disorder | damage | failure is a skin disorder | damage | failure, the improvement agent of this invention can also be made into the composition for external use of skin provided, for example as cosmetics compositions (makeup cosmetics, basic cosmetics, cosmetics).
本発明の改善剤が提供される剤形は特に限定されるものではなく、湿布剤、テープ剤、パッチ剤などの貼付剤；液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤などの塗布剤、吸引剤等が挙げられる。 The dosage form provided with the improving agent of the present invention is not particularly limited; patches such as poultices, tapes, patches; solutions, suspensions, emulsions, creams, ointments, gels, Examples thereof include coating agents such as liniments and lotions, and suction agents.
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。 Examples are given below to illustrate the present invention in more detail. However, the present invention is not limited to this.
測定結果の統計処理において、Student t検定及び差異分析ANOVAを用い、被験群間の統計学的有意差を検討した。P < 0.05をもって有意差とした。 In statistical processing of measurement results, statistical significance between test groups was examined using Student t test and difference analysis ANOVA. P <0.05 was considered significant.
［実施例１］
上皮細胞を、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG ODN）の存在下で培養し、経上皮電気抵抗（transepithelial electric resistance、TER）の測定により上皮バリア機能を評価した。
[Example 1]
Epithelial cells were cultured in the presence of oligonucleotides containing unmethylated CpG sequences (CpG ODN), and epithelial barrier function was evaluated by measuring transepithelial electric resistance (TER).
＜方法＞
（１）細胞及び細胞培養
実験細胞として、16HBE細胞（ヒト由来正常気管支上皮細胞（温度感受性SV40 T抗原を導入して不死化した細胞株）；D.C. Gruenert博士（Univ. of California, San Francisco, CA）より供与。）を用いた。16HBE細胞は、10%FBSを添加したMEM培地中で、37℃、二酸化炭素濃度5%の条件下で培養した。また、16HBE細胞は、10~30回の継代培養の間で使用した。
<Method>
(1) 16HBE cells (human-derived normal bronchial epithelial cells (cell lines immortalized by introducing temperature-sensitive SV40 T antigen); DC Gruenert (Univ. Of California, San Francisco, CA) ). 16HBE cells were cultured in a MEM medium supplemented with 10% FBS at 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5%. In addition, 16HBE cells were used between 10 to 30 subcultures.
（２）経上皮電気抵抗（Transepithelial electrical resistance、TER）の測定
16HBE細胞を、10%のFBSを添加したMEM培地中で、コンフルエントまで培養した。次に、16HBE細胞を細胞密度1x105細胞/cm2となるように24穴Transwellインサート（Corning社製、表面積0.33cm2）上に藩種し、10%のFBSを添加したMEM培地中で24時間培養した。
(2) Measurement of transepithelial electrical resistance (TER)
16HBE cells were cultured to confluence in MEM medium supplemented with 10% FBS. Next, 16HBE cells were seeded on a 24-well Transwell insert (Corning, surface area 0.33 cm 2 ) so that the cell density was 1 × 10 5 cells / cm 2, and the cells were cultured in MEM medium supplemented with 10% FBS. Incubate for hours.
その後、培地交換を行い、PBSに溶解した下記CpG ODNを、終濃度が1.25μM、2.5μMまたは5μMとなるように添加した培地中で、72時間さらに培養をした。 Thereafter, the medium was changed, and the cells were further cultured for 72 hours in a medium to which the following CpG ODN dissolved in PBS was added so that the final concentration was 1.25 μM, 2.5 μM, or 5 μM.
CpG ODNは、下記のものを用いた。
（i）ODN2216：5’-ggGGGACGATCGTCgggggg-3’ （配列番号１）
（ii）ODN2006：5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’ （配列番号４）
（iii）ODN2395：5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’ （配列番号７）
（配列中、大文字はホスホジエステル結合、小文字はホスホロチオエート結合をそれぞれ示す。下線部は、パリンドローム配列を示す。）
The following CpG ODN was used.
(I) ODN2216: 5'-ggGG GACGATCGTC gggggg-3 '(SEQ ID NO: 1)
(Ii) ODN2006: 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3 '(SEQ ID NO: 4)
(Iii) ODN2395: 5'-tcgtcgtttt cggcgcgcgccg- 3 '(SEQ ID NO: 7)
(In the sequences, capital letters indicate phosphodiester bonds, and small letters indicate phosphorothioate bonds. Underlined parts indicate palindromic sequences.)
72時間の培養後、Millicell-ERS装置（Millipore社製）を用いて、製造者の指示書に従い、銀及び塩化銀からなる2つの電極を頂端側と基底側にそれぞれ浸して、経上皮電気抵抗（Transepithelial electrical resistance、TER）を測定した。ブランクとして、細胞を藩種していないTranswellのTERを測定した（ブランクTER）。 After 72 hours of incubation, transepithelial electrical resistance using a Millicell-ERS device (Millipore), soaking two electrodes consisting of silver and silver chloride on the apical side and basal side, respectively, according to the manufacturer's instructions (Transepithelial electrical resistance, TER) was measured. As a blank, Transwell TER in which cells were not seeded was measured (blank TER).
以下の方程式を用いてTER（Ω x cm2）を算出した：
（試料TER−ブランクTER）x 表面積TERブランク。
TER (Ω x cm 2 ) was calculated using the following equation:
(Sample TER-Blank TER) x Surface area TER blank.
＜結果及び考察＞
図１に、経上皮電気抵抗の測定結果を、対照に対する相対値（% TER (compared to vehicle control)）により示す。
<Results and discussion>
FIG. 1 shows the measurement result of transepithelial electrical resistance as a relative value (% TER (compared to vehicle control)) with respect to the control.
TER測定において、上皮のバリアが形成されていくと、上皮細胞の頂端側と基底側との間の電気抵抗が上昇する。このような観察を通じて、単層細胞層のバリア機能を定量的に観察することができる。 In the TER measurement, as the epithelial barrier is formed, the electrical resistance between the apical side and the basal side of the epithelial cells increases. Through such observation, the barrier function of the monolayer cell layer can be quantitatively observed.
各CpG ODN添加培地で培養した細胞において、CpG ODNの濃度に依存して、TERが有意に上昇した。従って、上皮細胞をCpG ODNの存在下で培養を行うことにより、上皮バリア機能の増強が達成されたことが示された。 In cells cultured in each medium containing CpG ODN, TER increased significantly depending on the concentration of CpG ODN. Therefore, it was shown that the enhancement of epithelial barrier function was achieved by culturing epithelial cells in the presence of CpG ODN.
［実施例２］
上皮細胞を、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG ODN）の存在下で培養し、傍細胞透過率（Apparent permeability coefficient、Papp）の測定により上皮バリア機能を評価した。
[Example 2]
The epithelial cells were cultured in the presence of an oligonucleotide (CpG ODN) containing an unmethylated CpG sequence, and the epithelial barrier function was evaluated by measuring the paracellular permeability (Apparent permeability coefficient, Papp).
＜方法＞
（１）実施例１と同様にして、CpG ODNの存在下、16HBE細胞を培養した。CpG ODNは、下記のものを用いた。
（i）ODN2006：5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’ （配列番号４）
（ii）ODN2395：5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’ （配列番号７）
（配列中、小文字はホスホロチオエート結合を示す。下線部は、パリンドローム配列を示す。）
<Method>
(1) In the same manner as in Example 1, 16HBE cells were cultured in the presence of CpG ODN. The following CpG ODN was used.
(I) ODN2006: 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3 '(SEQ ID NO: 4)
(Ii) ODN2395: 5'-tcgtcgtttt cggcgcgcgccg- 3 '(SEQ ID NO: 7)
(In the sequences, lower case letters indicate phosphorothioate bonds. Underlined portions indicate palindromic sequences.)
（２）4-kDa FITC-デキストラン（1 mg/ml）（Sigma社製）を含む溶液を、Transwell上層（培地液0.18ml、Transwellインサート中の頂端側コンパートメント）に20μl加えた。Transwell上層のFITC-デキストラン初期濃度は、10 mg/mlであった。 (2) 20 μl of a solution containing 4-kDa FITC-dextran (1 mg / ml) (manufactured by Sigma) was added to the upper layer of Transwell (0.18 ml of medium solution, apical compartment in Transwell insert). The initial FITC-dextran concentration in the upper Transwell layer was 10 mg / ml.
FITC-デキストラン溶液の添加60分後、Transwell下層（培地液1ml、基底側コンパートメント）から培地液を100 μl採取し、PTIフルオロメーター（Photon Technology International社製）を用いて、FITCの蛍光を測定した（励起波長：492 nm、蛍光波長：520 nm）。蛍光測定からTranswell下層中のFITC濃度を算出した。さらに、1秒あたりのFITC-デキストランの透過率（dQ/dt（mol/s））を算出した。 60 minutes after addition of FITC-dextran solution, extract 100 μl of medium solution from Transwell lower layer ( 1 ml of medium solution, basal compartment), and measure FITC fluorescence using PTI fluorometer (Photon Technology International) (Excitation wavelength: 492 nm, fluorescence wavelength: 520 nm). The FITC concentration in the lower layer of Transwell was calculated from the fluorescence measurement. Furthermore, the permeability (dQ / dt (mol / s)) of FITC-dextran per second was calculated.
以下の方程式に従い、傍細胞透過率（Papp)を算出した：
Papp (cm/s) = dQ/dt(1/AC0)
dQ/dt：透過率（mol/s）
C0：Transwell上層に加えたデキストランの初期濃度（mol/ml）
A：Transwellの表面積。
Paracellular permeability (Papp) was calculated according to the following equation:
Papp (cm / s) = dQ / dt (1 / AC 0 )
dQ / dt: Transmittance (mol / s)
C 0 : Initial concentration of dextran added to the upper layer of Transwell (mol / ml)
A: Transwell surface area.
＜結果及び考察＞
図２に、傍細胞透過率の測定結果を示す。結果は、下記式により求めた、CpG ODN未処理細胞の傍細胞透過率に対する相対値（% Dextran permeability compared to vehicle control)）により示す。
<Results and discussion>
FIG. 2 shows the measurement results of the paracellular permeability. A result is shown by the relative value (% Dextran permeability compared to vehicle control) with respect to the paracellular permeability of the CpG ODN untreated cell calculated | required by the following formula.
％デキストラン透過率 = Paap (CpG ODN処理細胞) / Paap (CpG ODN未処理細胞) x 100。 % Dextran permeability = Paap (CpG ODN treated cells) / Paap (CpG ODN untreated cells) x 100.
Papp測定において、上皮のバリアが形成されていくと、上皮細胞の頂端側から基底側への分子の透過率が低下する。このような観察を通じて、単層細胞層のバリア機能を定量的に観察することができる。 In the Papp measurement, when the epithelial barrier is formed, the permeability of the molecules from the apical side to the basal side of the epithelial cells decreases. Through such observation, the barrier function of the monolayer cell layer can be quantitatively observed.
各CpG ODN添加培地で培養した細胞において、CpG ODNの濃度に依存して、FITC-デキストランの傍細胞透過性は有意に減少した。従って、上皮細胞をCpG ODNの存在下で培養を行うことにより、上皮バリア機能の増強が達成されたことが示された。 In cells cultured in each medium supplemented with CpG ODN, the paracellular permeability of FITC-dextran was significantly reduced depending on the concentration of CpG ODN. Therefore, it was shown that the enhancement of epithelial barrier function was achieved by culturing epithelial cells in the presence of CpG ODN.
［実施例３］
上皮細胞を、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG ODN）の存在下で培養し、タイトジャンクションを構成するZO-1タンパク質及びアドヘレンスジャンクション（接着結合）を構成するE-cadherinタンパク質を免疫染色により検出し、タイトジャンクション及びアドヘレンスジャンクションの形成を評価した。
[Example 3]
Epithelial cells are cultured in the presence of oligonucleotides containing unmethylated CpG sequences (CpG ODN), and ZO-1 protein constituting tight junction and E-cadherin protein constituting adherence junction (adhesion bond) Detection was by immunostaining and the formation of tight junctions and adherence junctions was evaluated.
＜方法＞
（１）実施例１と同様にして、CpG ODNの存在下、16HBE細胞を培養した。CpG ODNは、ODN2006：5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’（配列番号４、配列中、小文字はホスホロチオエート結合を示す。）を、5μMで用いた。
<Method>
(1) In the same manner as in Example 1, 16HBE cells were cultured in the presence of CpG ODN. As CpG ODN, ODN2006: 5′-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3 ′ (SEQ ID NO: 4, in which lower case letters indicate phosphorothioate bonds) was used at 5 μM.
（２）培養後、細胞を4%パラホルムアルデヒド中で37℃にて60分間静置し、試料を固定した。リン酸緩衝食塩液（PBS: Phosphate Buffered Saline）にて洗浄後、3%ウシ血清アルブミン(BSA: Bovine serum albumin)を添加したPBS中でさらに10分間、室温で静置した。その後、さらにPBSで洗浄を行った。 (2) After culturing, the cells were allowed to stand in 4% paraformaldehyde at 37 ° C. for 60 minutes to fix the sample. After washing with a phosphate buffered saline solution (PBS: Phosphate Buffered Saline), the plate was further allowed to stand at room temperature for 10 minutes in PBS supplemented with 3% bovine serum albumin (BSA). Thereafter, further washing with PBS was performed.
一次抗体及び二次抗体は下記のものを用いて、ZO-1及びE-cadherinの二重染色を行った。
（i）一次抗体（4℃、24時間静置）
抗ヒトZO-1マウスモノクローナル抗体（Zymed Laboratories社製、使用濃度：10μg/ml）、
抗ヒトE-cadherinラビットポリクローナル抗体（Cell Signaling Technology社製、使用濃度：1：400）
（ii）二次抗体（室温、30分静置）
Alexa 488標識抗マウスIgG 抗体（Molecular Probes社製、使用濃度：1:400）、
Alexa 547抗ラビットIgG 抗体（Molecular Probes社製、使用濃度：1:400）。
Double staining of ZO-1 and E-cadherin was performed using the following primary and secondary antibodies.
(I) Primary antibody (4 ° C, left for 24 hours)
Anti-human ZO-1 mouse monoclonal antibody (Zymed Laboratories, use concentration: 10 μg / ml),
Anti-human E-cadherin rabbit polyclonal antibody (Cell Signaling Technology, working concentration: 1: 400)
(Ii) Secondary antibody (room temperature, left for 30 minutes)
Alexa 488-labeled anti-mouse IgG antibody (Molecular Probes, use concentration: 1: 400),
Alexa 547 anti-rabbit IgG antibody (Molecular Probes, working concentration: 1: 400).
最後に、DAPI染色核染色を行い、プレパラートを作成した。 Finally, DAPI staining nuclear staining was performed to prepare a preparation.
試料を、共焦点顕微鏡（Olympus FV1000, Tokyo, Japan）を用いて、細胞の頂端面（Surface）及び基底面（Bottom）を観察した。 The sample was observed using a confocal microscope (Olympus FV1000, Tokyo, Japan) for the top and bottom surfaces (Bottom) of the cells.
＜結果及び考察＞
図３に、免疫染色の結果を示す。CpG ODN添加培地で培養した細胞において、ZO-1タンパク質及びE-cadherinタンパク質の細胞境界への局在増加が観察された。
<Results and discussion>
FIG. 3 shows the results of immunostaining. Increased localization of ZO-1 protein and E-cadherin protein at the cell boundary was observed in cells cultured in a medium containing CpG ODN.
従って、上皮細胞をCpG ODNの存在下で培養を行うことにより、タイトジャンクション及びアドヘレンスジャンクションの形成が促進されることが示された。すなわち、CpG ODNの存在下で培養を行うことにより、上皮バリア機能の増強が達成されたことが強く示唆される。 Therefore, it was shown that the formation of tight junctions and adherence junctions is promoted by culturing epithelial cells in the presence of CpG ODN. That is, it is strongly suggested that the enhancement of epithelial barrier function was achieved by culturing in the presence of CpG ODN.
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