JP2013528394A - Mlk4遺伝子、新規の癌診断および予後マーカー - Google Patents
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Abstract
Description
このマーカーは、KRASおよびBRAF遺伝子に突然変異を有する腫瘍の治療に関する診断、予後および応答において中心的な役割を果たす。このような腫瘍は、極めて悪い予後と治療応答の欠如を特徴とする。
突然変異解析
PCRプライマーをプライマー3(Primer 3)(http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/ primer3/primer3_www.cgi)を用いて設計し、インビトロジェン/ライフ・テクノロジーズ社(Invitrogen/Life Technologies, Inc., 英国ペーズリー)によって合成した。表2にPCRおよび配列解析プライマーを列挙した。
パラフィン包埋切片をパラフィンから取り出し、水を加えて、プロテイナーゼK(DAKO, デンマーク国グロストルプ)で処理し、標識した高分子検出システム(Bond Polymer Define Detection, ビジョン・バイオシステム(Vision Biosystem),オーストラリア国マウントウェイヴァリー)、および、自動染色装置(BOND-maX, ビジョン・バイオシステム)を用いて免疫染色した。一次ポリクローナル抗体を1:1000の希釈率で使用した。一次抗血清を緩衝液で置き換えることによりネガティブコントロールを得た。高強度で示された膜を有する腫瘍だけを、MLK4を過剰発現しているものと分類した。
配列番号46に記載のMLK4をコードするcDNAをまずTopoTAベクターに挿入し、RT−PCRによって合成した。全長MLK4cDNAをpCEV29.1(10)またはpRRLプラスミド(11)にサブクローニングした。クイックチェンジ(QuikChange)II XL部位特異的変異誘発キット(ストラタジーン(Stratagene))でテンプレートDNAとしてMLK4野生型プラスミドを用いて点突然変異を含むMLK4突然変異体を構築した。以下のオリゴヌクレオチドおよびそれらの逆の相補体を変異誘発プライマーとして使用した:
G291E、
5’−CTTTGAAGATTACAGATTTTGAGTTGGCGAGGGAATGGCAC−3’(配列番号47);
R470C、
5’−TGAGCAGCAGCTGGCAGAGTGCGAGATCGACGTGCTGGAG−3’(配列番号48)。
我々は、標準的な免疫化プロトコール(2匹のウサギをエピトープごとに免疫化した)を用いてMLK4特異的ポリクローナル抗体を開発し、MLK4NまたはC末端のいずれかに対して向けられたポリクローナル抗血清および抗体を生成した。両方の抗体を免疫沈降およびウェスタンブロット実験で試験したところ、これらの抗体は、全ての細胞溶解産物のなかから114kDa(MLK4の予想分子量)のタンパク質を検出するのに用いることができることが示された。免疫ブロッティングで用いられる一次抗体は以下の通りである:抗ビンキュリン(シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich))、抗アクチン(サンタ・クルーズ(S. Cruz))、抗PERK1/2、抗ERK1/2、抗P−SAPK/JNK、抗SAPK/JNK、抗P−AKT、抗AKT、抗P−p38および抗P−38(セル・シグナリング(Cell Signaling))。
A549、Colo−201およびHCT116をRPMI−1640培地(インビトロジェン)中で培養し、NIH3T3、DLD−1およびHCT116−HKE−3から誘導されたクローンをDMEM(インビトロジェン)中で増殖させた。HTERT−HME1を20ng/mLEGF、10μg/mlインスリン、および、100μg/mlヒドロコルチゾンが補充されたDMEM/F−12(インビトロジェン)含有増殖培地中で培養し、一方でDiFi細胞をF−12(インビトロジェン)中で増殖させた。哺乳動物細胞の培養物を、10%ウシ胎児血清(シグマ−アルドリッチ)、2mMのL−グルタミン、100ユニット/mlペニシリン/ストレプトマイシンが補充された適切な培地中で、37℃で、5%CO2を含む加湿した空気中で維持した。マウスNIH3T3線維芽細胞をATCC(CRL−1658)から入手し、10%ウシ血清(56℃で30分、熱で不活性化した)(インビトロジェン)および2mMのL−グルタミンが補充されたDMEM中で培養した。全ての細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection; ATCC, 米国マナサス)で公共的に利用可能である。
100mmプレートにNIH3T3線維芽細胞を2×105細胞で植え付けし、24時間増殖させ、その後、高効率リポソームトランスフェクション法(リポフェクトアミン2000およびプラス(Plus)試薬;インビトロジェン)を用いてトランスフェクションした。各プレートを、インサート非含有またはMLK4タンパク質(野生型または突然変異体)をコードするcDNAを含むpCEV29.1ベクター(4μg)のいずれかにでトランスフェクションした。協同実験のために、細胞を異なるMLK4野生型および突然変異体を含む0.1μgのRasV12プラスミドおよび4μgのpCEVで一時的にコトランスフェクションした。トランスフェクションしてから2日後に、細胞を3つのプレートに分け、5%ウシ血清を含むDMEM中で培養し、病巣形成の測定に使用した。トランスフェクションに続いてグルタルアルデヒド11%およびギムザ染色で固定した後に、増殖巣を2週間スコア付けした。
沸騰したSDS緩衝液(50mMのトリス−HCl、pH7.5、150mMのNaCl、および、1%SDS)中で細胞を可溶化することにより体細胞タンパク質全を抽出した。BCAタンパク質分析試薬キット(ピアース・ケミカル社(Pierce Chemical Co.))によってタンパク質の量を定量した。抽出物をSDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロースメンブレン(ハイボンド(Hybond);GEヘルスケア(GE Healthcare))にトランスファーし、リン酸緩衝生理食塩水、0.1%トゥイーン(Tween)20、5%BSA中でブロッキングした。続いてメンブレンを一次抗体(MLK4、ビンキュリン、アクチン、pERK、ERK、pJNK、JNK、pAKT、AKT,pP38、P38のいずれか)、続いて適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体(ロバ抗ウサギ,バイオ・ラッド・ラボラトリーズ)の適切な希釈液と共にインキュベートした。強化された化学発光(GEヘルスケア)によって最終的な検出を行った。免疫沈降のために、4℃で、20mMトリス−HCl[pH7.4]、150mMのNaCl、10%グリセロールおよび1%トリトンX−100を含む緩衝液800μlを用いて、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤(1mMのNa3VO4、100mMのNaF、1mMのPMSF、10μg/mlロイペプチン、10μg/mlアプロチニン、および、1μg/mlペプスタチン)の存在下で細胞を溶解させた。12,000rpm、20分で抽出物を透明化し、ビシンコニン酸分析で定量した。プロテインA−セファロースビーズを一次抗体と共にプレインキュベートし(4℃で1時間)、次に溶解緩衝液で3回洗浄し、その後全細胞タンパク質と共にインキュベートした。抽出物を一次抗体と共に4℃で2時間インキュベートした。プロテインA−セファロースを用いて免疫複合体を回収し、溶解緩衝液中で3回洗浄した。SDS−PAGEウェスタンブロッティングをこれまでに述べられたようにして行った。
細胞溶解産物をグルタチオン−アガロースビーズ上のGST−RBDと共に4℃で1時間インキュベートした。続いてこれらのビーズを遠心分離で回収し、レムリー(Laemmli)還元サンプル緩衝液に再懸濁し、8分沸騰させた。抗Ras抗体(カルバイオケム(CalBiochem))を用いてウェスタンブロット解析を行った。
免疫沈降したMLK4を2つの独立した方法で処理した。放射性キナーゼ分析に関して、免疫沈降物をキナーゼ分析緩衝液[50mMのHepes(pH7.5)、150mMのNaCl、12.5mMのMgCl2、2mMのEGTA、1mMジチオスレイトールおよび1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム]で3回洗浄し、キナーゼ緩衝液で、[γ−32P]ATPを含む15μMのATPの存在下で37℃で30分インキュベートした。30μlのレムリー緩衝液を添加して1分沸騰させることにより反応を止めた。15%SDS−PAGE、続いてオートラジオグラフィでサンプルを解析した。
腫瘍細胞において、MLK4転写を特異的に標的化するshRNAのレンチウイルスが介在する発現によりMLK4発現は抑制された。我々は、生体反応のばらつきを除外するために、MLK4配列に対して向けられた4種の異なるshRNAを使用した。shRNA配列は、シグマ−アルドリッチのミッション・ライブラリー(Mission library)から登録番号NM_032435(配列1、TRCN0000003209;配列2、TRCN0000003210;配列3、TRCN0000003211;配列4、TRCN0000003213)で入手した。いずれの配列もMLK4レベルを抑制することができる(ただしコントロールShCTRL(SHC002V)はそうではない)。続いて、様々なレシピエント細胞系のなかから2種の最も効率的なshRNAを選択し、その後の実験に用いた。shRNAに感染した細胞のウェスタンブロッティング解析から、MLK4タンパク質が80%より多く減少したことが示された。図に示される結果は、配列2および4(それぞれSh1およびSh2とも称される)についてのものである。
CRC HCT116細胞におけるMLK4エキソン1の破壊をこれまでに述べられたようにして行った(12)。標的化ベクターpAAV−Neo−MLK4をPCRで構築した;DLD1ゲノムを両方の相同性アームのためのテンプレートとして使用した。コンストラクトおよびプライマー配列は、トリノ大学腫瘍科学科(Universita degli Studi di Torino-Dipartimento Scienze Oncologiche, strada Provinciale 142, Candiolo (TO))において公共的に利用可能である。0.4mg/mlのHCT116細胞ゲネチシン(インビトロジェン,カリフォルニア州カールスバッド)での選択条件下で2週間増殖させた後、クローンを選択し、続いて選択的な物質の非存在下で増殖させた。相同組換え現象が遺伝子座特異的PCRスクリーニングで確認された。
5%FBS、0.5%シープラーク(Seaplaque)寒天を含む適切な培地中で細胞を500〜1000細胞/mlの濃度に希釈した。底に1%寒天を敷いた24ウェルプレート(1ml/ウェル)に細胞を植え付け、1週間に3回相当する培地を補充した。植え付けから2週間後にコロニーを撮影してスコア付けした。
コースター(Costar)の24ウェルプレートトランスウェルの、それぞれ8μm孔サイズのトランスウェル移動プレートまたはマトリゲルマトリックスでコーティングしたポリカーボネートフィルターのいずれかを用いて細胞移動および浸潤分析を行った。下部のウェルは、5%血清(基底状態を測定するため)または10ng/mlHGF(誘導された浸潤を測定するため)が添加された500μlの培地を含み、それに対して上部のウェルは、下部のウェルと同じ血清濃度を含む培地中でHCT116については105個またはA549およびDLD1については5×104個の濃度になるように懸濁された100μlの細胞を含む。20時間インキュベートした後、上部のウェル中の細胞/培地を捨て、トランスウェルメンブレンの裏面を移動した細胞をPBS中のグルタルアルデヒド11%で固定し、クリスタルバイオレットで染色し、メタモルフ(MetaMorph)画像解析ソフトウェアでカウントした。
セツキシマブを病院の薬局から得た。96ウェルプラスチック培養プレートで、100μl培地中に適切な密度で細胞系を植え付けた。プレートを37℃、5%CO2で72時間インキュベートし、その後細胞の生存率を、セルタイター−グロー(CellTiter−Glo(R))発光分析(プロメガ(Promega))を用いてATP含量によって評価した。DTX−880プレートリーダー(ベックマン−コールター)を用いて発光を検出した。
動物を用いた手法はいずれもトリノ大学倫理委委員会(the Ethical Commission of the University of Turin)およびイタリア国厚生省(the Italian Ministry of Health)によって承認済みである。6週齢の免疫無防備状態のCD1−/−ヌード無胸腺雌マウス(チャールス・リバー・ラボラトリーズ(Charles River Laboratories),イタリア国レッコ)の右後方の脇腹に皮下注射した。2日毎に腫瘍の外観をキャリパーを用いて計測した。式V=4/3×(d/2)2×(D/2)を用いて腫瘍体積を計算した(式中dは腫瘍の短径であり、Dは腫瘍の長径である)。切り出しの前に黒色の墨を気道に流し込むことにより表在性の肺転移にコントラストを付けて、実体顕微鏡下で解剖した肺葉上でカウントした。
(省略)
参考文献
1. A. Bardelli et al, Science (New York, N.Y300, 949 (May 9, 2003).
2. H. Davies et al, Nature 417, 949 (Jim 27, 2002).
3. T. Maeda et al., Nature 433, 278 (Jan 20, 2005).
4. S. Shirasawa, M. Furuse, N. Yokoyama, T. Sasazuki, Science (New York, NY260, 85 (Apr2, 1993).
5. P. M. Comoglio, L. Trusolino, The Journal of clinical investigation 109, 857 (Apr, 2002).
6. S. Velho et al, Human molecular genetics 19, 697 (Feb 15).
7. D. Brancho et al9 Molecular and cellular biology? 25, 3670 (May, 2005).
8. S. Arena, A. Pisacane, M. Mazzone, P. M. Comoglio, A. Bardelli, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 11412 (Jul 3, 2007).
9. Y. Samuels etal, Cancercell 7, 561 (Jim, 2005).
10. P. Michieli etal, Oncogene 12, 775 (Feb 15, 1996).
11. A. Follenzi, L. E. Ailles, S. Bakovic, M. Geuna, L. Naldini, Nature genetics 25, 217 (Jun, 2000).
12. M. Kohli, C. Rago, C. Lengauer, K. W. Kinzler, B. Vogelstein, Nucleic acids research 32, e3 (2004).
Claims (15)
- インビトロでの診断方法であって、患者の腫瘍細胞サンプル材料中のMLK4遺伝子発現を測定することを含み、ここで前記腫瘍細胞サンプル材料中でMLK4遺伝子が過剰発現されているという測定結果は、前記腫瘍の浸潤能を示す指標であることを特徴とする、上記診断方法。
- 前記MLK4遺伝子発現の測定が、MLK4タンパク質発現、および/または、MLK4をコードする核酸、好ましくはRNAの発現を測定することを含む、請求項1に記載のインビトロでの診断方法。
- 前記腫瘍細胞サンプル材料が、生検サンプルである、請求項1または請求項2に記載のインビトロでの診断方法。
- 前記生検サンプルが、前記腫瘍細胞サンプル材料の浸潤部分に相当する部分である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
- 前記MLK4遺伝子発現の測定が、野生型および/または突然変異MLK4遺伝子発現を測定することを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
- 前記突然変異MLK4遺伝子が、アミノ酸レベルで、H261Y、H261Q、G291E、A293E、W296Stp、R470C、R553Stp、R555Stp、N596I、K629E、P843S、H890P、および、M894T突然変異から選択される少なくとも1つの体細胞変異を含む、請求項5に記載のインビトロでの診断方法。
- 前記突然変異MLK4遺伝子が、核酸レベルで、C781T、C783G、G872A、C878A、G888A、C1408T、C1657T、C1663T、A1787T、A1885G、C2788T、A2669C、T2681C突然変異から選択される少なくとも1つの体細胞変異を含む、請求項5に記載のインビトロでの診断方法。
- 前記MLK4遺伝子発現の測定が、MLK4タンパク質および/またはMLK4をコードする核酸に選択的に結合することができる試薬を用いて行われ、ここで前記試薬は、直接的または間接的に検出可能な物質で標識されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
- 前記試薬が、MLK4タンパク質および/またはそれらの一部に特異的な抗体、または、MLK4核酸および/またはそれらのフラグメントに特異的な核酸プローブである、請求項9に記載のインビトロでの診断方法。
- 前記方法が、前記腫瘍細胞サンプル材料中の少なくとも1種のKRAS遺伝子の分子の変更を測定することをさらに含み、ここで前記少なくとも1種のKRAS遺伝子の変更を測定することは、KRASタンパク質および/またはRNAの発現、および/または、KRAS遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を測定することを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
- (原文脱落)
- 前記腫瘍が、結腸直腸、膀胱、乳房、胃、黒色腫、肺、卵巣またはGMBの腫瘍である、請求項1〜11のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
- 前記突然変異MLK4遺伝子の過剰発現を測定することにより、前記患者が、EGFR特異的な結合因子、好ましくはEGFR特異的な抗体を用いた治療に対して不応性かどうかの予測が可能になる、請求項5〜12のいずれか一項に記載のインビトロでの診断方法。
- MLK4のRNAもしくはタンパク質発現の低減または阻害、または、MLK4酵素活性阻害剤の使用を含む、KRAS遺伝子におけるヌクレオチド配列に突然変異が含まれる腫瘍を有する患者を治療するための、治療的アプローチ。
- 腫瘍が、KRAS遺伝子によってコードされたタンパク質中に少なくとも1つの突然変異を有し、ここで前記KRAS遺伝子によってコードされたタンパク質の少なくとも1つの突然変異は、G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G13AおよびG13Dから選択される、腫瘍の治療に使用するためのMLK4発現および/またはMLK4酵素活性のアンタゴニストおよび/または阻害剤。
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