従って、本発明は、第1の局面および第2の局面において、疼痛に関与する化合物を同定する方法であって、以下の工程:
a)Ctla2b核酸もしくはCtla2bタンパク質、またはその機能的に活性な変異体を含む試験システムを提供する工程、
b)その試験システムを試験化合物と接触させる工程、および
c)その試験システムに対する試験化合物の効果を測定する工程、
を包含し、コントロールと比べて、該試験システムに対する該試験化合物の有意な効果が検出された場合、該試験化合物は、疼痛に関与する化合物と同定される、方法を提供する。
本発明の第1の局面は、Ctla2b核酸を含む試験システムに関し、第2の局面は、Ctla2bタンパク質、またはその機能的に活性な変異体を含む試験システムに関する。
本発明の試験システムは、疼痛に関与するメカニズムを解明するために用いることができる。特に、この試験システムは、疼痛に関与する薬剤(これはCtla2b核酸またはタンパク質と相互作用する、特にそれらを活性化または不活性化させる)を開発、同定および/または特徴付けるために用いることができる。同定された薬剤は、疼痛(特に神経因性疼痛)の治療に用いることのできる、興味深い治療薬となり得る。あるいは、Ctla2bは、痛覚過敏の診断に用いることができる。
種々の試験デザインが当該分野で公知であり、これらのデザインに本発明に従う試験システムが適応され得る。例示的な試験のさらなる詳細は、本発明の方法にて与えられる。この試験システムは、試験システムに対する試験化合物の効果を測定するために用いられ得る。当業者は、例えば、意図する特定の試験方法に適切な一般的な方法に関連して必要なさらなる薬剤を加えることによって、試験システムをデザインすることができる。
Ctla2b核酸もしくはタンパク質またはその機能的に活性な変異体に加えて、本発明の試験システムは1つまたはそれ以上のさらなる構成要素を含むことができる。試験デザインおよび検出方法により、その試験システムは、例えば公知のCtla2bリガンド、Ctla2bシグナル伝達の構成要素、検出のための手段を含んでもよい。当業者は、その試験システムをその研究デザインに適応させる、すなわち適切な緩衝液、補助因子、1つまたはそれ以上の異なる抗体、マーカー、酵素または任意の他の必要な薬剤を選択することによって、適応させることができる。この試験システムは、一般的な条件下で、適切な場合、細胞系または無細胞系であってもよい。
本発明の方法の第1工程において、Ctla2b核酸(例えばCtla2b遺伝子またはCtla2b cDNAもしくはCtla2b mRNAまたはCtla2bプロモーター)、またはタンパク質が提供される。
Ctla2bはまた、細胞障害性Tリンパ球関連タンパク質2βまたはCtla2βと呼ばれている。このCtla2b遺伝子は、活性化されたTリンパ球および肥満細胞中だけでなく、胎盤および子宮内においても発現される。Ctla2bをコードするゲノム配列は、13番染色体のC1バンドにマッピングされている。
このCtla2bタンパク質は、システインプロテアーゼ前駆体のプロ領域に相同性を示す。このCtla2bタンパク質は、パパイン、カテプシンLおよびH(細胞障害性Tリンパ球の機能に重要なBではない)のような特定のシステインプロテアーゼのタンパク質分解活性の競合阻害剤であり、かつそれは、細胞障害性Tリンパ球の機能に重要な遺伝子産物である。Ctla2bは、妊娠初期に胚−子宮の相互作用を調節する役割を持っている。それは、脱落フェーズ中に妊娠マウスの子宮に誘導される。それにより、Ctla2b mRNAは、子宮上皮への胚の結合直後にマウス子宮内膜に誘導され、妊娠5〜8日の間に増加して脱落フェーズの完了に伴って減少する。この子宮発現は、プロゲステロン受容体だけでなく脱落膜応答に関連付けられる他の因子にも依存することが見出された。妊娠中の子宮内のCtla2bの標的の1つは、カテプシンLであり、脱落膜化と注入プロセスに重要なシステインプロテアーゼである。従って、Ctla2bは、栄養膜を増殖することによって生成されたカテプシンLの活性を中和することにより、子宮内への胚の移植を調節するようである。これは、特定のサブタイプのT細胞の減少につながる可能性があり、従って侵入胚に応答する母体の免疫応答を調節することが容易となる。さらに、Ctla2bは、造血幹細胞の集団の再生および拡大に関与することが報告されている。
もともとマウスCtla2bの見かけの完全長アミノ酸配列として同定された以前の登録番号XP_001477616.1(以前の登録番号XM_001477566.1によってコードされ、NCBI(National Centre for Biotechnology Information;National Library of Medicine 38A,Bethesda,MD20894,USA;www.ncbi.nih.gov)より入手可能)の配列を置き換えるCtla2bの2つのアイソフォームがマウス中で確認されている。これらの2つのアイソフォームは、転写変異体1によってコードされるアイソフォームa、および転写変異体2によってコードされるアイソフォームbである。Ctla2bの転写変異体1は、NM_007797.1によってコードされ、NCBIから登録番号NP_031823.1で入手できる(UniProtKB/Swiss−Prot P12400(CTL2B_MOUSE)を参照のこと)。このタンパク質は、113固のアミノ酸から構成されている。配列は、アミノ酸位86から開始し、登録番号XP_001477616.1を持つ配列のアミノ酸位198まで続いている。141アミノ酸長のCtla2bの転写変異体1の前駆形態は、AY034578.1によってコードされる場合、登録番号AAK58454.1(配列番号1)でNCBIから入手可能である。これは、32位の直後に高い割合の荷電アミノ酸を含む非常に親水性の領域を含んでおり、43〜48位でGlu−Trp−Lysトリプレットが反復されている。特定のアミノ酸の保存、特に二次構造モチーフの足場のようなそれらの役目は、C1Aシステインペプチダーゼのプロ領域との対応関係を示している。さらに、Ctla2bは、C1Aペプチダーゼのプロ領域を有しており、アミノ酸60〜78で見いだされるERWNINモチーフ(EX2RX2(I/V)F/WX2NX3(I/V)X3N)および44、47および67位で見いだされる高度に保存されたTrp残基(3つのα−ヘリックスおよび接続ループを含む球状ドメインの疎水性コアに寄与する)の保存を示している。
転写変異体2は、NM_001145801.1によってコードされ、NCBIより登録番号NP_001139273.1で入手可能である。これは、112個のアミノ酸から構成されている。この変異体は、変異体1と比較して、3’コード領域および3’UTRが異なっている。これにより、配列番号1のPro140およびGlu141は、転写変異体2のValによって置き換えられている。得られたアイソフォームbは異なるC末端を有しており、アイソフォームaよりも短い。
Ctla2bは、Ctla2aと90%以上の相同性を示している。それは、両方のタンパク質をコードする遺伝子が、進化中に複製されて、Ctla2aに対して90%以上の相同性を示すCtla2bを生じていると推定される。両方のタンパク質をコードする遺伝子が進化中に複製されて、Ctla2bおよびCtla2a遺伝子を生じさせたと推定される。Ctla2bおよびCtla2aに対する遺伝子は、カテプシンJクラスタ内のカテプシンJ様システインペプチダーゼと高密度にクラスタ化されている。Ctla2a遺伝子の発現は、Tリンパ球および肥満細胞に限定されている。Ctla2aはまた、妊娠子宮および非妊娠子宮のマウスディファレンシャルディスプレイライブラリーから単離される。Ctla2aは、カイコシステインプロテイナーゼ(BCP)およびカテプシンLの強力な阻害剤である。
Ctla2bは、Ctla2aに90%以上の相同性を示している。両方のタンパク質を固−するこれらの遺伝子が、進化中に複製されてCtla2bおよびCtla2a遺伝子を生じていることが推定される。Ctla2bおよびCtla2aの遺伝子は、カテプシンJクラスタ中でカテプシンJ様システインペプチダーゼと高密度にクラスタ化されている。Ctla2a遺伝子発現は、Tリンパ球および肥満細胞に限定されている。Ctla2aはまた、非妊娠子宮に対する妊娠子宮のマウスディファレンシャルディスプレイライブラリから単離される。Ctla2aは、カイコシステインプロテイナーゼ(BCP)およびカテプシンLの強力な阻害剤である。
Ctla2aタンパク質の高度な相同性について、アイソフォームaは、登録番号NP_031822.2(配列番号2;対応するヌクレオチド配列:NM_007796.2)でNCBIより入手可能である。このタンパク質は、137個のアミノ酸から構成されている。
Ctla2aタンパク質のアイソフォームbは、登録番号NP_001139271.1(対応するヌクレオチド配列NM_001145799.1)でNCBIより入手可能である。この変異体は、アイソフォームaと比較して、5’UTRが異なっており、下流翻訳開始コドンを用いている。得られたアイソフォームbは、アイソフォームaと比較してN末端が短い。このタンパク質は、113個のアミノ酸から構成されており、配列番号2のアミノ酸25から出発している。
Ctla2bとCtla2aとの高い相同性により、Ctla2aは、Ctla2bと相当に本発明に含まれる。その結果、Ctla2bに関して記載される全ての特徴および実施態様が、Ctla2aにも適用可能である。このことは、用語Ctla2bが、用語Ctla2aと交換可能に用いられることを意味している。このことはまた、Ctla2bに関して本明細書中に示されているこれらの用語の定義内であるCtla2aの全てのフラグメントおよび変異体にも言及する。
用語Ctla2bタンパク質はまた、同じまたは異なる種(特にヒト)における天然に存在する変異体(例えば、相同体およびオルソログ)も包含する。
非天然変異体は、限られた数のアミノ酸の欠失、挿入および/または置換、特に最大で10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個のアミノ酸の欠失、挿入および/または置換によって得ることができる。
本発明のCtla2b変異体は、その変異体が生物学的機能(例えば、痛みへの関与(例えば、痛みの表現型「力学的痛覚過敏(mechanic hyperalgesia)」の症状として))を維持しているという点で、またはシステインプロテアーゼのタンパク質分解活性のいインヒビターとして、機能的に活性な変異体であるということに留意すべきである。好ましくは、生物学的機能の維持は、天然に存在するCtla2bの活性の少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、80%または90%、さらにより好ましくは95%を有しているとして定義される。この生物学的活性は、当業者に知られているように決定することができる。例えば、痛みの表現型「力学的痛覚過敏」の症状は、実施例およびPersson et al.,2009,Molecular Pain 5:7に詳述されるように決定することができる。
この変異体は、さらなる構成要素を含むために変更される場合がある。したがって、この変異体は、本明細書中に詳述される天然に存在するCtla2bタンパク質またはその変異体および、少なくとも1つのさらなる構成要素で構成されるドメインを有する分子であってもよい。1つの好ましい実施態様において、変異体は、(i)Ctla2bタンパク質または機能的に活性な変異体および(ii)さらなるタンパク質構成要素を含む融合タンパク質であり得る。例えば、このタンパク質は、精製目的で用いられるタグ(例えば、6His(またはHexaHis)タグ、Strepタグ、HAタグ、c−mycタグまたはグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)タグ)のようなマーカーに結合され得る。例えば、より高度に生成されたCtla2bタンパク質または変異体が要求される場合、2重または複数のマーカー(例えば、上記のマーカーまたはタグの組み合わせ)が用いられる。この場合において、これらのタンパク質は2つまたはそれ以上の分離クロマトグラフィー工程で精製され、各場合において最初および2番目のタグの親和性を利用している。このような2重またはタンデムタグの例は、GST−His−タグ(ポリヒスチジンタグに融合されているグルタチオン−S−トランスフェラーゼ)、6xHis−Strep−タグ(Strepタグに融合されている6ヒスチジン残基)、6xHis−タグ100−タグ(哺乳動物MAPキナーゼ2の12アミノ酸タンパク質に融合されている6ヒスチジン残基)、8xHis−HA−タグ(ヘマグルチニン−エピトープ−タグに融合されている8ヒスチジン残基)、His−MBP(マルトース結合タンパク質に融合されているHisタグ)、FLAG−HA−タグ(ヘマグルチニン−エピトープタグに融合されているFLAGタグ)、およびFLAG−Strep−タグである。このマーカーは、タグ付けされたタンパク質を検出するために用いることができ、ここでは特異的抗体が用いられる。適切な抗体としては、抗HA(例えば、12CA5または3F10)、抗6His、抗c−mycおよび抗GSTが挙げられる。さらに、Ctla2bタンパク質は、Ctla2bを検出することのできる蛍光マーカーまたは放射性マーカーのような異なるカテゴリーのマーカーに連結される。さらなる実施態様において、Ctla2bは、融合タンパク質の一部であり得、第2の部分は、酵素活性を有するタンパク質構成要素のように検出用に用いることができる。
本発明の別の実施態様において、Ctla2b変異体はCtla2bフラグメントであり得、このフラグメントは、まだ機能的に活性である。これは、短い内部および/またはC−および/またはN−末端欠失(例えば、多くとも20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個のアミノ酸の欠失)を伴うCtla2bタンパク質を含み得る。さらにCtla2bフラグメントは、Ctla2bタンパク質について上に詳述したようにさらに改変されてもよい。
あるいは、またはさらに、上記のようなCtla2bタンパク質またはその変異体は、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。しかしながら半保存的および特には保存的アミノ酸置換(ここでこのアミノ酸は、化学的に関連のあるアミノ酸で置換されている)が好ましい。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、アミド誘導体刊、塩基性残基を有するアミノ酸間、または芳香族残基を有するアミノ酸間である。典型的な反保存的および保存的置換は以下のとおりである:
新しいシステインが遊離チオールとして残っている場合、A、F、H、I、L、M、P、V、WまたはYからCへの変更は反保存的である。さらに、当業者は、立体的にかさ高い(sterically demanding)位置にあるグリシンは置換されるべきではなく、Pはα−へリックスまたはβ−シート構造を有するタンパク質の一部に導入されるべきではないことを理解する。
置換基を有するCtla2bタンパク質またはフラグメントまたは変異体は、Ctla2bタンパク質またはフラグメントまたは変異体について上記に詳述されたように改変され得る。本発明の以下の記載において、Ctla2bに関して与えられるすべての詳細はまた、特に断らない限り、機能的に活性な変異体にも関連している。
Ctla2bタンパク質の上記の変更は組み合わせることができることに留意されたい。本発明の変異体は、例えばそれに融合されているマーカーを有するCtla2bのフラグメント、または1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むCtla2bタンパク質フラグメントであり得る。
しかしながら、最も好ましくは、Ctla2bタンパク質は、上に詳述したような天然に存在するCtla2bタンパク質であり、さらにより好ましくは、天然に存在するマウスCtla2bタンパク質(特に、配列番号1)およびさらにより好ましくは、天然に存在するヒトオルソログタンパク質である。本発明に含まれるタンパク質は、アイソフォームaまたはb(特に配列番号2)のような天然に存在するマウスCtla2aタンパク質であってもよく、さらにより好ましくは、天然に存在するヒトオルソログタンパク質であってもよい。
用語Ctla2b核酸は、上記のCtla2bタンパク質ならびに天然に存在するおよび天然に存在しないその変異体(本明細書中に定義されるとおり)を包含する。好ましくは、この用語は、Ctla2b遺伝子のコード領域または非コード領域に関し、これらのセクションは、その遺伝子に特異的である適切なサイズのものである。これらの領域の例は、イントロン、エキソンまたはCtla2bプロモーターなどの調節エレメントである。
最も好ましいCtla2b核酸は、上に詳述するように天然に存在するCtla2bタンパク質をコードし、さらにより好ましくは天然に存在するマウスCtla2b(例えば、配列番号1)をコードし、さらにより好ましくは天然に存在するヒトオルソログタンパク質をコードする。本発明に含まれる核酸はまた、上記のような天然に存在するCtla2aタンパク質をコードし、さらにより好ましくは、アイソフォームaまたはbのような天然に存在するマウスCtla2aタンパク質(特に、配列番号2)をコードし、さらにより好ましくは、天然に存在するヒトオルソログタンパク質をコードする。この核酸は、細胞内で遺伝情報やフォーム構造を保持しているモノマーヌクレオチドの鎖から構成される任意の高分子であってもよい。最も一般的(従って好ましい)核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)である。最も好ましくは、用語Ctla2b核酸は、Ctla2b遺伝子、プロモーター、DNA、cDNAまたはmRNAに関連する。
人工核酸は、ペプチド核酸(PNA)、モルホリノおよびロックド核酸(locked nucleic acid(LNA))、ならびにグリコール核酸(GNA)およびトレオース核酸(TNA)が含まれる。これらの各々は、分子の骨格への変化によって、天然に存在するDNAまたはRANと区別される。
本発明の方法の第2の工程において、Ctla2b核酸もしくはタンパク質または機能的に活性なそれらの変異体を含む試験システムは、一時的に薬剤または試験化合物と、試験システムに対する効果を有するのに適切な条件下で接触され、そしてその試験システムを検出する。
適切な条件には、例えば、関与するタンパク質の変性を避け、存在する場合には生存細胞を維持するような適切な温度および溶液が含まれる。適切な条件は、選択される特定の試験システムに依存し、当業者は、一般的な知識に基づいて選択することができる。インキュベーション工程は、約5秒〜数時間、好ましくは約5分〜約24時間に変動させることができる。しかしながら、このインキュベーション時間は、アッセイ形式、マーカー、溶液量、濃度などに依存する。通常、これらのアッセイは、周囲温度で実行されるが、10℃〜40℃などの温度範囲にわたって行うこともできる。
本発明の試験システムで試験される薬剤は、任意の試験物質または任意の化学的性質の試験化合物であってよい。それは既に疾患用の薬剤または医薬として公知であるかもしれない。あるいは、別の実施態様において治療効果を有することがまだ知られていない公知の化学化合物であっても、その化合物が新規であるかまたは未知の化学化合物であってもよい。これらの薬剤は、試験物質または試験化合物の混合物であってもよい。
本発明のスクリーニング法の1実施態様において、試験物質は化学化合物ライブラリの形式で提供される。化学化合物ライブラリは、複数の化学化合物を含み、化学合成された分子または天然の生成物を含む複数の供給源のいずれかから構築されているか、またはコンビナトリアルケミストリー技術によって作製されている。これらは、特にハイスループットスクリーニングに適しており、特定の構造の化学化合物または植物などの特定の生物の化合物から構築されていてもよい。本発明の文脈において、化学化合物ライブラリは、好ましくはタンパク質およびポリペプチドまたは有機低分子を含むライブラリである。好ましくは、有機低分子は、500ダルトン未満のサイズ、特には水溶性の非オリゴマーである有機化合物である。
本発明の第3の工程において、試験システムに対する試験化合物の効果が検出される。以下では、一連の異なる検出系がより詳細に記載される。しかしながら、これらは例示であり、他の試験システムおよび方法もまた適切であるかもしれないことを理解すべきである。
試験化合物が試験システムに対して特異的かつ重要な効果を有している場合、この試験化合物は痛みに関与する化合物であると同定される。このためには、試験化合物の効果は、コントロール(特にネガティブコントロール)と比較される。
それらが意図しない影響(バックグラウンドシグナルなど)を排除または最小限に抑えることができるので、コントロールはこの試験方法の一部である。比較実験は、特定の系に対する変数の影響を調査するために用いられる。比較実験において、1セットのサンプルは改変され(または改変されたと考えられる)、他のセットのサンプルは、変化を示さない(ネガティブコントロール)と予想されるかまたは明確な変化を示す(ポジティブコントロール)と予想されるかのいずれかである。このコントロールは、試験物質と一緒に、1度の試験実行において決定することができる。それは、試験化合物の効果を決定する前または後に決定することができるかまたは公知の値であってもよい。
試験システムに対して効果を有する試験化合物は、試験システムのシグナルを変化、試験システムのシグナルを変化、増加または減少させる場合がある。本発明の文脈において、コントロールと比較して効果を有する試験化合物は、その試験システムが試験化合物と接触するとコントロール(例えば、試験システムを試験化合物と接触させない)よりも明らかに低いまたは高いシグナルを発する。当業者は、スチューデントt−検定やカイ二乗検定のように、2つの値が互いに大きく異なっているかどうかを評価するための統計学的手法を知っている。さらに、当業者は、適切なコントロールを選択する方法を知っている。
好ましい実施態様において、この試験システムのシグナルは、試験化合物によって、ポジティブまたはネガティブコントロールの少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、なおより好ましくは少なくとも75%および最も好ましくは少なくとも90%変更される。
本発明の方法については、任意の適切な検出方法を用いることができる。適切な方法は、試験システムおよび試験される薬剤の特徴により、選択され得る。
この方法は、不均一アッセイまたは均一アッセイであってもよい。本明細書中で用いられる場合、不均一アッセイは、1つまたはそれ以上の洗浄工程を含むアッセイであるが、均一アッセイはそのような洗浄工程が不要なアッセイである。これらの試薬および化合物のみが混合され、測定される。
の試験方法は、連続アッセイであるかまたは不連続アッセイのいずれであってもよい。連続アッセイは、さらなる作業を必要とせずに反応速度を与える。多くの異なるタイプの連続アッセイが存在する。分光光度アッセイにおいては、反応の過程は、吸光度の変化を測定することによって追跡されている。蛍光は、異なる波長の光を吸収した後にある波長の光を放出するときのものである。蛍光アッセイは、生成物からの基質の蛍光の差を用いて酵素反応を測定している。これらのアッセイは、一般的には分光光度アッセイよりもより高感度であるが、不純物によって引き起こされる干渉および光に曝されたときの多くの蛍光化合物の不安定さに悩まされる。熱量測定は、化学反応によって放出または吸収される熱の測定である。多くの反応は、いくらかの熱変化を含み、マイクロカロリーメーターを用いるので、多くの酵素または基質は必要とされず、非常に一般的である。これらのアッセイは、任意の他の方法でアッセイすることが不可能な反応を測定するのに用いることができる。化学発光は、化学反応による光の発光である。いくつかの酵素反応は、光を生成し、これは、生成物形成を検出するために用いることができる。これらの型のアッセイは非常に敏感であり得るが、反応により放出された全ての光が検出されるわけではないので定量が困難であり得る。静的光散乱は、溶液中の高分子の重量平均モル質量及び濃度の積を測定する。測定時間にわたって1つ又はそれ以上の化学種の固定された総濃度と仮定して、散乱シグナルは、溶液の重量平均モル質量の直接的尺度であり、これは複合体が形成するか解離するかによって変動する。それ故、この測定は複合体の化学量論、さらには動力学を定量する。タンパク質動力学の光散乱アッセイは、酵素を必要としない非常に一般的な技術である。
非連続的アッセイは、間隔を置いて酵素反応からサンプルを採取する場合であり、生成物産生又は基質消費の量がこれらのサンプルにおいて測定される。放射測定アッセイは、基質への放射能取り込み又は基質からのその放出を測定する。これらのアッセイにおいて最も頻繁に使用される放射性同位体は、14C、32P、35S及び125Iである。放射性同位体は基質の単一原子の特異的標識を可能にすることができるので、これらのアッセイは非常に敏感でかつ特異的である。これらは生化学において頻繁に使用され、そしてしばしば、粗製抽出物(細胞をすすいだ場合に生じる酵素の複雑な混合物)において特定の反応を測定する唯一の方法である。クロマトグラフィーアッセイは、クロマトグラフィーにより反応混合物をその構成要素に分離することにより生成物形成を測定する。これは通常高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により行われるが、薄層クロマトグラフィーというより単純な技術も使用することができる。このアプローチは大量の材料を必要とし得るが、その感度は、基質/生成物を放射性タグ又は蛍光タグで標識することにより増加され得る。
本発明によると、試験化合物の効果は、Ctla2b核酸またはタンパク質との相互作用によるものであってもよい。従って、Ctla2b核酸またはタンパク質に対する試験化合物の相互作用および/または結合は、(i)Ctla2b核酸またはタンパク質および(ii)試験化合物の複合体を検出することによって検出することができる。2つまたはそれ以上の成分の複合体を検出するのに適した方法は、以下に詳述する。
あるいは、試験化合物の効果(例えば結合)およびCtla2b核酸またはタンパク質に対する影響は、間接的に検出することが可能である。このために、Ctla2b核酸またはタンパク質下流の効果を検出することができる。例えば、Ctla2bに関連する転写および翻訳を測定することができる。1実施態様において、Ctla2b mRNAまたはCtla2bタンパク質が検出される。
特定のタンパク質または他の核酸の存在または量を測定するように設計されている検出のための多くの公知の方法は、タグ、マーカーまたは標識の使用に依存している。試験システムの成分または試験化合物は、十分な検出や精製を可能にする様々な方法で標識されていてもよい。1つの好ましい実施態様において、検出可能なマーカーは、試験システムへの効果を検出するために用いられる。このために、(i)核酸またはCtla2bタンパク質、(ii)試験化合物および/または(iii)試験システムのさらなる成分が、少なくとも1つの検出可能なマーカーで標識され得る。
一般的な標識方法が、コンポーネントの表面上の1つ又はそれ以上の官能基の標識のために使用され得る。タンパク質について、これらは、例えば、各ポリペプチド鎖のN末端及びリジン残基の側鎖に存在する、第1級アミノ基;還元剤でジスルフィド結合を処理することによって又はスクシンイミジル−S−アセチルチオアセテート(SATA)などの試薬でリジン残基を修飾することによって利用可能にされたシステイン残基上に存在するスルフヒドリル基;又は、カップリングのための活性アルデヒドを生成するために酸化され得る、抗体のFc領域に通常存在する、炭水化物基であり得る。コンポーネント又は化合物は、一連の種々の薬剤、例えば、ビオチン(アビジン−ビオチン化学のため)、酵素、アミン、スルフヒドリル若しくは他の官能基を標識するための活性化蛍光色素、例えば、FITC、フルオレセイン、ローダミン、Cy色素又はAlexa fluosで標識され得る。3H、32P、35S、125I又は14Cなどの放射性標識、並びにペニシリナーゼ、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを含む一般的な酵素標識が、同様に使用され得る。
本発明の実施態様において、このマーカーは放射標識、特に3H、32P、33P、35S、125I、または14Cである。
別の実施態様において、このマーカーは1つまたはそれ以上の蛍光マーカーである。適切な蛍光マーカーは、本発明の方法の文脈で説明されている。
これらの方法において特に有用なのは、それらの化学タグ、マーカーまたは標識を介して検出可能な標的特異的プローブの使用である。抗体は最も一般的なタイプのプローブであり:特定の抗原に対するそれらの結合親和性により、それらの標的を「見い出し」、複合サンプル中で検出することを可能にする。しかしながら、抗体はそれ自身がタンパク質であり、それらが可視化のために標識されるかまたは、標識されている別の分子で2次的にプローブされていない限り、アッセイシステム中で特異的に検出できない。
マーカー(又はタグ又は標識)は、別の物質又は物質の複合体の存在を示すことができるいずれかの種類の物質である。マーカーは検出しようとする物質に連結されているか導入されている物質であり得る。検出可能なマーカーは、例えばタンパク質、酵素反応の生成物、第二のメッセンジャー、DNAなどを検出するために分子生物学及びバイオテクノロジーにおいて使用される。適切なマーカーまたは標識の例としては、フルオロフォア、発色団、放射性標識、金属コロイド、酵素、または化学発光もしくは生物発光分子が挙げられる。フルオロフォアの例としては、フルオレセイン、ローダミンおよびスルホインドシアニン色素Cy5が挙げられる。放射性標識の例としては、3H、14C、32P、33P、35S、99mTcまたは125Iが挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アリカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびウレアーゼが挙げられる。さらなる例および好ましい実施態様は、本明細書中に詳述される。
異なるタイプの化学標識またはタグは、様々な方法によってそれらの可視化(すなわち検出および測定)を容易にする2次抗体または1次抗体および他の分子に結合させることができる。放射性同位体は、過去広く用いられたが、それらは効果であり、貯蔵寿命が短く、シグナル:ノイズの非を向上させず、そして特殊な操作および廃棄を必要とする。酵素および蛍光団は、アッセイ用の検出可能なタグとして放射性同位元素に取ってかわっている。試薬及び計測機器の多くの進歩により、これらのより新しい技術がより汎用的で強力なものとなる。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)のような酵素タグは、ブロッティング、免疫学的検定および免疫組織化学的検定法に最も一般的に用いられる。蛍光タグは、細胞イメージング、核酸増幅およびシーケンスおよびマイクロアレイに主に用いられるが、蛍光技術は、全てのタイプのアッセイへの適用のために急速に発展している。
タンパク質の検出は、しばしば特異的抗体の使用を含む。従って、Ctla2bタンパク質またはその変異体の検出は、特異的Ctla2b抗体を含み得る。Ctla2bタンパク質またはその変異体の検出は、特異的Ctla2a抗体を含み得る。あるいは、抗体は、動物を調製された形式の抗原で免疫化する、十分に確立された技術を用いて発生させることができる。様々な試薬が抗体の産生および精製を支援するために利用可能であり、様々な企業が抗体産生のサービスに特化している。実行するアプリケーションによって、異なるレベルの純度および特異性のタイプが、供給される一次抗体において必要とされる。いくつかのパラメーターに名前を付けるために、抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、抗血清またはアフィニティー精製溶液として供給され、天然のタンパク質または変性タンパク質の検出のために検証される。
標的抗原(ここではCtla2bまたはそのフラグメントもしくは改変体)を認識する抗体は、「1次抗体」と呼ばれる。この抗体がタグで標識されると、抗原の直接的な検出が可能となる。しかしながら通常、この1次抗体は、直接的な検出用に標識されていない。代わりに検出可能なタグで標識された「2次抗体」が標的抗原に結合している1次抗体をプローブするための第2工程で適用される。従って、抗原は間接的に検出されている。間接的検出の別の形式は、ビオチンのようなアフィニティータグで標識された1次または2次抗体を用いることを包含する。その後、検出可能な酵素または蛍光タグで標識されたストレプトアビジンなどの2次(または3次)プローブが、ビオチンタグを探索するために用いられ、検出可能なシグナルを得ることができる。いくつかの異なるこれらの探索および検出ストラテジーが存在する。しかしながら、それぞれが、その存在がある種の測定可能なタグ(例えば、その活性がその物質との反応で着色された生成物を作り出すことのできる酵素)に直接または間接的にリンクされている特異的プローブ(例えば、1次抗体)に依存している。
通常、検出可能な標識を持たない1次抗体とある種の2次(間接的)検出法がアッセイ法において必要とされる。それにもかかわらず、ほぼすべての抗体は、必要に応じてビオチン、HRP酵素またはいくつかの蛍光色素分子の1つで標識することができる。ほとんどの1次抗体は、マウス、ウサギまたは他のいくつかの種において産生される。これらのほぼすべてがIgGクラスの抗体である。従って、ほとんどの用途および検出システムのための、すぐに使用できる標識された2次抗体を産生および供給することは、製造業者にとっては比較的容易で経済的である。そうであるとしても、純度のレベル、IgG特異性および種特異性、および検出標識の異なる数百のオプションが利用可能である。2次抗体の選択は、1次抗体が生じた動物の種(宿主種)に依存している。例えば、1次抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、2次抗体はマウス以外の宿主から得られた抗マウス抗体でなければならない。
プローブとしてビオチン結合タンパク質を用いると、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンタンパク質との高く特異的な親和性相互作用が、多くの種類の検出法および親和性精製法のベースとなっている。ビオチンは、非常に小さい(244ダルトン)ので、その抗体や他のプローブへのその共有結合は、ほとんどそれらの機能に干渉しない。なおプローブ上での標識としてのその存在は、アビジンまたはストレプトアビジンによる効率的かつ特異的な2次検出を可能にする。両方の種類のビオチン結合タンパク質が、多くの種類のアッセイシステムで検出可能な酵素または蛍光月で標識された精製形態において利用可能である。
酵素標識は、ブロッティングおよびイムノアッセイにおける2次抗体(またはストレプトアビジン)タグとして最も一般的に用いられている。酵素は、それらの活性を介して検出可能なシグナルを提供し;特定の化学基質との反応によって着色、発光、または蛍光生成物が得られる。βガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼのようなレポーター酵素がプローブを作成するために首尾よく用いられているが、アルカリホスファターゼ(AP)および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)は、タンパク質検出における標識として最も広範囲に用いられる2つの酵素である。色素生産性、蛍光発生的および化学発光的な基質の配列は、どちらの酵素も使用することが可能である。
通常子ウシの腸から単離されるアルカリホスファターゼは、基質分子からのリン酸基の加水分解を触媒する大きな(140kDa)タンパク質であり、反応の副産物として着色生成物もしくは蛍光生成物、または光の放出をもたらす。APは、塩基性のpH(pH8〜10)で最適な酵素活性を有しており、シアン化物、ヒ酸塩、無機リン酸およびEDTAのような2価カチオンキレート剤によって阻害され得る。ウエスタンブロッティングの標識として、APは他の酵素よりも明らかな利点を提供している。その反応速度が線形のままであるので、検出感度を簡単に向上させることができ、長い期間にわたって反応を進行させることができる。
西洋ワサビペルオキシダーゼは、過酸化水素による基質の酸化を触媒する40kDaのタンパク質であり、反応の副産物として、着色生成物もしくは蛍光生成物または光の放出をもたらす。HRPは、中性に近いpHで最適に機能し、シアン化物、硫化物およびアジドによって阻害され得る。抗体−HRP複合体は、酵素と抗体両方の特異的活性に関して、抗体−AP複合体よりも優れている。さらに、高い代謝率、優れた安定性、低コストおよび基質の大きなアベイラビリティーにより、HRPはほとんどの用途に最適な酵素となる。HRP酵素のサイズは小さいので、感度の増加はポリHRP複合体化2次抗体を用いることによって達成され得、いくらかの研究者のためにABC型を用いる必要性を排除することができる。
検出用の蛍光標識は、蛍光顕微鏡を用いて、フローサイトメトリー(FC)、蛍光標示式細胞分取(FACS)および免疫組織化学(IHC)のような少数の細胞生物学アプリケーションにおいて歴史的に用いられてきた。最近まで、プローブを標識するための2つの最も一般的なフルオロフォアは、フルオレセイン(フルオレセインイソチオシアネート、FITC)およびローダミン(テトラメチルローダミンイソチオシアネート、TRITC)であった。他の標識としては、種々の形式の緑色蛍光タンパク質(GFP)およびフィコビリタンパク質(アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリトリンおよびフィコエリトロシアニン)のような蛍光タンパク質が挙げられる。検出のために強力な蛍光シグナルを産生する能力を有する一方、蛍光タンパク質は結合の目的のために最適化するのが困難であり、結合アッセイにおいて立体障害やバックグラウンドシグナルの問題をもたらす可能性がある。
実行するための基質の開発工程が存在しないために、ブロッティングおよびイムノアッセイにおけるフルオロフォア結合プローブの使用は、酵素標識の使用と比較して少ない工程しか必要としない。プロトコルはより短いが、蛍光検出は、特別な装置を必要とし、その感度は、酵素化学発光システムで得ることのできるものほど高くない。酵素検出のように高感度ではないが、蛍光検出法は、化学廃棄物を減少させ、(同じ実験において複数の蛍光色素を用いて)多重適合性の利点が加えられる。
あるいは、またはさらに、2つのマーカーが2つの物質(例えば、試験化合物または公知のCtla2bリガンドおよびCtla2bタンパク質)の接近を検出するために用いられ得る。パパインならびにカテプシンLおよびHが、Ctla2bの公知のリガンドである。このマーカーは、例えば、1つの放射性または蛍光マーカー、および1つのシンチレーター(例えば、シンチレーション近接アッセイ用)または2つの蛍光マーカー(例えば、FRET用)が用いられ得る。1つの実施例において、Ctla2bタンパク質および試験物質は、第1および第2のマーカーで標識され得る。試験物質がタンパク質に結合し、それにより標識が近接している場合には、エネルギーは第1の標識から第2の標識に移動することが可能であり、それによりCtla2bタンパク質と試験物質との相互作用を検出する。この試験は、公知のCtla2bリガンドがそれらの標識のうちの1つを保持している競合結合試験として設計され得る。
適切なマーカーの組み合わせとしては以下が挙げられる。
- ケイ酸イットリウムまたはポリビニルトルエンのようなシンチレーターと組み合わせた放射性標識3H、33P、35Sまたは14C、125I(例えば、微 粒子に区画化されている)または
- LC−Red 610、LC−Red 640、LC−Red 670、LC−Red 705、Cy5、Cy5.5、リッサミンローダミンBスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又はランタニドイオン(例えば、ユーロピウム、又はテルビウム)のようなアクセプター蛍光マーカーと組み合わせた、ドナー蛍光マーカー(例えば、フルオレセイン、ルシファーイエロー(Lucifer Yellow)、B−フィコエリトリン、9−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローVS、4−アセトアミド−4’−イソチオシアナトスチルベン−2,2’−ジスルホン酸、7−ジエチルアミノ−3−(4’−イソチオシアナトフェニル)−4−メチルクマリン、スクシンイミジル1−ピレンブチレート、及び4−アセトアミド−4’−イソチオシアナトスチルベン−2,2’−ジスルホン酸誘導体)。
抗体による検出の代替として、本発明の方法は、試験物質による、Ctla2bからの既知のCtla2bリガンドの結合の置換が研究される、競合結合試験として設計することができる。タンパク質からの既知のリガンドの正常な置換は、タンパク質に対する試験物質の結合の指標である。このアプローチにおいて、複数の試験化合物(例えばライブラリの試験化合物)の簡単なテストを可能にすることは、試験化合物の各々が標識される必要がないために、既知のCtla2bリガンドを標識するのに有利である。
リガンドは、生体分子(本明細書では例えばCtla2bタンパク質または核酸)に結合して複合体を形成することができる物質である。それはイオン性結合、水素結合、疎水性相互作用及びファン・デル・ワールス力のような分子間力によって生体分子上の部位に結合する分子である。ドッキング(会合)は通常可逆性である(解離)。実際に、リガンドとその標的分子との間の不可逆的な共有結合は生物系では稀である。生体分子に結合するリガンドは、その酵素の酵素活性を変更し得る。リガンドには阻害剤及び活性化因子が含まれる。
阻害剤は、酵素に結合してそれらの活性を減少させる分子である。酵素の活性をブロックすることは代謝の不均衡を正し得るので、多くの薬物は酵素阻害剤である。酵素に結合する全ての分子が阻害剤であるわけではなく;酵素活性化因子は酵素に結合してそれらの酵素活性を増加させる。
阻害剤の結合は、基質が酵素の活性部位に入ることを阻止し得、かつ/又は酵素がその反応を触媒することを妨げる。阻害剤の結合は、可逆的又は不可逆的のいずれかである。不可逆的阻害剤は、通常は酵素と反応してそれを化学的に変化させる。これらの阻害剤は酵素活性に必要な鍵となるアミノ酸残基を改変する。対照的に、可逆的阻害剤は、非共有結合で結合し、これらの阻害剤が酵素、酵素−基質複合体、又は両方のいずれに結合するかによって様々な種類の阻害がもたらされる。
選択的リガンドは、酵素のような非常に限られた型の標的(生体分子)に結合する傾向があるが、非選択的リガンドはいくつかの型の標的に結合する。非選択的である薬物は、所望の効果を生じる物に加えていくつかの他の生体分子に結合するため、それらがより有害な影響を有する傾向がある場合、これは薬理学において重要な役割を果たす。
競合結合試験について、公知のリガンドは、少なくとも1つの検出可能なマーカーで標識され、b)のインキュベーション工程に加えられる。工程b)の後、結合された標識リガンドは、非結合リガンドから分離される。この分離は、ろ過、遠心分離、固定化、相分離および液体の除去のような通常の分離工程によってなされ得る。標識によって提供されるシグナルの量は、リガンド結合の量を示しており、すなわち生体分子への結合に対して競合するリガンドおよび試験化合物のような、生体分子に結合している試験化合物の量を示している。
一実施態様において、アッセイはSPA(シンチレーション近接アッセイ)、FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)アッセイ、TR−FRET(時間分解蛍光共鳴エネルギー移動)アッセイ又はFP(蛍光偏光)アッセイである。
SPA(シンチレーション近接アッセイ)は、生化学スクリーニングに使用される技術の型であり、均一系における広範囲のプロセスの迅速で感受性の高い測定を可能にする。SPAに含まれるビーズの種類は、微視的サイズであり、ビーズ自体の中に刺激された場合に光を放出するシンチラント(scintillant)が存在する。刺激は放射標識分子がビーズと相互作用するときに起こる。この相互作用はビーズの光放射を誘発し、これがシンチレーションカウンタを使用して検出され得る。
より詳細には、放射標識分子がビーズに結合するか近接する場合に光の放射が刺激される。しかし、ビーズが放射標識分子と未結合のままである場合、ビーズは光を放射するように刺激されない。これは、SPAビーズから遠く離れすぎている場合、未結合の放射能から放出されるエネルギーが希釈され過ぎているため、ビーズはシグナルを生じるように刺激されない。
トリチウムはSPAに非常によく適しているため大いに推奨される。これは非常に短い1.5μmの水中経路長に起因する。従ってβ粒子がシンチラントビーズから1.5μmという特定の範囲内似ある場合、シンチラントビーズが光を放射するように刺激するために十分なエネルギーが存在する。その距離が1.5μmより長い場合、β粒子は不十分なエネルギーのためビーズを刺激するために必要な距離を移動することができない。この方法が広範囲の適用に適用されることを可能にする、利用可能なビーズコーティングの取り合わせ、例えば酵素アッセイ及びラジオイムノアッセイがある。
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)は、2つの発色団間の放射線フリーのエネルギー転移を記載する。その励起状態にあるドナー発色団は、非放射性長距離双極子−双極子カップリング機構によって、接近している(典型的に<10nm)アクセプターフルオロフォアへエネルギーを移し得る。分子は両方とも蛍光性であるので、エネルギー転移はしばしば「蛍光共鳴エネルギー転移」と呼ばれるが、エネルギーは、実際には、蛍光によって移されない。FRETは、タンパク質−薬剤相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−DNA相互作用、及びタンパク質構造変化を検出及び定量するための有用なツールである。タンパク質の薬剤への、あるタンパク質の別のものへの、又はタンパク質のDNAへの結合をモニタリングするために、分子の一方がドナーで標識され、他方がアクセプターで標識され、これらのフルオロフォア標識分子が混合される。それらが非結合状態で存在する場合、ドナー発光が、ドナー励起時に検出される。分子が結合されると、ドナー及びアクセプターは接近し、ドナーからアクセプターへの分子間FRETに起因して、アクセプター発光が主に観察される。FRETについての好適な隣接物は当技術分野において公知であり、当業者は、両方の抗体についての標識の好適な組み合わせを選択することができる。ドナー及び対応のアクセプターに関して本明細書において使用される場合、「対応の」は、ドナーの励起スペクトルと重複する発光スペクトルを有するアクセプター蛍光部分を指す。しかし、両方のシグナルは、互いから分離可能であるべきである。従って、アクセプターの発光スペクトルの波長最大値は、ドナーの励起スペクトルの波長最大値よりも、好ましくは少なくとも30nm、より好ましくは少なくとも50nm、例えば少なくとも80nm、少なくとも100nm又は少なくとも150nmより大きくあるべきである。
FRET技術において種々のアクセプター蛍光部分と共に使用され得る代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー(Lucifer Yellow)、B−フィコエリトリン、9−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローVS、4−アセトアミド−4’−イソチオシアナトスチルベン−2,2’−ジスルホン酸、7−ジエチルアミノ−3−(4’−イソチオシアナトフェニル)−4−メチルクマリン、スクシンイミジル1−ピレンブチレート、及び4−アセトアミド−4’−イソチオシアナトスチルベン−2,2’−ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、LC−Red 610、LC−Red 640、LC−Red 670、LC−Red 705、Cy5、Cy5.5、リッサミンローダミンBスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンxイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又はランタニドイオン(例えば、ユーロピウム、又はテルビウム)の他のキレートが挙げられる。ドナー及びアクセプター蛍光部分は、例えば、Molecular Probes(Junction City,OR)又はSigma Chemical Co.(St.Louis,MO)から得ることができる。
あるいは、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移(TR−FRET)が、本発明のテストシステムについて使用され得る。TR−FRETは、TRF(時間分解蛍光)及びFRET原理を合わせる。この組み合わせは、TRFの低バックグラウンド利益とFRETのホモジニアスアッセイ形式とを組み合わせる。FRETは既に上記に説明し、TRFは、ランタニド又は長い半減期を有する任意の他のドナーの特有の性質を利用する。TR−FRETについての好適なドナーとしては、特に、ランタニドキレート(クリプタート)及びいくつかの他の金属配位子錯体が挙げられ、これらは、マイクロ〜ミリ秒時間範囲内の蛍光半減期を有し得、従って、これらはまた、エネルギー転移がマイクロ〜ミリ秒測定値で生じることを可能にする。蛍光ランタニドキレートは、70年代後半にエネルギードナーとして使用されていた。一般的に使用されるランタニドとしては、サマリウム(Sm)、ユーロピウム(Eu)、テルビウム(Tb)及びジスプロシウム(Dy)が挙げられる。それらの特殊な光物理学的及びスペクトル的特性のために、ランタニドの錯体は、生物学における蛍光適用について大いに興味深い。具体的には、それらは、より伝統的なフルオロフォアと比較した場合、大きなストークシフト及び極めて長い発光半減期(マイクロ秒〜ミリ秒)を有する。
通常、有機発色団がアクセプターとして使用される。これらとしては、アロフィコシアニン(APC)が挙げられる。TR−FRET並びにアクセプターについての適切な詳細は、WO98/15830に記載されている。
蛍光偏光(FP)に基づくアッセイは、溶液中の蛍光性基質ペプチドを励起するために偏光を使用するアッセイである。これらの蛍光性ペプチドは、溶液中において自由であり、回転し、そのため放射光が脱偏光する。基質ペプチドがより大きな分子へ結合すると、その回転速度は大いに減少し、放射光は高度に偏光されたままとなる。
あるいは、質量分析を使用してもよい。用語「質量分析」は、表面上のサンプルから気相イオンを生成するためにイオン化源を使用し、その気相イオンを質量分析計で検出することを指す。用語「レーザー脱離質量分析」は、表面上のサンプルから気相イオンを生成するためのイオン化源としてレーザーを使用し、そしてその気相イオンを質量分析計で検出することを指す。アシル化されたアシル受容体のような生体分子の質量分析の好ましい方法は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析すなわちMALDIである。MALDIにおいて、検体は典型的にマトリックス物質と混合され、そのマトリックス物質は乾燥させると検体と共に共結晶化する。マトリックス物質はエネルギー源からエネルギーを吸収し、これが別に不安定な生体分子又は検体を断片化する。別の好ましい方法は、表面増強レーザー脱離/イオン化質量分析、すなわちSELDIである。SELDIにおいて、検体が付着された表面は、検体捕捉及び/又は脱離において能動的役割を果たす。本発明の文脈において、サンプルは、クロマトグラフィー又は他の化学的処理を受けていてもよい生物学的サンプル及び適切なマトリックス物質を含む。
質量分析において、「見掛けの分子質量」は、検出されたイオンの分子質量(ダルトン)−対−電荷値(m/z)を指す。見掛けの分子質量がどのように誘導されるかは、使用される質量分析計の型に依存する。飛行時間型質量分析計では、見掛けの分子質量は、イオン化から検出までの時間の関数である。用語「シグナル」は、研究中の生体分子により生じるいずれかの応答を指す。例えば、用語シグナルは、質量分析計の検出器に衝突する生体分子により生じた応答を指す。シグナル強度は生体分子の量又は濃度と相関する。シグナルは2つの値により定義される:記載されるように生成される見掛けの分子質量値及び強度値。質量値は、その生体分子の基本的特徴であるが、強度値は対応する見掛けの分子質量値を有する生体分子の一定の量又は濃度に一致する。従って、「シグナル」は生体分子の特性を常に示す。
上に詳述したように、第1の局面において、疼痛に関与する化合物を同定する方法は、以下の工程:
a)Ctla2b核酸を含む試験システムを提供する工程、
b)該試験システムを試験化合物と接触させる工程、および
c)該試験システムに対する該試験化合物の効果を測定する工程、
を包含し、コントロールと比べて、該試験システムに対する該試験化合物の有意な効果が検出された場合、該試験化合物は、疼痛に関与する化合物と同定される。
核酸に対する試験化合物の効果は、様々な発現レベルまたはシグナル伝達レベルで測定することができる。
この試験化合物は、Ctla2b遺伝子またはCtla2b遺伝子自体の調節配列に結合するように設計することができる。これにより、試験化合物は遺伝子の発現に影響を及ぼす可能性がある。
従って、調節配列への試験化合物の結合は、(i)調節配列または遺伝子と、(ii)試験化合物との複合体を検出することによって測定することができる。2つまたはそれ以上の成分の複合体の適切な検出方法は、本明細書中に詳述されている。
調節配列は、転写因子のような調節タンパク質が優先的に結合するDNAのセグメントである。これらの調節タンパク質は、調節領域(これらはゲノム中に適切に配置されている)と呼ばれるDNAの短い伸展部に結合し、通常遺伝子の「上流」の短い距離が調節される。そうすることによって、これらの調節タンパク質はRNAポリメラーゼと呼ばれる別のタンパク質複合体を補充することができる。この調節配列としては、特定の遺伝子の転写レベルを指示するために通常他の調節領域(エンハンサー、サイレンサー、境界要素/インスレーター)に呼応して作用するプロモーターが挙げられる。
あるいは、試験化合物の効果(例えば結合)および遺伝子転写に及ぼす影響は、間接的に検出することができる。このためには、Md4a6d遺伝子の下流の効果を検出することができる。例えば、Ctla2bに関連する転写および翻訳に及ぼす効果を測定することができる。1実施態様において、Ctla2b mRNAまたはCtla2bタンパク質の量が検出される。
mRNAを検出する適切な方法は本明細書中に記載されており、例えば、ノーザンブロット解析、ヌクレアーゼ保護アッセイ(NPA)、インサイチュハイブリダイゼーション、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)が挙げられる。
ノーザンブロッティング手順については、RNAサンプルは、最初に変性条件下でアガロースゲル中での電気泳動によって、サイズで分離され得る。次いでこのRNAを膜に移し、標識プローブと架橋およびハイブリダイズさせる。非同位体または高非活性放射標識されたプローブを用いることができ、これらとしては、ランダム−プライム法による、ニックトランスレーションされた、またはPCRによって得られたDNAプローブ、インビトロで転写されたRNAプローブ、およびオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、部分的同一性(例えば、エクソンを含み得る、異なる種またはゲノムDNAフラグメント由来のcDNA)のみを有する配列がプローブとして用いられ得る。
ヌクレアーゼ保護アッセイは、特定のmRNAの検出および定量のための非常に感度の高い方法である。NPAの基礎は、RNAサンプルに対するアンチセンスプローブ(放射性標識されているかまたは非同位体)の溶液ハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーション後、1本鎖のハイブリダイズされていないプローブとRNAがヌクレアーゼによって分解される。残りの保護されたフラグメントは、例えばアクリルアミドゲル上で分離される。溶液ハイブリダイゼーションは、典型的には膜ベースのハイブリダイゼーションよりもより効率的であり、部六とハイブリダイゼーションは20〜30μgが最大値であるのに比べ、サンプルRNAを100μgまで収容できる。さらにNPAは、切断が、プローブと重なっている領域のみで検出される(プローブは、通常約100〜400塩基程度の長さである)ので、ノーザン解析よりもRNAサンプルの分解に対して感度が低い。
RT−PCR法においては、RNAテンプレートは、レトロウイルス逆転写酵素を用いて相補的DNA(cDNA)中にコピーされる。その後cDNAは、PCRによって指数関数的に増幅される。相対定量的RT−PCRは、目的の遺伝子と同時に内部コントロールの増幅を含む。内部コントロールは、サンプルの正規化に用いられる。一旦正規化されると、特定のmRNAの相対存在量の直接的な比較は、サンプル全体で行うことができる。競合RT−PCRは、絶対定量のために用いられる。この技術は、サイズやシーケンスの小さな差異によって内因性標的と区別することのできる競合RNAを設計し、合成し、そして正確に定量する工程を含む。既知の量の競合RNAを実験サンプルに加え、RT−PCRを実行する。内因性標的からのシグナルを、コンペティターからの信号と比較して、サンプル中に存在する標的の量を決定する。
上記の方法としては、核酸標識が挙げられ得る。一連の技術は、当業者に公知であり、DNA、RNAまたはオリゴヌクレオチドの標識を可能にする。これらには、例えばニックトランスレーションラベリング、ランダムプライムドDNAラベリング、DNAプローブのPCRラベリングおよびオリゴヌクレオチド3’/5’末端ラベリング、RNAプローブの転写ラベリング、オリゴヌクレオチド3’/5’末端ラベリングおよびオリゴヌクレオチドテーリングが含まれる。
ニックトランスレーション法は、DNAにランダムに分布したニックを導入するためのDNaseの能力に基づいている。DNAポリメラーゼIは、プリマーとしてニックの3’−OH末端を用いて5’→3’方向に無傷な鎖に相補的なDNAを合成する。DNAポリメラーゼIの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、同時に合成の方向にヌクレオチドを除去する。このポリメラーゼ活性は、除去されたヌクレオチドと同位体標識またはハプテン標識されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を順次置き換える。低温(15℃)で、反応中の非標識DNAは、新たに合成された標識DNAによって置き換えられる。一般的な標識としては、ジゴキシゲニン−、ビオチン−、またはフルオレセインもしくはテトラメチルローダミンのような蛍光色素が挙げられる。
「ランダムプライムド」DNAラベリング法は、標識すべきDNAに対して可能な全てのヘキサヌクレオチドの混合物のハイブリダイゼーションに基づいている。全てのシーケンスの組み合わせは、統計的様式で、鋳型DNAへのプライマーの結合を導くヘキサヌクレオチドプライマー混合物で表わされる。従って、鋳型DNAの全長に沿った等しい程度のラベリングが保障されている。この相補鎖は、Klenow酵素の標識グレードを用いて、ランダムヘキサヌクレオチドプライマーの3’OH末端から合成される。修正されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸(例えば、[32P]−、[35S]−、[3H]−、[125I]−、ジゴシゲニン−またはビオチン標識された)は、新たに合成された相補DNA鎖中に組み込まれる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、微量のDNAの増幅を可能にする。唯一の前提条件は、適切なプライマーを合成するために標的配列のいくつかの配列情報が知られているということである。PCRによる標識の組み合わせは、PCR産物の分析のため、また少量の各標的配列から標識されたプローブを調製するための強力なツールである。例えば、ジゴキシゲニン、ステロイドハプテンが、ハイブリダイゼーションおよびその後の色検出または発光検出のために、DNA、RNA、またはオリゴヌクレオチドを標識するために用いられ得る。ジゴキシゲニンは、通常アルカリに不安定なエステル結合を介してdUTPに結合されている。標識dUTPは、DNAポリメラーゼを用いて、酵素を用いた核酸合成によって簡単に組み込むことができる。
オリゴヌクレオチドは、単一のジゴキシゲニン標識されたジデオキシウリジン−三リン酸(DIG−ddUTP)のような標識の取込かまたはより長いヌクレオチドテールの付加によるかのいずれかにより、ターミナルトランスフェラーゼによってその3’末端で酵素的に標識され得る。ターミナルトランスフェラーゼは、2本鎖および1本鎖のDNAフラグメントおよびオリゴヌクレオチドの3’OH末端にデオキシ‐およびジデオキシヌクレオシド三リン酸の鋳型独立した付加を即売する。ターミナルトランスフェラーゼは、ジゴキシゲニン−、ビオチン−、および蛍光標識されたデオキシ−およびジデオキシヌクレオチドと同様放射性標識されたデオキシ−およびジデオキシヌクレオチドを組み込む。あるいは、またはさらに、オリゴヌクレオチドは、例えば従来の固相ホスホラミダイト合成法に従う最終工程におけるホスホラミダイトとの反応によって、オリゴヌクレオチドは5’末端で標識され得る。この処理により、5’末端のアミノ酸官能基が作成される。アンモニアによる処理により、支持体からオリゴヌクレオチドを放出し、保護基を切断する。後続の工程において、このジゴキシゲニン部分は、5’位に導入される。
上記の標識法に用いることのできる異なる標識が知られている。それらに含まれる標識法のいくつかを以下に例示的に記載する:
ビオチン標識化合物は、例えば抗ビオチン抗体またはストレプトアビジンコンジュゲートによって検出することができる。抗ビオチン抗体(例えば、アルカリホスファターゼ(AP)と結合しているモノクローナル抗ビオチン抗体またはFabフラグメント)を、ナイロン膜上での発光を用いた酵素免疫測定法によって、ビオチン標識された核酸の検出に用いることができる。この検出法は、膜上(例えばサザンブロット、ドットブロット)、細胞および組織中(例えばインサイチュハイブリダイゼーション)、免疫ブロット法、免疫組織化学法またはELISAにおいてビオチン標識された核酸の検出用に用いられ得る。ストレプトアビジンコンジュゲートは、いくつかの免疫学的検出システムに用いることのできるビオチン標識された物質(例えば、ビオチン化抗体)の検出に用いられる。このために、ストレプトアビジン(例えば、Streptomyces avidinii由来)は、アルカリホスファターゼまたはβ−ペルオキシダーゼに結合することができる。この検出法は、免疫ブロット法、免疫組織化学法またはELISAに用いることができる。
プローブ−標的ハイブリッドは、酵素結合免疫測定法を用いて検出することができる。この免疫化学的検出工程は、通常放射性検出法よりも高感度である。このアッセイにおいて、膜は、フィルターによって抗体の非特異的な相互作用を防ぐように保護されていてもよい。アルカリホスファターゼ結合抗体は、ジゴキシゲニンに特異的であり、標識されたハイブリッド上のジゴキシゲニン分子を認識する。アルカリホスファターゼ基質の添加により、ハイブリッドの可視化が可能となる。
化学発光検出について、3−(4−メトキシスピロ{1,2−ジオキセタン−3,2−(5−クロロ)トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}−4−イル)フェニルリン酸二ナトリウムまたは4−クロロ−3−(メトキシスピロ{1,2−ジオキセタン−3,2−(5−クロロ)トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}−4−イル)フェニルリン酸二ナトリウムのようなアルカリホスファターゼに適切な基質は、ジオキセタンフェニルホスフェートの群に属している。アルカリホスファターゼによって脱リン酸化されると、形成された中間体の分解により、例えば、X線フィルム上に記録することのできる発光をもたらす。
DIG標識プローブの比色検出は、通常酸化還元系を形成する無色の基質を用いて実施される。例としては、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−ホスフェートおよび4−ニトロ−ブルー−テトラゾリウム−クロライドのようなものである。5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−ホスフェートは、アルカリホスファターゼによって酸化され、ホスフェート基の放出によってインディゴとなる。並行して、4−ニトロ−ブルー−テトラゾリウム−クロライドは、ジホルマザンに還元される。反応生成物は、膜のタイプに応じて、水不溶性のダークブルーから茶色の沈殿物を形成する。
抗体を検出して特定のプローブ−標的ハイブリダイゼーションを可視化するために結合され得る様々なレポーター分子としては、酵素結合抗体、蛍光色素標識抗体(蛍光顕微鏡および蛍光色素によって発せられる波長の可視化を可能にする特定のフィルターによる検出)および金コロイドに結合している抗体(低温セクション(cryostatic section)における電子顕微鏡による検出)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
複数の同時ハイブリダイゼーションは、1つの調製物中の異なる染色体領域または異なるRNA配列を局在化させるために、ジゴキシゲニン−、ビオチン−および蛍光色素−標識されたプローブの組み合わせを用いて実施することができる。このようなマルチプローブ実験は、抗体に結合される異なる蛍光色素のアベイラビリティーによって可能となる。これらには、フルオレセインまたはFITC(フルオレセインイソチオシアネート;黄色)、ローダミンまたはTRITC(テトラメチルローダミンイソチオシアネート;赤)およびAMCA(アミノ−メチルクマリン酢酸;青)が含まれる。
調節配列における効果は、調節配列をレポーター遺伝子に連結し、細胞または生物中に得られたDNA構築物を導入することによっても検出することができる。培養物中の細菌または真核細胞では、このことはプラスミドと呼ばれる環状DNA分子の形態において通常である。研究対象の細胞または生物中で自然に発現されないレポーター遺伝子を用いるのが重要であり、このレポーター遺伝子の発現が、目的の遺伝子の取込が成功したことのマーカーとして用いられるからである。視覚的に識別可能な特徴を誘発する一般的に用いられるレポーター遺伝子は、通常蛍光タンパク質および発光タンパク質に関与しており;例としては、クラゲの緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子(この遺伝子は、それを発現する細胞を、青色光下で緑色に輝かせる)、酵素ルシフェラーゼ(これは、ルシフェリンとの反応を触媒し、光を生成する)、および遺伝子dsRed由来の赤色蛍光タンパク質が挙げられる。細菌における別の通常のレポーターは、タンパク質β−ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子である。この酵素は、基質アナログX−galを含む培地上で増殖されると遺伝子を発現する細菌が、青く見えるようになる(IPTGのような誘導分子はまた、天然のプロモーター下で必要とされる)。細菌において選択可能なマーカーレポーターの例は、抗生物質クロラムフェニコールに耐性を付与するクラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子である。試験化合物の影響は、コントロールと比較して上記のシグナルの量を測定することによって検出することができる。
上に詳述したように、第2の局面において、疼痛に関与する化合物を同定する方法は、以下の工程:
a)Ctla2bタンパク質またはその機能的に活性な変異体を含む試験システムを提供する工程、
b)該試験システムを試験化合物と接触させる工程、および
c)該試験システムに対する該試験化合物の効果を測定する工程、
を包含し、ここで、コントロールと比べて、該試験システムに対する該試験化合物の有意な効果が検出された場合、該試験化合物は、疼痛に関与する化合物と同定される。
従って、Ctla2bタンパク質またはその変異体への試験化合物の結合は、(i)Ctla2bタンパク質またはその変異体と(ii)試験化合物との複合体を検出することによって測定することができる。2つまたはそれ以上の構成要素の複合体の適切な検出方法は、上記および以下に詳述されている。
タンパク質を検出するための適切な方法は、本明細書中に記載されており、例えば、標識されたタンパク質(検出可能なマーカー、タグまたは酵素成分を含む融合タンパク質など)の検出、タンパク質免疫染色、タンパク質の免疫沈降、免疫電気泳動、免疫ブロット法、ウエスタンブロット法、吸光光度法、酵素アッセイなどが挙げられる。この方法は、検出前にタンパク質の精製を必要とする場合があり、タンパク質の単離(例えば、クロマトグラフィー法、タンパク質抽出、タンパク質の可溶化、ゲル電気泳動、および焦点電気泳動による)を含んでもよい。
タンパク質の免疫染色は、サンプル中の特定のタンパク質を検出するための抗体ベースの方法である。免疫染色という用語は、もともと組織切片の免疫組織化学的染色を言及するのに用いられていた。しかし現在、免疫染色は、抗体ベースの染色法を利用する組織学、細胞生物学および分子生物学において用いられる広範な技術を包含している。組織切片または細胞の免疫組織または細胞化学は、固定化によって保存される。
IHC染色の最初の例は、蛍光染料を用いているが、今はペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素を用いた他の非蛍光の方法がより頻繁に用いられている。これらの酵素は、光学顕微鏡で容易に検出され得る着色生成物をもたらす反応を触媒することが可能である。あるいは、放射性元素を用いることができ、また免疫反応はオートラジオグラフィーによって可視化することができる。組織の調製や固定化は、細胞形態および組織構造の保存のために不可欠である。不適切な固定化または長期の固定化は、抗体結合能を著しく低下させる場合がある。多くの抗原は、ホルマリン固定化パラフィン包埋組織切片で首尾よく実証することができる。固定化の方法および時間の最適化、ブロッキング剤による前処理、高濃度の塩による抗体のインキュベート、および抗体の洗浄バッファーと洗浄時間の最適化は、高品質の免疫染色を得るために重要であり得る。
ウエスタンブロッティングは、任意の精製工程の前または後に、細胞または組織から作られた抽出物由来の特定のタンパク質(ネイティブまたは変性)の検出を可能にする。タンパク質は、一般的には乾燥、半乾燥または湿式のブロッティング法により、合成膜(代表的にはニトロセルロースまたはPVDF)に移される前に電気泳動を用いてサイズで分離される。その後この膜は、免疫組織化学と同様の方法を用いるが、固定化を必要とせずに、抗体を用いて調べられる。検出は、通常化学発光反応を触媒する、ペルオキシダーゼ結合抗体を用いて実施される。ウエスタンブロッティングは、半定量的または定量的に抽出物間のタンパク質レベルを比較するために用いることのできる日常的な分子生物学的手法である。ブロッティングの前にサイズ分離することによって、既知の分子量マーカーと比較してタンパク質の分子量を判断することが可能となる。ウエスタンブロッティングは、組織ホモジネートまたは抽出物の所定のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために用いられる分析技術である。これは、ポリペプチドの長さ(変性条件)またはタンパク質の3D構造(ネイティブ/非変性条件)によってタンパク質を分離するためにゲル電気泳動を使用する。
酵素結合免疫吸着検定法またはELISAは、マルチウエルプレートフォーマット(通常はプレートあたり98ウエル)中の血漿、血清または細胞/組織抽出物からタンパク質濃度を定量的または反定量的に決定するための診断法である。広義には、溶液中のタンパク質がELISAプレートに吸着される。目的のタンパク質に特異的な抗体がそのプレートをプローブするのに用いられる。バックグラウンドは、ブロッキングおよび洗浄法(IHC用など)を最適化することによって最小化され、特異性は、ポジティブおよびネガティブコントロールの存在によって保証されている。検出法は、通常は比色または化学発光ベースである。
電子顕微鏡やEMは、組織や細胞の詳細なマイクロアーキテクチャを研究するために用いることができる。免疫EMは、極薄組織切片中の特定のタンパク質の検出を可能にする。重金属粒子(例えば金)で標識された抗体は、直接透過型電子顕微鏡を用いて直接的に見ることができる。タンパク質の細胞内局在化を検出するには強力であるものの、免疫EMは、技術的に難しく、高価でありそして組織の固定化と処理方法の厳密な最適化を必要とする。
代わりに、試験化合物の効果(例えば結合)およびCtla2bタンパク質に対する影響は、間接的に検出することができた。これについて、Ctla2bタンパク質下流の効果を検出することができた。例えば、表現型に対する効果(例えば、痛覚過敏表現型の発現)が測定された。
本発明の好ましい実施態様において、疼痛に関与する化合物は、Ctla2b遺伝子および/またはCtla2bタンパク質のシグナル伝達経路に天然に関与している細胞化合物である。
上に記載したように、このCtla2bタンパク質は、パパイン、カテプシンLおよびH(細胞障害性Tリンパ球の機能に重要なBではない)のような特定のシステインプロテアーゼのタンパク質分解活性の競合阻害剤である。Ctla2bは、妊娠初期において胚−子宮の相互作用を調節する役割を持っている。さらに、Ctla2bは、造血幹細胞の集団の再生および拡張に関与している。
しかしながら、疼痛におけるCtla2bのシグナル伝達経路についてわずかな詳細が知られている。従って、シグナル伝達経路の構成要素を同定することが望ましい。このために、(場合によりCtla2bのシグナル伝達に関与していると推測される)細胞成分を検出することができた。これらは、疼痛に関与する医薬のさらなる目的になり得る。
本発明の好ましい実施態様において、疼痛に関与する化合物が、Ctla2bタンパク質の上流または下流のシグナル伝達を変化させる。さらに、またはあるいは、疼痛に関与する化合物が、Ctla2b遺伝子の上流または下流のシグナル伝達を変化させる、特にこの化合物がCtla2b遺伝子の発現を変化させる。
すでに上に詳述したように、この効果はCtla2bタンパク質または遺伝子のレベルにおいて決定されるだけではなく、上流または下流のシグナル伝達または発現レベルにおいても決定され得る。例としては、Ctla2b遺伝子レベル(Ctla2bタンパク質の上流)、mRNAレベル(Ctla2bタンパク質の上流およびCtla2b遺伝子の下流)、タンパク質レベル(Ctla2b遺伝子の下流)および表現型レベル(Ctla2b遺伝子およびタンパク質のカリュ)が挙げられる。
本発明の好ましい実施態様において、疼痛に関与する化合物は、Ctla2b遺伝子および/またはCtla2bタンパク質のシグナル伝達経路に天然に関与している細胞化合物に結合する、特にこの疼痛に関与する化合物は、Ctla2b核酸またはCtla2bタンパク質、特にCtla2bタンパク質に結合する。
明らかに、Ctla2b遺伝子および/またはCtla2bタンパク質のシグナル伝達経路に天然に関与している細胞化合物への化合物の結合は、シグナル伝達に対して最も影響を及ぼしている可能性がある。しばしば、シグナル伝達経路に天然に関与している細胞化合物への人工化合物の結合は、経路の阻害をもたらす。しかしながら、この人工化合物は、その経路を活性化するように設計することができる。両方のケースにおいて、この結合は経路に影響を及ぼしており、それによって疼痛の感受性が変更される可能性がある。
本発明の好ましい実施態様において、疼痛に関与している化合物は、Ctla2b遺伝子の上流または下流のシグナル伝達を阻害し、特にはその化合物がCtla2b遺伝子の発現を阻害する。
本発明の好ましい実施態様において、疼痛に関与する化合物は、Ctla2bタンパク質の上流または下流のシグナル伝達を阻害し、特にはその化合物がCtla2bタンパク質に結合する。実施例の結果に基づいて、これらの化合物が疼痛を阻害または低減し得ることが期待される。従って、これらは好ましい。
本発明の別の好ましい実施態様において、試験システムは動物細胞などの細胞中、特には哺乳動物細胞、さらに特にはヒト細胞中にある。
細胞ベースのシステムは、細胞のグルコース取込の変化を示す信号を検出するのに用いることができるような細胞および細胞メカニズム(例えば、インスリンの下流またはCtla2bタンパク質もしくは遺伝子の下流もしくは上流のシグナル伝達要素)の増殖(propagate)によって試験システムを簡単に増幅させることができるため、有利である。
本発明の文脈において適切な細胞としては、これらに限定されないが、HEK293、745−A、A−431、心房筋細胞、BxPC3、C5N、Caco−2、Capan−1、CC531、CFPAC、CHO、CHOK1、COS−1、COS−7、CV−1、EAHY、EAHY926、F98、GH3、GP&envAM12、H−295R、H−4−II−E、HACAT、HACATA131、HEK、HEL、HeLa、HepG2、ハイファイブ(High Five)、Hs766T、HT29、HUV−ECR24、HUV−EC−C、IEC17、IEC18、Jurkat、K562、KARPAS−299、L929、LIN175、MAt−LYLU、MCF−7、MNEL、MRC−5、MT4、N64、NCTC2544、NDCKII、Neuro2A、NIH3T3、NT2/D1、P19、一次ニューロン性細胞、一次樹状細胞、一次ヒト筋原細胞、一次ケラチノサイト、SF9、SK−UT−1、ST、SW480、SWU−2OS、U−373、U−937、および、Y−1が挙げられる。その他の適切な細胞としては、当業者に既知のものが挙げられる。
動物やヒトから直接培養される細胞は、初代細胞として知られている。腫瘍由来のいくつかの細胞株を除いて、ほとんどの初代細胞培養は、限られた寿命を持っている。一定数の集団倍加細胞は、一般的に生存能力を保持しながら老化および分裂停止の過程を経る。
樹立細胞株または不死化細胞株は、ランダム変異または故意の改変(テロメラーゼ遺伝子の人工発現など)のいずれかを介して増殖する能力を獲得した。そこには特定の細胞型の代表的な数々の樹立細胞株が存在し、適切な細胞株を選択することは、当業者の知識の範囲内である。
従って、本発明の好ましい実施態様において、細胞は細胞株である。細胞株は、単一の共通祖先細胞から派生し、従って遺伝的に同一である培養中で増殖した細胞の集団である。好ましい細胞株は、HEK293細胞(一次ヒト胎児腎臓)、3T3細胞(マウス胎児線維芽細胞)、CHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)、COS−7細胞(アフリカミドリザル細胞株)、HeLa細胞(ヒト頚部の類上皮細胞ガン)、JURKAT細胞(ヒトT細胞白血病)、BHK21細胞(ハムスターの正常な腎臓、線維芽細胞)、および、MCF−7細胞(ヒト乳ガン)である。
細胞または細胞株は、Ctla2bまたは効果の検出に必要とされる要素を含むように遺伝的に改変され得る。特に好ましい細胞株は、既知のプロモーター系の制御下でCtla2bをコードする遺伝子を包含している。このプロモーター系は、例えば制御可能(化学物質によって誘発できる)であるかまたは恒常的に活性であってもよい。これらのプロモーター系は、当業者に十分に公知である。
あるいは、細胞溶解物(粗生成物、分取されたものまたは精製されたもの)を使用することもできる。これらを製造する例示的な方法は当業者に公知であり、断片化、遠心分離および再懸濁が挙げられ得る。
本発明の好ましい実施態様において、この方法はハイスループットスクリーニング法である。
ハイスループットスクリーニング(HTS)は、創薬において特に使用され、生物学及び化学の分野に関連する科学実験のための方法である。HTSは、しばしば現代のロボット工学、データ処理及び制御ソフトウェア、液体ハンドリング装置、及び高感度検出器の組み合わせを通して、短期間で何百万個もの生物化学的、遺伝子学的又は薬理学的テストを研究者が有効に行うことを可能にする。このプロセスを通して、特定の生体分子経路を調節する活性化合物、抗体または遺伝子を迅速に同定することができる。通常、HTSは、候補化合物のライブラリに対してアッセイのスクリーニングをオートメーションで実行している。典型的なHTSスクリーニングライブラリまたは「デッキ(decks)」は、100,000から2,000,000以上の化合物を含めることができる。
最も頻繁には、HTSの主な試験容器はマルチウエルプレートまたはマイクロプレートである。現代的なHTS用マイクロプレートは、一般的には96、384、1536、または3456のいずれかのウエルを有している。これらは、8×12で9mmの間隔をあけたウエルを有する元々の96ウエルマイクロプレートを反映して、全て96の倍数である。ほとんどのウエルは、実験的に有用な物質(ジメチルスルホキシド(DMSO)水溶液および他の化学化合物)を含んでおり、後者は、プレートを横切る各ウエルごとに異なる。他のウエルは空であってもよく、オプションの実験的なコントロールとしての使用が意図される。
アッセイの準備をするために、研究者は、彼または彼女が実験を行いたい生物学的実態でそのプレートの各ウエルを満たす。本発明の場合においては、Ctla2b核酸またはタンパク質を含む試験システムが満たされる。ウエル中の化合物の吸着、化合物への結合、またはそうでなければ化合物との反応(または反応の失敗)をさせるためにいくらかのインキュベーション時間を経過させたのち、プレートのウエル全体の測定を手動または機械のいずれかによって行う。特殊な自動分析器は、ウエル上で多くの実験(例えばそれらに偏光を照らして、タンパク質結合の指標となり得る反射率を測定する)を行うことができる。この場合において、この機会は、1つのウエルから得られた値に各値のマッピングをして、数値のグリッドとして各実験結果を出力することができる。大容量の分析機は、このような数分のスペースに数十のプレートを測定し、数千もの実験データポイントを非常に迅速に作成することができる。
本発明の好ましい実施態様において、疼痛は神経因性疼痛である。神経痛または神経因性疼痛は、非侵害受容性疼痛、つまり、身体のあらゆる部分における疼痛受容細胞の活性化に関連していない痛みと定義することができる。神経痛は、神経構造や機能の変化によってもたらされる痛みであると考えられている。侵害受容性疼痛とは異なり、神経痛は継続的な侵害受容のインプットなしに存在している。神経痛は、2つのカテゴリ:中枢神経痛および末梢神経痛に分けられる。この異常な痛みは、4つの可能性のあるメカニズムにリンクしていると考えられている;イオンゲートの誤作動;神経が力学的に敏感になり、異所性の信号を作成する;大線維と小線維との間の横断信号;および中央処理装置(central processor)の損傷に起因する誤作動。
神経痛を診断するのはしばしば困難であり、ほとんどの治療はわずかな効果であるかまたはまったく効果を示さない。診断は典型的には不足している感覚や運動機能を識別することによって損傷した神経を見つけ出すことを含む。これは、EMGテストや神経伝導検査のような試験を伴う場合がある。神経痛は、通常の鎮痛薬に対して十分反応しないために、他のタイプの痛みに比べ、治療がより困難である。このことは、この痛みを診断し、治療する新規の方法を開発する必要性があり、ゆえにCtla2b核酸およびタンパク質が興味深い標的を提供することを証明している。
第3の局面において、本発明は、疼痛に関与する化合物を同定するためのCtla2b核酸の使用を提供し、第4の局面において、本発明は、疼痛に関与する化合物を同定するためのCtla2bタンパク質の使用を提供する。
「Ctla2b核酸」、「Ctla2bタンパク質」および「疼痛に関与する化合物を同定する」という用語に関しては、本発明の方法の文脈において提供された定義に言及される。上記の方法は、識別のために用いることができることに留意されたい。
本発明の第3または第4の局面の好ましい実施態様において、化合物および/または疼痛は、本発明の方法の好ましい実施態様の文脈において上に定義したとおりである。
本発明にしたがって同定される疼痛に関与する化合物は、医薬として用いることができる。その医薬の製造のために、同定された標的またはその薬学的に許容される塩は、所望される特性を提供するために組み合わせられる薬学的に許容される担体または補助剤のような成分の混合物からなる一般の医薬剤形である必要がある。
製剤は、少なくとも1種の適切な製薬上許容できるキャリアー、または、補助剤を含む。このような物質の例としては、脱塩水、等張塩類溶液、リンゲル液、緩衝液、有機または無機酸および有機または無機塩基ならびにそれらの塩、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは二リン酸カルシウム、グリコール、例えばプロピレングリコール、エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、糖類例えばグルコース、スクロースおよびラクトース、スターチ、例えばコーンスターチおよびポテトスターチ、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類、例えば落花生油、綿実油、トウモロコシ油、ダイズ油、ヒマシ油、合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、高分子の補助剤、例えばゼラチン、デキストラン、セルロースおよびその誘導体、アルブミン、有機溶媒、錯化剤、例えばクエン酸塩および尿素、安定剤、例えばプロテアーゼまたはヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはアプロチニン、ε−アミノカプロン酸またはペプスタチンA、保存剤、例えばベンジルアルコール、酸化阻害剤、例えば亜硫酸ナトリウム、ワックスおよび安定剤、例えばEDTAが挙げられる。また、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭薬剤および芳香剤、保存剤および抗酸化剤が組成物に含まれていてもよい。生理緩衝溶液のpHは、好ましくは、約6.0〜8.0、特に約6.8〜7.8、特に約7.4であり、および/または、浸透圧モル濃度は、約200〜400ミリオスモル/リットル、好ましくは約290〜310ミリオスモル/リットルである。このような医薬品のpHは、一般的に、例えば適切な有機または無機緩衝液を用いて調節され、好ましくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、HEPES緩衝液([4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジノ]メタンスルホン酸)、または、MOPS緩衝液(3−モルホリノ−1−プロパンスルホン酸)を用いて調節される。それぞれの緩衝液の選択は一般的に、望ましい緩衝液のモル濃度に依存する。例えば注射および輸液には、リン酸緩衝液が適切である。医薬品を製剤化する方法、同様に、適切な製薬上許容できる担体または補助剤は当業者周知である。製薬上許容できる担体および補助剤は、最も一般的な投薬形態および同定された化合物に従って、適宜(a.o.)選択される。
本医薬組成物は、経口、鼻、直腸、非経口、膣、局部または膣への投与に適するように製造することができる。非経口投与としては、皮下の、皮内、筋肉内、静脈内または腹膜内投与が挙げられる。
本医薬品は、例えば、経口投与のための固形製剤、例えばカプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒、経口投与のための液状製剤、例えば製薬上許容できる乳濁液、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル、注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液、直腸または膣投与のための組成物、好ましくは坐剤、および、局所または経皮投与のための製剤、例えば軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチのような様々な投薬形態に応じて製剤化することができる。
あらゆる特定の患者に対応する具体的な治療上有効な用量レベルは、多種多様な要素、例えば、同定された化合物の活性、投薬形態、患者の年齢、体重および性別、治療の継続時間など、医療分野で周知の要素に応じて決定されると予想される。
ヒトまたはその他の哺乳動物に投与される本発明の化合物の、1回または数回に分けた用量での1日用量の総量は、例えば、約0.01〜約50mg/kg体重、または、より好ましくは約0.1〜約25mg/kg体重であり得る。単回投与の組成物には、上記の量またはそれらの約数を1日用量になるように含ませることができる。一般的に、本発明に係る治療計画は、このような治療が必要な患者への、本発明の化合物を、1回または複数回の用量に、1日あたり化合物約10mg〜約1000mgの投与を含む。
第5の局面において、本発明は、痛覚過敏を診断する方法であって、以下の工程:
a)被験者のサンプル中のCtla2b遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
b)該Ctla2b遺伝子の発現レベルがコントロールと比較して被験者のサンプル中で増加している場合、該被験者を痛覚過敏と同定する工程、
を包含する、方法を提供する。
実施例に示されるように、Ctla2b遺伝子の発現レベルは、痛覚過敏と創刊している。したがって、この発現レベルはCtla2b関連の痛覚過敏を診断するのに用いることができる。遺伝子の発現レベルは、遺伝子レベル、mRNAレベル、またはタンパク質レベルで検出することができる。
発現の増加は、Ctla2b遺伝子のコピー数の増加に起因するものであると考えられる。一連の疾患は、遺伝子のコピー数の増加に起因していることが知られている。例えば、乳がんの原因の一つは、HER−2の増幅である場合がある。遺伝子増幅は、免疫組織化学(IHC)および銀、発色または蛍光のいずれかのインサイチュハイブリダイゼーション(SISH/CISH/FISH)によって検出することができる。
プローブのインサイチュハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞または組織内で行われる。細胞構造は、その手順を通して維持されているので、ISHは組織サンプル内でmRNAの位置に関する情報を提供する。この手順は、例えば、中性緩衝ホルマリン中にサンプルを固定化し、その組織をパラフィン中に埋め込むことにより開始する。次いでそのサンプルを薄い切片にスライスし、顕微鏡スライド上にマウントする。(あるいは、組織を区分して凍結し、パラホルムアルデヒド中に後固定することもできる)。脱ワックスのための一連の洗浄および切片の再水和後、プローブのアクセシビリティを高めるためにプロテイナーゼK消化を行い、その後標識プローブをサンプル切片にハイブリダイズさせる。非同位体的に標識したプローブを、比色試薬または蛍光試薬を用いて簡単に検出している間に、放射標識されたプローブを、液膜を用いて可視化し、スライド上で乾燥させる。
あるいは、遺伝子増幅は、仮想核型分析や比較ゲノムハイブリダイゼーションによって検出することができる。破壊されたDNAからインシリコでの高分解能核型を作成するためのプラットホームは、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(arrayCGH)およびSNPアレイなどとして出現している。概念的には、これらのアレイは、ゲノム内の目的の領域に相補的である数百から数百万のプローブで構成されている。試験サンプル由来の破壊されたDNAは、断片化され、標識され、そしてそのアレイにハイブリダイズされる。各プローブについてのハイブリダイゼーションシグナル強度は、アレイ上の各プローブについてのテスト/ノーマルのlog2比を作成する特殊なソフトウエアによって用いられる。アレイ上の各プローブのアドレスおよびゲノム中の各プローブのアドレスを知ることにより、そのソフトウエアは、インシリコで染色体順にプローブを並べ、ゲノムを再構築する。
さらに多数のPCRベースの方法論も上記に記載されている。
あるいは、またはさらに、Ctla2b発現レベルはまた、mRNAまたはタンパク質レベルで検出することもできる。この場合においては、mRNAまたはCtla2bタンパク質の量が検出される。mRNAまたはタンパク質の適切な検出方法は上に詳述されている。
本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬は変化してもよいので、本発明はこれらに限定されない。さらに、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を記載するのみの目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図されない。本明細書及び添付の特許請求において使用される、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明確に別の指示を示していなければ、複数形への言及を含む。同様に、語「含む(comprise)」、「含有する(contain)」及び「包含する(encompass)」は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。
別の定義がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語並びにいずれの頭字語も、本発明の分野における当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似するか又は等しいいずれの方法及び材料も本発明の実施において使用され得るが、好ましい方法及び材料は本明細書に記載される。
本発明は以下の実施例によりさらに説明されるが、当然のことながら、実施例は単に説明の目的のためのみに含まれるのであり、他に具体的に示されていなければ、本発明の範囲を限定することを意図されない。