JP2013525351A - Nanoparticle pharmaceutical composition - Google Patents

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Abstract

本発明は、キトサン、酵素耐性ＰＧＡ−コンプレキソン、および生物活性剤からなる生物活性ナノ粒子の経口送達用の医薬組成物を開示する。キトサンベースのナノ粒子は、薬物の経口送達のために正荷電表面、透過性の増強、およびＧＩＴ内の酵素耐性を特徴とする。
【選択図】図３The present invention discloses a pharmaceutical composition for oral delivery of bioactive nanoparticles comprising chitosan, enzyme resistant PGA-complexone, and a bioactive agent. Chitosan-based nanoparticles are characterized by a positively charged surface, enhanced permeability, and enzyme resistance within GIT for oral drug delivery.
[Selection] Figure 3

Description

本発明は、少なくとも１種の生物活性薬剤とそれらの透過性増強および酵素耐性を有する、キトサンと負荷電基質の組成物を有する、経口薬剤送達のためのナノ粒子の一般的使用に関する。   The present invention relates to the general use of nanoparticles for oral drug delivery having a composition of chitosan and negatively charged substrate having at least one bioactive agent and their permeability enhancement and enzyme resistance.

経口経路は、患者または動物対象に対する薬剤投与の最も簡便な方法と考えられる。それにもかかわらず、腸管上皮は、ペプチドやタンパク質などの親水性薬剤の吸収に対して主要なバリアである。これは、親水性薬剤が、脂質二重層の細胞膜を通って細胞へ容易に拡散することができないためである。傍細胞経路による親水性分子の輸送は、隣接上皮細胞の管腔面に位置する密着帯の存在により厳しく制限されている。密着帯は、親水性分子の傍細胞拡散を制限するバリアを形成する。   The oral route is considered the simplest method of drug administration to a patient or animal subject. Nevertheless, the intestinal epithelium is a major barrier to the absorption of hydrophilic drugs such as peptides and proteins. This is because hydrophilic drugs cannot easily diffuse into cells through the lipid bilayer cell membrane. Transport of hydrophilic molecules by the paracellular pathway is severely limited by the presence of tight junctions located on the luminal surface of adjacent epithelial cells. The cohesive zone forms a barrier that limits the paracellular diffusion of hydrophilic molecules.

胃腸管の上皮細胞などの層内へ細胞を相互に結合させる密着帯を通る細胞間の溶質移動は傍細胞輸送と称される。密着帯は、細胞層の頂端液区画と基底液区画を分離する細胞間バリアを形成する。傍細胞輸送は受動的であり、頂端区画から基底区画へと密着帯を通る溶質の移動は、その溶質に対する密着帯の透過性に依る。   Solute movement between cells through the tight junctions that bind cells together into layers such as epithelial cells of the gastrointestinal tract is called paracellular transport. The cohesive zone forms an intercellular barrier that separates the apical fluid compartment and the basal fluid compartment of the cell layer. Paracellular transport is passive and the movement of a solute through the cohesive zone from the apical compartment to the basal compartment depends on the permeability of the cohesive zone to that solute.

高分子ナノ粒子は、薬剤送達の担体として広範に研究されてきた。ポリ−ε−カプロラクトンおよびポリラクチドなどの生分解性の合成ポリマーから作製されたナノ粒子は、それらの生体適合性により多くの注目を浴びてきた。しかしながら、これらのナノ粒子はそれらの疎水性のため、親水性薬剤の理想的な担体ではない。   Polymeric nanoparticles have been extensively studied as carriers for drug delivery. Nanoparticles made from biodegradable synthetic polymers such as poly-ε-caprolactone and polylactide have received much attention due to their biocompatibility. However, these nanoparticles are not ideal carriers for hydrophilic drugs due to their hydrophobic nature.

経口薬剤送達経路の後、タンパク質薬剤は胃内の低ｐＨの胃媒体により直ちに分解される。経口投与後のタンパク質薬剤の吸収は、それらの高分子量、親水性、および酵素不活化の受け易さにより困難である。胃腸管（ＧＩＴ）内の酵素的バリアを克服するために、プロテアーゼ阻害剤と共に経口的ペプチド剤が同時投与されてきた。短期間では、多くの酵素阻害剤が関係する細胞毒性は最少であるが、長期投与では、栄養タンパク質の消化を妨げ、プロテアーゼの分泌刺激または膵臓肥大を生じさせることが示されている。ペプチド剤分子と酵素阻害剤との間の距離は、ＧＩＴにおいて、最良のシナリオで約数マイクロメートルである。同時投与の際、ペプチド剤分子はＧＩＴ内でプロテアーゼに遭遇するが、酵素阻害剤は保護のための近接位に存在できず、酵素阻害剤の酵素耐性効力の低下に至る恐れがある。   Following the oral drug delivery route, protein drugs are readily degraded by the low pH gastric medium in the stomach. Absorption of protein drugs after oral administration is difficult due to their high molecular weight, hydrophilicity, and susceptibility to enzyme inactivation. To overcome the enzymatic barrier in the gastrointestinal tract (GIT), oral peptide agents have been co-administered with protease inhibitors. In the short term, the cytotoxicity associated with many enzyme inhibitors is minimal, but long-term administration has been shown to prevent digestion of nutrient proteins, resulting in stimulation of protease secretion or pancreatic hypertrophy. The distance between the peptide agent molecule and the enzyme inhibitor is about a few micrometers in the best scenario in GIT. Upon co-administration, the peptide agent molecule encounters a protease within the GIT, but the enzyme inhibitor cannot be in close proximity for protection and can lead to a decrease in the enzyme resistance potency of the enzyme inhibitor.

カチオン性多糖のキトサン（ＣＳ）は、非毒性であり、軟組織適合性である。また、キトサンは、粘膜表面に付着する特性（すなわち、粘膜付着性）を有して上皮細胞間の密着帯を一時的に開放し、ペイロードを放出する生理的範囲に近いｐＨ値において良好な溶解性を有することが知られている。薬剤送達媒体へのペプチド剤またはタンパク質剤（ペイロード）の生理的ｐＨ範囲における装入により、それらの生物活性は保持されると考えられる。   The cationic polysaccharide chitosan (CS) is non-toxic and soft tissue compatible. Chitosan also has a property of adhering to the mucosal surface (ie, mucoadhesiveness), and temporarily releases the adhesion zone between epithelial cells, and dissolves well at a pH value close to the physiological range where the payload is released. It is known to have sex. It is believed that their bioactivity is retained upon introduction of the peptide or protein agent (payload) into the drug delivery vehicle in the physiological pH range.

Ｔｈａｎｏｕらは、腸吸収増強剤としてのキトサンとその誘導体を報告している。酸性ｐＨでプロトン化されたキトサンは、ペプチド剤の粘膜上皮を越えての傍細胞透過性を増加させることができる。ペプチド剤とキトサンまたはＮ−トリメチルキトサンとの同時投与は、キトサン成分による吸収増強のない投与と比較して、動物におけるペプチドの生物学的利用能を実質的に増加させることが分かっている。   Thanou et al. Report chitosan and its derivatives as intestinal absorption enhancers. Chitosan protonated at acidic pH can increase the paracellular permeability of the peptide agent across the mucosal epithelium. Co-administration of peptide agents with chitosan or N-trimethylchitosan has been found to substantially increase the bioavailability of peptides in animals compared to administration without enhanced absorption by the chitosan component.

アニオン性ペプチドであるγ−ＰＧＡは、桿菌属メンバーによるカプセル物質または粘液として産生される天然化合物である。γ−ＰＧＡは、アミド結合を介して相互に結合している天然のＬ−グルタミン酸からなっている点でユニークである。この天然γ−ＰＧＡは、水溶性であり、生分解性であり、非毒性のポリマーであることが報告されている。ジエチレントリアミン五酢酸などのポリアミノカルボン酸（コンプレキソン）は、酵素耐性を示している。経口薬剤送達にとって、吸収増強性能と酵素作用の低下を目的とするナノ粒子製剤において、正荷電物質としてのキトサンと共に使用する負荷電物質としてＰＧＡ−コンプレキソン複合体を組み込むことは臨床的に有益である。   Γ-PGA, an anionic peptide, is a natural compound produced as a capsule material or mucus by members of the genus Neisseria. γ-PGA is unique in that it consists of natural L-glutamic acid linked together through amide bonds. This natural γ-PGA is reported to be a water-soluble, biodegradable, non-toxic polymer. Polyaminocarboxylic acids (complexone) such as diethylenetriaminepentaacetic acid have shown enzyme resistance. For oral drug delivery, it is clinically beneficial to incorporate a PGA-complexone complex as a negatively charged substance for use with chitosan as a positively charged substance in nanoparticulate formulations aimed at enhanced absorption performance and reduced enzyme action is there.

経口投与後のペプチド剤を吸収させるためには、胃腸管（ＧＩＴ）に沿って移行し、粘膜／多糖外被層を通過して腸上皮を横断し門脈に入り、最終的に全身の血液循環内へと排出される必要がある。多くのペプチド剤は、胃腸液および粘膜／多糖外被層に存在する消化酵素により分解され易い。一般に、胃腸管内での吸収過程中、酵素の猛攻撃に抵抗できるペプチド剤はごくわずかである。動物対象に対する酵素耐性化合物（例えば、プロテアーゼ阻害剤）と生物活性剤（例えば、ペプチド剤）との同時投与は、両方の物質を封入するカプセルによって達成することができる。しかしながら、近接限界（ＧＩＴでの酵素の存在下、酵素耐性化合物と生物活性剤は、マイクロメートルまたはミリメートル離れる可能性がある）のため、酵素阻害作用は大きく損なわれることになる。   In order to absorb the peptide agent after oral administration, it moves along the gastrointestinal tract (GIT), crosses the mucosa / polysaccharide envelope, crosses the intestinal epithelium and enters the portal vein, and finally the whole body blood It needs to be discharged into the circulation. Many peptide agents are susceptible to degradation by digestive enzymes present in the gastrointestinal fluid and the mucosa / polysaccharide envelope. In general, very few peptide agents can resist enzyme attack during the absorption process in the gastrointestinal tract. Co-administration of an enzyme resistant compound (eg, a protease inhibitor) and a bioactive agent (eg, a peptide agent) to an animal subject can be achieved by a capsule that encapsulates both substances. However, due to the proximity limit (in the presence of enzymes at GIT, enzyme resistant compounds and bioactive agents can be separated by micrometers or millimeters), enzyme inhibition is greatly impaired.

したがって、本発明の目的の一つは、ＧＩＴ内での酵素攻撃から薬剤を保護するために、対象の薬剤に近接した酵素耐性化合物を有する経口薬剤送達系を提供することである。本発明の態様の幾つかは、正荷電キトサン優勢のシェル部分、正荷電キトサン、ＰＧＡ−コンプレキソン複合体の１つの負荷電基質、ナノ粒子内に装入された少なくとも１種の生物活性剤、および任意にゼロ荷電の化合物を含んでなるコア部分からなるナノ粒子の医薬組成物を提供する。一実施形態において、近接性とは、１マイクロメートル未満であるナノメートルの距離以内として定義される。別の実施形態において、ＰＧＡ−コンプレキソン複合体の負荷電基質は、現行のナノ粒子系の酵素耐性化合物である。   Accordingly, one object of the present invention is to provide an oral drug delivery system having an enzyme resistant compound in close proximity to the drug of interest to protect the drug from enzymatic attack within the GIT. Some of the aspects of the invention include a positively charged chitosan predominant shell portion, a positively charged chitosan, one negatively charged substrate of a PGA-complexone complex, at least one bioactive agent loaded within the nanoparticle, And optionally a pharmaceutical composition of nanoparticles comprising a core portion comprising a zero-charged compound. In one embodiment, proximity is defined as within a nanometer distance that is less than 1 micrometer. In another embodiment, the negatively charged substrate of the PGA-complexone complex is a current nanoparticulate enzyme resistant compound.

本発明の一態様は、キトサン溶液内へのポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）溶液（または、ＰＧＡ−コンプレキソン複合体などの他の負荷電成分）の添加の際に、単純で緩和なイオン性ゲル化法を用いることにより動物対象へのタンパク質剤／ペプチド剤または生物活性剤の送達のための新規でユニークなナノ粒子系を提供する。一実施形態において、使用されるキトサンは、Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）、低分子量キトサン、ＥＤＴＡ−キトサン、キトサン誘導体、および／またはそれらの組み合わせである。一実施形態において、本発明のＣＳの分子量は、タンパク質剤およびペプチド剤の生物活性を維持するｐＨにおける適切な溶解性のために適合した約８０ｋＤａ以下である。低分子量キトサン粒子は、腎臓での不活性が要求される。調製されたナノ粒子の粒径およびゼータ電位値は、それらの成分組成によって制御される。ＴＥＭ（通過電子顕微鏡）およびＡＦＭ（原子間力顕微鏡）検査によって得られた結果は、調製されたナノ粒子の形態が、一般に球形または回転楕円形の形状であることを示した。   One aspect of the present invention is that the addition of a poly-γ-glutamic acid (γ-PGA) solution (or other negatively charged component such as a PGA-complexone complex) into the chitosan solution is simple and relaxed. The use of ionic gelation methods provides new and unique nanoparticle systems for the delivery of protein / peptide or bioactive agents to animal subjects. In one embodiment, the chitosan used is N-trimethyl chitosan (TMC), low molecular weight chitosan, EDTA-chitosan, chitosan derivatives, and / or combinations thereof. In one embodiment, the molecular weight of the CS of the present invention is about 80 kDa or less adapted for proper solubility at a pH that maintains the biological activity of the protein and peptide agents. Low molecular weight chitosan particles are required to be inactive in the kidney. The particle size and zeta potential value of the prepared nanoparticles are controlled by their component composition. The results obtained by TEM (transmission electron microscope) and AFM (atomic force microscope) examination indicated that the prepared nanoparticles had a generally spherical or spheroid shape.

ナノ粒子の投与は、経口投与でもよく、鼻腔内吸収、皮下注射または血管内注射などの非経口投与でもよい。一実施形態において、キトサンはシェル基質としてナノ粒子の表面上で優勢であり、ナノ粒子表面の大部分は正荷電が特徴的である。コア部分では、負荷電のγ−ＰＧＡまたはＰＧＡ−コンプレキソン複合体などの他の好適な負荷電成分が、正荷電キトサンと静電的に相互作用する。一実施形態において、コア部分で、実質的に全ての負荷電コア基質が正荷電基質の部分と複合化または相互作用するので、実質的にゼロ荷電（中性）のコアが維持される。   The administration of the nanoparticles may be oral administration or parenteral administration such as intranasal absorption, subcutaneous injection or intravascular injection. In one embodiment, chitosan predominates on the surface of the nanoparticle as a shell substrate, and the majority of the nanoparticle surface is characterized by a positive charge. In the core part, other suitable negatively charged components, such as negatively charged γ-PGA or PGA-complexone complex, interact electrostatically with the positively charged chitosan. In one embodiment, a substantially zero charged (neutral) core is maintained in the core portion since substantially all of the negatively charged core substrate is complexed or interacts with a portion of the positively charged substrate.

さらなる実施形態において、ナノ粒子は約５０ナノメートル〜４００ナノメートルの間、好ましくは、約１００ナノメートル〜３００ナノメートルの間、最も好ましくは、約１００ナノメートル〜２００ナノメートルの間の平均粒径を有する。酵素耐性ＰＧＡ−コンプレキソン複合体と生物活性剤は両方ともナノ粒子内に封入されるので、それらの距離は常にナノメートルの範囲内にある。   In a further embodiment, the nanoparticles have an average particle size between about 50 nanometers and 400 nanometers, preferably between about 100 nanometers and 300 nanometers, and most preferably between about 100 nanometers and 200 nanometers. Have a diameter. Since the enzyme-resistant PGA-complexone complex and the bioactive agent are both encapsulated within the nanoparticles, their distance is always in the nanometer range.

一実施形態において、生物活性剤含有ナノ粒子は、ナノ粒子の基本製剤にもナノ粒子構造の静電ネットワーク形成にも関与していない少なくとも１種の透過増強剤をさらに含んでなる。透過増強剤は、キレート化剤、胆汁酸塩、アニオン性界面活性剤、中鎖脂肪酸、リン酸エステルなどからなる群から選択できる。別の実施形態において、ナノ粒子と透過性増強剤は、同時投与のために、１カプセル中に共装入されるか、または２組のカプセルに別々に封入される。   In one embodiment, the bioactive agent-containing nanoparticles further comprise at least one permeation enhancer that is not involved in the basic formulation of nanoparticles or the formation of an electrostatic network of nanoparticle structures. The permeation enhancer can be selected from the group consisting of chelating agents, bile salts, anionic surfactants, medium chain fatty acids, phosphate esters and the like. In another embodiment, the nanoparticles and permeability enhancer are co-loaded in one capsule or encapsulated separately in two sets of capsules for simultaneous administration.

一実施形態において、アルツハイマー病治療のための方法は、アルツハイマー病治療のための少なくとも１種の生物活性剤の有効量と共に、ナノ粒子を、１日約１０ｍｇ〜４０ｍｇ、１ヶ月から１年またはそれ以上の期間、患者に投与することを含んでなる。別の実施形態において、シェル部分の少なくとも一部は架橋されており、架橋の程度は、好ましくは約５０％未満であり、最も好ましくは約１％〜２０％の間である。   In one embodiment, the method for treating Alzheimer's disease comprises treating the nanoparticles with an effective amount of at least one bioactive agent for treating Alzheimer's disease, about 10 mg to 40 mg, 1 month to 1 year or more per day. Administering to the patient for the above period. In another embodiment, at least a portion of the shell portion is crosslinked, and the degree of crosslinking is preferably less than about 50%, and most preferably between about 1% and 20%.

本発明の一態様は、ナノ粒子を凍結乾燥して固体乾燥ナノ粒子を形成することのできるナノ粒子の医薬組成物を提供する。乾燥ナノ粒子は、カプセル剤、錠剤、丸剤、チュアブル錬剤、または任意の簡便な薬剤送達媒体内に装入でき、カプセル剤は、動物対象における経口投与のための腸溶コーティングによってさらに処理できる。凍結乾燥ナノ粒子は、凍結乾燥前のナノ粒子とほぼ同じ物理的および生化学的性質の正電荷表面を有する湿潤ナノ粒子に戻るように、溶液中で、または体液との接触により再水和できる。一実施形態において、ナノ粒子は、凍結乾燥過程で、トレハロースまたはヘキサン−１，２，３，４，５，６−ヘキソールと混合できる。一実施形態において、カプセル剤の内面は、親油性または疎水性になるように処理される。別の実施形態において、カプセル剤の外面は、腸溶コーティングされるか、または腸溶コーティングポリマーによって処理される。   One aspect of the invention provides a pharmaceutical composition of nanoparticles that can be lyophilized to form solid dry nanoparticles. The dry nanoparticles can be loaded into capsules, tablets, pills, chewable smelts, or any convenient drug delivery vehicle, and the capsules can be further processed with an enteric coating for oral administration in animal subjects. . Freeze-dried nanoparticles can be rehydrated in solution or by contact with bodily fluids to return to wet nanoparticles with positively charged surfaces of approximately the same physical and biochemical properties as the nanoparticles prior to freeze-drying . In one embodiment, the nanoparticles can be mixed with trehalose or hexane-1,2,3,4,5,6-hexol in a lyophilization process. In one embodiment, the inner surface of the capsule is treated to become lipophilic or hydrophobic. In another embodiment, the outer surface of the capsule is enteric coated or treated with an enteric coating polymer.

本発明の態様の幾つかは、動物対象における経口投与のために、正荷電キトサン優勢のシェル部分、負荷電のＰＧＡ−コンプレキソン複合体基質を含有するコア部分を含んでなる酵素耐性ナノ粒子の医薬組成物を提供し、負荷電基質は、コア部分における正荷電キトサンの一部分と少なくとも部分的に中和しており、少なくとも１種の生物活性剤がナノ粒子内に装入されている。一実施形態において、ＰＧＡ−コンプレキソン複合体は酵素耐性特性を有する。   Some of the embodiments of the present invention provide for enzyme-resistant nanoparticles comprising a positively charged chitosan predominant shell portion, a core portion containing a negatively charged PGA-complexone complex substrate for oral administration in an animal subject. A pharmaceutical composition is provided, wherein the negatively charged substrate is at least partially neutralized with a portion of the positively charged chitosan in the core portion, and at least one bioactive agent is loaded into the nanoparticles. In one embodiment, the PGA-complexone complex has enzyme resistance properties.

一実施形態において、本発明の医薬組成物のナノ粒子表面は、正電荷表面を特徴としており、ナノ粒子は、約＋５ｍＶから約＋７５ｍＶ、好ましくは、約＋１５ｍＶから約＋５０ｍＶの表面電荷を有する。さらなる一実施形態において、ナノ粒子は凍結乾燥粉末の形態にある。一実施形態において、本発明の医薬組成物のナノ粒子は、鉄、亜鉛、カルシウム、硫酸マグネシウムおよびＴＰＰをさらに含んでなる。   In one embodiment, the nanoparticle surface of the pharmaceutical composition of the invention is characterized by a positively charged surface, and the nanoparticle has a surface charge of about +5 mV to about +75 mV, preferably about +15 mV to about +50 mV. In a further embodiment, the nanoparticles are in the form of a lyophilized powder. In one embodiment, the nanoparticles of the pharmaceutical composition of the present invention further comprise iron, zinc, calcium, magnesium sulfate and TPP.

本発明の態様の幾つかは、動物対象における腫瘍壊死因子により生じた炎症反応を低下させる方法を提供し、この方法は、ＴＮＦ阻害剤、キトサン、およびＰＧＡ−コンプレキソン複合体のコア基質からなるナノ粒子を経口投与することを含んでなる。一実施形態において、ＴＮＦ阻害剤はモノクローナル抗体である。別の実施形態において、ＴＮＦ阻害剤は、インフリキシマブまたはアダリムマブである。一実施形態において、ＴＮＦ阻害剤は、循環性受容体融合タンパク質である。別の実施形態において、ＴＮＦ阻害剤はエタネルセプトである。   Some aspects of the present invention provide a method of reducing the inflammatory response produced by tumor necrosis factor in an animal subject, the method comprising a TNF inhibitor, chitosan, and a core substrate of a PGA-complexone complex. Orally administering the nanoparticles. In one embodiment, the TNF inhibitor is a monoclonal antibody. In another embodiment, the TNF inhibitor is infliximab or adalimumab. In one embodiment, the TNF inhibitor is a circulating receptor fusion protein. In another embodiment, the TNF inhibitor is etanercept.

本発明の態様の幾つかは、生物活性ナノ粒子内の生物活性剤に関連した酵素耐性を増強させた生物活性ナノ粒子の対象への投与を提供し、ナノ粒子は、正荷電キトサンが優勢のシェル部分、少なくとも１種の酵素耐性剤および負荷電基質を含有するコア部分を含んでなり、負荷電基質は、正荷電キトサンの一部分によって少なくとも部分的に中和されている。一実施形態において、酵素耐性剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのコンプレキソンであり、これらは、ナノ粒子の製造において、キトサン基質またはＰＧＡ基質と複合化することができる。   Some of the aspects of the invention provide for administration of bioactive nanoparticles to a subject with enhanced enzyme resistance associated with bioactive agents within the bioactive nanoparticles, wherein the nanoparticles are dominated by positively charged chitosan. A core portion comprising a shell portion, at least one enzyme resistance agent and a negatively charged substrate, wherein the negatively charged substrate is at least partially neutralized by a portion of the positively charged chitosan. In one embodiment, the enzyme resistance agent is a complexone such as diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), which can be complexed with a chitosan or PGA substrate in the production of nanoparticles. it can.

本発明の態様の幾つかは、ナノ粒子の医薬組成物を提供し、ナノ粒子は、正荷電キトサンが優勢のシェル部分、１種の負荷電基質を含んでなるコア部分を含んでなり、負荷電基質は正荷電キトサンの部分と少なくとも部分的に中和しており、少なくとも１種の生物活性剤がナノ粒子内にロードされている。一実施形態において、ナノ粒子の医薬組成物は、薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、または他の不活性添加物をさらに含んでなる。   Some embodiments of the present invention provide a pharmaceutical composition of nanoparticles, the nanoparticles comprising a shell portion that is dominated by positively charged chitosan, a core portion comprising a negatively charged substrate, The electrosubstrate is at least partially neutralized with a portion of the positively charged chitosan and at least one bioactive agent is loaded into the nanoparticles. In one embodiment, the nanoparticulate pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient, or other inert additive.

一実施形態において、ナノ粒子はカプセル剤に封入され、カプセル剤は、少なくとも１種の可溶化剤、発泡剤、乳化剤、局方賦形剤または少なくとも１種の透過増強剤をさらに含んでなる。別の実施形態において、ナノ粒子は凍結乾燥され、それにより、ナノ粒子は粉末形態にある。   In one embodiment, the nanoparticles are encapsulated in a capsule, the capsule further comprising at least one solubilizer, foaming agent, emulsifier, pharmacopoeia or at least one permeation enhancer. In another embodiment, the nanoparticles are lyophilized so that the nanoparticles are in powder form.

本発明のナノ粒子は、動物対象に、酵素耐性化合物（例えば、ＰＧＡ−コンプレキソン複合体）と生物活性剤（例えば、ペプチド剤）を同時投与する有益な手段を提供し、ＰＧＡ−コンプレキソン複合体は、生物活性剤に対して大部分はナノメートルの距離以内にあるので、酵素に満たされたＧＩＴ内で酵素耐性の保護を提供する。   The nanoparticles of the present invention provide a beneficial means of co-administering an enzyme resistant compound (eg, a PGA-complexone complex) and a bioactive agent (eg, a peptide agent) to an animal subject, and the PGA-complexone complex Since the body is largely within nanometer distance to the bioactive agent, it provides protection of enzyme resistance within the GIT filled with enzymes.

本発明のさらなる目的および特徴は、添付の図面と関連させて以下の実施形態の説明を読めば、より明らかになり、開示自体も最も良く理解されるであろう。   Further objects and features of the present invention will become more apparent and the disclosure itself will be best understood when the following description of embodiments is read in conjunction with the accompanying drawings.

図１は、（ａ）調製ＣＳ−γ―ＰＧＡナノ粒子（０．１０％のγ−ＰＧＡ：０．２０％のＣＳ）のＴＥＭ顕微鏡写真を示す図であり、（ｂ）調製ＣＳ−γ―ＰＧＡナノ粒子（０．０１％のγ−ＰＧＡ：０．０１％のＣＳ）のＡＦＭ顕微鏡写真を示す図である。FIG. 1 shows a TEM micrograph of (a) prepared CS-γ-PGA nanoparticles (0.10% γ-PGA: 0.20% CS), and (b) prepared CS-γ- It is a figure which shows the AFM micrograph of a PGA nanoparticle (0.01% (gamma) -PGA: 0.01% CS). 図２は、Ｃａｃｏ−２細胞単層のＴＥＥＲ値に及ぼす調製ＣＳ−γ―ＰＧＡナノ粒子の作用を示す図である。FIG. 2 is a graph showing the effect of prepared CS-γ-PGA nanoparticles on the TEER value of Caco-2 cell monolayers. 図３は、正電荷表面を有するＦＩＴＣ標識キトサンを有するｆＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing fCS-γ-PGA nanoparticles with FITC-labeled chitosan having a positively charged surface. 図４は、糖尿病ラットにおける、経口投与されたインスリン装入ナノ粒子の時間に対する血漿中インスリン含量を示す図であり、送達時に腸溶するコーティングカプセル剤に凍結乾燥ナノ粒子が装入されている。FIG. 4 is a diagram showing the insulin content in plasma with respect to time of insulin-loaded nanoparticles administered orally in diabetic rats, in which lyophilized nanoparticles are loaded into a coated capsule that is enteric at the time of delivery. 図５は、（γ−ＰＧＡ）−ＤＴＰＡ複合体による酵素阻害試験についての実験データを示す図である。FIG. 5 is a diagram showing experimental data on an enzyme inhibition test using a (γ-PGA) -DTPA complex.

下記の本発明の好ましい実施形態は特に、キトサン／ＰＧＡ−コンプレキソン／インスリンからなるナノ粒子の調製、および上皮細胞間の密着帯を開放することにより腸または血液脳の傍細胞の透過性を増強させるそれらの透過性に関するものである。説明は種々の実施形態の具体的な詳細を記載しているが、この説明は例示のみを目的としており、当然のことながら、決して本発明を限定するものとして解釈してはならない。さらに、当業者によってなされる本発明の種々の応用、および本発明への修飾もまた下記の一般的な概念により包含されている。   The preferred embodiments of the invention described below, in particular, enhance the permeability of paracells of the intestine or blood brain by preparing nanoparticles composed of chitosan / PGA-complexone / insulin and opening the tight junctions between epithelial cells It relates to their permeability. While the description sets forth specific details for various embodiments, this description is for purposes of illustration only and is, of course, not to be construed as limiting the invention in any way. Further, various applications of the present invention made by those skilled in the art and modifications to the present invention are also encompassed by the following general concepts.

本明細書における「生物活性剤」は、投与された後、レシピエント（動物対象）に対し、身体的に、生理学的に、精神的に、生化学的に、生物学的に、または陽性もしくは陰性の様式で他の身体機能に作用し得る任意の薬剤を含むことを意味する。「生物活性剤」は、限定はしないが、薬剤、タンパク質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、酵素、補助栄養素、ビタミン類、他の活性剤を含み得る。一実施形態において、生物活性剤は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、抗生剤、酸素富化剤、酸素含有剤、抗癲癇剤、および抗炎症剤からなる群から選択される。抗癲癇剤は、Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ（ガンマ−アミノ酪酸類縁体であるガバペンチン）、Ｌａｍｉｃｔａｌ（電圧感受性のナトリウムチャネルに作用して、神経膜を安定化し、興奮性神経伝達物質の放出を阻害することが示されているラモトリジン）、Ｆｅｂａｔｏｌ（ＧＡＢＡ受容体結合部位に対して弱い阻害作用を有することが示されているフェルバメート）、Ｔｏｐａｍａｘ（電圧感受性のナトリウムチャネルをブロックするＤ−フルクトースから誘導された新規な化学構造を有し、阻害性の神経伝達物質であるＧＡＢＡ活性を増強し、興奮性の神経伝達物質であるグルタミン酸の作用をブロックするトピラメート）、および／またはＣｅｒｅｂｙｘ（非経口投与後に急速に変換されるフェニトイン前駆体であるホスフェニトイン）を含み得る。   A “bioactive agent” as used herein refers to a recipient (animal subject) physically, physiologically, mentally, biochemically, biologically, positively or positively after being administered. It is meant to include any drug that can affect other bodily functions in a negative manner. “Bioactive agents” can include, but are not limited to, drugs, proteins, peptides, siRNA, enzymes, supplements, vitamins, and other active agents. In one embodiment, the bioactive agent is from the group consisting of proteins, peptides, nucleosides, nucleotides, antiviral agents, antitumor agents, antibiotic agents, oxygen enrichers, oxygen-containing agents, antiepileptic agents, and anti-inflammatory agents. Selected. Antiepileptics have been shown to act on Neurotin (gamma-aminobutyric acid gabapentin), Lamictal (voltage sensitive sodium channels, stabilize the nerve membrane and inhibit excitatory neurotransmitter release) Lamotrigine), Febatol (ferbamate which has been shown to have a weak inhibitory effect on the GABA receptor binding site), Topamax (a novel chemical structure derived from D-fructose that blocks voltage-sensitive sodium channels) And an inhibitory neurotransmitter, GABA activity, and topiramate, which blocks the action of glutamate, an excitatory neurotransmitter, and / or Cerebyx (phenytoin that is rapidly converted after parenteral administration) Including the precursor phosphenytoin) Get.

さらに、生物活性剤は、カルシトニン、シクロスポリン、インスリン、オキシトシン、チロシン、エンケファリン、ホルモン放出性チロトロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、バソプレシンおよびバソプレシン類縁体、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキン−１１、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子阻害剤、およびメラニン細胞刺激ホルモンからなる群から選択することができる。インターロイキン１１（ＩＬ−１１）は、造血幹細胞および巨核球前駆細胞の増殖を直接刺激して巨核球の成熟を誘導し、その結果、血小板産生の増加をもたらす（Ｏｐｒｅｌｖｅｋｉｎ（登録商標））血小板新生成長因子である。好ましい一実施形態において、生物活性剤はアルツハイマーアンタゴニストまたはワクチンである。アルツハイマー病治療のための生物活性剤は、塩酸メマンチン（Ｍｅｒｚ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによるＡｘｕｒａ（登録商標））、塩酸ドネペジル（エーザイ株式会社によるＡｒｉｃｅｐｔ（登録商標））、酒石酸リバスチグミン（ＮｏｖａｒｔｉｓによるＥｘｅｌｏｎ（登録商標））、塩酸ガランタミン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ ＪｏｈｎｓｏｎによるＲｅｍｉｎｙｌ（登録商標））、または塩酸タクリン（Ｐａｒｋｅ ＤａｖｉｓによるＣｏｇｎｅｘ（登録商標））を含み得る。一実施形態において、生物活性剤は、薬学的有効量の硫酸コンドロイチン、ヒアルロン酸、成長因子およびタンパク質からなる群から選択される。   In addition, bioactive agents include calcitonin, cyclosporine, insulin, oxytocin, tyrosine, enkephalin, hormone-releasing thyrotropin, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone, vasopressin and vasopressin analogs, catalase, superoxide dismutase, interleukin-11, interferon , Colony stimulating factor, tumor necrosis factor, tumor necrosis factor inhibitor, and melanocyte stimulating hormone. Interleukin-11 (IL-11) directly stimulates proliferation of hematopoietic stem cells and megakaryocyte progenitor cells to induce megakaryocyte maturation, resulting in increased platelet production (Oprelvekin®) thrombopoiesis It is a growth factor. In one preferred embodiment, the bioactive agent is an Alzheimer antagonist or vaccine. Bioactive agents for the treatment of Alzheimer's disease include memantine hydrochloride (Axura (R) by Merz Pharmaceuticals), donepezil hydrochloride (Alicept (R) by Eisai Co., Ltd.), rivastigmine tartrate (Exelon (R) by Novartis), Galantamine hydrochloride (Reminyl® by Johnson & Johnson) or tacrine hydrochloride (Cognex® by Parke Davis) may be included. In one embodiment, the bioactive agent is selected from the group consisting of a pharmaceutically effective amount of chondroitin sulfate, hyaluronic acid, growth factor and protein.

さらなる一実施形態において、少なくとも１種の生物活性剤は、インスリンまたはインスリン類縁体である。さらに別の実施形態において、少なくとも１種の生物活性剤は、インスリン増感剤、インスリン分泌促進剤、ＧＬＰ−１類縁体、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２類縁体、ジペプチジルペプチダーゼ４の阻害剤（ＤＰＰ−４阻害剤）、エキセナチド、リラグルチド、アルビグルチド、またはタスポグルチド、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、アミリン類縁体、ナトリウム−グルコース共輸送体２型（ＳＧＬＴ２）阻害剤、ベンフルオレックスおよびトルレスタットからなる群から選択される。さらなる一実施形態において、インスリン含有ナノ粒子は、極微量の亜鉛またはカルシウムを含んでなるか、または腸溶コーティングで処理される。一実施形態において、生物活性剤は、非インスリンエキセナチド、非インスリンプラムリンチド、インスリン、インスリン類縁体、またはそれらの組み合わせである。   In a further embodiment, the at least one bioactive agent is insulin or an insulin analog. In yet another embodiment, the at least one bioactive agent is an insulin sensitizer, insulin secretagogue, GLP-1 analog, GLP-2, GLP-2 analog, dipeptidyl peptidase 4 inhibitor ( DPP-4 inhibitor), exenatide, liraglutide, arubyglutide, or taspoglutide, alpha-glucosidase inhibitor, amylin analog, sodium-glucose cotransporter type 2 (SGLT2) inhibitor, benfluorex and tolrestat Is done. In a further embodiment, the insulin-containing nanoparticles comprise trace amounts of zinc or calcium or are treated with an enteric coating. In one embodiment, the bioactive agent is non-insulin exenatide, non-insulin pramlintide, insulin, insulin analog, or combinations thereof.

本発明の生物活性剤はまた、オキシトシン、バソプレッシン、副腎皮質刺激ホルモン、プロラクチン、ルリベリンまたは黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、グルカゴン、インターフェロン、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストリン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン類、エンドルフィン類、アンジオテンシン類、レニン、ブラジキニン、バシトラシン類、ポリミキシン類、コリスチン類、チロシジン、グラミシジン類、ならびにそれらの合成類縁体、修飾体および薬理学的活性断片、モノクローナル抗体および可溶性ワクチン類からなる群からも選択できる。成長ホルモン（ＧＨ）は、ヒトならびに他の動物における成長および細胞増殖を刺激するペプチドホルモンである。それは、下垂体前葉の側翼内の成長ホルモン分泌細胞により合成され、貯蔵され、分泌される１９１のアミノ酸の単鎖ポリペプチドホルモンである。ソマトロピンとは、動物において固有に産生される成長ホルモンのことであり、用語のソマトロピンとは、組換えＤＮＡ技法によって生産される成長ホルモンのことであり、ヒトでは、「ｒｈＧＨ」と略記される。   The bioactive agents of the present invention also include oxytocin, vasopressin, adrenocorticotropic hormone, prolactin, luriberin or luteinizing hormone releasing hormone, growth hormone, growth hormone releasing factor, somatostatin, glucagon, interferon, gastrin, tetragastrin, pentagastrin, Urogastrin, secretin, calcitonin, enkephalins, endorphins, angiotensins, renin, bradykinin, bacitracin, polymyxins, colistins, tyrosidine, gramicidins, and their synthetic analogues, modified and pharmacologically active fragments, It can also be selected from the group consisting of monoclonal antibodies and soluble vaccines. Growth hormone (GH) is a peptide hormone that stimulates growth and cell proliferation in humans and other animals. It is a 191 amino acid single chain polypeptide hormone that is synthesized, stored, and secreted by growth hormone secreting cells in the lateral wing of the anterior pituitary gland. Somatropin refers to growth hormone that is produced uniquely in animals, and the term somatropin refers to growth hormone that is produced by recombinant DNA techniques and is abbreviated as “rhGH” in humans.

さらなる一実施形態において、生物活性剤は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、抗生剤、抗癲癇剤、および抗炎症剤よりなる群から選択される。さらなる一実施形態においた、生物活性剤は、カルシトニン、シクロスポリン、インスリン、オキシトシン、チロシン、エンケファリン、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、バソプレッシンならびにバソプレッシン類縁体、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキン−ＩＩ（ＩＬ−２）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびメラニン細胞刺激ホルモンからなる群から選択される。   In a further embodiment, the bioactive agent is selected from the group consisting of proteins, peptides, nucleosides, nucleotides, antiviral agents, antitumor agents, antibiotic agents, antiepileptic agents, and anti-inflammatory agents. In a further embodiment, the bioactive agent is calcitonin, cyclosporine, insulin, oxytocin, tyrosine, enkephalin, thyrotropin releasing hormone (TRH), follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), vasopressin and vasopressin analogs , Catalase, superoxide dismutase, interleukin-II (IL-2), interleukin-11 (IL-11), interferon, colony stimulating factor (CSF), tumor necrosis factor (TNF) and melanocyte stimulating hormone Selected from.

さらなる一実施形態において、生物活性剤は、アルツハイマーアンタゴニストである。一実施形態において、抗癲癇剤はＮｅｕｒｏｎｔｉｎ（ガバペンチン）、Ｌａｍｉｃｔａｌ（ラモトリジン）、Ｆｅｂａｔｏｌ（フェルバメート）、Ｔｏｐａｍａｘ（トピラメート）、Ｃｅｒｅｂｙｘ（ホスフェニトイン）、Ｄｉｌａｎｔｉｎ（フェニトイン）、Ｄｅｐａｋｅｎｅ（バルプロ酸）、Ｔｅｇｒｅｔｏｌ（カルバマゼピン）、カルバマゼピンエポキシド、Ｖｉｍｐａｔ（ラコサミド）およびフェノバルビトールを含み得る。ホスフェニトイン（Ｐａｒｋｅ−ＤａｖｉｓによるＣｅｒｅｂｙｘ；Ｐｆｉｚｅｒ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＦｒａｎｃｅによるＰｒｏｄｉｌａｎｔｉｎ）は、癲癇発作の治療のために非経口送達により病院でのみ使用される水溶性フェニトインのプロドラッグである。ホスフェニトインは、（２，５−ジオキソ−４，４−ジフェニル−イミダゾリジン−１−イル）メトキシホスホン酸という系統（ＩＵＰＡＣ）名を有する。これは、分子量３６２．２７４ｇ／モルで、化学式Ｃ１６Ｈ１５Ｎ２Ｏ６Ｐを有する。 In a further embodiment, the bioactive agent is an Alzheimer antagonist. In one embodiment, the antidepressant is Neurontin (gabapentin), Lamictal (lamotrigine), Febatol (felbamate), Topamax (topiramate), Cerebyx (phosphenytoin), Dilantin (phenytoin), Depakene (valprote), carbproteol, Tegal , Carbamazepine epoxide, Vimpat (lacosamide) and phenobarbitol. Phosphenytoin (Cerebyx by Parke-Davis; Prodilantin by Pfizer Holding France) is a water-soluble phenytoin prodrug used only in hospitals by parenteral delivery for the treatment of epileptic seizures. Phosphenytoin has the lineage (IUPAC) name (2,5-dioxo-4,4-diphenyl-imidazolidin-1-yl) methoxyphosphonic acid. It has a molecular weight of 362.274 g / mol and has the chemical formula C 16 H 15 N 2 O 6 P.

実施例１
ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子の材料および調製
比較的低分子量（約８０ｋＤａ以下）のキトサンは、ｐＨ６．０で水溶液に容易に溶解し得るが、脱重合前のものは、約４．０のｐＨ値で酢酸溶液に溶解させる必要がある。一例として、低分子量のＣＳ溶液（粘度１．２９±０．０２ｃｐ）中に、０．１０％のγ―ＰＧＡを加えると、０．３（ｎ＝５）の多分散指数を有する平均粒径が２１８．１±４．１ｎｍのナノ粒子が形成された。 Example 1
Materials and Preparation of CS-γ-PGA Nanoparticles Chitosan with a relatively low molecular weight (less than about 80 kDa) can be easily dissolved in an aqueous solution at pH 6.0, but before depolymerization it has a pH of about 4.0. The value should be dissolved in the acetic acid solution. As an example, when 0.10% γ-PGA is added to a low molecular weight CS solution (viscosity 1.29 ± 0.02 cp), the average particle size has a polydispersity index of 0.3 (n = 5) Of 218.1 ± 4.1 nm were formed.

室温で磁気攪拌下、種々の濃度（０．０１重容量％、０．０５重容量％、０．１０重容量％、０．１５重容量％、または０．２０重容量％）における低分子量のＣＳ水溶液（ｐＨ６．０、１０ｍｌ）に、ピペット（０．５〜５ｍｌ、ＰＬＡＳＴＩＢＲＡＮＤ（登録商標）、ＢｒａｎｄＴｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、γ―ＰＧＡ水溶液（ｐＨ７．４、２ｍｌ）を加えると、ナノ粒子が得られた。ナノ粒子を、３８，０００ｒｐｍで１時間、超遠心分離により採集した。上澄液を棄て、さらなる試験用に、脱イオン水中にナノ粒子を再懸濁させた。本明細書に記載された単純で緩和なイオン性ゲル化法により得られたナノ粒子は、約５０ｎｍ〜４００ｎｍの間の粒径、正電荷表面および狭い多分散指数を有する球状の形状で、典型的な特徴を示す。本明細書に開示したナノ粒子形成におけるγ―ＰＧＡは、ＰＧＡコンプレキソンに置き換えることができる。   Low molecular weight at various concentrations (0.01%, 0.05%, 0.10%, 0.15%, or 0.20%) by magnetic stirring at room temperature When an aqueous γ-PGA solution (pH 7.4, 2 ml) is added to an aqueous CS solution (pH 6.0, 10 ml) using a pipette (0.5-5 ml, PLASTIBRAND (registered trademark), BrandTech Scientific Inc., Germany) Nanoparticles were obtained. Nanoparticles were collected by ultracentrifugation at 38,000 rpm for 1 hour. The supernatant was discarded and the nanoparticles were resuspended in deionized water for further testing. Nanoparticles obtained by the simple and relaxed ionic gelation method described herein are typically spherical in shape with a particle size between about 50 nm and 400 nm, a positively charged surface and a narrow polydispersity index. Characteristic features. Γ-PGA in the nanoparticle formation disclosed herein can be replaced by PGA complexone.

種々の濃度のγ―ＰＧＡとＣＳで調製されたＣＳ−γ―ＰＧＡナノ粒子の粒径およびゼータ電位値を測定した。それらの結果は、表１ａおよび１ｂに示してある。調製されたナノ粒子の粒径およびゼータ電位値は、シンク溶液中のＣＳの周囲濃度に対する添加溶液中γ―ＰＧＡの局所濃度の相対量によって主に決定されることが分かった。固定濃度のＣＳでのγ―ＰＧＡ濃度の増加は、γ―ＰＧＡ分子がより多くのＣＳ分子と相互作用することを可能にし、したがって、より大型のサイズのナノ粒子が形成された（表１ａ、ｐ＜０．０５）。ＣＳ分子の量が局所γ―ＰＧＡ分子の量を超えた場合は、幾らか過剰のＣＳ分子が、ＣＳ−γ―ＰＧＡナノ粒子の表面に絡み合った。   The particle size and zeta potential of CS-γ-PGA nanoparticles prepared with various concentrations of γ-PGA and CS were measured. The results are shown in Tables 1a and 1b. It was found that the particle size and zeta potential value of the prepared nanoparticles were mainly determined by the relative amount of local concentration of γ-PGA in the additive solution relative to the ambient concentration of CS in the sink solution. Increasing the γ-PGA concentration at a fixed concentration of CS allowed the γ-PGA molecule to interact with more CS molecules, thus forming larger size nanoparticles (Table 1a, p <0.05). When the amount of CS molecules exceeded the amount of local γ-PGA molecules, some excess CS molecules entangled with the surface of the CS-γ-PGA nanoparticles.

したがって、得られたナノ粒子は、コロイド安定化を確実にする正荷電ＣＳシェルに囲まれた中性多電解質−複合体コア（表１ｂ）を表示し得る。対照的に、局所γ―ＰＧＡ分子の量は、周囲のＣＳ分子の量を十分越えていたので、形成したナノ粒子は、表面上に露出したγ―ＰＧＡを有し、したがって負電荷のゼータ電位を有した。それ故、調製したＣＳ−γ―ＰＧＡナノ粒子の粒径およびゼータ電位値は、それらの成分組成によって制御することができる。ＴＥＭとＡＦＭの試験によって得られた結果は、調製したナノ粒子の形態が滑らかな表面を有する球状の形状であることを示した（図１ａおよび１ｂ）。ナノ粒子の形態は、２．５と６．６の間のいずれのｐＨにおいても、滑らかな表面を有する球状の形状である。一実施形態において、２．５付近の低ｐＨにおける本発明のナノ粒子の安定性により、ナノ粒子が胃内の酸性媒体に晒された際にナノ粒子が非損傷であることが可能になる。   Thus, the resulting nanoparticles can display a neutral polyelectrolyte-composite core (Table 1b) surrounded by a positively charged CS shell that ensures colloidal stabilization. In contrast, since the amount of local γ-PGA molecules was well above the amount of surrounding CS molecules, the formed nanoparticles had γ-PGA exposed on the surface, and thus a negatively charged zeta potential. Had. Therefore, the particle size and zeta potential value of the prepared CS-γ-PGA nanoparticles can be controlled by their component composition. The results obtained by TEM and AFM tests showed that the prepared nanoparticles had a spherical shape with a smooth surface (FIGS. 1a and 1b). The nanoparticle morphology is a spherical shape with a smooth surface at any pH between 2.5 and 6.6. In one embodiment, the stability of the inventive nanoparticles at a low pH around 2.5 allows the nanoparticles to be undamaged when exposed to acidic media in the stomach.

さらなる一試験において、室温、磁気攪拌下で、水性γ―ＰＧＡを、６：１のＴＭＣ／γ―ＰＧＡ重量比で水性ＴＭＣ（Ｎ−トリメチルキトサン）へ添加すると、ＮＰは直ちに自己集合化した。キトサンとＮ−トリメチルキトサンの化学式を以下に示す。

Figure 2013525351
In a further test, NP immediately self-assembled when aqueous γ-PGA was added to aqueous TMC (N-trimethylchitosan) at a 6: 1 TMC / γ-PGA weight ratio under magnetic stirring at room temperature. The chemical formulas of chitosan and N-trimethylchitosan are shown below.
Figure 2013525351

正荷電ＴＭＣの量は、負荷電γ―ＰＧＡの量を有意に越えており；過剰なＴＭＣ分子の幾らかはＮＰの表面上に絡まり合い、したがって、正電荷表面を示した（表２）。ＴＭＣ上の四級化度は、ＮＰの平均粒径およびゼータ電位に対して、ほとんど作用を及ぼさなかった。

Figure 2013525351
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Figure 2013525351
The amount of positively charged TMC was significantly above the amount of negatively charged γ-PGA; some of the excess TMC molecules were entangled on the surface of the NP, thus indicating a positively charged surface (Table 2). The degree of quaternization on TMC had little effect on the average particle size and zeta potential of NP.
Figure 2013525351
Figure 2013525351
Figure 2013525351

実施例２
Ｃａｃｏ−２細胞培養およびＴＥＥＲ測定
Ｃｏｓｔａｒ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ６ウェル／プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏａｔａｒ Ｃｏｒｐ．，ＮＹ）における組織培養処理ポリカーボネートフィルター（直径２４．５ｍｍ、増殖域４．７ｃｍ２）上に、Ｃａｃｏ−２細胞を、３×１０５細胞／挿入体の接種密度で接種した。培養培地として、２０％のＦＢＳ、１％のＮＥＡＡ、および４０μｇ／ｍｌの抗生−ゲンタマイシンを添加したＭＥＭ（ｐＨ７．４）を用いて、ドナー区画と受容体区画の双方に添加した。培地は、最初の６日間は４８時間ごとに、それ以後は２４時間ごとに交換した。９５％の大気と５％のＣＯ２中、３７℃で培養を維持し、接種１８〜２１日後に（６００〜８００Ωｃｍ２の範囲のＴＥＥＲ値）傍細胞輸送実験に用いた。 Example 2
Caco-2 cell culture and TEER measurement Caco-2 cells were placed on a tissue culture treated polycarbonate filter (Corning Coater Corp., NY) in a Costar Transwell 6 well / plate (diameter 24.5 mm, growth area 4.7 cm 2 ). Inoculated at an inoculation density of 3 × 10 5 cells / insert. As culture medium, MEM (pH 7.4) supplemented with 20% FBS, 1% NEAA, and 40 μg / ml antibiotic-gentamicin was added to both the donor and recipient compartments. The medium was changed every 48 hours for the first 6 days and every 24 hours thereafter. Cultures were maintained at 37 ° C. in 95% air and 5% CO 2 and used for paracellular transport experiments 18-21 days after inoculation (TEER values in the range of 600-800 Ωcm 2 ).

細胞間密着帯は、高分子の傍細胞輸送にとって主要なバリアの一つである。経上皮イオン輸送は、細胞間接合部の密着性の良好な指標であると考えられ、したがって試験では、Ｃａｃｏ−２細胞単層のＴＥＥＲを測定することにより評価した。ＴＥＥＲの測定は、親水性分子の傍細胞輸送を予測するために使用できることが報告されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００４年；２２５−２３５頁）。密着帯が開放すると、傍細胞経路を水とイオンが通過することにより、ＴＥＥＲ値は低下する。Ｃａｃｏ−２細胞単層は、高分子の腸の傍細胞透過性を評価するためのインビトロモデルとして広く用いられている。   The intercellular adhesion zone is one of the major barriers to the paracellular transport of macromolecules. Transepithelial ion transport is considered to be a good indicator of cell-cell junction adhesion and was therefore evaluated in the test by measuring the TEER of Caco-2 cell monolayers. It has been reported that TEER measurements can be used to predict the paracellular transport of hydrophilic molecules (Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004; 225-235). When the adhesion band is released, the TEER value decreases due to water and ions passing through the paracellular pathway. Caco-2 cell monolayers are widely used as an in vitro model to assess macromolecular intestinal paracellular permeability.

Ｃａｃｏ−２細胞単層のＴＥＥＲ値に及ぼす調製ＣＳ−γ―ＰＧＡナノ粒子の効果は図２に示してある。示されているように、正電荷表面を有する調製ナノ粒子（表面はＣＳ優勢、０．０１％のγ―ＰＧＡ：０．０５％のＣＳ、０．１０％のγ―ＰＧＡ：０．２％のＣＳ、および０．２０％のγ―ＰＧＡ：０．２０％のＣＳ）は、Ｃａｃｏ−２細胞単層のＴＥＥＲ値を有意に低下させることができた（ｐ＜０．０５）。これらのナノ粒子によるインキュベーション２時間後、Ｃａｃｏ−２細胞単層のＴＥＥＲ値は、対照群（輸送媒体中にナノ粒子の添加なし）と比較して、初期値の約５０％に低下した。これにより、表面上にＣＳ優勢のナノ粒子がＣａｃｏ−２細胞間の密着帯を開放するか、または緩め、その結果、ＴＥＥＲ値の低下をもたらすことが示された。ＣＳの正荷電アミノ基と細胞表面上の負電荷部位および密着帯との相互作用が、傍細胞の透過性増大に伴うＦ−アクチンおよび密着帯のタンパク質ＺＯ−１の再分布を誘導することが報告されている。キトサンと密着帯タンパク質ＺＯ−１との相互作用により、細胞骨格へのその移行に至ることが示唆されている。   The effect of prepared CS-γ-PGA nanoparticles on the TEER value of Caco-2 cell monolayers is shown in FIG. As shown, prepared nanoparticles with a positively charged surface (surface is CS dominant, 0.01% γ-PGA: 0.05% CS, 0.10% γ-PGA: 0.2% CS, and 0.20% γ-PGA: 0.20% CS) were able to significantly reduce the TEER value of Caco-2 cell monolayers (p <0.05). After 2 hours of incubation with these nanoparticles, the TEER value of the Caco-2 cell monolayer decreased to about 50% of the initial value compared to the control group (no addition of nanoparticles in the transport medium). This indicated that CS-dominated nanoparticles on the surface open or loosen the adhesion band between Caco-2 cells, resulting in a decrease in TEER values. The interaction between the positively charged amino group of CS and the negatively charged sites on the cell surface and the adhesion band may induce redistribution of F-actin and the protein ZO-1 in the adhesion band with increased paracellular permeability. It has been reported. It has been suggested that the interaction between chitosan and the tight junction protein ZO-1 leads to its transition to the cytoskeleton.

インキュベートしたナノ粒子の除去後、ＴＥＥＲ値が徐々に増加したことが認められた。この現象は、Ｃａｃｏ−２細胞単層の細胞間密着帯が徐々に回復し始めたことを示した；しかし、ＴＥＥＲ値は初期値までは回復しなかった（図２）。培養細胞を損傷せずにＣＳから誘導されたポリマーを完全除去することは、ＣＳの高い接着特性により困難であることが報告されている（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９７年；１４：１１９７−１２０２頁）。ＴＥＥＲ値が当初値まで回復しないことの理由は、これであると考えられる。対照的に、負電荷表面を有するナノ粒子（表面はγ―ＰＧＡ優勢、０．１０％のγ―ＰＧＡ：０．０１％のＣＳおよび０．２０％のγ―ＰＧＡ：０．０１％のＣＳ、図２）によりインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞単層のＴＥＥＲ値は、対照群に比較して有意差を示さなかった（ｐ＞０．０５）。これは、γ―ＰＧＡが細胞間密着帯の開放に対して何の効果も及ぼさないことを示した。   It was observed that TEER values gradually increased after removal of the incubated nanoparticles. This phenomenon indicated that the intercellular adhesion zone of the Caco-2 cell monolayer began to gradually recover; however, the TEER value did not recover to the initial value (FIG. 2). It has been reported that complete removal of polymers derived from CS without damaging cultured cells is difficult due to the high adhesive properties of CS (Pharm. Res. 1997; 14: 1197-1202). . This is the reason why the TEER value does not recover to the initial value. In contrast, nanoparticles with negatively charged surfaces (surface is γ-PGA dominant, 0.10% γ-PGA: 0.01% CS and 0.20% γ-PGA: 0.01% CS 2), the TEER value of the Caco-2 cell monolayer incubated according to FIG. 2) showed no significant difference compared to the control group (p> 0.05). This indicated that γ-PGA had no effect on the release of the intercellular adhesion zone.

密着帯における正荷電ＣＳと細胞表面上のＺＯ−１タンパク質の負荷電部位との静電気的相互作用が、細胞のＦ−アクチンの再分布ならびに細胞骨格へのＺＯ−１の移行を誘導し、その結果、透過性の増大がもたらされることが示唆された。経口投与されたナノ粒子は、十二指腸の粘膜層への接着および浸透の後、腸液内の異なる消化酵素の存在により分解され得る。また、ナノ粒子が粘膜層内に浸透し、腸の上皮細胞に接近している間、ｐＨ環境は中性になり得る。ｐＨ環境に晒されて変化することにより、さらにナノ粒子の崩壊へと至る。次いで、分解／崩壊したナノ粒子からの解離ＣＳが相互作用して、上皮細胞間のＺＯ−１タンパク質の機能を調節することができた。ＺＯ−１タンパク質は、オクルジンとＦ−アクチン細胞骨格との間の結合分子であると共に、密着帯における細胞−細胞接触の再配置において重要な役割を演じていると考えられた。   The electrostatic interaction between the positively charged CS in the adhesion zone and the negatively charged site of the ZO-1 protein on the cell surface induces the redistribution of F-actin in the cell and the transfer of ZO-1 to the cytoskeleton. The results suggested an increase in permeability. Orally administered nanoparticles can be degraded by the presence of different digestive enzymes in the intestinal fluid after adhesion and penetration into the mucosal layer of the duodenum. Also, the pH environment can become neutral while the nanoparticles penetrate into the mucosal layer and approach the intestinal epithelial cells. By changing the exposure to the pH environment, the nanoparticles further collapse. The dissociated CS from the degraded / collapsed nanoparticles could then interact to regulate the function of the ZO-1 protein between epithelial cells. The ZO-1 protein is a binding molecule between occludin and the F-actin cytoskeleton and was thought to play an important role in the relocation of cell-cell contacts in the tight junctions.

２種のインスリン濃度を有するナノ粒子は、キトサン対γ―ＰＧＡの比率が０．７５ｍｇ／ｍｌ対０．１６７ｍｇ／ｍｌで調製する。それらの粒径を下表３に示してある。

Figure 2013525351
Nanoparticles with two insulin concentrations are prepared with a chitosan to γ-PGA ratio of 0.75 mg / ml to 0.167 mg / ml. Their particle sizes are shown in Table 3 below.
Figure 2013525351

ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子に関するＡＰＩ装入効率（ＬＥ４０〜５５％）およびＡＰＩ装入含量（ＬＣ５．０〜１４．０％）は、γ−ＰＧＡ溶液と混合されたモデルＡＰＩ（この場合、インスリン）をＣＳ溶液へ添加した際にイオン性ゲル化法を用い、引き続きナノ粒子分離のために磁気攪拌することにより得られた。本発明の態様の幾つかは、ナノ粒子のコア基質としての負荷電グルコサミノグリカン類（ＧＡＧ）に関する。ＧＡＧはまた、薬物担持ナノ粒子を形成するために、低分子量キトサンと複合化させることができる。ＧＡＧｓはまた、ナノ粒子内のコア基質の結合効率を増強させるために、本明細書に開示されたタンパク質剤と複合化させることができる。特に、本発明のナノ粒子の負荷電コア基質（ＧＡＧｓ、ヘパリン、ＰＧＡ、アルギネートなど）は、硫酸コンドロイチン、ヒアルロン酸、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＢＳＡ、ＥＧＦ、ＭＫ、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＭＫ、ＰＴＮなどと複合化させることができる。   The API loading efficiency (LE 40-55%) and API loading content (LC 5.0-14.0%) for CS-γ-PGA nanoparticles was determined by the model API (in this case insulin) mixed with the γ-PGA solution. ) Was added to the CS solution using an ionic gelation method followed by magnetic stirring for nanoparticle separation. Some of the aspects of the invention relate to negatively charged glucosaminoglycans (GAGs) as the core substrate for the nanoparticles. GAG can also be complexed with low molecular weight chitosan to form drug-loaded nanoparticles. GAGs can also be complexed with the protein agents disclosed herein to enhance the binding efficiency of the core substrate within the nanoparticles. In particular, the negatively charged core substrates (GAGs, heparin, PGA, alginate, etc.) of the nanoparticles of the present invention are chondroitin sulfate, hyaluronic acid, PDGF-BB, BSA, EGF, MK, VEGF, KGF, bFGF, aFGF, MK, It can be combined with PTN or the like.

別の実施形態において、カプセル剤は、溶解剤、発泡剤、乳化剤、またはＧｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）など、他の局方賦形剤を含有することができる。ＧＲＡＳは、食品に添加される化学物質または物質が、専門家により安全と考えられ、したがって、通常の連邦食品医薬品化粧品法（ＦＦＤＣＡ）の食品添加物の許容要件から免除されている米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の指定物である。発泡剤は、カプセル剤を破裂させる目的で、またはカプセル剤内容物とカプセル剤外部の周囲物質との密な接触を促進させる目的で液体を接触させる際に炭酸ガスを放出する試剤である。例えば、重炭酸ナトリウムと酸との反応により塩と炭酸が得られ、炭酸は容易に炭酸ガスと水に分解する。発泡剤としては、重炭酸ナトリウム／クエン酸混合物、Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌなどを挙げることができる。化学物質Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌは、酢酸、２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキサナルナトリウムのＩＵＰＡＣ名を有し、Ｃ８Ｈ１６ＮａＯ８の化学式を有する。乳化剤は、動力学的安定性を増加させることにより乳濁液を安定化させる物質である。乳化剤の一クラスは、界面活性物質、または界面活性剤として知られている。洗浄剤は、別のクラスの界面活性乳化剤であり、油と水の双方と物理的に相互作用することによって、懸濁液中の油滴または水滴間の界面を安定化させる。最も一般的な乳濁液は、低毒性を有する理由から非イオン性である。本明細書ではカチオン性乳濁液もまた、抗菌性を有することから使用することができる。 In another embodiment, the capsules can contain other pharmacological excipients such as solubilizers, blowing agents, emulsifiers, or General Recognized as Safe (GRAS). GRAS is a United States Food and Drug Administration where chemicals or substances added to food are considered safe by professionals and are therefore exempted from the acceptable requirements for food additives under the normal Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (FFDCA) (FDA) designation. The foaming agent is an agent that releases carbon dioxide gas when the liquid is brought into contact with the purpose of rupturing the capsule or for promoting intimate contact between the capsule contents and the surrounding substance outside the capsule. For example, a reaction between sodium bicarbonate and an acid provides a salt and carbonic acid, which is easily decomposed into carbon dioxide gas and water. Examples of the foaming agent include sodium bicarbonate / citric acid mixture, Ac-Di-Sol and the like. Chemicals Ac-Di-Sol has acetic acid, 2,3,4,5,6-IUPAC name penta hydroxyhexanoate null sodium, having the formula of C 8 H 16 NaO 8. An emulsifier is a substance that stabilizes an emulsion by increasing kinetic stability. One class of emulsifiers is known as surfactants or surfactants. Detergents are another class of surfactant emulsifiers that stabilize the interface between oil droplets or water droplets in suspension by physically interacting with both oil and water. The most common emulsions are nonionic for reasons of low toxicity. Cationic emulsions can also be used herein because of their antibacterial properties.

したがって、便利かつ有効な経口投与のために、薬学的有効量の本発明のナノ粒子を、１種または複数種の賦形剤と共に錠剤化するか、ゲルカプセル剤などのカプセル剤中に入れるか、または液体溶液中などに懸濁させることができる。ナノ粒子は、非経口投与（例えば、鼻腔内スプレー、皮下注射、または静脈内注射）のために、脱イオン溶液または同様の溶液中に懸濁させることができる。ナノ粒子を摂取用に、従来の技法により充填錬剤またはチュアブル錬剤へと形成することができる。例えば、既知の封入操作および封入材料を用いて「硬質充填カプセル剤」または「軟弾性カプセル剤」として、ナノ粒子を封入することができる。カプセル剤の摂取後に、粒子が胃内で迅速に分散するように、封入材料は、胃液に高溶解性の必要がある。カプセル剤にせよ錠剤にせよ、各単位用量は、薬学的有効量のナノ粒子を提供する好適なサイズと含量のナノ粒子を含有することが好ましい。カプセル剤の適用可能な形状とサイズとして、０．７５ｍｍから８０ｍｍまたはそれ以上のサイズを有する丸形、卵円形、長円形、管形または座剤形状が挙げられる。カプセル剤の容量は、０．０５ｃｃから５ｃｃ超であり得る。一実施形態において、カプセル剤内部は、疎水性または親油性になるように処理される。   Thus, for convenient and effective oral administration, is a pharmaceutically effective amount of the nanoparticles of the invention tableted with one or more excipients or placed in a capsule such as a gel capsule? Or suspended in a liquid solution or the like. The nanoparticles can be suspended in a deionized solution or similar solution for parenteral administration (eg, intranasal spray, subcutaneous injection, or intravenous injection). Nanoparticles can be formed into ingestible or chewable smelting agents for consumption by conventional techniques. For example, the nanoparticles can be encapsulated as “hard-filled capsules” or “soft-elastic capsules” using known encapsulation procedures and encapsulating materials. The encapsulating material needs to be highly soluble in gastric juice so that the particles are rapidly dispersed in the stomach after ingestion of the capsule. Whether in capsules or tablets, each unit dose preferably contains nanoparticles of a suitable size and content that provides a pharmaceutically effective amount of nanoparticles. Applicable shapes and sizes of capsules include round, oval, oval, tubular or suppository shapes having a size of 0.75 mm to 80 mm or more. Capsule capacity can be from 0.05 cc to more than 5 cc. In one embodiment, the capsule interior is treated to be hydrophobic or lipophilic.

別の実施形態において、本発明のナノ粒子は、血液脳関門および／または胃腸管バリヤを通って生物活性剤の吸収を増加させる。さらに別の実施形態において、生物活性剤とナノ粒子が経口投与されると、正荷電表面を示す外層においてキトサン優勢なナノ粒子は、投与された生物活性剤の薬剤（生物活性剤）の透過を増強する増強剤として寄与する。   In another embodiment, the nanoparticles of the present invention increase the absorption of bioactive agents through the blood brain barrier and / or gastrointestinal barrier. In yet another embodiment, when the bioactive agent and nanoparticles are administered orally, the chitosan-dominated nanoparticles in the outer layer exhibiting a positively charged surface will allow permeation of the administered bioactive agent (bioactive agent). Contributes as a potentiating enhancer.

実施例３
上皮透過性と増強剤
キトサンとその誘導体は、上皮吸収増強剤として機能することができる。酸性ｐＨでプロトン化された場合のキトサンは、粘膜上皮を通ってペプチド剤の透過性を増大させることができる。本発明の態様の幾つかは、本発明のナノ粒子と少なくとも１種の透過増強剤（非ナノ粒子形態またはナノ粒子形態で）の同時投与を提供する。一実施形態において、ナノ粒子は任意選択的に他の成分と添加して、少なくとも１種の透過増強剤と少なくとも１種の生物活性剤との同時カプセル化により製剤化することができる。一実施形態において、ナノ粒子は、透過増強剤をさらに含んでなる。透過増強剤は、キレート化剤（例えば、Ｃａ２＋キレート化剤）、胆汁酸塩類、アニオン性界面活性剤、中鎖脂肪酸類、リン酸エステル類、およびキトサンまたはキトサン誘導体からなる群から選択することができる。 Example 3
Epithelial permeability and enhancer Chitosan and its derivatives can function as an epithelial absorption enhancer. Chitosan when protonated at acidic pH can increase the permeability of the peptide agent through the mucosal epithelium. Some of the aspects of the present invention provide for the co-administration of the nanoparticles of the present invention and at least one permeation enhancer (in non-nanoparticulate or nanoparticulate form). In one embodiment, the nanoparticles can be formulated by simultaneous encapsulation of at least one permeation enhancer and at least one bioactive agent, optionally added with other ingredients. In one embodiment, the nanoparticles further comprise a permeation enhancer. The permeation enhancer is selected from the group consisting of chelating agents (eg, Ca 2+ chelating agents), bile salts, anionic surfactants, medium chain fatty acids, phosphate esters, and chitosan or chitosan derivatives. Can do.

幾つかの実施形態において、本発明のナノ粒子、または少なくとも１種の増強剤を有するナノ粒子を、軟質ゲル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錬剤、もしくはカプセル剤に装入するか、または軟質ゲル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錬剤、もしくはカプセル剤の腸溶コーティング対応物に装入する。増強剤とナノ粒子は、ほぼ同時に密着帯に到達して、密着帯の一時的な開放を増強するであろう。別の実施形態において、少なくとも１種の透過増強剤は、本発明のナノ粒子内に同時封入される。したがって、幾らかの破壊したナノ粒子または断片は増強剤を放出して、ナノ粒子が上皮層の密着帯を開放するのを助けるであろう。代替実施形態において、少なくとも１種の増強剤は、正荷電表面を有する第二のナノ粒子、特にキトサンタイプのナノ粒子内に封入され、第二のナノ粒子は、生物活性剤なしに、または第一のナノ粒子中の生物活性剤とは異なる生物活性剤と共に製剤化される。本発明の薬剤含有第一のナノ粒子が、上記に特定された第二のナノ粒子と共に経口的に同時投与される場合、第二のナノ粒子内の増強剤は、胃腸管内に放出されて、薬剤含有第一のナノ粒子が密着帯を開放して通過するのを助けるか、または増強された薬剤の吸収および輸送を促進する。   In some embodiments, the nanoparticles of the present invention, or nanoparticles having at least one enhancer, are loaded into a soft gel, pill, tablet, chewable or capsule, or soft Insert into enteric coated counterparts of gels, pills, tablets, chewable smelts, or capsules. The enhancer and the nanoparticles will reach the cohesive band almost simultaneously and enhance the temporary release of the cohesive band. In another embodiment, at least one permeation enhancer is co-encapsulated within the nanoparticles of the present invention. Thus, some disrupted nanoparticles or fragments will release the enhancer and help the nanoparticles release the adhesion zone of the epithelial layer. In an alternative embodiment, the at least one enhancer is encapsulated within a second nanoparticle having a positively charged surface, in particular a chitosan-type nanoparticle, the second nanoparticle without the bioactive agent or first Formulated with a bioactive agent different from the bioactive agent in one nanoparticle. When the first drug-containing nanoparticle of the present invention is orally co-administered with the second nanoparticle identified above, the enhancer in the second nanoparticle is released into the gastrointestinal tract, Helps the drug-containing first nanoparticles pass through the adhesive zone or promotes enhanced drug absorption and transport.

キトサンを、ＥＤＴＡ、メチル、Ｎ−トリメチル、アルキル（例えば、エチル、プロピル、ブチル、イソブチルなど）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはヘパリン（低分子量ヘパリン、通常分子量ヘパリン、および遺伝子改変ヘパリンを含む）とのグラフティングなど、キトサンの荷電特性を改変するためにキトサン構造を修飾することにより、ＣＳ−γＰＧＡ粒子の表面荷電密度（ゼータ電位）を、よりｐＨ耐性に、またはより親水性にすることができる。一実施形態において、キトサンは、ポリアクリル酸とグラフトされる。一実施形態において、使用されるキトサンは、Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）、低分子量キトサン、ＥＤＴＡ−キトサン、キトサン誘導体、および／またはそれらの組み合わせである。ＥＤＴＡ−キトサンに関する代表的な化学構造を、以下に示す：

Figure 2013525351
Chitosan with EDTA, methyl, N-trimethyl, alkyl (eg, ethyl, propyl, butyl, isobutyl, etc.), polyethylene glycol (PEG), or heparin (including low molecular weight heparin, normal molecular weight heparin, and genetically modified heparin) The surface charge density (zeta potential) of CS-γPGA particles can be made more pH tolerant or more hydrophilic by modifying the chitosan structure to alter the charge properties of chitosan, such as grafting . In one embodiment, chitosan is grafted with polyacrylic acid. In one embodiment, the chitosan used is N-trimethyl chitosan (TMC), low molecular weight chitosan, EDTA-chitosan, chitosan derivatives, and / or combinations thereof. A representative chemical structure for EDTA-chitosan is shown below:
Figure 2013525351

例を示すと、ＣＳ／ＰＧＡ−コンプレキソンナノ粒子の製剤化において、２．５以下のｐＨで、好ましくは１．０もの低いｐＨでのその球形の生体安定性を維持するために、塩化トリメチルキトサンを使用することができる。本発明の態様の幾つかは、２．５以下のｐＨで、好ましくは１．０もの低いｐＨ内での生体安定性を増強させるために生体適合性薬物担体として、ゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）または他の架橋剤によって架橋された薬物装入キトサン含有生体材料を提供する。   By way of example, in the formulation of CS / PGA-complexone nanoparticles, in order to maintain its spherical biostability at a pH below 2.5, preferably as low as 1.0, trimethyl chloride Chitosan can be used. Some of the embodiments of the present invention include genipin or other as biocompatible drug carriers to enhance biostability at a pH of 2.5 or less, preferably within a pH as low as 1.0. Provided is a drug-loaded chitosan-containing biomaterial crosslinked by a crosslinking agent.

ＣＳ（アミン基）とγ−ＰＧＡ（カルボン酸基）のｐＫａ値は、それぞれ６．５と２．９であることが知られている。ＮＰは、脱イオン水（ｐＨ６．０）中で調製した。ｐＨ６．０でＣＳ（ＴＭＣ２５）およびγ−ＰＧＡをイオン化した。イオン化したＣＳ（ＴＭＣ２５）およびγ−ＰＧＡは、高分子電解質複合体を形成でき、その結果、球形のマトリックス構造が生じた。ｐＨ１．２〜２．０で、γ−ＰＧＡ上のカルボン酸基の殆どが、−ＣＯＯＨの形態であった。そのため、ＣＳ（ＴＭＣ２５）とγ−ＰＧＡとの間の静電気的相互作用は殆どなく：したがってＮＰは崩壊してしまった（表４）。同様に、６．６超のｐＨ値でＣＳ（ＴＭＣ２５）上の遊離アミン基は、脱プロトン化され；したがってＮＰの崩壊に至った。このことは、小腸内での薬剤送達と吸収の効力を制限する可能性がある。   The pKa values of CS (amine group) and γ-PGA (carboxylic acid group) are known to be 6.5 and 2.9, respectively. NP was prepared in deionized water (pH 6.0). CS (TMC25) and γ-PGA were ionized at pH 6.0. Ionized CS (TMC25) and γ-PGA were able to form a polyelectrolyte complex, resulting in a spherical matrix structure. At pH 1.2-2.0, most of the carboxylic acid groups on γ-PGA were in the form of —COOH. Therefore, there was little electrostatic interaction between CS (TMC25) and γ-PGA: therefore NP had collapsed (Table 4). Similarly, free amine groups on CS (TMC25) at pH values above 6.6 were deprotonated; thus leading to NP decay. This can limit the efficacy of drug delivery and absorption in the small intestine.

ＴＭＣ（ＴＭＣ４０およびＴＭＣ５５）上の四級化度を増加させると、６．６〜７．４のｐＨ範囲でＮＰの安定性は有意に増加した。しかしながら、ｐＨ７．４でのＴＭＣ５５／γ−ＰＧＡＮＰの膨潤は最小（高四級化ＴＭＣ５５のため）であった。このことは、装入薬物の放出を制限する可能性がある。対照的に、ｐＨ値を増加させるにつれて、ＴＭＣ４０／γ−ＰＧＡ・ＮＰは有意に膨潤した。ＴＭＣ４０／γ−ＰＧＡ ＮＰ（崩壊ＮＰまたは断片）は、ｐＨ７．４において１７．３ｍＶのゼータ電位値を有し、依然として正電荷表面を保持した。   Increasing the degree of quaternization on TMC (TMC40 and TMC55) significantly increased the stability of NP in the pH range of 6.6-7.4. However, the swelling of TMC55 / γ-PGANP at pH 7.4 was minimal (due to highly quaternized TMC55). This can limit the release of the charged drug. In contrast, TMC40 / γ-PGA · NP swelled significantly as the pH value was increased. TMC40 / γ-PGA NP (decay NP or fragment) had a zeta potential value of 17.3 mV at pH 7.4 and still retained a positively charged surface.

したがって、ＴＭＣ４０／γ−ＰＧＡ／薬剤ＮＰは、ＣＳ／γ−ＰＧＡ／薬剤ＮＰと比較して、より幅広いｐＨ範囲で優れた安定性を有する。一実施形態において、約７．４の体液ｐＨ付近では、本発明の生物活性ナノ粒子は、キトサン−シェルの断片またはキトサン含有断片の形態になり得る。本発明の生物活性ナノ粒子からのキトサン−シェルの断片、またはキトサン含有断片の表面の少なくとも一部は、陽ゼータ電位特性を示す。   Therefore, TMC40 / γ-PGA / drug NP has superior stability over a wider pH range than CS / γ-PGA / drug NP. In one embodiment, near a body fluid pH of about 7.4, the bioactive nanoparticles of the present invention can be in the form of chitosan-shell fragments or chitosan-containing fragments. At least a portion of the surface of the chitosan-shell fragment or chitosan-containing fragment from the bioactive nanoparticles of the present invention exhibits a positive zeta potential characteristic.

表面優勢のＴＭＣ４０を有するＴＭＡ４０／γ−ＰＧＡ／薬剤断片は、血液脳関門の上皮膜の粘液に吸着して浸透し、次いで腸細胞間の密着帯の一時的な開放を誘発すせると思われる。表４は、異なる四級化度を有するＴＭＣポリマーと異なるｐＨ環境でのγ−ＰＧＡとにより自己集合化したナノ粒子（ＮＰ）の粒径、ゼータ電位値、および多分散指数を示す（ｎ＝５バッチ）。表４に示されるように、ＴＭＣ４０／γ−ＰＧＡ ＮＰは、ｐＨ７．４で１７．３のゼータ電位値を有し、依然として正電荷表面を保持した。   A TMA40 / γ-PGA / drug fragment with surface-dominated TMC40 appears to adsorb and penetrate the mucus of the epithelium of the blood brain barrier and then induce a temporary release of the tight junctions between the enterocytes . Table 4 shows the particle size, zeta potential value, and polydispersity index of nanoparticles (NP) self-assembled with TMC polymers having different degrees of quaternization and γ-PGA in different pH environments (n = 5 batches). As shown in Table 4, TMC40 / γ-PGA NP had a zeta potential value of 17.3 at pH 7.4 and still retained a positively charged surface.

凍結乾燥ナノ粒子
粒子上に保護層を形成する従来のコーティング化合物の幾つかを用いて、凍結乾燥工程前に物理的にコーティングするか、またはナノ粒子と混合する。コーティング化合物としては、トレハロース、マンニトール、グリセロールなどを挙げることができる。ミコースとしても知られているトレハロースは、天然に多量ではないが広範に見られるアルファ−結合（二糖）糖である。トレハロースは、真菌類、植物、および無脊椎動物により合成することができる。トレハロースは、植物および動物が長期間の乾燥状態に耐える能力、アンヒドロビオシスと関連する。その後、通常は脱水／再水和サイクルに従うと考えられる再水和により、全般的に大きな致命的損傷なしに、正常な細胞活動の再開が可能になる。トレハロースは、抗酸化剤であるという利点をさらに有する。トレハローズは、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１・２Ｈ２Ｏの化学構造を有する。トレハロースは、ＣＡＳ番号９９−２０−７およびＰｕｂＣｈｅｍ７４２７として記載されている。 Lyophilized nanoparticles Some of the conventional coating compounds that form a protective layer on the particles are used to physically coat or mix with the nanoparticles prior to the lyophilization process. Examples of the coating compound include trehalose, mannitol, glycerol and the like. Trehalose, also known as mycose, is an alpha-linked (disaccharide) sugar that is not widely found in nature but is widespread. Trehalose can be synthesized by fungi, plants, and invertebrates. Trehalose is associated with anhydrobiosis, the ability of plants and animals to withstand prolonged drying. Subsequent rehydration, which would normally follow a dehydration / rehydration cycle, allows normal cell activity to resume without overall fatal damage. Trehalose further has the advantage of being an antioxidant. Trehalose has the chemical structure of C 12 H 22 O 11 · 2H 2 O. Trehalose is described as CAS number 99-20-7 and PubChem 7427.

各ナノ粒子（２．５％の濃度で）を、４つのタイプの液体溶液と、１：１の容量比で、完全に分散されるまで約３０分間混合した。次に混合した粒子−液体を、凍結乾燥条件下、例えば、約−８０℃、＜２５ｍｍＨｇ圧で約６時間凍結乾燥した。選択した凍結乾燥条件におけるパラメータは、前述の数値から僅かに変化し得る。実験に用いた４つのタイプの液体としては：（Ａ）脱イオン水；（Ｂ）トレハロース；（Ｃ）マンニトール；および（Ｄ）グリセロールが挙げられるが、一方、溶液中の液体（Ａ）から液体（Ｃ）の濃度は、２．５％、５％および１０％に設定した。凍結乾燥工程後、混合した粒子−液体を、脱イオン水により１：５の容量比で再水和し、各タイプの液体中でのナノ粒子の完全性を評価した。粒径、多分散指数、およびゼータ電位のデータを比較することによって、凍結乾燥粒子−トレハロースの操作（２．５％、５％および１０％の濃度レベルで）からのナノ粒子は、凍結乾燥前のナノ粒子と同等の性質を示す。同一のデータ分析下、凍結乾燥粒子−マンノースの操作（２．５％、および５％の濃度レベルで）からのナノ粒子は、凍結乾燥前のナノ粒子とやや同等の性質を示す。   Each nanoparticle (at a concentration of 2.5%) was mixed with four types of liquid solutions in a 1: 1 volume ratio for about 30 minutes until fully dispersed. The mixed particle-liquid was then lyophilized under lyophilization conditions, eg, at about -80 ° C. and <25 mm Hg pressure for about 6 hours. The parameters in the selected lyophilization conditions can vary slightly from the aforementioned values. The four types of liquids used in the experiments include: (A) deionized water; (B) trehalose; (C) mannitol; and (D) glycerol, while liquid (A) to liquid in solution. The concentration of (C) was set to 2.5%, 5% and 10%. After the lyophilization step, the mixed particle-liquid was rehydrated with deionized water at a volume ratio of 1: 5 to assess the integrity of the nanoparticles in each type of liquid. By comparing particle size, polydispersity index, and zeta potential data, nanoparticles from the lyophilized particle-trehalose operation (at 2.5%, 5% and 10% concentration levels) were pre-lyophilized. The same properties as those of the nanoparticles. Under the same data analysis, nanoparticles from the lyophilized particle-mannose operation (at 2.5% and 5% concentration levels) show somewhat similar properties to the nanoparticles prior to lyophilization.

実施例４
動物評価における凍結乾燥ナノ粒子
インスリンの経口送達用の凍結乾燥ＮＰを装入した腸溶コーティングカプセル剤を、ラットモデルにおいて試験する。基本概念としては、腸溶コーティングカプセル剤は胃の高酸性環境中では無傷のままであるが、小腸の中性（または僅かに塩基性）環境中では迅速に溶解することである。結果として、このようなカプセル剤は、胃内でのＮＰの崩壊を防ぎ、したがって、小腸の基部区域に送達される無傷のＮＰ量を増加させ得ると考えられる。糖尿病ラットを、実験１２時間前に絶食させ、実験中も絶食させたままにしたが、水は自由に取らせた。以下の３種の製剤を糖尿病ラットに投与した：（ａ）遊離形態のインスリン（３０ＩＵ／ｋｇ）とトレハロースを充填した経口用Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５−コーティングカプセル剤；（ｂ）凍結乾燥ＮＰ（３０．０Ｉ．Ｕ．／ｋｇ）を充填した経口用Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５−コーティングカプセル剤；および（ｃ）遊離形態のインスリン溶液（５．０ＩＵ／ｋｇ、各試験群についてｎ＝５）の皮下（ＳＣ）注射。血液サンプルを、ラットの尾静脈から、薬物投与前と投与後の種々の時間間隔で採取した。対応する血漿中インスリン濃度−時間プロファイルを図４に示してある。示されているように、遊離形態のインスリン溶液を皮下処置したラットは、投与後１時間目に最大の血漿中濃度となり、一方、インスリン装入ＮＰで充填したＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５−コーティングカプセル剤の経口投与では、処置後５時間目に最大の血漿中濃度を示した。対照的に、遊離形態のインスリンを充填したＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００−５５−コーティングカプセル剤を経口処置したラットでは、検出可能な血漿中インスリン（ウシインスリン）は見られなかった。

Figure 2013525351
Example 4
Lyophilized nanoparticles in animal evaluation Enteric coated capsules loaded with lyophilized NP for oral delivery of insulin are tested in a rat model. The basic concept is that enteric-coated capsules remain intact in the highly acidic environment of the stomach but dissolve rapidly in the neutral (or slightly basic) environment of the small intestine. As a result, it is believed that such capsules can prevent NP disintegration in the stomach and thus increase the amount of intact NP delivered to the proximal segment of the small intestine. Diabetic rats were fasted 12 hours prior to the experiment and remained fasted during the experiment, but water was freely taken. The following three formulations were administered to diabetic rats: (a) oral Eudragit® L100-55-coated capsules filled with free form insulin (30 IU / kg) and trehalose; (b) lyophilized. Oral Eudragit® L100-55-coated capsules filled with NP (30.0 IU / kg); and (c) free form insulin solution (5.0 IU / kg, n for each test group = 5) Subcutaneous (SC) injection. Blood samples were taken from the tail vein of rats at various time intervals before and after drug administration. The corresponding plasma insulin concentration-time profile is shown in FIG. As shown, rats treated subcutaneously with the free form of insulin solution had a maximum plasma concentration 1 hour after administration, while Eudragit® L100-55- filled with insulin-loaded NP. Oral administration of coated capsules showed maximum plasma concentration at 5 hours after treatment. In contrast, no detectable plasma insulin (bovine insulin) was seen in rats treated orally with Eudragit® L100-55-coated capsules filled with free form of insulin.
Figure 2013525351

一実施形態において、本発明のナノ粒子に装入される生物活性剤は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤であるが、ＴＮＦは炎症反応を促進し、次いで炎症反応は、リウマチ様関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬、および難治性喘息などの自己免疫障害に関連する多くの臨床問題を引き起こす。これらの障害は、時にはＴＮＦ阻害剤を用いることにより処置される。この阻害は、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）またはアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）などのモノクローナル抗体、またはエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）などの循環性受容体融合タンパク質により達成することができる。別の例として、ペントキシフィリンがある。   In one embodiment, the bioactive agent loaded into the nanoparticles of the present invention is a tumor necrosis factor (TNF) inhibitor, but TNF promotes an inflammatory response, which is then rheumatoid arthritis, ankylosing Causes many clinical problems associated with autoimmune disorders such as ankylosing spondylitis, Crohn's disease, psoriasis and refractory asthma. These disorders are sometimes treated by using TNF inhibitors. This inhibition can be achieved by a monoclonal antibody such as infliximab (Remicade) or adalimumab (Humira) or a circulating receptor fusion protein such as etanercept (Enbrel). Another example is pentoxifylline.

実施例５
ＤＴＰＡを装入したナノ粒子
本発明の態様の幾つかは、キトサン、ＰＧＡ−コンプレキソン複合体および生物活性剤を含んでなるナノ粒子の医薬組成物に関する。一実施形態において、ＰＧＡ−コンプレキソン複合体は、γ−ＰＧＡ、α−ＰＧＡ、ＰＧＡの誘導体またはＰＧＡの塩類などのＰＧＡ誘導体との複合体を広く含むことができ、一方、コンプレキソンは、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＩＤＡ（イミノ二酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−四酢酸）、ＮＯＴＡ（２，２’，２’’−（１，４，７−トリアゾナン−１，４，７−トリイル）三酢酸）などであり得る。ポリアミノカルボン酸（コンプレキソン）は、１つまたは複数のカルボン酸基に炭素原子を介して結合した１つまたは複数の窒素原子を含有する化合物である。 Example 5
Nanoparticles Charged with DTPA Some embodiments of the invention relate to pharmaceutical compositions of nanoparticles comprising chitosan, a PGA-complexone complex and a bioactive agent. In one embodiment, the PGA-complexone complex can broadly comprise a complex with a PGA derivative such as γ-PGA, α-PGA, a derivative of PGA, or a salt of PGA, while the complexone is DTPA. (Diethylenetriaminepentaacetic acid), EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), IDA (iminodiacetic acid), NTA (nitrilotriacetic acid), EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid), BAPTA (1,2-bis (o-aminophenoxy) ethane- N, N, N ′, N′-tetraacetic acid), DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′, N, N′-tetraacetic acid), NOTA (2,2 ′, 2 ″-(1,4,7-triazonan-1,4,7-triyl) triacetic acid) and the like. A polyaminocarboxylic acid (complexone) is a compound that contains one or more nitrogen atoms bonded to one or more carboxylic acid groups via a carbon atom.

ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）は、５つのカルボキシメチル基で修飾されたジエチレントリアミン主鎖からなるポリアミノカルボン酸である。分子は、ＥＤＴＡの拡張版としてみなすことができる。ＤＴＰＡは、定義されていないことの多いその共役塩基として使用され、金属カチオンに対して高親和性を有する。例えば、ランタニドイオンおよびアクチニドイオンに対する複合化の際、ＤＴＰＡは、ペンタアニオン形態として存在する。すなわち、５つのカルボン酸基は全て、脱プロトン化される。ＤＴＰＡは、分子式Ｃ１４Ｈ２３Ｎ３Ｏ１０、モル質量は３９３．３５８ｇ／モルを有し、化学式：

Figure 2013525351
を有する。 Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) is a polyaminocarboxylic acid consisting of a diethylenetriamine backbone modified with five carboxymethyl groups. The molecule can be viewed as an extended version of EDTA. DTPA is used as its conjugate base, which is often undefined, and has a high affinity for metal cations. For example, upon conjugation to lanthanide and actinide ions, DTPA exists as a pentaanion form. That is, all five carboxylic acid groups are deprotonated. DTPA has the molecular formula C 14 H 23 N 3 O 10 , the molar mass is 393.358 g / mol, the chemical formula:
Figure 2013525351
Have

現在、ＤＴＰＡは、３種の放射性物質：プルトニウム、アメリシウム、およびキュリウムのキレート化用に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されている。ＤＴＰＡは、オクタデンテートリガンド、ジエチレントリアミン五酢酸の親酸である。幾つかの状況において、５本のアセテートアームの全てが、金属イオンに結合していない。本発明の一態様において、ＤＴＰＡは、下記：

Figure 2013525351
に示したようにヘキサンジアミン（（γ−ＰＧＡ）−ＤＴＰＡ）を介してγ−ＰＧＡに複合化されている。 Currently, DTPA is approved by the US Food and Drug Administration (FDA) for chelation of three radioactive materials: plutonium, americium, and curium. DTPA is the parent acid of the octadentate ligand, diethylenetriaminepentaacetic acid. In some situations, all five acetate arms are not bound to metal ions. In one embodiment of the invention, the DTPA is:
Figure 2013525351
As shown in Fig. 5, it is complexed with γ-PGA via hexanediamine ((γ-PGA) -DTPA).

本発明の一態様において、（γ−ＰＧＡ）−ＤＴＰＡは、ナノ粒子の現在の医薬組成物に使用されるＰＧＡ−コンプレキソン複合体の一種である。（γ−ＰＧＡ）−ＤＴＰＡ複合体におけるＤＴＰＡの総置換度は、一般に約１〜７０％の範囲、好ましくは約５〜４０％の範囲、最も好ましくは約１０〜３０％の範囲である。ＤＴＰＡは、体内で増加したり、長期の健康作用を引き起こしたりしない。   In one aspect of the invention, (γ-PGA) -DTPA is a type of PGA-complexone complex used in current pharmaceutical compositions of nanoparticles. The total degree of substitution of DTPA in the (γ-PGA) -DTPA complex is generally in the range of about 1-70%, preferably in the range of about 5-40%, and most preferably in the range of about 10-30%. DTPA does not increase in the body or cause long-term health effects.

本明細書に記載された単純かつ緩和なイオン性ゲル化法を用いるキトサン、ＰＧＡ−コンプレキソン複合体および少なくとも１種の生物活性剤を含んでなるナノ粒子は、Ｃａｃｏ−２細胞培養モデルにおけるＴＥＥＲ測定によって、所望の傍細胞輸送効力を立証した。   Nanoparticles comprising chitosan, PGA-complexone complex and at least one bioactive agent using the simple and relaxed ionic gelation method described herein are TEER in a Caco-2 cell culture model. Measurements demonstrated the desired paracellular transport efficacy.

実施例６
（γ−ＰＧＡ）−ＤＴＰＡ複合体による酵素阻害試験
ブラシ縁膜結合酵素を用いて、ドナー区画の底部における接触膜をシミュレートし、ドナー区画内のインスリン装入媒体（クレブス・リンゲル緩衝液）を、時間０における出発物質として用いた。この酵素阻害試験では、３つの成分を用いてブラシ縁膜結合酵素によりインスリンの酵素分解対時間を評価した。３つの成分は、（ａ）対照としてインスリン１ｍｇ／ｍｌ；（ｂ）ＤＴＰＡ５ｍｇ／ｍｌ；および（ｃ）（γ−ＰＧＡ）−ＤＴＰＡ５ｍｇ／ｍｌであった。図５に示されるように、実験時間を超えて２時間まで、ＤＴＰＡと（γ−ＰＧＡ）−ＤＴＰＡの双方が、インスリン活性または生存含量を実質的に保護するか、または維持する。本発明の態様の幾つかは、ナノ粒子の医薬組成物を提供するものであり、正荷電キトサンが優勢のシェル部分、コンプレキソンと基質がＰＧＡである１つの負荷電基質を含むコア部分を含んでなるナノ粒子において、負荷電基質が、コア部分内の正荷電キトサンの一部により少なくとも部分的に中和されており、少なくとも１種の生物活性剤が、ナノ粒子内に装入されている。一実施形態において、ＰＧＡは、コンプレキソンと複合化し、ナノ粒子内にＰＧＡ−コンプレキソン複合体を形成する。 Example 6
Enzyme inhibition test with (γ-PGA) -DTPA complex Using brush border membrane bound enzyme, the contact membrane at the bottom of the donor compartment was simulated and the insulin loading medium (Krebs-Ringer buffer) in the donor compartment was , Used as starting material at time 0. In this enzyme inhibition test, the enzymatic degradation versus time of insulin was evaluated by brush border membrane-bound enzyme using three components. The three components were (a) 1 mg / ml insulin as a control; (b) DTPA 5 mg / ml; and (c) (γ-PGA) -DTPA 5 mg / ml. As shown in FIG. 5, both DTPA and (γ-PGA) -DTPA substantially protect or maintain insulin activity or survival content up to 2 hours beyond the experimental time. Some of the embodiments of the present invention provide a nanoparticulate pharmaceutical composition comprising a core portion comprising a positively charged chitosan-dominated shell portion, a complexone and a negatively charged substrate wherein the substrate is PGA. In which the negatively charged substrate is at least partially neutralized by a portion of the positively charged chitosan in the core portion and at least one bioactive agent is loaded into the nanoparticle. . In one embodiment, the PGA is complexed with the complexone to form a PGA-complexone complex within the nanoparticle.

本発明の態様の幾つかは、ナノ粒子内に生物活性剤を封入することにより、経口投与における生物活性剤の酵素耐性を増強する方法を提供し、ナノ粒子は、本開示および請求項に記載された医薬製剤および／または医薬組成物を有する。一実施形態において、錠剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル錬剤などにおいて、ナノ粒子は、薬学的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤がさらに装入される。   Some aspects of the present invention provide a method for enhancing the enzyme resistance of a bioactive agent upon oral administration by encapsulating the bioactive agent within the nanoparticle, wherein the nanoparticle is described in the present disclosure and claims. Having a formulated pharmaceutical formulation and / or pharmaceutical composition. In one embodiment, in tablets, pills, capsules, chewable smelts, etc., the nanoparticles are further loaded with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient.

本発明の態様の幾つかは、ナノ粒子の医薬組成物に関するものであり、正荷電キトサンが優勢のシェル部分、ＰＧＡコンプレキソン複合体の１つの負荷電基質を含むコア部分を含んでなるナノ粒子において、負荷電基質は、コア部分内の正荷電キトサンの一部により少なくとも部分的に中和されており、少なくとも１種の生物活性剤が、ナノ粒子内に装入されている。一実施形態において、ナノ粒子は、亜鉛、硫酸マグネシウム、またはトリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）をさらに含んでなる。別の実施形態において、ナノ粒子は、腸溶コーティングにより処理される   Some of the aspects of the invention relate to nanoparticulate pharmaceutical compositions, comprising a core portion comprising a positively charged chitosan-dominated shell portion, one negatively charged substrate of a PGA complexone complex. In which the negatively charged substrate is at least partially neutralized by a portion of the positively charged chitosan in the core portion, and at least one bioactive agent is loaded into the nanoparticles. In one embodiment, the nanoparticles further comprise zinc, magnesium sulfate, or sodium tripolyphosphate (TPP). In another embodiment, the nanoparticles are treated with an enteric coating.

本発明を、その一定の実施形態の具体的な詳細を挙げて記載したが、添付の請求項に含まれている範囲を除き、また、請求項に含まれている限りこのような詳細を、本発明の範囲の限定として見なすことは意図していない。多くの修飾および変更が、上記の開示に鑑みて可能である。   While the invention has been described with specific details for certain embodiments thereof, such details are within the scope of the appended claims, and as long as they are included in the claims, It is not intended as a limitation on the scope of the invention. Many modifications and variations are possible in light of the above disclosure.

少なくとも１種の生物活性剤を装入したナノ粒子の医薬製剤は、生物活性剤がＧＩＴ内の酵素攻撃に存続する限り、経口薬物送達に好適であり問題のない方法である。本発明は、動物対象において生物活性剤の生物学的利用能および効力を増強するために、ナノ粒子内に酵素耐性ＰＧＡ−コンプレキソンを生物活性剤と密接させて装入する新規なナノ粒子製剤を開示する。   Nanoparticulate pharmaceutical formulations loaded with at least one bioactive agent are suitable and oral methods for oral drug delivery as long as the bioactive agent persists in enzymatic attack within the GIT. The present invention relates to a novel nanoparticle formulation in which an enzyme resistant PGA-complexone is placed in intimate contact with a bioactive agent within the nanoparticle to enhance the bioavailability and efficacy of the bioactive agent in animal subjects. Is disclosed.

引用文献リスト
特許文献
・米国特許第６，３８３，４７８Ｂ１号明細書（２００２年５月７日）
・米国特許第６，６４９，１９２Ｂ２号明細書（２００３年１１月１８日）
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Claims (20)

ナノ粒子の医薬組成物において、前記ナノ粒子が正荷電キトサン優勢のシェル部分、ＰＧＡ−コンプレキソン複合体のうち１つの負荷電基質を含むコア部分を含んでなる医薬組成物であって、前記負荷電基質が、前記コア部分内の前記正荷電キトサンの一部により少なくとも部分的に中和されており、少なくとも１種の生物活性剤が、前記ナノ粒子内に装入されていることを特徴とする医薬組成物。   A pharmaceutical composition of nanoparticles, wherein the nanoparticles comprise a positively charged chitosan predominant shell portion, a core portion comprising one negatively charged substrate of a PGA-complexone complex, wherein An electrosubstrate is at least partially neutralized by a portion of the positively charged chitosan in the core portion, and at least one bioactive agent is charged into the nanoparticles. A pharmaceutical composition. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記ナノ粒子が、約５０ナノメートル〜４００ナノメートルの間の平均粒径を有することを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the nanoparticles have an average particle size between about 50 nanometers and 400 nanometers. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記キトサンが、Ｎ−トリメチルキトサン、ＥＤＴＡ−キトサン、低分子量キトサン、キトサン誘導体、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the chitosan is N-trimethylchitosan, EDTA-chitosan, low molecular weight chitosan, chitosan derivative, or a combination thereof. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記ナノ粒子が、単純で緩和なイオン性ゲル化法によって形成されることを特徴とする、医薬組成物。   2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the nanoparticles are formed by a simple and relaxed ionic gelation method. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記ナノ粒子が、錠剤、丸剤またはチュアブル錬剤の形態に製剤化されることを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 1, characterized in that the nanoparticles are formulated in the form of tablets, pills or chewable demulcents. 請求項５に記載の医薬組成物において、前記錠剤または丸剤が、腸溶コーティングにより処理されることを特徴とする、医薬組成物。   6. The pharmaceutical composition according to claim 5, wherein the tablet or pill is treated with an enteric coating. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記ナノ粒子が、カプセル剤に封入されることを特徴とする医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the nanoparticles are encapsulated in a capsule. 請求項７に記載の医薬組成物において、前記カプセル剤が、薬学的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含んでなることを特徴とする、医薬組成物。   8. The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the capsule further comprises a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient. 請求項７に記載の医薬組成物において、前記カプセル剤が、少なくとも１種の可溶化剤、発泡剤、または乳化剤をさらに含んでなることを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the capsule further comprises at least one solubilizer, foaming agent or emulsifier. 請求項７に記載の医薬組成物において、前記カプセル剤が、腸溶コーティングにより処理されることを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the capsule is treated with an enteric coating. 請求項７に記載の医薬組成物において、前記カプセル剤が、少なくとも１種の透過増強剤をさらに含んでなることを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the capsule further comprises at least one permeation enhancer. 請求項１１に記載の医薬組成物において、前記透過増強剤が、キレート化剤、胆汁酸塩、アニオン性界面活性剤、中鎖脂肪酸、リン酸エステル、キトサン、およびキトサン誘導体からなる群から選択されることを特徴とする、医薬組成物。   12. The pharmaceutical composition according to claim 11, wherein the permeation enhancer is selected from the group consisting of chelating agents, bile salts, anionic surfactants, medium chain fatty acids, phosphate esters, chitosan, and chitosan derivatives. A pharmaceutical composition characterized by the above. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記コンプレキソンが、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＩＤＡ（イミノ二酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−四酢酸）、およびＮＯＴＡ（２，２’，２’’−（１，４，７−トリアゾナン−１，４，７−トリイル）三酢酸）からなる群から選択されることを特徴とする、医薬組成物。   2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the complexone is DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), IDA (iminodiacetic acid), NTA (nitrilotriacetic acid), EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid). ), BAPTA (1,2-bis (o-aminophenoxy) ethane-N, N, N ′, N′-tetraacetic acid), DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′) , N, N′-tetraacetic acid), and NOTA (2,2 ′, 2 ″-(1,4,7-triazonan-1,4,7-triyl) triacetic acid) A pharmaceutical composition characterized by the above. 請求項１１に記載の医薬組成物において、前記少なくとも１種の生物活性剤が、タンパク質、ペプチド類、インスリン、インスリン類縁体、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類縁体、インスリン増感剤、インスリン分泌促進剤、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２類縁体、ジペプチジルペプチダーゼ４の阻害剤（ＤＰＰ−４阻害剤）、エクセナチド、リラグルチド、アルビグルチド、タスポグルチド、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、アミリン類縁体、ナトリウム−グルコース共輸送体タイプ２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、ベンフルオレックス、およびトルレスタートからなる群から選択されることを特徴とする、医薬組成物。   12. The pharmaceutical composition according to claim 11, wherein the at least one bioactive agent is a protein, peptide, insulin, insulin analog, GLP-1, GLP-1 analog, insulin sensitizer, insulin secretagogue. Agents, GLP-2, GLP-2 analogs, inhibitors of dipeptidyl peptidase 4 (DPP-4 inhibitors), exenatide, liraglutide, arubyglutide, taspoglutide, alpha-glucosidase inhibitor, amylin analog, sodium-glucose cotransport A pharmaceutical composition characterized in that it is selected from the group consisting of a body type 2 (SGLT2) inhibitor, benfluorex, and tolrestart. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記ナノ粒子を凍結乾燥し、それによって前記ナノ粒子が粉末形態であることを特徴とする、医薬組成物。   2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the nanoparticles are lyophilized, whereby the nanoparticles are in powder form. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記ナノ粒子をトレハロースと混合してから、凍結乾燥し、それによって前記ナノ粒子が粉末形態であることを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 1, characterized in that the nanoparticles are mixed with trehalose and then lyophilized, whereby the nanoparticles are in powder form. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記ナノ粒子が、亜鉛、硫酸マグネシウム、またはトリポリリン酸ナトリウム（ＴＰＰ）をさらに含んでなることを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the nanoparticles further comprise zinc, magnesium sulfate, or sodium tripolyphosphate (TPP). 請求項１に記載の医薬組成物において、前記ナノ粒子が、腸溶コーティングにより処理されることを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the nanoparticles are treated with an enteric coating. 請求項１に記載の医薬組成物において、前記ＰＧＡ−コンプレキソン複合体中のＰＧＡが、γ−ＰＧＡ、α−ＰＧＡ、ＰＧＡの誘導体、またはＰＧＡの塩類であることを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein PGA in the PGA-complexone complex is γ-PGA, α-PGA, a derivative of PGA, or a salt of PGA. . 請求項１に記載の医薬組成物において、前記ナノ粒子が、少なくとも１種の透過エンハンサーをさらに含んでなることを特徴とする、医薬組成物。   The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the nanoparticles further comprise at least one permeation enhancer.
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