JP2013238463A - Cell identification method utilizing dielectrophoresis - Google Patents
Cell identification method utilizing dielectrophoresis Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013238463A JP2013238463A JP2012111134A JP2012111134A JP2013238463A JP 2013238463 A JP2013238463 A JP 2013238463A JP 2012111134 A JP2012111134 A JP 2012111134A JP 2012111134 A JP2012111134 A JP 2012111134A JP 2013238463 A JP2013238463 A JP 2013238463A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electrode
- band
- electrodes
- cells
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 238000004720 dielectrophoresis Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 90
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 37
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 227
- 239000010409 thin film Substances 0.000 claims description 21
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 19
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N indium;oxotin Chemical compound [In].[Sn]=O AMGQUBHHOARCQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 28
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 21
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 12
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 11
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 11
- 108010029180 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Proteins 0.000 description 11
- 102000001555 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Human genes 0.000 description 11
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 10
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 8
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 7
- WABPQHHGFIMREM-UHFFFAOYSA-N lead(0) Chemical compound [Pb] WABPQHHGFIMREM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 229920002120 photoresistant polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 238000003486 chemical etching Methods 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004380 ashing Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920006267 polyester film Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- LLHKCFNBLRBOGN-UHFFFAOYSA-N propylene glycol methyl ether acetate Chemical compound COCC(C)OC(C)=O LLHKCFNBLRBOGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 succinimidyl ester Chemical class 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
Abstract
Description
本発明は、誘電泳動による細胞操作技術を利用し、特定の抗原を表面に発現している細胞を、細胞群の中から簡便かつ迅速に識別する、細胞識別方法に関する。 The present invention relates to a cell identification method that uses a cell manipulation technique based on dielectrophoresis to easily and quickly identify a cell expressing a specific antigen on the surface from a cell group.
白血球細胞の表面抗原は、細胞表膜表面に存在するタンパク質であり、それぞれが固有の機能を有する。表面抗原の発現パターンは、細胞の種類、状態、成熟度又は分化度によって異なり、発現パターンを知ることは医学的及び生物学的に極めて重要な知見となる。細胞の表面抗原発現パターンを解析するイムノフェノタイピングには、抗体を使用した手法が有効である。 White blood cell surface antigens are proteins present on the surface of the cell membrane, each having a unique function. The expression pattern of the surface antigen varies depending on the cell type, state, maturity or differentiation level, and knowing the expression pattern is very important medically and biologically. A technique using an antibody is effective for immunophenotyping for analyzing cell surface antigen expression patterns.
イムノフェノタイピングに利用されるモノクローナル抗体は、CD分類（cluster of differentiation）されている。測定対象とする表面抗原に対する抗体を細胞に捕捉させれば、細胞群の中から抗体が反応した細胞を識別することが可能となる。例えば、イムノフェノタイピングにより細胞の成熟度又は分化度を知ることができ、細胞分化の基礎研究においては重要な指標となる。このように、臨床診断、特に白血病診断においては、CD抗体を用いたイムノフェノタイピングが不可欠となっている。 Monoclonal antibodies used for immunophenotyping are CD classified (cluster of differentiation). If an antibody against a surface antigen to be measured is captured by a cell, it is possible to identify a cell to which the antibody has reacted from a cell group. For example, the degree of maturation or differentiation of cells can be known by immunophenotyping, which is an important index in basic research of cell differentiation. Thus, immunophenotyping using CD antibodies is indispensable in clinical diagnosis, particularly in leukemia diagnosis.
これまでに、白血病の分類、進行度、又は白血病細胞の帰属を決定する際に指標となるCD抗原については、多くの知見が蓄積されている。CD33抗原もそのうちの１つである。CD33は、細胞間接着因子の一種であると推測されている67kDaの膜貫通型糖タンパク質であり、骨髄球性の細胞に発現するために骨髄性白血病の陽性マーカーとして用いられている。具体的には、イムノフェノタイピングを行い、CD33又はCD13が陽性でCD19及びCD20が陰性であれば、骨髄性白血病と診断される。 To date, a great deal of knowledge has been accumulated about CD antigens, which serve as indices when determining leukemia classification, progression, or leukemia cell assignment. The CD33 antigen is one of them. CD33 is a 67 kDa transmembrane glycoprotein presumed to be a kind of intercellular adhesion factor, and is used as a positive marker for myeloid leukemia because it is expressed in myeloid cells. Specifically, immunophenotyping is performed, and if CD33 or CD13 is positive and CD19 and CD20 are negative, myelogenous leukemia is diagnosed.
イムノフェノタイピングの従来法としては、フローサイトメトリー（FCM）を利用する方法、磁気細胞分離装置（MACS）を利用する方法、抗体アレイを利用する方法が挙げられる（非特許文献１〜６）。FCMを利用する方法は、免疫蛍光染色法に基づいた識別方法であり、細胞表面抗原を蛍光分子で標識した抗体によってラベルし、溶液中を流れる細胞にレーザー光を照射し、蛍光を発する細胞が光学的に計測される。表面抗原を異なる種類の蛍光分子でラベルすることにより、複数種の表面抗原を対象に同時計測が可能となる。FCMは、精密な分析結果が得られるために、イムノフェノタイピング手法の基準となっているが、免疫蛍光染色操作には1時間以上を要する。また、それぞれの抗体について濃度及び反応時間の最適化を行う必要があり、操作が煩雑である。さらに、フローサイトメーターは、大型の自動化機器であるため非常に高価な装置であり、熟練した技術者が操作する必要もある。 Examples of conventional immunophenotyping methods include a method using flow cytometry (FCM), a method using a magnetic cell separation device (MACS), and a method using an antibody array (Non-Patent Documents 1 to 6). The method using FCM is an identification method based on immunofluorescence staining, in which cell surface antigens are labeled with an antibody labeled with a fluorescent molecule, and the cells that emit fluorescence are irradiated by irradiating laser light to cells flowing in the solution. Measured optically. By labeling surface antigens with different types of fluorescent molecules, simultaneous measurement of multiple types of surface antigens becomes possible. FCM is a standard for immunophenotyping methods because precise analysis results can be obtained, but immunofluorescent staining requires more than 1 hour. Further, it is necessary to optimize the concentration and reaction time for each antibody, and the operation is complicated. Furthermore, since the flow cytometer is a large automation device, it is a very expensive device and needs to be operated by a skilled engineer.
MACSを利用する方法は、細胞表面抗原を磁性微粒子で標識し、強力な磁場のカラムに導入することにより、磁性微粒子で修飾された細胞の溶出を遅らせることにより、目的とする表面抗原を発現せず、磁気微粒子によって標識されていない細胞画分は、カラムを素通り早く溶出され、磁性微粒子で修飾された細胞は遅く溶出されるため、両者を分離することが可能となる。しかし、この方法では、発現細胞の存在比を知るためには、それぞれの画分の細胞濃度を計測する必要がある。また、分離の状況をリアルタイムで観測することはできず、複数種類の表面抗原への適用も困難である。 In the method using MACS, cell surface antigens are labeled with magnetic microparticles and introduced into a column with a strong magnetic field to delay the elution of cells modified with magnetic microparticles, thereby expressing the target surface antigen. In addition, the cell fraction not labeled with the magnetic microparticles is eluted early through the column, and the cells modified with the magnetic microparticles are eluted later, so that both can be separated. However, in this method, in order to know the abundance ratio of the expressed cells, it is necessary to measure the cell concentration of each fraction. In addition, the state of separation cannot be observed in real time, and application to multiple types of surface antigens is difficult.
抗体アレイを利用する方法では、ガラス上の金薄膜又はニトロセルロース膜のような基板に数十種類の抗体をそれぞれスポット状に固定化し、抗体アレイを作製する。その抗体アレイ上に細胞を播種し、30分程度のインキュベーションを行うことにより。細胞が基板表面にスポット固定された抗体と接触し、その場所に固定化された抗体に対応する表面抗原を発現している細胞は、免疫反応により基板表面に捕捉される。一方、対応する表面抗原を発現していない細胞は捕捉されず、後続する洗浄行程で基板表面から除去される。細胞の捕捉された位置情報及びスポット固定化された抗体の種類から、細胞群において、どのような表面抗原を発現している細胞がどのくらいの比率で存在しているかを知ることができる。 In the method using an antibody array, dozens of types of antibodies are immobilized in a spot shape on a substrate such as a gold thin film or a nitrocellulose film on glass to prepare an antibody array. By seeding the cells on the antibody array and incubating for about 30 minutes. Cells that contact the spot-fixed antibody on the substrate surface and express the surface antigen corresponding to the antibody immobilized at that location are captured on the substrate surface by the immune reaction. On the other hand, cells that do not express the corresponding surface antigen are not captured and are removed from the substrate surface in a subsequent washing step. It is possible to know what ratio of cells expressing what kind of surface antigen is present in the cell group from the position information of the captured cells and the kind of the spot-fixed antibody.
抗体アレイを用いる方法は、簡便かつ安価で、パラレル化が容易な優れた方法である。しかし、抗体アレイ上に添加した細胞懸濁液中の細胞を積極的に移動させていないため、沈降した細胞の表面濃度とスポットの大きさとを最適化する必要がある。また、細胞が沈降し、細胞表面の抗原と基板表面の抗体とが免疫反応を起こすためには、30分程度のインキュベーション時間を要する。さらに、非捕捉細胞の除去は、手作業による洗浄操作によって行う必要があるために、操作に時間がかかるだけでなく、熟練した技術者が操作する場合でなければ、論文で発表されている70％〜90％という高い細胞捕捉率を達成することは極めて困難である。 The method using an antibody array is an excellent method that is simple and inexpensive and easy to parallelize. However, since the cells in the cell suspension added on the antibody array are not actively moved, it is necessary to optimize the surface concentration of the precipitated cells and the spot size. In addition, an incubation time of about 30 minutes is required for the cells to settle and an immune reaction between the cell surface antigen and the substrate surface antibody. Furthermore, since removal of non-captured cells must be performed by manual washing operations, not only is the operation time consuming, but it is published in the paper unless it is operated by a skilled technician. Achieving high cell capture rates of% -90% is extremely difficult.
そこで、本発明者等は、誘電泳動による細胞操作を用いることにより、細胞を迅速に識別できる方法を開発した（非特許文献７）。非特許文献７に開示されている細胞識別方法では、表面抗原としてCD33を発現しているHL60細胞を対象として、抗CD33抗体を固定化した交互くし型マイクロバンドアレイ電極を組み込んだマイクロ流路デバイスを用い、HL60細胞を正の誘電泳動による引力を利用して迅速にマイクロバンドアレイ電極表面に移動させる。これにより、細胞と抗体を強制的に接触させて、免疫反応による結合を促し、HL60細胞をマイクロバンドアレイ電極表面に不可逆的に捕捉する。 Therefore, the present inventors have developed a method that can quickly identify cells by using cell manipulation by dielectrophoresis (Non-patent Document 7). In the cell identification method disclosed in Non-Patent Document 7, a microchannel device incorporating an alternating comb-type microband array electrode on which an anti-CD33 antibody is immobilized, targeting HL60 cells expressing CD33 as a surface antigen. HL60 cells are rapidly moved to the surface of the microband array electrode using the attractive force of positive dielectrophoresis. As a result, the cell and the antibody are forcibly contacted to promote binding by an immune reaction, and the HL60 cells are irreversibly captured on the surface of the microband array electrode.
次に、マイクロバンドアレイ電極に印加している交流電圧の周波数を切り替え、負の誘電泳動による電極からの斥力を利用して、免疫反応を起こさずにマイクロバンドアレイ電極表面に捕捉されなかったHL60細胞を、バンド電極間へと除去する。それによって、CD33を発現しているHL60細胞のみがバンド電極間の表面に保持される。このようにして、表面抗原発現細胞の識別と空間的な分離とが行われる。 Next, the frequency of the alternating voltage applied to the microband array electrode was switched, and the repulsive force from the electrode due to negative dielectrophoresis was used to cause no HL60 that was not trapped on the microband array electrode surface. Cells are removed between the band electrodes. Thereby, only HL60 cells expressing CD33 are retained on the surface between the band electrodes. In this way, surface antigen-expressing cells are identified and spatially separated.
非特許文献７に開示される細胞識別方法は、わずか数分で表面抗原発現細胞を識別可能であり、均一な力で非捕捉細胞を除去できるために再現性にも優れる。また、蛍光ラベルが不要であり、操作が簡便で、所要時間も短いという特徴がある。 The cell identification method disclosed in Non-Patent Document 7 can identify surface antigen-expressing cells in just a few minutes, and is excellent in reproducibility because non-captured cells can be removed with uniform force. Further, there is a feature that a fluorescent label is unnecessary, the operation is simple, and the required time is short.
しかし、ほぼ100％のHL60細胞の表面にCD33抗原が発現しているにも関わらず、非特許文献７に開示される細胞識別方法では、マイクロバンドアレイ電極表面に捕捉される細胞は半数未満であった。そのため、細胞の診断方法として利用されることを考慮すると、測定精度が十分ではなく、さらなる細胞捕捉率の向上が必要とされた。 However, although the CD33 antigen is expressed on the surface of almost 100% of HL60 cells, in the cell identification method disclosed in Non-Patent Document 7, less than half of the cells are captured on the surface of the microband array electrode. there were. For this reason, considering that it is used as a method for diagnosing cells, the measurement accuracy is not sufficient, and further improvement in the cell capture rate is required.
本発明は、非特許文献７に開示されている細胞識別方法よりも、表面抗原を発現している細胞のマイクロバンドアレイ電極表面への捕捉率が高く、かつ、簡便な新規細胞識別方法の提供を目的とする。 The present invention provides a novel cell identification method that has a higher capture rate on the surface of a microband array electrode of cells expressing surface antigens than the cell identification method disclosed in Non-Patent Document 7. With the goal.
HL60細胞の誘電泳動挙動では、低周波数領域で負の誘電泳動、高周波数領域で正の誘電泳動が作用する。また、溶媒導電率の増加により、正の誘電泳動と負の誘電泳動の切り替わる周波数（交差周波数）が高周波数側へシフトし、正の誘電泳動力は減少する。このため、免疫反応が効果的に進行する200mS/m以上の導電率を有する溶媒を細胞懸濁液として用いた場合には、細胞に正の誘電泳動は作用せず、負の誘電泳動のみが作用することになる。 In the dielectrophoretic behavior of HL60 cells, negative dielectrophoresis acts in the low frequency region and positive dielectrophoresis acts in the high frequency region. In addition, as the solvent conductivity increases, the frequency (crossing frequency) at which positive dielectrophoresis and negative dielectrophoresis are switched shifts to the high frequency side, and the positive dielectrophoretic force decreases. For this reason, when a solvent having a conductivity of 200 mS / m or higher that effectively promotes an immune reaction is used as a cell suspension, positive dielectrophoresis does not act on cells, and only negative dielectrophoresis occurs. Will work.
本発明者等は、非特許文献７に開示されている細胞識別方法の改良について鋭意検討した結果、使用している細胞懸濁液の導電率が80mS/mであり、免疫反応が効果的に進行する導電率と比較して小さいことが、細胞捕捉率が低い原因であることを突き止めた。そして、細胞懸濁液の導電率を200mS/m〜500mS/mとし、交互くし型マイクロバンドアレイ電極のすべてのバンド電極と対向する導電性基板との間に50kHz以上500kHz以下の周波数と15Vpp以上25Vpp以下の振幅とを有する交流電圧を印加する工程と、交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の印加を停止する工程とを順次行うことにより、上記課題を解決し得ることを見出した。 As a result of intensive studies on the improvement of the cell identification method disclosed in Non-Patent Document 7, the present inventors have found that the conductivity of the cell suspension used is 80 mS / m, and the immune reaction is effective. It has been found that the fact that the cell conductivity is small compared to the proceeding conductivity is the cause of the low cell capture rate. The cell suspension has a conductivity of 200 mS / m to 500 mS / m, and a frequency of 50 kHz or more and 500 kHz or less and 15 Vpp or more between all band electrodes of the alternating micro-band array electrode and the conductive substrate facing each other. Applying an alternating voltage having an amplitude of 25 Vpp or less, and applying an alternating voltage between half of the band electrodes of the alternating microband array electrode and the conductive substrate It has been found that the above-described problems can be solved by sequentially performing the process of stopping the process.
また、本発明者等は、交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の振幅（印加電圧強度）を、すべてのバンド電極に印可する工程の振幅（印加電圧強度）の85％〜100％の間で周期的に変動させる工程を行うことによって、さらに細胞捕捉率を向上させ得ることも見出し、本発明を完成させるに至った。 Moreover, the present inventors set the amplitude (applied voltage intensity) of the alternating voltage between the half of the band electrodes of the alternating comb-type microband array electrode and the conductive substrate every other band electrode, It has also been found that the cell capture rate can be further improved by performing a step of periodically varying between 85% and 100% of the amplitude (applied voltage intensity) of the step applied to all band electrodes. It came to complete.
具体的に、本発明は、
マイクロ流路型デバイスを利用し、表面に特定抗原を発現している細胞を誘電泳動によって識別する細胞識別方法であって、
前記マイクロ流路型デバイスは、
基板と、
基板上に配置される交互くし型マイクロバンドアレイ電極と、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極が露出するように前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極上に配置される絶縁性薄膜と、
前記絶縁性薄膜上に配置されるスペーサーと、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極に対向するように前記スペーサー上に配置される導電性基板とを備え、
前記基板表面の少なくともバンド電極間には細胞表面に発現する抗原に対する抗体が固定化されており、
前記方法は、
細胞を含有する導電率200mS/m以上500mS/m以下の試料液を調製する工程Ａと、
前記試料液を前記マイクロ流路型デバイスのバンド電極上に導入する工程Ｂと、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のすべてのバンド電極と前記導電性基板との間に50kHz以上500kHz以下の周波数と15Vpp以上20Vpp以下の振幅とを有する交流電圧を印加する工程Ｃと、
前記工程Ｃ後、交互くし型マイクロバンドアレイ電極を観察し、電極間ギャップに存在する細胞数を測定する工程Ｅ０と、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の印加を停止する工程Ｄと、
前記工程Ｄ後、交互くし型マイクロバンドアレイを観察し、電極間ギャップに存在する細胞数を測定する工程Ｅと、
を順に有する方法に関する。
Specifically, the present invention
A cell identification method using a microchannel device to identify cells expressing a specific antigen on the surface by dielectrophoresis,
The microchannel device is
A substrate,
Alternating comb microband array electrodes disposed on the substrate;
Insulating thin films disposed on the alternating microband array electrodes so that the band electrodes of the alternating microband array electrodes are exposed; and
A spacer disposed on the insulating thin film;
A conductive substrate disposed on the spacer to face the alternating comb-type microband array electrode;
An antibody against an antigen expressed on the cell surface is immobilized between at least the band electrodes on the surface of the substrate,
The method
Step A for preparing a sample solution containing cells having a conductivity of 200 mS / m to 500 mS / m;
Introducing the sample solution onto the band electrode of the microchannel device; and
Applying an AC voltage having a frequency of 50 kHz or more and 500 kHz or less and an amplitude of 15 Vpp or more and 20 Vpp or less between all the band electrodes of the alternating comb-type microband array electrode and the conductive substrate;
After step C, step E0 of observing alternating comb-type microband array electrodes and measuring the number of cells present in the interelectrode gap;
Step D for stopping application of an alternating voltage between every other half of the band electrodes of the alternating micro-band array electrode and the conductive substrate;
After the step D, the step E of observing the alternating microband array and measuring the number of cells present in the gap between the electrodes;
In order.
本発明の細胞識別方法は、非特許文献７に開示されている発明とは、使用されるマイクロ流路型デバイスは共通するが、細胞を含有する試料液（細胞懸濁液）の導電率が異なり、さらに、工程Ｃと工程Ｄの組み合わせにおいて、負の誘電泳動のみによって細胞を移動させる点でも異なる。 The cell identification method of the present invention is the same as the invention disclosed in Non-Patent Document 7, but the microchannel device used is common, but the conductivity of the sample liquid (cell suspension) containing cells is low. Further, it is different in that the cell is moved only by negative dielectrophoresis in the combination of Step C and Step D.
前記工程Ｄの前に、前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の振幅（印加電圧強度）を、工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の85％〜100％の間で周期的に変動させる工程Ｄ０をさらに有することが好ましい。 Before the step D, the amplitude of the alternating voltage (applied voltage intensity) between the half of the band electrodes of the alternating comb-type micro band array electrode and the other half of the band electrodes and the conductive substrate, It is preferable to further include a step D0 that periodically varies between 85% and 100% of the amplitude (applied voltage intensity) of the step C.
工程Ｄ０によって、細胞が振とうされ、細胞と基板表面に固定された抗体とが接触する機会が増し、細胞捕捉率の向上が図れる。 By the step D0, the cells are shaken, and the opportunity for the cells to come into contact with the antibody fixed on the substrate surface is increased, so that the cell capture rate can be improved.
前記表面に特定抗原を発現している細胞は白血球であり、前記基板表面に固定される抗体は抗CD33抗体であることが好ましい。 The cells expressing the specific antigen on the surface are preferably white blood cells, and the antibody immobilized on the substrate surface is preferably an anti-CD33 antibody.
前記導電性基板は、インジウムスズ酸化物から構成される基板（ITO基板）であることが好ましい。 The conductive substrate is preferably a substrate (ITO substrate) made of indium tin oxide.
ITO基板は、透明であるため、一般的な透過型光学顕微鏡を用いて、工程Ｅを行うことが可能である。ただし、反射型光学顕微鏡を用いれば、ITO基板のように透明でない導電性基板を有しないマイクロ流路型デバイスであっても、交互くし型マイクロバンドアレイ電極上に存在する細胞の位置を観察することは可能である。 Since the ITO substrate is transparent, the process E can be performed using a general transmission optical microscope. However, if a reflective optical microscope is used, the position of cells present on alternating microband array electrodes can be observed even in a microchannel device that does not have a non-transparent conductive substrate such as an ITO substrate. It is possible.
前記工程Ｄ０の実行時間は、30秒以上120秒以下であることが好ましい。細胞の非特異的な吸着による発現していない細胞の捕捉が進行するからである。なお、前記工程Ｄ０の実行時間は、30秒以上60秒以下であることがより好ましい。 The execution time of the step D0 is preferably 30 seconds or longer and 120 seconds or shorter. This is because capture of non-expressed cells by nonspecific adsorption of cells proceeds. The execution time of the process D0 is more preferably 30 seconds or more and 60 seconds or less.
本発明によれば、特定の抗原を表面に発現している細胞を、非特許文献７に開示されている方法よりも高い捕捉率で、細胞群の中から簡便かつ迅速に識別することが可能である。 According to the present invention, cells expressing a specific antigen on the surface can be easily and quickly identified from a group of cells with a higher capture rate than the method disclosed in Non-Patent Document 7. It is.
本発明の実施に形態について、適宜図面を参照しながら説明する。本発明は、以下の記載に限定されない。 Embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings as appropriate. The present invention is not limited to the following description.
＜マイクロ流路型デバイスの構造＞
図１は、本発明で使用されるマイクロ流路型デバイスの構造を説明する上面図を示す。図２は、図１のＸ−Ｘ断面図である。図１では、最上部に設置される導電性基板は省略されている。マイクロ流路型デバイス１は、ガラス基板２、電極ａ（符号３）及び電極ｂ（符号４）から構成される交互くし型マイクロバンドアレイ電極をベースとしている。電極ａは、バンド電極ａ１〜ａ４を有し、電極ｂは、バンド電極ｂ１〜ｂ４を有している。電極ａ及び電極ｂの有するバンド電極の数は、４つに限定されない。電極ａの接続部３ｃ及び電極ｂの接続部４ｃには、リード線７ａ及びリード線７ｂがそれぞれ接続されている。リード線７ａ及びリード線７ｂは、それぞれ、交流電源発生装置に独立して接続されている。交互くし型マイクロバンドアレイ電極としては、電極間ギャップが細胞サイズ以上である市販の交互くし型マイクロバンドアレイ電極を使用し得る。
<Structure of microchannel device>
FIG. 1 is a top view illustrating the structure of a microchannel device used in the present invention. FIG. 2 is a sectional view taken along line XX in FIG. In FIG. 1, the conductive substrate installed at the top is omitted. The microchannel device 1 is based on an alternating microband array electrode composed of a glass substrate 2, an electrode a (reference numeral 3) and an electrode b (reference numeral 4). The electrode a has band electrodes a1 to a4, and the electrode b has band electrodes b1 to b4. The number of band electrodes included in the electrode a and the electrode b is not limited to four. A lead wire 7a and a lead wire 7b are connected to the connection portion 3c of the electrode a and the connection portion 4c of the electrode b, respectively. The lead wire 7a and the lead wire 7b are each independently connected to an AC power supply generator. As the alternating type microband array electrode, a commercially available alternating type microband array electrode in which the gap between the electrodes is equal to or larger than the cell size can be used.
交互くし型マイクロバンドアレイ電極の上には、バンド電極ａ１〜ａ４及びバンド電極ｂ１〜ｂ４が交差している部分が開口するように、絶縁性薄膜５が設けられている。図１では、絶縁性薄膜５は枠状となっているが、電極ａのリード部３ｄ及び電極ｂのリード部４ｄを覆っていれば足りる。絶縁性薄膜５の上部には、スペーサー６ａ及びスペーサー６ｂが設けられている。そして、スペーサー６ａ及びスペーサー６ｂの上部には、図２に示されるように、導電性基板８が設けられている。導電性基板８は、導電性薄膜８ａ及びガラス基板８ｂから構成されており、導電性薄膜８ａが下向きとなるように配置される。導電性薄膜は、ITOであることが好ましい。導電性薄膜８ａには、リード線９が接続されており、これはアースに接続されている。 Insulating thin films 5 are provided on the alternating microband array electrodes so that the portions where the band electrodes a1 to a4 and the band electrodes b1 to b4 intersect with each other are opened. In FIG. 1, the insulating thin film 5 has a frame shape, but it is sufficient to cover the lead portion 3d of the electrode a and the lead portion 4d of the electrode b. A spacer 6 a and a spacer 6 b are provided on the insulating thin film 5. As shown in FIG. 2, a conductive substrate 8 is provided above the spacers 6a and 6b. The conductive substrate 8 includes a conductive thin film 8a and a glass substrate 8b, and is disposed so that the conductive thin film 8a faces downward. The conductive thin film is preferably ITO. A lead wire 9 is connected to the conductive thin film 8a, which is connected to the ground.
＜交互くし型マイクロバンドアレイ電極の作製例＞
図３は、交互くし型マイクロバンドアレイ電極の作製方法を説明する概念図である。まず、ITO薄膜（厚さ250nm、規格抵抗値7Ω/sq）が形成されたガラス基板（ITO基板）を、ガラスカッターを用いて切り出した（寸法：20mm×30mm）。切り出された基板を、アセトン、次いでイソパノール中で、それぞれ10分間超音波洗浄し、窒素ブロアを用いて乾燥させた（図３(A)）。
<Production example of alternating comb-type microband array electrode>
FIG. 3 is a conceptual diagram illustrating a method for producing an alternating comb-type microband array electrode. First, a glass substrate (ITO substrate) on which an ITO thin film (thickness 250 nm, standard resistance value 7Ω / sq) was formed was cut out using a glass cutter (dimensions: 20 mm × 30 mm). The cut out substrate was ultrasonically cleaned for 10 minutes in acetone and then in isopropanol, respectively, and dried using a nitrogen blower (FIG. 3 (A)).
ITO基板のITO薄膜上に、ポジ型のフォトレジスト（Shipley社、S1818）をスピンコート（3000rpm、30秒）した（図３(B)）。その後、ITO基板をホットプレート上で焼成（60℃で1分間、その後95℃で10分間）した後、室温で穏やかに除熱した。 A positive photoresist (Shipley, S1818) was spin-coated (3000 rpm, 30 seconds) on the ITO thin film of the ITO substrate (FIG. 3B). Thereafter, the ITO substrate was baked on a hot plate (at 60 ° C. for 1 minute and then at 95 ° C. for 10 minutes), and then gently removed at room temperature.
電極パターンを有するフォトマスクを通して、Hgランプ（6mW/cm2以上、30秒間）を照射した（図３(C)）。基板をディベロッパ（Shipley社、Microposit（登録商標)MF CD-26）に30秒程度浸漬するとともにピペッティングし、電極パターンの現像（ディベロップ）を行った（図３(D)）。イオン交換水で基板をすすぎ、自然乾燥させた。その後、さらに焼成（120℃、60分）した。 An Hg lamp (6 mW / cm 2 or more, 30 seconds) was irradiated through a photomask having an electrode pattern (FIG. 3C). The substrate was dipped in a developer (Shipley, Microposit (registered trademark) MF CD-26) for about 30 seconds and pipetted to develop (develop) the electrode pattern (FIG. 3D). The substrate was rinsed with ion exchange water and allowed to dry naturally. Thereafter, it was further baked (120 ° C., 60 minutes).
フォトレジストで被覆されていない部分のITO薄膜を、ケミカルエッチングにより除去した。具体的には、透明導電薄膜用エッチング液（関東化学株式会社、混酸ITO-02）にITO基板を浸漬し、5〜30分超音波処理することによって、ケミカルエッチングを行った（図３(E)）。基板をイオン交換水ですすぎ、自然乾燥させた。その後、基板をアセトン及びイソパノール中でそれぞれ5分間超音波処理することによって、レジストを基板上から除去した（図３(F)）。その後、窒素ブロアを用いて基板を乾燥させた。 The portion of the ITO thin film not covered with the photoresist was removed by chemical etching. Specifically, chemical etching was performed by immersing the ITO substrate in an etching solution for transparent conductive thin film (Kanto Chemical Co., Ltd., mixed acid ITO-02) and ultrasonicating for 5 to 30 minutes (FIG. 3 (E )). The substrate was rinsed with ion exchange water and allowed to dry naturally. Then, the resist was removed from the substrate by sonicating the substrate in acetone and isopropanol for 5 minutes each (FIG. 3 (F)). Thereafter, the substrate was dried using a nitrogen blower.
溶液と電極の不必要な接触は、予期せぬ対流現象や電気化学現象を生む可能性がある。このため、露出させる必要の無い導電部分を、ネガ型のフォトレジストによって被覆し、絶縁処理を行った。基板にネガ型のフォトレジスト（化薬マイクロケム株式会社、SU-8 3005）をスピンコート（3000rpm、50秒）した（図３(G)）。その後、焼成（65℃で1分間、その後95℃で3分間）を行い、室温で穏やかに除熱した。 Unnecessary contact between the solution and the electrode can cause unexpected convection and electrochemical phenomena. For this reason, the conductive part which does not need to be exposed was covered with a negative photoresist, and insulation treatment was performed. A negative photoresist (Kayaku Microchem Corporation, SU-8 3005) was spin-coated (3000 rpm, 50 seconds) on the substrate (FIG. 3 (G)). Thereafter, firing was performed at 65 ° C. for 1 minute, and then at 95 ° C. for 3 minutes, and the heat was gently removed at room temperature.
次に、フォトマスクを通してHgランプ（6mW/cm2以上、30秒間）を照射した（図３(H)）。焼成（65℃で1分間、その後95℃で2分間）を行った後、室温で穏やかに除熱した。基板を現像液（化薬マイクロケム株式会社、SU-8 Developer）に5分間浸漬させ、現像を行った（図３(I)）。基板をイソプロパノールですすぎ、自然乾燥させた後、焼成（140℃、30分間）を行った。 Next, an Hg lamp (6 mW / cm 2 or more, 30 seconds) was irradiated through a photomask (FIG. 3 (H)). After firing (65 ° C. for 1 minute, then 95 ° C. for 2 minutes), heat was gently removed at room temperature. The substrate was immersed in a developer (Kayaku Microchem Corp., SU-8 Developer) for 5 minutes for development (FIG. 3 (I)). The substrate was rinsed with isopropanol, allowed to dry naturally, and then fired (140 ° C., 30 minutes).
電極部分の接続部（図１の３ｃ及び４ｃ）にカーボンペーストを介して銅線（図１の７ａ及び７ｂ）を接続し、140℃で30分間焼成した。最後に、接続部をアラルダイドで被覆し、室温で除熱した。 Copper wires (7a and 7b in FIG. 1) were connected to the electrode connection portions (3c and 4c in FIG. 1) via carbon paste and baked at 140 ° C. for 30 minutes. Finally, the connection part was covered with araldide and heat was removed at room temperature.
図４は、作製された交互くし型マイクロバンドアレイ電極（ITO-IDA電極）のうち、バンド電極部周辺の光学顕微鏡写真を示す。バンド電極幅は12μm、電極間ギャップ（バンド電極間の距離）は50μm、バンド電極長は2mm、バンド電極数は片側の電極（電極ａ又は電極ｂ）について5本である。 FIG. 4 shows an optical micrograph around the band electrode portion of the produced alternating comb microband array electrode (ITO-IDA electrode). The band electrode width is 12 μm, the interelectrode gap (distance between band electrodes) is 50 μm, the band electrode length is 2 mm, and the number of band electrodes is five for one electrode (electrode a or electrode b).
＜マイクロ流路型デバイスの作製例＞
作製された交互くし型マイクロバンドアレイ電極は、図１示されるように、絶縁性薄膜５が上部に設けられている。この絶縁性薄膜５の上に、2枚のスペーサー（材質：ポリエステルフィルム、寸法：8mm×3mm、厚さ35μm、日東電工株式会社、型番5603）を、図１に示される位置へと貼り付けた。さらに、2枚のスペーサーの上に、リード線を接続したITO電極基板（導電性基板である対向ITO電極基板、寸法10mm×25mm、三容真空工業株式会社、硝子上ITO膜）を重ねた。交互くし型マイクロバンドアレイ電極のガラス基板と、ITO電極基板との隙間は、試料液を供給した際に、試料液が交互くし型マイクロバンドアレイ電極のガラス基板とITO電極基板との両方に接触した状態となるように調整されなければならない。
<Production example of microchannel device>
As shown in FIG. 1, the fabricated alternating micro-band array electrode has an insulating thin film 5 provided on the upper part. Two spacers (material: polyester film, dimensions: 8 mm × 3 mm, thickness 35 μm, Nitto Denko Corporation, model number 5603) were pasted on the insulating thin film 5 at the position shown in FIG. . Furthermore, an ITO electrode substrate (an opposing ITO electrode substrate, which is a conductive substrate, dimensions 10 mm × 25 mm, Sanyo Vacuum Industries, Ltd., ITO glass on glass) connected with lead wires was overlaid on the two spacers. The gap between the glass substrate of the alternating micro-band array electrode and the ITO electrode substrate is such that when the sample solution is supplied, the sample solution contacts both the glass substrate and the ITO electrode substrate of the alternating micro-band array electrode. Must be adjusted so that
＜試料液（細胞懸濁液）の調製／工程Ａ＞
250mM スクロース水溶液と9.57mM PBS（Phosphate Buffered Saline）を混合し、誘電泳動用培地（DEP培地）を調製した。このDEP培地の誘電率は、400mS/mである。HL60細胞をこのDEP培地に懸濁させ（3.0×107cells/mL）、試料液とした。DEP培地の誘電率は、スクロース水溶液とPBSとの混合割合を変えることによって、調整可能である。なお、細胞表面抗原と抗体との反応結合性の理由から、DEP培地の誘電率は、200mS/m以上500mS/m以下とすることが好ましく、400mS/m以上500mS/m以下とすることがより好ましい。
<Preparation of sample solution (cell suspension) / Step A>
A 250 mM sucrose aqueous solution and 9.57 mM PBS (Phosphate Buffered Saline) were mixed to prepare a medium for dielectrophoresis (DEP medium). The dielectric constant of this DEP medium is 400 mS / m. HL60 cells were suspended in this DEP medium (3.0 × 10 7 cells / mL) to prepare a sample solution. The dielectric constant of the DEP medium can be adjusted by changing the mixing ratio of the sucrose aqueous solution and PBS. Note that the dielectric constant of the DEP medium is preferably 200 mS / m or more and 500 mS / m or less, more preferably 400 mS / m or more and 500 mS / m or less, because of the reaction binding property between the cell surface antigen and the antibody. preferable.
＜試料液のマイクロ流路型デバイスへの導入／工程Ｂ＞
試料液3μLをマイクロピペットに採取した。マイクロピペットの先端部を、図２に示されるバンド電極ａ１〜ｂ３と導電性基板８との間の隙間に差し込み、マイクロ流路型デバイスのバンド電極上へと試料液を供給した。試料液は、交互くし型マイクロバンドアレイ電極のガラス基板とITO電極基板との隙間に、両者に接触した状態で保持された。なお、導電性薄膜８ａを酸素プラズマアッシング処理（100W、1分間）して親水化することにより、デバイス内への細胞懸濁液の導入が容易となる。
<Introduction of sample liquid into microchannel device / process B>
3 μL of sample solution was collected in a micropipette. The tip of the micropipette was inserted into the gap between the band electrodes a1 to b3 and the conductive substrate 8 shown in FIG. 2, and the sample solution was supplied onto the band electrode of the microchannel device. The sample solution was held in the gap between the glass substrate of the alternating micro-band array electrode and the ITO electrode substrate in contact with both. In addition, introduction of the cell suspension into the device is facilitated by hydrophilizing the conductive thin film 8a by oxygen plasma ashing (100 W, 1 minute).
（負の誘電泳動のみによる細胞の移動及び集積）
試料液を供給されたマイクロ流路型デバイスについて、まず上下電極間（図２における電極ａ１〜ｂ３と導電性基板８との間）に周波数100kHz、振幅（印加電圧強度）20Vppの交流電圧を印加した。図５(A)は、このときの上下電極間に発生している電気力線の状態を示す。また、図５(B)は、このときのバンド電極付近の光学顕微鏡写真（マイクロ流路型デバイスを上方から撮影した写真）を示す。
(Cell migration and accumulation by negative dielectrophoresis only)
For the microchannel device supplied with the sample solution, first, an AC voltage with a frequency of 100 kHz and an amplitude (applied voltage strength) of 20 Vpp is applied between the upper and lower electrodes (between the electrodes a1 to b3 and the conductive substrate 8 in FIG. 2). did. FIG. 5A shows the state of the lines of electric force generated between the upper and lower electrodes at this time. FIG. 5B shows an optical microscope photograph (a photograph of the microchannel device taken from above) near the band electrode at this time.
交流電圧印加前は、HL60細胞は、上下電極間に保持されている試料液中に分散している。図５(A)に示されるように、すべてのバンド電極と導電性基板との間に、交流電圧を印加した場合には、隣り合うバンド電極間電極における電気力線が「疎」となる。その結果、HL60細胞は、図５(B)に示されるように、隣り合うバンド電極間に集積された。集積は、約3秒で完了した。 Prior to application of AC voltage, HL60 cells are dispersed in the sample solution held between the upper and lower electrodes. As shown in FIG. 5A, when an AC voltage is applied between all the band electrodes and the conductive substrate, the electric lines of force in the adjacent band electrode are “sparse”. As a result, HL60 cells were accumulated between adjacent band electrodes as shown in FIG. 5 (B). Accumulation was completed in about 3 seconds.
次に、交互くし型マイクロバンドアレイ電極の片側への交流電圧の印加を停止し（印加電圧強度を0Vppに切り替え）、片側は振幅20Vppのままにして、上下電極間に交流電圧を印加した。図６(A)は、このときの上下電極間に発生している電気力線の状態を示す。また、図６(B)は、このときのバンド電極付近の光学顕微鏡写真（マイクロ流路型デバイスを上方から撮影した写真）を示す。図６(A)及び図６(B)では、ａ１及びａ２のバンド電極に印加されている交流電圧は20Vpp、ｂ１及びｂ２のバンド電極に印加されている交流電圧は0Vppとなっている。 Next, the application of AC voltage to one side of the alternating microband array electrode was stopped (the applied voltage intensity was switched to 0 Vpp), and the AC voltage was applied between the upper and lower electrodes, leaving the amplitude at 20 Vpp on one side. FIG. 6A shows the state of the lines of electric force generated between the upper and lower electrodes at this time. FIG. 6B shows an optical microscope photograph (a photograph of the microchannel device taken from above) near the band electrode at this time. 6A and 6B, the AC voltage applied to the band electrodes a1 and a2 is 20 Vpp, and the AC voltage applied to the band electrodes b1 and b2 is 0 Vpp.
図６(A)に示されるように、一つおきとなる半数のバンド電極（図６(A)及び図６(B)では、電極ｂのバンド電極）と導電性基板との間の交流電圧の印加を停止した場合には、隣り合うバンド電極間電極に電気力線が発生し、交流電圧の印加を停止したバンド電極上方の電気力線が「疎」となる。その結果、HL60細胞は、図６(B)に示されるように、交流電圧の印加を停止したバンド電極上方に移動及び集積させられた。HL60細胞の移動及び集積は、約20秒で完了した。 As shown in FIG. 6 (A), an alternating voltage between half the other band electrodes (the band electrode of electrode b in FIGS. 6 (A) and 6 (B)) and the conductive substrate. When the application of is stopped, electric lines of force are generated in the adjacent inter-band electrode, and the electric lines of force above the band electrode where the application of the alternating voltage is stopped become “sparse”. As a result, as shown in FIG. 6 (B), HL60 cells were moved and accumulated above the band electrode where the application of the AC voltage was stopped. Migration and accumulation of HL60 cells was completed in about 20 seconds.
図７(A)は、図５(A)に示される状態における電場強度解析結果を示す。ここでいう電場強度は、バンド電極ａ１〜ｂ３に+10Vの電圧が印加された瞬間の電場強度を示している。電場強度の分布は、有限要素解析ソフト（COMSOL Multiphysics TM 3.2）を用いて計算した。隣り合う電極間の中央が最も電場強度の弱い領域となり、DEP培地が作用したHL60細胞は、この領域に集積すると考えられる。図７(A)に示される解析結果は、図５(B)に示される実験結果と一致していた。 FIG. 7A shows the electric field strength analysis result in the state shown in FIG. The electric field strength here indicates the electric field strength at the moment when a voltage of +10 V is applied to the band electrodes a1 to b3. The electric field strength distribution was calculated using finite element analysis software (COMSOL Multiphysics TM 3.2). The center between adjacent electrodes is the region with the weakest electric field strength, and the HL60 cells on which the DEP medium has acted are thought to accumulate in this region. The analysis result shown in FIG. 7 (A) was consistent with the experimental result shown in FIG. 5 (B).
図７(B)は、図６(A)に示される状態における電場強度解析結果を示す。電極ｂ１及びｂ２の上方が最も電場強度の弱い領域となり、DEP培地が作用したHL60細胞は、この領域に集積すると考えられる。図７(B)に示される解析結果は、図６(B)に示される実験結果と一致していた。 FIG. 7 (B) shows the electric field strength analysis result in the state shown in FIG. 6 (A). The region above the electrodes b1 and b2 has the weakest electric field strength, and the HL60 cells on which the DEP medium has acted are considered to accumulate in this region. The analysis result shown in FIG. 7 (B) was consistent with the experimental result shown in FIG. 6 (B).
ここで、細胞表面に発現している特定抗原に対する抗体をバンド電極間に固定化することにより、特定抗原を発現している細胞と、特定抗原を発現していない細胞とを分離及び識別することが可能となる。図８は、本発明の細胞識別方法において、細胞を分離及び識別する原理を説明する概念図を示す。 Here, by immobilizing an antibody against the specific antigen expressed on the cell surface between the band electrodes, the cell expressing the specific antigen is separated from the cell not expressing the specific antigen. Is possible. FIG. 8 is a conceptual diagram illustrating the principle of separating and identifying cells in the cell identification method of the present invention.
図８(A)は、図５(A)及び図５(B)に示される状態において、CD33抗原を表面に発現している細胞（左側の細胞）が、バンド電極間に固定された抗CD33抗体によって捕捉される様子を説明する概念図である。交流電圧印加前、細胞は、上下電極間に保持されている試料液中に分散しているため、バンド電極間に固定された抗CD33抗体との結合はほとんど起こらない。図５(A)及び図５(B)に示される状態では、細胞は、隣り合うバンド電極間に集積されるため、CD33抗原を表面に発現している細胞は、バンド電極間に固定された抗CD33抗体によって捕捉される。CD33抗原を表面に発現していない細胞（右側の細胞）は、バンド電極間に固定された抗CD33抗体によって捕捉されない。 FIG. 8A shows an anti-CD33 in which cells expressing the CD33 antigen on the surface (left cell) are fixed between the band electrodes in the state shown in FIG. 5A and FIG. 5B. It is a conceptual diagram explaining a mode that it captures with an antibody. Prior to application of the AC voltage, the cells are dispersed in the sample solution held between the upper and lower electrodes, and therefore, the binding with the anti-CD33 antibody immobilized between the band electrodes hardly occurs. In the state shown in FIG. 5 (A) and FIG. 5 (B), since the cells are accumulated between adjacent band electrodes, the cells expressing CD33 antigen on the surface were fixed between the band electrodes. Captured by anti-CD33 antibody. Cells that do not express CD33 antigen on the surface (right cells) are not captured by the anti-CD33 antibody immobilized between the band electrodes.
次に、図６(A)及び図６(B)に示される状態にすると、左側の細胞は、抗CD33抗体によって捕捉されているために移動されず、右側の細胞だけがバンド電極ｂ１上方に移動及び集積される。その結果、CD33抗原を表面に発現している細胞と、CD33抗原を表面に発現していない細胞とが分離される。その後、図8(A)に示された隣り合うバンド電極間に存在する細胞の位置と、図8(B)に示された交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極（電極ｂのバンド電極）上に存在する細胞の位置を観察し、その存在比率を求めることにより、細胞捕捉率を算出する。この細胞捕捉率によって、細胞集団の中における表面抗原を発現した細胞の割合を判断することが可能となる。 Next, in the state shown in FIG. 6 (A) and FIG. 6 (B), the left cell is not moved because it is captured by the anti-CD33 antibody, and only the right cell is above the band electrode b1. Moved and integrated. As a result, cells expressing the CD33 antigen on the surface and cells not expressing the CD33 antigen on the surface are separated. Then, the position of the cell existing between adjacent band electrodes shown in FIG. 8 (A), and the band electrode of the alternating micro-band array electrode shown in FIG. 8 (B) (band electrode of electrode b) The cell capture rate is calculated by observing the position of cells present on the surface and determining the abundance ratio. This cell capture rate makes it possible to determine the proportion of cells that have expressed surface antigens in the cell population.
ここで、細胞捕捉率とは、図８(A)の段階で隣り合うバンド電極間に存在する細胞の数に対する、図８(B)の段階で隣り合うバンド電極間に存在する細胞の割合を意味する。 Here, the cell capture rate is the ratio of cells existing between adjacent band electrodes in the step of FIG. 8 (B) to the number of cells existing between adjacent band electrodes in the step of FIG. 8 (A). means.
本発明の細胞識別方法では、細胞の集積及び異なる位置への移動及び集積に負の誘電泳動のみを利用している。電場に曝されることにより、細胞に何らかの影響が生じている可能性があるが、細胞への影響を考慮すると、低電場領域に細胞が集積する負の誘電泳動のみを用いる本発明の細胞識別方法は、正の誘電泳動と負の誘電泳動とを利用する非特許文献１に開示されている細胞識別方法よりも、細胞への影響が少ないといえる。また、細胞自身にとっても、より生体内の環境に近い高導電率（高塩強度）下におかれるほうが良いため、この意味においても、本発明の細胞識別方法は、正の誘電泳動と負の誘電泳動とを利用する非特許文献１に開示されている細胞識別方法よりも優れているといえる。 In the cell identification method of the present invention, only negative dielectrophoresis is used for cell accumulation, movement to different positions, and accumulation. Although there is a possibility that some influence is caused to the cell by exposure to the electric field, in consideration of the influence on the cell, the cell identification of the present invention using only the negative dielectrophoresis in which the cells are accumulated in the low electric field region. It can be said that the method has less influence on the cell than the cell identification method disclosed in Non-Patent Document 1 using positive dielectrophoresis and negative dielectrophoresis. Moreover, since it is better for the cell itself to be placed under a high conductivity (high salt strength) that is closer to the environment in the living body, the cell identification method of the present invention also has positive dielectrophoresis and negative polarity in this sense. It can be said that it is superior to the cell identification method disclosed in Non-Patent Document 1 using dielectrophoresis.
［実施例１］
上述したマイクロ流路型デバイスについて、交互くし型マイクロバンドアレイ電極間の表面に抗CD33抗体を固定した。交互くし型マイクロバンドアレイ電極を、エポキシシランの一種である3-(glycidoxypropyl)trimethoxysilaneのエタノール溶液（2質量％）に浸漬し、1時間、室温で静置して、アミノ基と容易に反応するエポキシ基を交互くし型マイクロバンドアレイ電極の表面に導入した。電極基板をエタノールで洗浄した後、交互くし型マイクロバンドアレイ電極を抗CD33抗体の50mM炭酸バッファー（抗体濃度0.1 mg/mL、pH9.6）に浸漬し、16時間、4℃で静置し、交互くし型マイクロバンドアレイ電極表面に抗CD33抗体を固定化した。PBSで洗浄後、細胞の非特異吸着を抑制するために牛血清アルブミン（BSA）を含有する炭酸バッファー（BSA濃度10mg/mL）に交互くし型マイクロバンドアレイ電極を浸漬し、24時間、4℃で静置し、未反応のエポキシ基をブロッキングした。最後にリン酸緩衝液（PBS、pH7.4）で洗浄し、使用するまで交互くし型マイクロバンドアレイ電極をPBSに浸漬し、4℃で保存した。
[Example 1]
For the microchannel device described above, an anti-CD33 antibody was immobilized on the surface between the alternating microband array electrodes. Alternating comb-type microband array electrodes are immersed in an ethanol solution (2-mass%) of 3- (glycidoxypropyl) trimethoxysilane, which is a kind of epoxy silane, and left at room temperature for 1 hour to easily react with amino groups. Epoxy groups were introduced on the surface of alternating microband array electrodes. After washing the electrode substrate with ethanol, the alternating microband array electrode was immersed in an anti-CD33 antibody 50 mM carbonate buffer (antibody concentration 0.1 mg / mL, pH 9.6) and allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. Anti-CD33 antibody was immobilized on the surface of the alternating comb-type microband array electrode. After washing with PBS, in order to suppress nonspecific adsorption of cells, soaked alternating microband array electrodes in carbonate buffer (BSA concentration 10 mg / mL) containing bovine serum albumin (BSA) for 24 hours at 4 ° C To block unreacted epoxy groups. Finally, it was washed with a phosphate buffer (PBS, pH 7.4), and the alternating microband array electrode was immersed in PBS until use and stored at 4 ° C.
抗CD33抗体を固定化したマイクロ流路型デバイスを用いて、上記と同様にして工程Ａ及び工程Ｂを行った。 Step A and Step B were performed in the same manner as described above, using a microchannel device to which an anti-CD33 antibody was immobilized.
＜交流電圧の一定な印加／工程Ｃ＞
まず、マイクロ流路型デバイスを透過型光学顕微鏡にセットし、200倍の倍率でバンド電極部付近を観察した。その後、上下電極間に100kHz、20Vppの交流電圧を印加した。すなわち、図５(A)に示されるように、すべてのバンド電極とITO電極基板との間に、100kHz、20Vppの交流電圧を印加した。すると、負の誘電泳動が作用し、図９(A)に示されるように、電極間の中央付近にHL60細胞が集積した。この集積は5秒以内に完了したが、1分間この電圧印加を続けた。このとき、HL60細胞表面上のCD33抗原と、電極基板表面に固定化されている抗CD33抗体との免疫反応により、CD33発現細胞は、電極間ギャップの中央付近に固定化されたと考えられる。
<Constant application of AC voltage / Process C>
First, the microchannel device was set on a transmission optical microscope, and the vicinity of the band electrode portion was observed at a magnification of 200 times. Thereafter, an alternating voltage of 100 kHz and 20 Vpp was applied between the upper and lower electrodes. That is, as shown in FIG. 5A, an alternating voltage of 100 kHz and 20 Vpp was applied between all the band electrodes and the ITO electrode substrate. Then, negative dielectrophoresis acted, and as shown in FIG. 9 (A), HL60 cells were accumulated near the center between the electrodes. This integration was completed within 5 seconds, but this voltage application was continued for 1 minute. At this time, it is considered that the CD33-expressing cells were immobilized in the vicinity of the center of the interelectrode gap by the immune reaction between the CD33 antigen on the HL60 cell surface and the anti-CD33 antibody immobilized on the electrode substrate surface.
＜バンド電極付近の観察／工程Ｅ０＞
電極間ギャップに集積した細胞数を計測した。
<Observation around band electrode / process E0>
The number of cells accumulated in the gap between the electrodes was counted.
＜一部電極への印加の停止／工程Ｄ＞
次に、抗CD33抗体に捕捉されていない細胞を電極間ギャップから除去するために、図６(A)に示されるように、片側の電極（電極ｂ）への交流電圧の印加を停止し、残りの電極（電極ａ）への交流電圧の印加は、振幅（印加電圧強度）20Vppのまま維持した。すると、図９(B)に示されるように、一部の細胞は、速やかに電極ｂ（図９(B)ではｂ１及びｂ２）の上方に移動及び集積し、その他の細胞は電極間の中央付近に保持されたままであった。振幅（印加電圧強度）を切り替えてから20秒程度で細胞の移動及び集積は完了し、それ以上の挙動は示されなかった。
<Stopping application to some electrodes / Process D>
Next, in order to remove cells not captured by the anti-CD33 antibody from the gap between the electrodes, as shown in FIG. 6 (A), the application of the alternating voltage to one electrode (electrode b) is stopped, The application of the AC voltage to the remaining electrode (electrode a) was maintained at an amplitude (applied voltage intensity) of 20 Vpp. Then, as shown in FIG. 9 (B), some cells quickly move and accumulate above the electrode b (b1 and b2 in FIG. 9 (B)), and other cells are in the center between the electrodes. It remained held nearby. Cell movement and accumulation were completed in about 20 seconds after switching the amplitude (applied voltage intensity), and no further behavior was shown.
一方、抗CD33抗体の代わりに、抗マウスIgG抗体を同様の方法によって固定化したマイクロ流路型デバイスを作製し、工程Ａ〜工程Ｄを行ったところ、図９(C)に示されるように、ほとんどの細胞が電極ｂ（図９(C)ではｂ１及びｂ２）上に集積された。このように、表面にCD33抗体を発現していない細胞はバンド電極間に保持されないため、表面にCD33抗体を発現している細胞とは、明らかに挙動が異なることが確認された。 On the other hand, instead of anti-CD33 antibody, a microchannel device in which anti-mouse IgG antibody was immobilized by the same method was prepared, and Step A to Step D were performed. As shown in FIG. Most of the cells were accumulated on the electrode b (b1 and b2 in FIG. 9C). Thus, since cells that do not express CD33 antibody on the surface are not retained between the band electrodes, it was confirmed that the behavior is clearly different from cells that express CD33 antibody on the surface.
＜細胞捕捉率の算出／工程Ｅ＞
工程Ｄ終了後、電極間ギャップに残っている細胞数を計測し、細胞捕捉率（％）を算出した。実施例１の細胞捕捉率は、68.3±3.2％であったのに対し、抗マウスIgG抗体を固定化した場合の細胞捕捉率は、4.2±1.4％であった。これらの結果から、本発明の細胞識別方法は、迅速かつ高い捕捉効率を持つ表面抗原発現細胞の検出方法であることが確認された。
<Calculation of cell capture rate / Step E>
After the completion of Step D, the number of cells remaining in the gap between the electrodes was measured, and the cell capture rate (%) was calculated. The cell capture rate of Example 1 was 68.3 ± 3.2%, whereas the cell capture rate when the anti-mouse IgG antibody was immobilized was 4.2 ± 1.4%. From these results, it was confirmed that the cell identification method of the present invention was a method for detecting surface antigen-expressing cells with rapid and high capture efficiency.
（工程Ｃ及び工程Ｄにおける印加電圧強度）
図１０(A)は、工程Ｃにおける印加電圧強度と細胞捕捉率の関係をプロットしたグラフを示す。工程Ｄは、実施例１と同じ条件とした。電圧強度の増加に伴って細胞捕捉率が増加し、電圧強度15Vpp以上であれば、細胞捕捉率が50％以上となることが確認された。印加電圧強度20〜25Vppにかけては、抗CD33抗体と抗マウスIgG抗体を用いた場合で、ほぼ同様に細胞捕捉率が増加した。これは、非特異吸着のみが増加していることを示している。このことから、細胞集積のための振幅（印加電圧強度）は15〜25Vppとすることが好ましいと考えられた。工程Ｄにおける振幅を変化させて実験を繰り返した結果、細胞集積のための振幅は、18〜22Vppとすることがより好ましいと考えられた。
(Applied voltage intensity in step C and step D)
FIG. 10A shows a graph in which the relationship between the applied voltage intensity and the cell capture rate in step C is plotted. Step D was performed under the same conditions as in Example 1. As the voltage intensity increased, the cell capture rate increased. When the voltage intensity was 15 Vpp or higher, the cell capture rate was confirmed to be 50% or higher. In the case of using an anti-CD33 antibody and an anti-mouse IgG antibody over the applied voltage strength of 20 to 25 Vpp, the cell capture rate increased almost similarly. This indicates that only non-specific adsorption is increasing. From this, it was considered that the amplitude (applied voltage intensity) for cell accumulation is preferably 15 to 25 Vpp. As a result of repeating the experiment while changing the amplitude in Step D, it was considered that the amplitude for cell accumulation was more preferably 18 to 22 Vpp.
図１０(B)は、抗マウスIgG抗体を固定化したマイクロ流路型デバイスを用い、実施例１と同様にしてHL60細胞を集積した後、電極ａのバンド電極へ印加する交流電圧の振幅（印加電圧強度）を15Vppとし、電極ｂのバンド電極への交流電圧印加を停止することにより、非捕捉細胞の除去（工程Ｄに相当する工程）を行った際の、バンド電極付近の光学顕微鏡写真を示す。非捕捉細胞がバンド電極ｂ１及びｂ２の周辺に、幅の広いラインパターンを形成しているために、電極間ギャップの中央付近に捕捉されている細胞と、電極上に存在する細胞とを識別しがたい。これは、印加電圧強度が小さく、誘電泳動力が小さいためである。 FIG. 10 (B) shows the amplitude of the alternating voltage applied to the band electrode of electrode a after collecting HL60 cells in the same manner as in Example 1 using a microfluidic device on which an anti-mouse IgG antibody is immobilized (FIG. 10B). An optical micrograph of the vicinity of the band electrode when removing non-captured cells (step corresponding to step D) by stopping the application of AC voltage to the band electrode of electrode b by setting the applied voltage intensity to 15 Vpp. Indicates. Since the non-captured cells form a wide line pattern around the band electrodes b1 and b2, the cells captured near the center of the gap between the electrodes are distinguished from the cells existing on the electrodes. It ’s hard. This is because the applied voltage strength is small and the dielectrophoretic force is small.
一方、電極ａのバンド電極へ印加する交流電圧の振幅（印加電圧強度）を20Vppとした場合には、捕捉細胞と非捕捉細胞とは、空間的に分離された。また、細胞の非特異的吸着量を表わす抗マウスIgG抗体を用いた際の細胞捕捉率は、4.2％とわずかな値であった。以上のことから、非捕捉細胞除去のために印加電圧強度25Vppよりも上昇させたとしても、抗CD33抗体を用いた際の特異的捕捉率が大きく下がり、もともと微小な非特異的吸着量は少し減少するのみであると推測される。 On the other hand, when the amplitude (applied voltage intensity) of the AC voltage applied to the band electrode of the electrode a was 20 Vpp, the captured cells and the non-captured cells were spatially separated. In addition, the cell capture rate when using an anti-mouse IgG antibody representing the non-specific adsorption amount of cells was a very small value of 4.2%. Based on the above, even when the applied voltage intensity was increased above 25 Vpp for removal of non-captured cells, the specific capture rate when using anti-CD33 antibody decreased greatly, and the amount of non-specific adsorption that was originally very small Presumed to only decrease.
［実施例２］
＜工程Ａ＞
HL60細胞を1μg/mLの5(and6)-carboxyfluoresceindiacetate, succinimidyl ester （CFSE）で染色した。CFSEは、細胞内部を緑色に染める細胞遊走追跡用の蛍光試薬である。その後、HL60細胞を10μg/mLの抗CD33抗体で処理し（20分間、37℃）、CD33抗原が抗体によりブロックされたHL60細胞（緑色の蛍光を発する）を作製した。この蛍光標識HL60細胞は、CD33抗原が抗CD33抗体によって既に占有されているため、バンド電極間の基板に固定された抗CD33抗体には捕捉されないと考えられる。この蛍光標識HL60細胞（CD33陰性細胞）と、通常のHL60細胞（CD33陽性細胞）とを混合し、8種類の試料液を作製した。試料液の調製方法は、実施例１と同様とした。
[Example 2]
<Process A>
HL60 cells were stained with 1 μg / mL of 5 (and6) -carboxyfluoresceindiacetate, succinimidyl ester (CFSE). CFSE is a fluorescent reagent for tracking cell migration that stains the inside of cells in green. Thereafter, HL60 cells were treated with 10 μg / mL anti-CD33 antibody (20 minutes, 37 ° C.) to produce HL60 cells (green fluorescence emitted) in which the CD33 antigen was blocked by the antibody. In this fluorescently labeled HL60 cell, since the CD33 antigen is already occupied by the anti-CD33 antibody, it is considered that the anti-CD33 antibody immobilized on the substrate between the band electrodes is not captured. This fluorescently labeled HL60 cell (CD33 negative cell) and normal HL60 cell (CD33 positive cell) were mixed to prepare 8 types of sample solutions. The method for preparing the sample solution was the same as in Example 1.
上記8種類の試料液について、実施例１と同様にして、工程Ｂ〜工程Ｅを行った。 For the eight types of sample solutions, Step B to Step E were performed in the same manner as in Example 1.
図１１(A)は、試料液の工程細胞の混合比と、細胞捕捉率との関係をプロットしたグラフを示す。図１１(A)において、横軸の混合比は、通常のHL60細胞の混合比（％）を示している。CD33陽性細胞の混合比と細胞捕捉率との間には、比例関係が認められた。図１１(B)は、混合比50％の場合のおけるバンド電極付近の蛍光顕微鏡写真を示す。緑色の蛍光を有していない通常のHL60細胞（CD33陽性細胞）は、その多くが電極間ギャップに捕捉されていた。一方、緑色の蛍光を有する蛍光標識HL60細胞（CD33陰性細胞）は、ほぼ全て電極ｂのバンド電極（図１１(B)では電極ｂ１及びｂ２）上に集積されていた。 FIG. 11A shows a graph in which the relationship between the mixing ratio of the process cells in the sample solution and the cell capture rate is plotted. In FIG. 11 (A), the mixing ratio on the horizontal axis shows the mixing ratio (%) of normal HL60 cells. A proportional relationship was observed between the mixing ratio of CD33 positive cells and the cell capture rate. FIG. 11B shows a fluorescence micrograph near the band electrode when the mixing ratio is 50%. Most of normal HL60 cells (CD33 positive cells) without green fluorescence were trapped in the gap between electrodes. On the other hand, almost all of the fluorescence-labeled HL60 cells (CD33-negative cells) having green fluorescence were accumulated on the band electrode of the electrode b (electrodes b1 and b2 in FIG. 11B).
このように、本発明の細胞識別方法は、目的とする抗原を表面に発現している細胞と、発現していない細胞が混合されている場合であっても、両者を識別することが可能であった。 As described above, the cell identification method of the present invention can discriminate between cells expressing the target antigen on the surface and cells not expressing the antigen. there were.
［実施例３］
実施例１と同一条件で、工程Ａ〜工程Ｅ０を行った。
[Example 3]
Under the same conditions as in Example 1, Step A to Step E0 were performed.
＜一部電極の印加電圧強度の周期的変動／工程Ｄ０＞
交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、片側の電極（電極ｂのバンド電極）については工程Ｃと同様に、ITO電極基板との間に、100kHz、20Vppの交流電圧を印加した。残りの半数の電極（電極ａのバンド電極）については、ITO基板との間の交流電圧の振幅（印加電圧強度）を、工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の90％と100％（18Vppと20Vpp）の間で周期的に変動させた。電極ａのバンド電極の印加電圧強度の切り替えは、1分間の工程Ｄ０のうち、5秒毎に行った。
<Periodic variation of applied voltage intensity of some electrodes / process D0>
Of the band electrodes of the alternating comb-type microband array electrode, an alternating voltage of 100 kHz and 20 Vpp was applied between the electrode electrode on one side (the band electrode of the electrode b) between the ITO electrode substrate in the same manner as in Step C. For the remaining half of the electrodes (band electrode of electrode a), the AC voltage amplitude (applied voltage intensity) between the ITO substrate is 90% and 100% of the amplitude (applied voltage intensity) of step C (18 Vpp). 20 Vpp). Switching of the applied voltage intensity of the band electrode of the electrode a was performed every 5 seconds in the process D0 for 1 minute.
工程Ｄ０の後、実施例１と同様にして、工程Ｄ及び工程Ｅを行った。その結果、実施例３の細胞捕捉率は、83.9±7.1％であった。また、抗CD33抗体の替わりに抗マウスIgG抗体を固定化した場合の細胞捕捉率は、4.3±1.3％であった。上述したように、実施例１の細胞捕捉率は、68.3±3.2％であったが、工程Ｄの前に工程Ｄ０を行うことによって、非特異的吸着量はほとんど増加せず、HL60細胞の細胞捕捉率のみ15.6％増加した。 After Step D0, Step D and Step E were performed in the same manner as in Example 1. As a result, the cell capture rate of Example 3 was 83.9 ± 7.1%. The cell capture rate when anti-mouse IgG antibody was immobilized instead of anti-CD33 antibody was 4.3 ± 1.3%. As described above, the cell capture rate of Example 1 was 68.3 ± 3.2%. However, by performing Step D0 before Step D, the non-specific adsorption amount hardly increased, and the cells of HL60 cells Only the capture rate increased by 15.6%.
（誘電泳動による細胞振とう操作を利用した細胞捕捉率の向上）
HL60細胞のCD33抗原の発現率は99.9％以上であるが、実施例１における細胞捕捉率68.3％は、発現率と比較して20％以上低い。試料液の培地を400mS/mとした場合、導電率は最大に近い免疫反応の効率を与える。つまり、培地の導電率以外の因子によって、細胞捕捉が制限されていると考えられる。その原因としては、立体障害によって、細胞表面の抗原と基板表面に固定化された抗体とが接触していない可能性が挙げられる。
(Improvement of cell capture rate using cell shaking by dielectrophoresis)
Although the expression rate of CD33 antigen in HL60 cells is 99.9% or more, the cell capture rate 68.3% in Example 1 is 20% or more lower than the expression rate. When the medium of the sample solution is 400 mS / m, the conductivity gives the efficiency of the immune reaction close to the maximum. In other words, it is considered that cell capture is limited by factors other than the conductivity of the medium. As the cause, there is a possibility that the antigen on the cell surface is not in contact with the antibody immobilized on the substrate surface due to steric hindrance.
図１２は、工程Ｄ０における電極ａのバンド電極への印加電圧の振幅の変化を示す。工程Ｃにおいては、電極ｂのバンド電極と同様に、電極ａのバンド電極へ印加される交流電圧の振幅は+10V〜-10Vである（20Vpp）。次に、Ｐ点以降は、電極ａのバンド電極へ印加される交流電圧の振幅は+9V〜-9Vである(18Vpp)。そして、Ｑ点以降は、電極ａのバンド電極へ印加される交流電圧の振幅は+10V〜-10Vである（20Vpp）。すなわち、Ｐ点以前は、工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の100％、Ｐ点からＱ点までは工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の90％、Ｑ点以降は工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の100％となっている。 FIG. 12 shows changes in the amplitude of the voltage applied to the band electrode of electrode a in step D0. In the process C, similarly to the band electrode of the electrode b, the amplitude of the AC voltage applied to the band electrode of the electrode a is +10 V to −10 V (20 Vpp). Next, after the point P, the amplitude of the AC voltage applied to the band electrode of the electrode a is +9 V to −9 V (18 Vpp). After the point Q, the amplitude of the AC voltage applied to the band electrode of the electrode a is + 10V to −10V (20Vpp). That is, before the point P, the amplitude of the process C (applied voltage intensity) is 100%, from the point P to the point Q is 90% of the amplitude of the process C (applied voltage intensity), and after the point Q, the amplitude of the process C (application) 100% of the voltage intensity).
図１３(A)は、電極ａのバンド電極（ａ１及びａ２）と電極ｂのバンド電極（ｂ１〜ｂ３）へ印加される交流電圧の振幅（印加電圧強度）を、共に20Vppとした場合の電場強度領域の分布を示す。図１３(B)は、電極ａのバンド電極へ印加される交流電圧の振幅（印加電圧強度）のみ18Vppとした場合の電場強度領域の分布を示す。図１３(C)は、電極ａのバンド電極へ印加される交流電圧の振幅（印加電圧強度）のみ15Vppとした場合の電場強度領域の分布を示す。電極ａのバンド電極に印加される交流電圧の印加電圧強度が低下するにつれて、形成される電場のパターンが変化し、最も弱い電場強度領域がバンド電極間ギャップの中央から電極ａ１及びａ２側へと少しシフトした。その後、電極ａのバンド電極と電極ｂのバンド電極へ印加される交流電圧の印加電圧強度を、共に20Vppに戻した場合、電場強度領域の分布も図１３(A)の状態に戻った。 FIG. 13A shows the electric field when the amplitude (applied voltage intensity) of the AC voltage applied to the band electrodes (a1 and a2) of the electrode a and the band electrodes (b1 to b3) of the electrode b is both 20 Vpp. The distribution of the intensity region is shown. FIG. 13B shows the distribution of the electric field strength region when only the amplitude (applied voltage strength) of the AC voltage applied to the band electrode of the electrode a is 18 Vpp. FIG. 13C shows the distribution of the electric field strength region when only the amplitude (applied voltage strength) of the AC voltage applied to the band electrode of the electrode a is 15 Vpp. As the applied voltage strength of the alternating voltage applied to the band electrode of the electrode a decreases, the pattern of the electric field formed changes, and the weakest electric field strength region moves from the center of the gap between the band electrodes to the electrodes a1 and a2 side. A little shifted. Thereafter, when the applied voltage strength of the alternating voltage applied to the band electrode of electrode a and the band electrode of electrode b is both returned to 20 Vpp, the distribution of the electric field strength region also returns to the state of FIG.
図１４(A)は、図１２(A)の電圧印加状態におけるバンド電極部付近の光学顕微鏡写真を示す。写真中央の点線は、バンド電極間ギャップの中央を示している。図１３(A)の状態では、HL60細胞はバンド電極間ギャップの中央に位置している。しかし、図１３（B）の電圧印加状態では、HL60細胞はバンド電極間ギャップの中央よりも左側に移動しており、図１３（C）の電圧印加状態では、図１４（B）よりも、HL60細胞はさらに左側に移動していた。電極ａのバンド電極の印加電圧強度を20Vppに戻すと、HL60細胞は、図１４(B)及び図１４(C)に示される位置から、図１４(A)に示される位置（バンド電極間ギャップの中央）に戻った。なお、印加電圧強度変化に伴うHL60細胞の移動は、１〜2秒程度で完了することが確認された。 FIG. 14A shows an optical micrograph in the vicinity of the band electrode portion in the voltage application state of FIG. The dotted line in the center of the photograph shows the center of the gap between the band electrodes. In the state of FIG. 13 (A), the HL60 cell is located in the center of the gap between the band electrodes. However, in the voltage application state of FIG. 13 (B), the HL60 cells move to the left side of the center of the gap between the band electrodes, and in the voltage application state of FIG. 13 (C), HL60 cells migrated further to the left. When the applied voltage intensity of the band electrode of the electrode a is returned to 20 Vpp, the HL60 cell changes from the position shown in FIGS. 14 (B) and 14 (C) to the position shown in FIG. 14 (A) (the gap between the band electrodes). Back to the middle). It was confirmed that the movement of HL60 cells accompanying changes in applied voltage intensity was completed in about 1 to 2 seconds.
誘電泳動により基板表面に集積化されている細胞は、最初に基板表面に接触したときの状態を保っており動かないと予想される。このため、細胞と基板の最初の接触時に、表面抗原と固定化された抗体とが立体的な障害により接触しなかった場合、免疫反応による細胞捕捉は進行しないと予想される。そこで、工程Ｄ０において、基板表面に集積させた細胞を誘電泳動によって振とうし、細胞表面上の抗原と基板表面に固定化された抗体との接触機会を増やすことで、細胞捕捉率が増加したと推察された。 The cells integrated on the substrate surface by dielectrophoresis maintain the state when they first contact the substrate surface and are expected not to move. For this reason, when the surface antigen and the immobilized antibody are not contacted due to steric hindrance at the first contact between the cell and the substrate, it is expected that cell capture by the immune reaction does not proceed. Therefore, in step D0, the cell trapping rate increased by shaking the cells accumulated on the substrate surface by dielectrophoresis and increasing the chance of contact between the antigen on the cell surface and the antibody immobilized on the substrate surface. It was guessed.
［比較例１］
工程Ｄ０において、電極ａのバンド電極とITO基板との間に印加される交流電圧の振幅（印加電圧強度）を、工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の75％と100％（15Vppと20Vpp）の間で周期的に変動させる以外、すべて実施例３と同様の操作を行った。その結果、HL60細胞の細胞捕捉率は、44.5±6.0％であり、実施例１及び非特許文献７の細胞識別方法の細胞捕捉率よりも低い値となった。また、抗CD33抗体の替わりに抗マウスIgG抗体を固定化した場合には、HL60細胞の細胞捕捉率は3.6±0.8％であった。
[Comparative Example 1]
In the process D0, the amplitude (applied voltage intensity) of the AC voltage applied between the band electrode of the electrode a and the ITO substrate is set to 75% and 100% (15 Vpp and 20 Vpp) of the amplitude (applied voltage intensity) of the process C. The same operation as in Example 3 was performed except that the period was periodically changed. As a result, the cell capture rate of HL60 cells was 44.5 ± 6.0%, which was lower than the cell capture rate of the cell identification method of Example 1 and Non-Patent Document 7. When the anti-mouse IgG antibody was immobilized instead of the anti-CD33 antibody, the cell capture rate of HL60 cells was 3.6 ± 0.8%.
印加電圧強度が15Vppの場合、18Vppの場合に比べて、電場強度が最も低い領域が大きくシフトし、細胞が大きく移動する。すなわち、振とう操作中、細胞により大きな誘電泳動力が作用している。そのため、一旦基板表面に固定された抗体と結合した細胞が、基板表面から剥離された可能性がある。工程Ｄ０における印加電圧強度は、工程Ｃの印加電圧強度の85％と100％の間（工程Ｃが20Vppの場合には、17Vppと20Vppの間）で周期的に変動させることが好ましく、90％と100％の間（工程Ｃが20Vppの場合には、18Vppと20Vppの間）で周期的に変動させることがより好ましいと考察された。 When the applied voltage strength is 15 Vpp, the region where the electric field strength is the lowest is greatly shifted and the cells move greatly compared to the case of 18 Vpp. That is, a large dielectrophoretic force acts on the cells during the shaking operation. Therefore, there is a possibility that the cells once bound to the antibody fixed on the substrate surface have been detached from the substrate surface. The applied voltage intensity in the process D0 is preferably periodically changed between 85% and 100% of the applied voltage intensity in the process C (when the process C is 20Vpp, between 17Vpp and 20Vpp), and 90% And 100% (when process C is 20 Vpp, it is considered more preferable to vary periodically between 18 Vpp and 20 Vpp).
本発明の細胞識別方法は、細胞識別に要する操作時間が2分間程度という短時間であり、30分以上を要する抗体アレイ法と比較し、極めて迅速であるといえる。また、操作が簡便で熟練を要さないため、再現性も非常に高い。さらに、細胞母集団中の、目的の表面抗原を発現している細胞のサブポピュレーションを知ることも可能である。 The cell identification method of the present invention has a short operation time of about 2 minutes required for cell identification, and can be said to be extremely rapid as compared with the antibody array method that requires 30 minutes or more. Moreover, since the operation is simple and does not require skill, reproducibility is very high. It is also possible to know the subpopulation of cells expressing the target surface antigen in the cell population.
本発明の細胞識別方法は、生化学、分子生物学又は臨床診断のような技術分野において有用である。 The cell identification method of the present invention is useful in technical fields such as biochemistry, molecular biology or clinical diagnosis.
１：マイクロ流路型デバイス
２：ガラス基板
３：電極ａ
ａ１〜ａ４：電極ａのバンド電極
３ｃ：電極ａの接続部
３ｄ：電極ａのリード部
４：電極ｂ
ｂ１〜ｂ４：電極ｂのバンド電極
４ｃ：電極ｂの接続部
４ｄ：電極ｂのリード部
５：枠状の絶縁性薄膜
６ａ，６ｂ：スペーサー
７ａ，７ｂ：リード線
８：導電性基板
８ａ：導電性薄膜
８ｂ：ガラス基板
９：導電性基板のリード線
1: Micro-channel type device 2: Glass substrate 3: Electrode a
a1 to a4: Band electrode of electrode a 3c: Connection portion of electrode a 3d: Lead portion of electrode a 4: Electrode b
b1 to b4: Band electrode of electrode b 4c: Connection portion of electrode b 4d: Lead portion of electrode b 5: Frame-like insulating thin film 6a, 6b: Spacer 7a, 7b: Lead wire 8: Conductive substrate 8a: Conductivity Thin film 8b: Glass substrate 9: Lead wire of conductive substrate
Claims (5)
前記マイクロ流路型デバイスは、
基板と、
基板上に配置される交互くし型マイクロバンドアレイ電極と、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極が露出するように前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極上に配置される絶縁性薄膜と、
前記絶縁性薄膜上に配置されるスペーサーと、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極に対向するように前記スペーサー上に配置される導電性基板とを備え、
前記基板表面の少なくともバンド電極間には細胞表面に発現する抗原に対する抗体が固定化されており、
前記方法は、
細胞を含有する導電率200mS/m以上500mS/m以下の試料液を調製する工程Ａと、
前記試料液を前記マイクロ流路型デバイスのバンド電極上に導入する工程Ｂと、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のすべてのバンド電極と前記導電性基板との間に50kHz以上500kHz以下の周波数と15Vpp以上25Vpp以下の振幅とを有する交流電圧を印加する工程Ｃと、
前記工程Ｃ後、交互くし型マイクロバンドアレイ電極を観察し、電極間ギャップに存在する細胞数を測定する工程Ｅ０と、
前記工程Ｅ０後、前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の印加を停止する工程Ｄと、
前記工程Ｄ後、交互くし型マイクロバンドアレイ電極を観察し、電極間ギャップに存在する細胞数を測定する工程Ｅと、
を順に有する方法。 A cell identification method using a microchannel device to identify cells expressing a specific antigen on the surface by dielectrophoresis,
The microchannel device is
A substrate,
Alternating comb microband array electrodes disposed on the substrate;
Insulating thin films disposed on the alternating microband array electrodes so that the band electrodes of the alternating microband array electrodes are exposed; and
A spacer disposed on the insulating thin film;
A conductive substrate disposed on the spacer to face the alternating comb-type microband array electrode;
An antibody against an antigen expressed on the cell surface is immobilized between at least the band electrodes on the surface of the substrate,
The method
Step A for preparing a sample solution containing cells having a conductivity of 200 mS / m to 500 mS / m;
Introducing the sample solution onto the band electrode of the microchannel device; and
Applying an AC voltage having a frequency of 50 kHz or more and 500 kHz or less and an amplitude of 15 Vpp or more and 25 Vpp or less between all the band electrodes of the alternating micro-band array electrode and the conductive substrate;
After step C, step E0 of observing alternating comb-type microband array electrodes and measuring the number of cells present in the interelectrode gap;
After the step E0, the step D of stopping the application of the alternating voltage between every other half of the band electrodes of the alternating comb microband array electrode and the conductive substrate;
After the step D, the step of observing the alternating micro-band array electrode and measuring the number of cells present in the gap between the electrodes;
In order.
The cell identification method according to claim 2, wherein an execution time of the step D0 is 1 second or more and 30 seconds or less.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012111134A JP2013238463A (en) | 2012-05-15 | 2012-05-15 | Cell identification method utilizing dielectrophoresis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012111134A JP2013238463A (en) | 2012-05-15 | 2012-05-15 | Cell identification method utilizing dielectrophoresis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013238463A true JP2013238463A (en) | 2013-11-28 |
Family
ID=49763628
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012111134A Pending JP2013238463A (en) | 2012-05-15 | 2012-05-15 | Cell identification method utilizing dielectrophoresis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2013238463A (en) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101613604B1 (en) | 2015-02-11 | 2016-04-20 | 서강대학교산학협력단 | Quantitative analysis for undifferentiated human pluripotent stem cells using cell-chip |
| GB2500216B (en) * | 2012-03-13 | 2017-07-26 | Usw Commercial Services Ltd | Method and apparatus for magnetic induction spectroscopy |
| JP2017187463A (en) * | 2016-04-05 | 2017-10-12 | シャープ株式会社 | Sensor device, detection method, and sensor unit |
| WO2017175879A1 (en) * | 2016-04-05 | 2017-10-12 | シャープ株式会社 | Sensor device, detection method, and sensor unit |
| JP2018527573A (en) * | 2015-09-07 | 2018-09-20 | マツクス−プランク−ゲゼルシヤフト ツール フエルデルング デル ヴイツセンシヤフテン エー フアウＭＡＸ−ＰＬＡＮＣＫ−ＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ ＺＵＲ ＦＯｅＲＤＥＲＵＮＧ ＤＥＲ ＷＩＳＳＥＮＳＣＨＡＦＴＥＮ Ｅ．Ｖ． | Method and apparatus for detecting particles such as biopolymers or nanoparticles |
| GB2565668A (en) * | 2016-04-08 | 2019-02-20 | Ibm | Particle manipulation and trapping in microfluidic devices using two-dimensional material |
| JP2019178985A (en) * | 2018-03-30 | 2019-10-17 | 公立大学法人兵庫県立大学 | Quantitation method of target substance using aptamer |
-
2012
- 2012-05-15 JP JP2012111134A patent/JP2013238463A/en active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2500216B (en) * | 2012-03-13 | 2017-07-26 | Usw Commercial Services Ltd | Method and apparatus for magnetic induction spectroscopy |
| KR101613604B1 (en) | 2015-02-11 | 2016-04-20 | 서강대학교산학협력단 | Quantitative analysis for undifferentiated human pluripotent stem cells using cell-chip |
| WO2016129762A1 (en) * | 2015-02-11 | 2016-08-18 | 서강대학교 산학협력단 | Cell chip-based quantitative analysis of undifferentiated human pluripotent stem cell |
| JP2018527573A (en) * | 2015-09-07 | 2018-09-20 | マツクス−プランク−ゲゼルシヤフト ツール フエルデルング デル ヴイツセンシヤフテン エー フアウＭＡＸ−ＰＬＡＮＣＫ−ＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ ＺＵＲ ＦＯｅＲＤＥＲＵＮＧ ＤＥＲ ＷＩＳＳＥＮＳＣＨＡＦＴＥＮ Ｅ．Ｖ． | Method and apparatus for detecting particles such as biopolymers or nanoparticles |
| US11397163B2 (en) | 2015-09-07 | 2022-07-26 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E. V. | Method and apparatus for detecting particles, like biological macromolecules or nanoparticles |
| JP2017187463A (en) * | 2016-04-05 | 2017-10-12 | シャープ株式会社 | Sensor device, detection method, and sensor unit |
| WO2017175879A1 (en) * | 2016-04-05 | 2017-10-12 | シャープ株式会社 | Sensor device, detection method, and sensor unit |
| GB2565668A (en) * | 2016-04-08 | 2019-02-20 | Ibm | Particle manipulation and trapping in microfluidic devices using two-dimensional material |
| US10386331B2 (en) | 2016-04-08 | 2019-08-20 | International Business Machines Corporation | Particle manipulation and trapping in microfluidic devices using two-dimensional material |
| GB2565668B (en) * | 2016-04-08 | 2020-10-14 | Ibm | Particle manipulation and trapping in microfluidic devices using two-dimensional material |
| JP2019178985A (en) * | 2018-03-30 | 2019-10-17 | 公立大学法人兵庫県立大学 | Quantitation method of target substance using aptamer |
| JP7085190B2 (en) | 2018-03-30 | 2022-06-16 | 兵庫県公立大学法人 | Quantitative method of target substance using aptamer |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2013238463A (en) | Cell identification method utilizing dielectrophoresis | |
| CN109863391B (en) | Device and method for sample analysis | |
| US6887362B2 (en) | Dielectrophoretic separation and immunoassay methods on active electronic matrix devices | |
| EP1648286B1 (en) | Sensitive and rapid biodetection | |
| US8241893B2 (en) | Method and device for separating molecular targets in a complex mixture | |
| Primiceri et al. | Cell chips as new tools for cell biology–results, perspectives and opportunities | |
| JP4093740B2 (en) | Fine particle sorting microchip and fine particle sorting device | |
| US20060073489A1 (en) | Nanopore separation devices and methods of using same | |
| EP2578674A1 (en) | Biological-sample affixing device | |
| CN109863396A (en) | Device and method for sample analysis | |
| JP6133780B2 (en) | Multi-directional microfluidic device with pan-trapping binding region and method of use | |
| Ramón-Azcón et al. | Sensitive and spatially multiplexed detection system based on dielectrophoretic manipulation of DNA-encoded particles used as immunoreactions platform | |
| AU2002213086B2 (en) | Evaluating binding affinities by force stratification and force panning | |
| Meighan et al. | Bioanalytical separations using electric field gradient techniques | |
| CN102762746A (en) | Methods for the detection of biologically relevant molecules and their interaction characteristics | |
| WO2019196270A1 (en) | Micro-nano particles detection system and method thereof | |
| US20190234902A1 (en) | Method for detecting analytes using dielectrophoresis related applications | |
| US20140216935A1 (en) | Dielectrophoretic Tweezers as a Platform for Molecular Force Spectroscopy in a Highly Parallel Format | |
| Matsunaga et al. | High-efficiency single-cell entrapment and fluorescence in situ hybridization analysis using a poly (dimethylsiloxane) microfluidic device integrated with a black poly (ethylene terephthalate) micromesh | |
| CN105883838A (en) | Single-layer mica sheet and preparation method and application of nanopore electronic device thereof | |
| Menze et al. | Selective single-cell sorting using a multisectorial electroactive nanowell platform | |
| Li et al. | Antifouling gold-inlaid BSA coating for the highly efficient capture of circulating tumor cells | |
| JPH02297053A (en) | Improvement in biosensor | |
| KR20140106268A (en) | Method for Detecting Biomolecules Using Magnetic Particles | |
| CN110741250B (en) | Electrophoresis method for changing electric field |