JP2013238407A - 1h-tetrazole derivative and mass analysis matrix - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析において試料のイオン化に用いられるマトリックスに関する。特に、本発明は、低分子物質の測定に有用な質量分析用マトリックスに関する。 The present invention relates to a matrix used for ionization of a sample in matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry. In particular, the present invention relates to a mass spectrometric matrix useful for measuring low molecular weight substances.
質量分析におけるイオン化の１つとしてマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ；Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法が知られている。ＭＡＬＤＩ法は、レーザー光を試料に短時間照射して瞬間的に試料を気化させることにより、試料中の測定対象の分子を分解することなくイオン化するものである。 Matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) is known as one of ionizations in mass spectrometry. In the MALDI method, a sample is irradiated with laser light for a short time to vaporize the sample instantaneously, thereby ionizing the molecule to be measured in the sample without decomposing.
一般にＭＡＬＤＩ法は、測定対象の溶液をマトリックス溶液と混合し、さらに必要であれば別のイオン化助剤を混合した上で試料プレート上に塗布し、溶媒を除去することにより質量分析用試料を調製する。
調製された質量分析用試料は、測定対象物質が多量のマトリックスとほぼ均一に混合された状態にある。この試料にレーザー光を照射すると、マトリックスがレーザー光のエネルギーを吸収して熱エネルギーに変換する。このときに試料の一部が急速に加熱され、マトリックス及び測定対象物質が気化する。その過程で測定対象物質がイオン化される。
In general, the MALDI method prepares a sample for mass spectrometry by mixing a solution to be measured with a matrix solution and, if necessary, mixing another ionization aid on the sample plate and removing the solvent. To do.
The prepared sample for mass spectrometry is in a state where the substance to be measured is almost uniformly mixed with a large amount of matrix. When this sample is irradiated with laser light, the matrix absorbs the energy of the laser light and converts it into thermal energy. At this time, a part of the sample is rapidly heated, and the matrix and the substance to be measured are vaporized. In the process, the substance to be measured is ionized.
ＭＡＬＤＩ法をイオン化に利用した質量分析装置、特にマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ；Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometer）は、タンパク質及び合成高分子化合物などの高分子物質を極めて温和な条件でイオン化することが特徴であり、測定対象化合物のイオンをあまり開裂させることなく分析することが可能である。さらに微量分析にも好適であることから、生命科学や工業材料の分野などで広範囲に利用されている。 Mass spectrometers using MALDI method for ionization, especially matrix-assisted laser desorption / ionization time of flight mass spectrometer (MALDI-TOFMS), such as proteins and synthetic polymer compounds The high molecular weight material is ionized under extremely mild conditions, and analysis can be performed without cleaving the ions of the compound to be measured. Furthermore, since it is suitable for trace analysis, it is widely used in the fields of life science and industrial materials.
ＭＡＬＤＩ法において、一般的にマトリックスとして用いられている化合物は、例えば、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、ジスラノール、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）などの低分子有機化合物である。また、ＭＡＬＤＩ法におけるイオン化効率やイオン化の安定性などを改善するために、例えば、特開２０１０−２０４０５０号公報（特許文献１）、特開２００４−３４７５９５号公報（特許文献２）、特開２００８−２６１８２４号公報（特許文献３）において、マトリックスとして用いられる化合物の改良が試みられている。 In the MALDI method, compounds generally used as a matrix are, for example, 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), disranol, 2- (4-hydroxy Low molecular organic compounds such as phenylazo) benzoic acid (HABA). In order to improve the ionization efficiency and ionization stability in the MALDI method, for example, JP 2010-204050 (Patent Document 1), JP 2004-347595 (Patent Document 2), JP 2008 -261824 (Patent Document 3) attempts to improve compounds used as a matrix.
これまでＭＡＬＤＩ法は、特に高分子化合物のイオン化に利用されてきたが、ＭＡＬＤＩ法が非常に簡便で且つ高感度なイオン化法であることから、近年、低分子化合物への適用の要望が非常に高まっている。従来のマトリックスを用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析を行った場合、マススペクトルにはマトリックス由来のイオンピークが低質量（m/z）領域に顕著に観測されるが、測定対象物質が高分子化合物である場合には、マトリックス由来のイオンピークは測定対象物質の分析の妨害にはならない。しかしながら、測定対象物質が低分子化合物である場合には、マススペクトル上で、目的とする測定対象物質由来の各種分子イオンピークとマトリックス由来ピークとが混在し、目的とする測定対象物質由来のピークを正確に把握することができなくなる。このような理由により、従来のマトリックスを用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで低分子化合物を適切に分析することは極めて困難であった。 Until now, the MALDI method has been used particularly for ionization of polymer compounds. However, since the MALDI method is a very simple and highly sensitive ionization method, there has been a great demand in recent years for application to low-molecular compounds. It is growing. When MALDI-TOFMS analysis is performed using a conventional matrix, the ion peak derived from the matrix is remarkably observed in the low mass (m / z) region in the mass spectrum, but the measurement target substance is a polymer compound. In some cases, the matrix-derived ion peak does not interfere with the analysis of the analyte. However, when the measurement target substance is a low-molecular compound, various molecular ion peaks derived from the target measurement target substance and matrix-derived peaks are mixed on the mass spectrum, and the peak derived from the target measurement target substance is present. It becomes impossible to grasp accurately. For these reasons, it has been extremely difficult to appropriately analyze low molecular weight compounds by MALDI-TOFMS using a conventional matrix.
一方、マトリックスとしての有機化合物を用いずにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより低分子化合物を分析する技術として、これまでいくつかの提案がなされている。例えば、ネイチャー(Nature)、１９９９年５月２０日、第３３９巻、ｐ．２４３−２４６（非特許文献１）には、多孔質シリコン（ポーラスシリコン）を基板としたＤＩＯＳ（Desorption/Ionization on Silicon）と呼ばれるレーザー脱離イオン化法が提案されている。また、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー・Ｃ（The Journal of physical chemistry C）、２００７年、第１１巻、ｐ．１６２７８−１６２８３（非特許文献２）には、ナノ・フラワーと名付けられた白金ナノ粒子を無機マトリックスとして用いたレーザー脱離イオン化法が提案されている。また、特開２００８−２６１８２４号公報（特許文献３）には、分子線エピタキシー法を用いてシリコン単結晶上にＧｅナノドットを形成したプレートを使用したレーザー脱離イオン化法が提案されている。 On the other hand, several proposals have been made as techniques for analyzing low molecular weight compounds by MALDI-TOFMS without using an organic compound as a matrix. For example, Nature, May 20, 1999, Vol. 339, p. 243-246 (Non-patent Document 1) proposes a laser desorption / ionization method called DIOS (Desorption / Ionization on Silicon) using porous silicon (porous silicon) as a substrate. The Journal of Physical Chemistry C (2007), Volume 11, p. 16278-16283 (Non-Patent Document 2) proposes a laser desorption ionization method using platinum nanoparticles named nano-flowers as an inorganic matrix. Japanese Patent Laid-Open No. 2008-261824 (Patent Document 3) proposes a laser desorption ionization method using a plate in which Ge nanodots are formed on a silicon single crystal using a molecular beam epitaxy method.
さらに、マススペクトル上で低質量領域にマトリックス由来のピークを生じさせないために、従来よりも分子量がかなり大きな、いわゆる高分子有機マトリックスを使用したレーザー脱離イオン化法の例も報告されている。 Furthermore, an example of a laser desorption ionization method using a so-called macromolecular organic matrix having a considerably higher molecular weight than that in the past has been reported in order not to cause a matrix-derived peak in a low mass region on the mass spectrum.
マトリックスを使用しない方法や、無機マトリックスを使用する方法は、従来のマトリックスを用いた場合に比べて分析コストがかなり高くなるという問題がある。一方、高分子有機マトリックスを用いる方法では、マトリックスの粘性が高いため作業性が悪く、試料調製が難しいために実用性に乏しいという問題がある。 The method that does not use a matrix or the method that uses an inorganic matrix has a problem in that the analysis cost is considerably higher than when a conventional matrix is used. On the other hand, the method using a polymer organic matrix has a problem that the workability is poor because the viscosity of the matrix is high, and the practicality is poor because sample preparation is difficult.
なお、特開２０１０−２０４０５０号公報においては、一置換フェニル基などを有する１Ｈ−テトラゾール誘導体にマトリックスとしての効果があることが確認されている。一方、上記誘導体とは置換基の数や位置を異にした誘導体が同様にマトリックスとしての効果を有するものであるか否かについては予想不可能であることが通常である。 In JP 2010-204050 A, it has been confirmed that a 1H-tetrazole derivative having a monosubstituted phenyl group has an effect as a matrix. On the other hand, it is usually unpredictable whether or not derivatives having different numbers and positions of substituents have the effect as a matrix.
本発明はこうした点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、特に分子量が５００以下である低分子化合物を測定対象として実用上十分なＭＡＬＤＩ質量分析が可能な、低分子有機化合物であるマトリックスを提供することにある。 The present invention has been made in view of these points, and the object of the present invention is to provide a low molecular organic compound capable of performing MALDI mass spectrometry practically sufficient particularly for a low molecular compound having a molecular weight of 500 or less. Is to provide a matrix that is
本発明者らは、鋭意検討の結果、２，５−二置換のフェニル基を有する新規の１Ｈ−テトラゾール誘導体によって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含む。
As a result of intensive studies, the present inventors have found that the object of the present invention can be achieved by a novel 1H-tetrazole derivative having a 2,5-disubstituted phenyl group, and have completed the present invention. It was.
The present invention includes the following inventions.
（１）
下記式（I）：
(1)
Formula (I) below:
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてよい水素又は炭素数１〜１０の有機基である。）
で示される、１Ｈ−テトラゾール誘導体。
(In the formula, R 1 and R 2 are the same or different hydrogen or an organic group having 1 to 10 carbon atoms.)
A 1H-tetrazole derivative represented by the formula:
（２）
前記有機基が、置換されていてもよいアルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選ばれる、（１）に記載の１Ｈ−テトラゾール誘導体。
（３）
前記有機基が、メチル基、フェニル基、トリル基及びベンジル基からなる群から選ばれる、（１）又は（２）に記載の１Ｈ−テトラゾール誘導体。
(2)
The 1H-tetrazole derivative according to (1), wherein the organic group is selected from the group consisting of an optionally substituted alkyl group, aryl group, and aralkyl group.
(3)
The 1H-tetrazole derivative according to (1) or (2), wherein the organic group is selected from the group consisting of a methyl group, a phenyl group, a tolyl group and a benzyl group.
（４）
下記式（I）：
(4)
Formula (I) below:
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてよい水素又は炭素数１〜１０の有機基である。）
で示される質量分析用マトリックス。
(In the formula, R 1 and R 2 are the same or different hydrogen or an organic group having 1 to 10 carbon atoms.)
The matrix for mass spectrometry shown by.
（５）
前記有機基が、置換されていてもよいアルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選ばれる、（４）に記載の質量分析用マトリックス。
（６）
前記有機基が、メチル基、フェニル基、トリル基及びベンジル基からなる群から選ばれる、（４）又は（５）に記載の質量分析用マトリックス。
(5)
The matrix for mass spectrometry according to (4), wherein the organic group is selected from the group consisting of an optionally substituted alkyl group, aryl group, and aralkyl group.
(6)
The matrix for mass spectrometry according to (4) or (5), wherein the organic group is selected from the group consisting of a methyl group, a phenyl group, a tolyl group, and a benzyl group.
（７）
分子量５００以下の物質を測定するための（４）〜（６）のいずれかに記載の質量分析用マトリックス。
(7)
The matrix for mass spectrometry according to any one of (4) to (6), for measuring a substance having a molecular weight of 500 or less.
本発明の１Ｈ−テトラゾール誘導体は、質量分析用マトリックスとして使用された場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析の正イオン測定モードにおいて、マトリックス由来のプロトン付加分子は実質的に検出されない。すなわち、全く検出されないか、又は検出されたとしても無視できる程度である。本発明の１Ｈ−テトラゾール誘導体は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析の負イオン測定モードにおいては、マトリックス由来のプロトン脱離イオンが極めて明瞭に検出される。これは、１Ｈ−テトラゾール誘導体に含まれるプロトンがテトラゾール環から容易に離れ、正イオン測定モードでは測定対象物質に移動してプロトン付加分子の生成に寄与していることを示している。従って、本発明の１Ｈ−テトラゾール誘導体は、低分子化合物を正イオン化するためのマトリックスとして極めて有用であることを示している。 When the 1H-tetrazole derivative of the present invention is used as a matrix for mass spectrometry, proton-added molecules derived from the matrix are not substantially detected in the positive ion measurement mode of MALDI-TOFMS analysis. That is, it is not detected at all, or even if detected, it is negligible. In the 1H-tetrazole derivative of the present invention, in the negative ion measurement mode of MALDI-TOFMS analysis, proton-eliminated ions derived from the matrix are detected very clearly. This indicates that the proton contained in the 1H-tetrazole derivative is easily separated from the tetrazole ring and moves to the measurement target substance in the positive ion measurement mode and contributes to the generation of proton-added molecules. Therefore, the 1H-tetrazole derivative of the present invention has been shown to be extremely useful as a matrix for positive ionization of low molecular compounds.
従来のマトリックスを使用したＭＡＬＤＩ質量分析では、マトリックス由来の分子イオンピークがマススペクトル上でm/z１００〜４００の低質量領域に顕著に出現する。そのため、特に分子量が５００以下の低分子物質を測定対象試料とする場合に、試料由来の分子イオンピークとマトリックス由来の分子イオンピークとが混在し又は重なり、目的とする試料由来のピークを正確に把握することが困難である。 In MALDI mass spectrometry using a conventional matrix, a molecular ion peak derived from the matrix appears remarkably in a low mass region of m / z 100 to 400 on the mass spectrum. Therefore, especially when a low molecular substance having a molecular weight of 500 or less is used as a measurement target sample, the molecular ion peak derived from the sample and the molecular ion peak derived from the matrix are mixed or overlapped, and the peak derived from the target sample is accurately obtained. It is difficult to grasp.
これに対し、本発明のマトリックスを使用したＭＡＬＤＩ質量分析では、正イオン測定モードにおいてマトリックス由来の分子イオンピークがマススペクトル上にほとんど観測されない。そのため、低分子化合物を測定対象試料とする場合でも、測定対象試料由来の分子イオンピークを正確に把握することが容易になる。これにより、これまで困難であった低分子化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析を容易に且つ正確に行うことができるようになる。 In contrast, in MALDI mass spectrometry using the matrix of the present invention, molecular ion peaks derived from the matrix are hardly observed on the mass spectrum in the positive ion measurement mode. Therefore, even when a low molecular compound is used as a measurement target sample, it is easy to accurately grasp a molecular ion peak derived from the measurement target sample. This makes it possible to easily and accurately perform MALDI-TOFMS analysis of low molecular weight compounds, which has been difficult until now.
本発明の質量分析マトリックスは、取り扱いも容易であり、試料調製の手順も従来のマトリックスと変わりない。従って、分析コストを抑えることができる。 The mass spectrometry matrix of the present invention is easy to handle, and the sample preparation procedure is the same as that of the conventional matrix. Therefore, the analysis cost can be suppressed.
本発明は、下記式（I）で示される、１Ｈ−テトラゾール誘導体である。 The present invention is a 1H-tetrazole derivative represented by the following formula (I).
式（I）中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてよい水素又は炭素数１〜１０の有機基である。
有機基としては、置換されていてもよいアルキル基、アリール基及びアラルキル基からなる群から選ばれうる。より具体的には、メチル基、フェニル基、トリル基、及びベンジル基からなる群から選ばれうる。
In formula (I), R 1 and R 2 are the same or different hydrogen or an organic group having 1 to 10 carbon atoms.
The organic group may be selected from the group consisting of an optionally substituted alkyl group, aryl group, and aralkyl group. More specifically, it can be selected from the group consisting of a methyl group, a phenyl group, a tolyl group, and a benzyl group.
本発明の１Ｈ−テトラゾール誘導体のｐＫａは、５．０〜５．７である。上記範囲とすることによって、質量分析用マトリックスとして使用された場合に、試料の効率的なイオン化を好ましく生じさせることができる。
本発明の１Ｈ−テトラゾール誘導体の融点は、一般的な質量分析用マトリックスの融点と同程度であることが好ましい。従って、本発明の１Ｈ−テトラゾール誘導体の融点はおよそ２００℃以上でありうる。上記範囲内に設定することによって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析におけるマトリックスとして適切な化合物となる。
The pKa of the 1H-tetrazole derivative of the present invention is 5.0 to 5.7. By setting it as the above range, when used as a matrix for mass spectrometry, efficient ionization of a sample can be preferably caused.
The melting point of the 1H-tetrazole derivative of the present invention is preferably about the same as the melting point of a general mass spectrometry matrix. Therefore, the melting point of the 1H-tetrazole derivative of the present invention can be about 200 ° C. or higher. By setting within the above range, the compound is suitable as a matrix in MALDI-TOFMS analysis.
本発明の１Ｈ−テトラゾール誘導体は、例えば、２，５−二置換ベンゾニトリルとアジ化化合物との付加環化反応により合成することができる。２，５−二置換ベンゾニトリルとアジ化化合物とは、１：４のモル比で反応させることができる。付加環化反応における条件は、１００℃、１８時間でありうる。 The 1H-tetrazole derivative of the present invention can be synthesized, for example, by a cycloaddition reaction between a 2,5-disubstituted benzonitrile and an azide compound. The 2,5-disubstituted benzonitrile and the azide compound can be reacted in a molar ratio of 1: 4. Conditions in the cycloaddition reaction can be 100 ° C. for 18 hours.
本発明の１Ｈ−テトラゾール誘導体は、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析におけるマトリックスとして有用である。質量分析においては、本発明の１Ｈ−テトラゾール誘導体は、これまでのマトリックスと同様に用いることができる。例えば、１〜２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１〜５ｍｇ／ｍＬのマトリックス溶液に調製して用いることができる。マトリックス溶液に用いられる溶媒としては、具体的には、アセトニトリル、メタノ−ル、エタノ−ルなどの有機溶剤、又は、有機溶剤が例えば１０〜９０体積％、好ましくは３０〜８０体積％、更に好ましくは３３〜７５体積％、一例として５０体積％水中に含まれる有機溶剤水溶液が用いられうる。 The 1H-tetrazole derivative of the present invention is useful as a matrix in MALDI (matrix-assisted laser desorption / ionization) mass spectrometry. In mass spectrometry, the 1H-tetrazole derivative of the present invention can be used in the same manner as the conventional matrix. For example, it can be prepared and used in a matrix solution of 1 to 20 mg / mL, preferably 1 to 5 mg / mL. Specific examples of the solvent used in the matrix solution include organic solvents such as acetonitrile, methanol, and ethanol, or organic solvents such as 10 to 90% by volume, preferably 30 to 80% by volume, and more preferably. May be used as an organic solvent aqueous solution contained in 33 to 75% by volume, for example, 50% by volume water.
本発明の１Ｈ−テトラゾール誘導体が質量分析用マトリックスとして用いる場合、質量分析対象となる試料の種類については特に限定されるものではない。質量分析対象の分子量は、例えば、５００以下、例えば１００〜４００の低分子量であることが好ましい。
上記の低分子量の試料を質量分析対象とする場合は、正イオン測定モードで測定する。
When the 1H-tetrazole derivative of the present invention is used as a matrix for mass spectrometry, the type of sample to be subjected to mass spectrometry is not particularly limited. The molecular weight of the mass analysis target is preferably a low molecular weight of, for example, 500 or less, for example, 100 to 400.
When the above-described low molecular weight sample is to be subjected to mass spectrometry, measurement is performed in the positive ion measurement mode.
本発明のマトリックスを用いて使用される質量分析装置としては、MALDIイオン源と組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、MALDI-IT（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、MALDI-TOF(マトリックス支援レ−ザ−脱離イオン化-飛行時間)型質量分析装置、MALDI-IT-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、MALDI-QIT-TOF(マトリックス支援レ−ザ−脱離イオン化-四重極イオントラップ-飛行時間)型質量分析装置、MALDI-FTICR（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置などが挙げられる。 The mass spectrometer used using the matrix of the present invention is not particularly limited as long as it is combined with a MALDI ion source. For example, MALDI-IT (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization / Ion Trap) Mass Spectrometer, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser / Desorption / Ionization / Time of Flight) Mass Spectrometer, MALDI-IT-TOF (Matrix) Assisted laser desorption ionization-ion trap-time-of-flight mass spectrometer, MALDI-QIT-TOF (Matrix-assisted laser-desorption ionization-quadrupole ion trap-time-of-flight) mass spectrometer, MALDI-FTICR (Matrix-assisted laser desorption ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance) type mass spectrometer.
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
以下の実施例において、質量分析における測定条件及び質量分析用ターゲットプレート上の試料搭載量は、以下の通りである。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
In the following examples, the measurement conditions in mass spectrometry and the sample mounting amount on the target plate for mass spectrometry are as follows.
＜測定条件＞
マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計
型名：島津製作所AXIMA-Performance
光源：パルスN2レーザー（337nm, 3nsec）
イオン極性：ポジティブ又はネガティブ
飛行モード：リフレクトロン
＜試料搭載量＞
被イオン化検体：50pmol/spot
マトリックス：5μg/spot
カチオン化剤：不使用
<Measurement conditions>
Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization-Time of Flight Mass Spectrometer Model name: Shimazu AXIMA-Performance
Light source: Pulsed N2 laser (337nm, 3nsec)
Ion polarity: positive or negative flight mode: reflectron <sample load>
Ionized sample: 50 pmol/spot
Matrix: 5μg / spot
Cationizing agent: Not used
［実施例１：５−（２，５−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾールの合成］
２，５−ジメトキシベンゾジトリル１０．０ｇ、アジ化ナトリウム１３．６ｇ及び塩化アンモニウム１１．９ｇをジメチルホルムアミド１００ｍｌに入れ、窒素気流下で１８時間、１００℃で撹拌した。その後、室温で２時間撹拌し、水３００ｍｌを加えて濃塩酸でｐＨ２として、酢酸エチル１５０ｍｌで３回抽出を行った。酢酸エチル層は、水１００ｍｌで４回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。硫酸ナトリウムをろ別し、得られた酢酸エチル溶液を４０℃、減圧下で溶媒留去し粗生成物１２．７ｇを得た。得られた粗生成物を熱時酢酸エチル６０ｍｌに溶解後、室温で２４時間放置することにより、析出物として目的化合物４．９６ｇ（ｍｐ：１９８．５℃）を得た。
元素分析：計算値 C 54.42, H 4.89, N 24.17 分析値：C 52.33, H 4.92, N 27.23
1H-NMR in DMSO d6：σ7.09(1H, dd, J=9.1, 2.9Hz), 7.20(1H, d, J=9.1 Hz), 7.61(1H, d, J=2.9Hz)
13C-NMR in DMSO d6：σ55.6, 56.0, 110.0, 112.5, 113.1, 113.6, 118.6, 150.7, 151.0, 153.2
Example 1: Synthesis of 5- (2,5-dimethoxyphenyl) -1H-tetrazole
10.0 g of 2,5-dimethoxybenzoditolyl, 13.6 g of sodium azide and 11.9 g of ammonium chloride were placed in 100 ml of dimethylformamide and stirred at 100 ° C. for 18 hours under a nitrogen stream. Thereafter, the mixture was stirred at room temperature for 2 hours, 300 ml of water was added to adjust to pH 2 with concentrated hydrochloric acid, and extraction was performed three times with 150 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed 4 times with 100 ml of water and then dehydrated with anhydrous sodium sulfate. Sodium sulfate was filtered off, and the obtained ethyl acetate solution was evaporated under reduced pressure at 40 ° C. to obtain 12.7 g of a crude product. The obtained crude product was dissolved in 60 ml of hot ethyl acetate and allowed to stand at room temperature for 24 hours to obtain 4.96 g (mp: 198.5 ° C.) of the target compound as a precipitate.
Elemental analysis: calculated value C 54.42, H 4.89, N 24.17 Analytical value: C 52.33, H 4.92, N 27.23
1H-NMR in DMSO d6: σ7.09 (1H, dd, J = 9.1, 2.9Hz), 7.20 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.61 (1H, d, J = 2.9Hz)
13C-NMR in DMSO d6: σ55.6, 56.0, 110.0, 112.5, 113.1, 113.6, 118.6, 150.7, 151.0, 153.2
得られた５−（２，５−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾールのマススペクトルを図１に示す。図１中、（ａ）は負イオン測定モード、（ｂ）は正イオン測定モードによるスペクトルである。
図１から明らかなように、マトリックスのみの測定では、正イオン測定（ｂ）においてマトリックス由来のピークが観測されなかった。一方、負イオン測定（ａ）においてはマトリックス由来の[matrix-H]-が観測された。
The mass spectrum of the obtained 5- (2,5-dimethoxyphenyl) -1H-tetrazole is shown in FIG. In FIG. 1, (a) is a spectrum in the negative ion measurement mode, and (b) is a spectrum in the positive ion measurement mode.
As is clear from FIG. 1, in the measurement using only the matrix, no matrix-derived peak was observed in the positive ion measurement (b). On the other hand, in the negative ion measurement (a), [matrix-H] − derived from the matrix was observed.
［実施例２：５−（２，５−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾールを用いたプロプラノロール塩酸塩の質量分析］
マトリックスとして、５−（２，５−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾール（分子量２０６．２０）：１００ｍＭ／メタノール溶液と、プロプラノロール塩酸塩：１．０ｍＭ／５０％アセトニトリル水溶液とを等量混合し、ステンレス製ターゲットプレート（島津製作所製）上に５０ピコモル載せ風乾することにより、質量分析用試料を調製した。この試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（島津製作所製ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）で測定した。図２に、正イオンモードで得られたマススペクトル（ｂ）を、負イオンモードで得られたスペクトル（ａ）と比較して示す。
[Example 2: Mass spectrometry of propranolol hydrochloride using 5- (2,5-dimethoxyphenyl) -1H-tetrazole]
As a matrix, 5- (2,5-dimethoxyphenyl) -1H-tetrazole (molecular weight 206.20): 100 mM / methanol solution and propranolol hydrochloride: 1.0 mM / 50% acetonitrile aqueous solution were mixed in equal amounts, and stainless steel was mixed. A sample for mass spectrometry was prepared by placing 50 pmoles on a target plate (manufactured by Shimadzu Corporation) and air drying. This sample was measured by MALDI-TOFMS (AXIMA-CFR manufactured by Shimadzu Corporation). FIG. 2 shows the mass spectrum (b) obtained in the positive ion mode in comparison with the spectrum (a) obtained in the negative ion mode.
図２に示すように、測定対象であるプロプラノロール由来のプロトン付加分子[M+H]+、ナトリウムイオン付加分子[M+Na]+、及びカリウムイオン付加分子[M+K]+のピークが、それぞれm/z 260、282及び298の位置に出現している。一方、m/z 72などの同定不能のイオンを除き、m/z 23及び39にそれぞれナトリウムイオン及びカリウムイオンのピークが観測される以外に、低質量領域に明確なピークは観測されなかった。これは、マトリックスである５−（２，５−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾール由来のプロトン付加分子[matrix+H]+などが検出されなかったことを意味している。これにより、マトリックスが測定対象由来のイオンの検出を妨げないことが分かる。なお、同定不能であるイオンは、ターゲットプレートなどに起因する不可避のイオンであると考えられる。これは他の実施例でも同様である。 As shown in FIG. 2, the peaks of the protonated molecule [M + H] + , sodium ion added molecule [M + Na] + , and potassium ion added molecule [M + K] + derived from propranolol to be measured are They appear at m / z 260, 282 and 298 respectively. On the other hand, with the exception of unidentifiable ions such as m / z 72, no peaks were clearly observed in the low-mass region, except that sodium and potassium ions were observed at m / z 23 and 39, respectively. This means that a protonated molecule [matrix + H] + derived from 5- (2,5-dimethoxyphenyl) -1H-tetrazole as a matrix was not detected. Thereby, it turns out that a matrix does not prevent the detection of the ion derived from a measuring object. In addition, it is thought that the ion which cannot be identified is an unavoidable ion resulting from a target plate etc. The same applies to other embodiments.
［実施例３：５−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾールの合成］
２，５−ジヒドロキシベンゾニトリル３．５０ｇ、アジ化ナトリウム６．５８ｇ及び塩化アンモニウム５．４１ｇをジメチルホルムアミド５０ｍｌにいれ、窒素気流下で１８時間、１００℃で撹拌した。その後、室温で２時間撹拌し、水３００ｍｌを加えて濃塩酸でｐＨ２として、酢酸エチル２００ｍｌで３回抽出を行った。酢酸エチル層は、水１００ｍｌで３回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水した。硫酸ナトリウムをろ別し、得られた酢酸エチル溶液を４０℃、減圧下で溶媒留去し粗生成物４．６１ｇを得た。得られた粗生成物を酢酸エチル１００ｍｌとエタノール１００ｍｌとの混合溶液に熱時溶解後、室温で２４時間放置することにより、析出物として目的化合物１．５５ｇ（ｍｐ：２９１℃）を得た。
元素分析：計算値 C 47.19, H 3.39, N 31.45 分析値：C 47.22, H 3.36, N 31.55
1H-NMR in DMSO d6：σ6.82(1H, d), 6.85(1H, d),6.92(1H, dd)
[Example 3: Synthesis of 5- (2,5-dihydroxyphenyl) -1H-tetrazole]
2,5-dihydroxybenzonitrile (3.50 g), sodium azide (6.58 g) and ammonium chloride (5.41 g) were placed in dimethylformamide (50 ml), and the mixture was stirred at 100 ° C. for 18 hours under a nitrogen stream. Then, it stirred at room temperature for 2 hours, 300 ml of water was added, it was made pH 2 with concentrated hydrochloric acid, and extraction was performed 3 times with 200 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with 100 ml of water three times and dehydrated with anhydrous sodium sulfate. Sodium sulfate was filtered off, and the obtained ethyl acetate solution was evaporated under reduced pressure at 40 ° C. to obtain 4.61 g of a crude product. The obtained crude product was dissolved in a mixed solution of 100 ml of ethyl acetate and 100 ml of ethanol when heated, and then allowed to stand at room temperature for 24 hours to obtain 1.55 g (mp: 291 ° C.) of the target compound as a precipitate.
Elemental analysis: calculated C 47.19, H 3.39, N 31.45 Analytical value: C 47.22, H 3.36, N 31.55
1H-NMR in DMSO d6: σ6.82 (1H, d), 6.85 (1H, d), 6.92 (1H, dd)
得られた５−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾールのマススペクトルを図３に示す。図３中、（ａ）は正イオン測定モード、（ｂ）は負イオン測定モードによるスペクトルである。
図３から明らかなように、マトリックスのみの測定では正イオン測定（ａ）においてマトリックス由来のピークが観測されなかった。一方、負イオン測定（ｂ）においてはマトリックス由来のm/z 177に[matrix-H]-が観測された。
The mass spectrum of the obtained 5- (2,5-dihydroxyphenyl) -1H-tetrazole is shown in FIG. In FIG. 3, (a) is a spectrum in the positive ion measurement mode, and (b) is a spectrum in the negative ion measurement mode.
As is clear from FIG. 3, no matrix-derived peak was observed in the positive ion measurement (a) in the measurement of the matrix alone. On the other hand, in the negative ion measurement (b), [matrix-H] − was observed at m / z 177 derived from the matrix.
［実施例４：５−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾールを用いたプロプラノロール塩酸塩の質量分析］
マトリックスとして５−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾールを用いたことを除いて、実施例２と同様の操作を行うことによって、プロプラノロール塩酸塩の質量分析を行った。
図４に、正イオン測定モードで得られたマススペクトル（ａ）を、負イオン測定モードで得られたスペクトル（ｂ）と比較して示す。
[Example 4: Mass spectrometry of propranolol hydrochloride using 5- (2,5-dihydroxyphenyl) -1H-tetrazole]
Mass spectrometry of propranolol hydrochloride was performed by performing the same operation as in Example 2 except that 5- (2,5-dihydroxyphenyl) -1H-tetrazole was used as a matrix.
FIG. 4 shows the mass spectrum (a) obtained in the positive ion measurement mode in comparison with the spectrum (b) obtained in the negative ion measurement mode.
図４に示すように、測定対象であるプロプラノール由来のプロトン付加分子[M+H]+ m/z 260が検出されている。一方、同定不能のイオンを除き、低質量領域に明確なピークは観測されなかった。これは、マトリックスである５−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾール由来のプロトン付加分子[matrix+H]+などが検出されなかったことを意味している。なお、同定不能であるイオンは、ターゲットプレートなどに起因する不可避のイオンであると考えられる。 As shown in FIG. 4, a protonated molecule [M + H] + m / z 260 derived from propranol which is a measurement target is detected. On the other hand, no clear peak was observed in the low mass region except for unidentifiable ions. This means that a protonated molecule [matrix + H] + derived from 5- (2,5-dihydroxyphenyl) -1H-tetrazole as a matrix was not detected. In addition, it is thought that the ion which cannot be identified is an unavoidable ion resulting from a target plate etc.
一方、負イオン測定では、m/z 177に顕著に５−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾールのプロトン脱離イオン[matrix-H]-のピークが観測された。これは、レーザー脱離イオン化により、５−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾールから１個のプロトンが容易に脱離することを意味している。換言すれば、正イオン化の際に、このマトリックス由来のプロトン付加分子[M+H]+のプロトンH+がマトリックス由来のものであるとの高い確証が得られた。従って、ＭＡＬＤＩ質量分析において５−（２，５−ジヒドロキシフェニル）−１Ｈ−テトラゾールは低分子化合物の正イオン測定に有用なマトリックスであるということができる。 On the other hand, in the negative ion measurement, a peak of proton-eliminated ion [matrix-H] − of 5- (2,5-dihydroxyphenyl) -1H-tetrazole was remarkably observed at m / z 177. This means that one proton is easily desorbed from 5- (2,5-dihydroxyphenyl) -1H-tetrazole by laser desorption ionization. In other words, during positive ionization, high confirmation was obtained that the proton H + of the proton-added molecule [M + H] + derived from this matrix was derived from the matrix. Accordingly, it can be said that 5- (2,5-dihydroxyphenyl) -1H-tetrazole is a useful matrix for measuring positive ions of low molecular weight compounds in MALDI mass spectrometry.
なお、上記実施例は本発明のいくつかの例に過ぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても当然に本願特許請求の範囲に包含される。 It should be noted that the above-described embodiments are merely some examples of the present invention, and any modification, correction, or addition as appropriate within the spirit of the present invention will naturally be included in the scope of the claims of the present application.
Claims (7)
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてよい水素又は炭素数１〜１０の有機基である。）
で示される、１Ｈ−テトラゾール誘導体。 Formula (I) below:
(In the formula, R 1 and R 2 are the same or different hydrogen or an organic group having 1 to 10 carbon atoms.)
A 1H-tetrazole derivative represented by the formula:
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっていてよい水素又は炭素数１〜１０の有機基である。）
で示される質量分析用マトリックス。 Formula (I) below:
(In the formula, R 1 and R 2 are the same or different hydrogen or an organic group having 1 to 10 carbon atoms.)
The matrix for mass spectrometry shown by.
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