JP2013236558A - Cytostatic - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、キシロースを有効成分とする細胞増殖抑制剤、および該細胞増殖抑制剤を用いた細胞の増殖制御方法に関する。
The present invention relates to a cell growth inhibitor containing xylose as an active ingredient, and a cell growth control method using the cell growth inhibitor.
背景技術
生物学では、人為的に生体外で培養する培養細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験系や再生医療および細胞療法において広く用いられている。その細胞の有する性状を一定に維持するためには、継代を行うことにより培地中にて細胞を増殖し続ける必要がある。しかしながら、初代培養細胞や有限細胞系などの継代回数に制限（寿命）のある株化していない細胞では、継代を行うことによってその細胞の性状が変化することが多い。
In background art biology, cultured cells that are artificially cultured in vitro are widely used in in vitro experimental systems, regenerative medicine, and cell therapy. In order to keep the properties of the cells constant, it is necessary to continue to grow the cells in the medium by performing subculture. However, in noncultured cells that have a limited number of passages (lifetime), such as primary cultured cells and finite cell lines, the properties of the cells often change by passage.
そのため、培養細胞を中〜長期間、その性状を一定に維持する場合には、凍結保存を行うのが一般的である。しかしながら、霊長類、特にヒトのＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のような凍結・解凍に弱い細胞では、凍結保存を行うことによる細胞へのダメージが大きい。 Therefore, cryopreservation is generally performed when maintaining the properties of cultured cells for a medium to long period. However, in primates, especially cells that are vulnerable to freezing and thawing, such as human ES cells and iPS cells, damage to the cells caused by cryopreservation is significant.
また、増殖スピードの速い細胞や遅い培養細胞の場合、それらを使用する際、所望の細胞濃度に調整することは難しく、熟練が必要であった。一時的に細胞の環境温度を４℃など低温に変化させることにより細胞増殖を抑える方法も知られているが、維持できる時間は数時間単位であった。 In addition, in the case of cells having a high growth speed or slow culture cells, it is difficult to adjust the cell concentration to a desired level when using them, and skill is required. Although a method of suppressing cell growth by temporarily changing the environmental temperature of the cell to a low temperature such as 4 ° C. is also known, the time that can be maintained was several hours.
さらに、培養細胞の中でもＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞では、継代を行うことによってそれら細胞の有する性状の一つである未分化性（分化能）を失うことが知られている。そこで、未分化性を維持するために、マウスＥＳ細胞の場合は、例えばＬＩＦ（白血病抑制因子）を添加する必要があった。また、霊長類ＥＳ細胞の場合は、未分化維持因子を添加し、あるいはフィーダー細胞の共存下培養を行う必要があった（特開２００７−２２８８１５号公報（特許文献１）参照）。しかしながら、これら未分化維持因子は高価なものが多く、またフィーダー細胞との共存下培養は煩雑なものであった。 Furthermore, among cultivated cells, pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are known to lose undifferentiated (differentiating ability), which is one of the properties of those cells, by passage. Yes. Thus, in order to maintain undifferentiation, in the case of mouse ES cells, it was necessary to add, for example, LIF (leukemia inhibitory factor). In the case of primate ES cells, it was necessary to add an undifferentiation maintenance factor or to perform culture in the presence of feeder cells (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-228815 (Patent Document 1)). However, many of these undifferentiation maintenance factors are expensive, and culturing in the presence of feeder cells is complicated.
したがって、凍結保存以外の方法で、細胞を継代する必要なく、その有する性状を維持したまま、簡便に細胞の増殖制御をする方法が求められている。 Therefore, there is a need for a method for simply controlling cell growth while maintaining the properties of cells without the need to pass through cells by methods other than cryopreservation.
凍結保存以外の方法として、例えば、特開２００８−１０４４０７号公報（特許文献２）には、還元糖を含む細胞保存液を用いた冷蔵条件にて保存することを特徴とする付着生細胞の保存方法が開示されている。しかしながら、この方法では低温での冷蔵が必須であり、保存できる細胞の種類も限られていた。また、この文献には、キシロースを用いることについては何ら記載されていない。 As a method other than cryopreservation, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-104407 (Patent Document 2) discloses preservation of viable living cells, which is preserved under refrigerated conditions using a cell preservation solution containing a reducing sugar. A method is disclosed. However, this method requires refrigeration at a low temperature, and the types of cells that can be stored are limited. This document does not describe any use of xylose.
キシロース（Ｘｙｌｏｓｅ）は、糖鎖の構成糖の一つであり、細胞間のコミュニケーションなど生体内において重要な役割を担っている。また、キシロースは、木質系バイオマスに豊富に含まれることが知られており、未利用資源として様々な分野での利用用途の拡大が求められている。しかしながら、培養細胞の分野では、細胞がキシロースをエネルギーとして利用できないと考えられているため、キシロースは用いられてこなかった。 Xylose is one of the constituent sugars of the sugar chain and plays an important role in the living body such as communication between cells. In addition, xylose is known to be abundantly contained in woody biomass, and expansion of usage in various fields is required as an unused resource. However, in the field of cultured cells, xylose has not been used because it is believed that cells cannot use xylose as energy.
本発明者らは、以前に、各種糖質（グルコース、キシロース、ガラクトースなど）によるマウスＥＳ細胞への影響を確認し、キシロースのマウスＥＳ細胞での未分化を維持できる可能性を報告している（横山忠幸ら,「各種糖含有環境下におけるマウスＥＳ細胞の増殖及びＥＢ形成への影響」, 第７回日本再生医療学会総会 抄録集, Vol.7, pp.239, 2008（非特許文献１）、横山忠幸ら,「Ｘｙｌｏｓｅ含有環境下におけるマウスＥＳ細胞の未分化維持に関する有効性の検討」, 第８回日本再生医療学会総会 抄録集, Vol.8, pp.221, 2009（非特許文献２））。 The present inventors have previously confirmed the influence of various carbohydrates (glucose, xylose, galactose, etc.) on mouse ES cells and reported the possibility of maintaining undifferentiation of xylose in mouse ES cells. (Tadayuki Yokoyama et al., “Effects of mouse ES cell proliferation and EB formation under various sugar-containing environments”, 7th Annual Meeting of the Japanese Society for Regenerative Medicine, Vol.7, pp.239, 2008 (Non-patent Document 1 ), Tadayuki Yokoyama, et al., "Examination of the effectiveness of maintaining undifferentiated mouse ES cells in an Xylose-containing environment", 8th Annual Meeting of the Japanese Society for Regenerative Medicine, Vol.8, pp.221, 2009 (non-patent literature) 2)).
しかしながら、これらの文献では、マウスＥＳ細胞の未分化性以外の性状については、何ら記載されていない。中でも増殖能については、キシロース培地での３日間培養による細胞数がグルコース培地のものより少なかったことが報告されているのみであり、キシロース培地から通常培地に置換した場合の増殖能については何ら報告されていない。また、キシロースの利用は、発明者らが知る限り、マウスＥＳ細胞以外の細胞に関しては、何ら報告されていない。 However, these documents do not describe any properties other than the undifferentiated nature of mouse ES cells. Above all, regarding the growth ability, it was only reported that the number of cells cultured in xylose medium for 3 days was less than that of glucose medium, and no report was made on the growth ability when the xylose medium was replaced with a normal medium. It has not been. In addition, as far as the inventors know, no utilization of xylose has been reported for cells other than mouse ES cells.
本発明者らは、今般、細胞培養において、一般的な培地に含まれるグルコースをキシロースに代替した培地を用いると、細胞がグルコース以外の糖類をエネルギーとして利用できないため生存できないと考えられていたにもかかわらず、１週間を超える長い期間、通常の培養温度で、生存を維持でき、かつ、細胞増殖を抑えることができることを見出した。また、キシロース培地で細胞増殖を抑えた後に、通常のグルコース培地に置換したところ、初めからグルコース培地で培養した細胞と同レベルまで短期間で増殖できることを見出し、細胞に生存に影響する重大な障害を与えることなく、細胞の増殖を制御することに成功した。さらに、多能性幹細胞の場合には、未分化性と多能性とを保持したまま、細胞の増殖を制御することに成功した。 In the cell culture, the present inventors have been considered that when a medium in which glucose contained in a general medium is replaced with xylose is used, the cells cannot survive because sugars other than glucose cannot be used as energy. Nevertheless, it has been found that survival can be maintained at a normal culture temperature for a long period exceeding 1 week, and cell proliferation can be suppressed. In addition, after suppressing cell growth with xylose medium, when it was replaced with normal glucose medium, it was found that it could proliferate in the short time to the same level as cells cultured in glucose medium from the beginning, and serious damage affecting the survival of cells. Without controlling the growth of the cells. Furthermore, in the case of pluripotent stem cells, they succeeded in controlling cell proliferation while maintaining undifferentiation and pluripotency.
よって本発明は、細胞増殖抑制剤を提供すること、および該細胞増殖抑制剤を用いた細胞の増殖制御方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a cell growth inhibitor and to provide a cell growth control method using the cell growth inhibitor.
本発明による細胞増殖抑制剤は、キシロースを有効成分とする。 The cell growth inhibitor according to the present invention contains xylose as an active ingredient.
本発明の一つの態様によれば、前記した剤において、細胞は多能性幹細胞である。 According to one aspect of the present invention, in the aforementioned agent, the cell is a pluripotent stem cell.
本発明の一つの態様によれば、前記した剤において、細胞はガン細胞である。 According to one aspect of the present invention, in the agent described above, the cell is a cancer cell.
本発明の一つの態様によれば、本発明による細胞増殖抑制剤を含んでなる、細胞培養用培地が提供される。 According to one aspect of the present invention, there is provided a cell culture medium comprising the cell growth inhibitor according to the present invention.
本発明の一つの態様によれば、本発明による細胞増殖抑制剤を含んでなる、多能性幹細胞維持用培地であって、キシロース以外の未分化維持因子を実質的に含まない、多能性幹細胞維持用培地が提供される。 According to one aspect of the present invention, there is provided a pluripotent stem cell maintenance medium comprising the cell growth inhibitor according to the present invention, which is substantially free of undifferentiated maintenance factors other than xylose. A medium for maintaining stem cells is provided.
本発明の一つの態様によれば、本発明による培地を使用して、細胞を維持することを含んでなる、細胞の増殖制御方法が提供される。 According to one aspect of the present invention, there is provided a method for controlling cell growth comprising maintaining cells using a medium according to the present invention.
本発明の一つの態様によれば、本発明による多能性幹細胞維持用培地を使用して細胞を維持することによって、多能性幹細胞の未分化性と多能性とを保持しつつ、細胞増殖を抑制することを含んでなる、多能性幹細胞の維持方法が提供される。 According to one aspect of the present invention, cells are maintained using the medium for maintaining pluripotent stem cells according to the present invention, thereby maintaining the undifferentiation and pluripotency of pluripotent stem cells. There is provided a method for maintaining pluripotent stem cells comprising inhibiting proliferation.
本発明の細胞増殖抑制剤によれば、通常の培養条件下において、細胞の性状を維持したまま、細胞の増殖を抑制することができる。このため、本発明による細胞増殖抑制剤は、凍結保存をするまでもない、細胞の短期間保存および維持に極めて有用である。 According to the cell growth inhibitor of the present invention, cell growth can be suppressed under normal culture conditions while maintaining the cell properties. For this reason, the cell growth inhibitor according to the present invention is extremely useful for short-term storage and maintenance of cells, not to be cryopreserved.
また、本発明による細胞の増殖制御方法は、通常の培地と、本発明の細胞増殖抑制剤を含んでなる培地とを置換する操作のみを行うため、熟練を要さず、大変簡便である。さらに本発明に用いられるキシロースは、未利用資源であるため、培養コストを低減することができる。 In addition, the cell growth control method according to the present invention is very simple and requires no skill because only the operation of replacing the normal medium and the medium containing the cell growth inhibitor of the present invention is performed. Furthermore, since xylose used in the present invention is an unused resource, the culture cost can be reduced.
さらに、細胞が多能性幹細胞の場合には、本発明の増殖抑制剤を含んでなる培地を使用すると、多能性幹細胞の増殖を抑制しながら細胞を維持するのと共に、未分化維持因子を添加し、あるいはフィーダー細胞の共存下培養を行わなくても、細胞の未分化性と全能性とを保持することができる。したがって、凍結に弱い多能性幹細胞であっても、短期間であれば、凍結保存するのと同じように、未分化性と全能性とを保持したまま、多能性細胞を維持することができる。 Furthermore, when the cell is a pluripotent stem cell, the use of the medium comprising the growth inhibitor of the present invention maintains the cell while suppressing the proliferation of the pluripotent stem cell, and an undifferentiated maintenance factor. Without adding or culturing in the presence of feeder cells, the undifferentiation and totipotency of the cells can be maintained. Therefore, even for pluripotent stem cells that are vulnerable to freezing, it is possible to maintain pluripotent cells while retaining undifferentiation and totipotency, as long as they are cryopreserved, for a short period of time. it can.
細胞増殖抑制剤
本発明による細胞増殖抑制剤は、前記したように、キシロースを有効成分とする。
As described above, the cell growth inhibitor according to the present invention contains xylose as an active ingredient.
キシロースは、木質系バイオマスに多く存在し、木糖とも呼ばれる五炭糖の単糖である。本発明に用いられるキシロースは、天然に多く存在するＤ−キシロースであってもよいし、合成により調製されるＬ−キシロース、ＤＬ−キシロースであってもよい。本発明で用いられるキシロースは、好ましくは、Ｄ−キシロースである。 Xylose is a pentose monosaccharide which is abundant in woody biomass and is also called wood sugar. The xylose used in the present invention may be naturally occurring D-xylose, or may be L-xylose or DL-xylose prepared by synthesis. The xylose used in the present invention is preferably D-xylose.
本発明において、「有効成分」とは、本発明の目的である細胞増殖抑制作用を奏する上で必要とされる成分のことを意味する。ここで、細胞増殖抑制作用とは、細胞の生存を維持し、かつ、細胞増殖を抑えることを意味する。細胞増殖を抑制することによって、細胞を保存することができる。 In the present invention, the “active ingredient” means a component required for exerting the cell growth inhibitory action which is the object of the present invention. Here, the cell growth inhibitory action means maintaining cell survival and suppressing cell growth. By inhibiting cell proliferation, cells can be preserved.
本明細書において細胞とは、人為的に生体外で培養することができる細胞を意味し、例えば、多能性幹細胞、ガン細胞、株化細胞、初代培養細胞、および有限細胞系が包含される。本発明に用いられる細胞は、細胞増殖性が著しく高く、未分化性などの形質を保持する必要がある点で、好ましくは多能性幹細胞である。 In the present specification, the cell means a cell that can be artificially cultured in vitro, and includes, for example, pluripotent stem cells, cancer cells, established cells, primary cultured cells, and finite cell systems. . The cells used in the present invention are preferably pluripotent stem cells because they have extremely high cell proliferative properties and need to retain undifferentiated characteristics.
本発明に用いられる多能性幹細胞とは、自分と同じ細胞を作る自己複製能と、組織や臓器を構成する他種類の細胞に分化する多分化能とを有する細胞のことを意味する。 The pluripotent stem cell used in the present invention means a cell having a self-replicating ability for producing the same cell as itself and a pluripotency for differentiating into other types of cells constituting tissues and organs.
多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性ガン細胞（ＥＣ細胞）、成体多能性幹細胞（ＡＰＳ細胞）が包含される。また、多能性幹細胞は、動物、昆虫などを由来とするものが含まれうるが、好ましくは哺乳動物由来のものであり、より好ましくは霊長類由来のものである。本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。 Examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic germ cells (EG cells), embryonic cancer cells (EC cells), and adult pluripotent stem cells. (APS cells) are included. In addition, pluripotent stem cells may include those derived from animals, insects, and the like, but are preferably derived from mammals, and more preferably derived from primates. The pluripotent stem cells used in the present invention are preferably ES cells or iPS cells.
ここで「多能性」とは、多分化能とも言い換えることができるが、外胚葉、中胚葉、内胚葉に属するいずれの分化細胞にも分化しうる能力、および外胚葉、中胚葉、内胚葉に属する少なくともそれぞれ一種の分化細胞に分化しうる性質をいい、生殖細胞への分化能も包含されうる。なお、分化細胞は、将来、体内の組織や臓器を構成する多種類の細胞に分化しうる。多能性を有するか否かは、例えば、ＰＡ６フィーダー細胞と多能性細胞とを共存下培養を行い、神経細胞に誘導されるか否かを評価すること、または各種分化マーカーの発現により判断することができる。 Here, “pluripotency” can be rephrased as pluripotency, but can differentiate into any differentiated cell belonging to ectoderm, mesoderm, endoderm, and ectoderm, mesoderm, endoderm. It can be differentiated into at least one type of differentiated cell belonging to each other, and can also include the ability to differentiate into germ cells. In the future, differentiated cells can differentiate into many types of cells that constitute tissues and organs in the body. Whether or not it has pluripotency is determined by, for example, performing culture in the presence of PA6 feeder cells and pluripotent cells and evaluating whether or not they are induced by nerve cells, or by expression of various differentiation markers. can do.
「未分化性」とは、まだ特定の細胞系列に分化していないことを意味し、幹細胞の階層的には比較的上位に位置する幹細胞が有する性状である。未分化性を有するか否かは、未分化細胞マーカー、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１を測定することにより判断することができる。 “Undifferentiated” means that the stem cell has not yet differentiated into a specific cell lineage, and is a property possessed by a stem cell located relatively higher in the hierarchy of the stem cell. Whether or not it has undifferentiation can be determined by measuring an undifferentiated cell marker, for example, Oct3 / 4, Nanog, Rex-1.
本発明に用いられるガン細胞とは、ガン由来の細胞を意味する。例えば、膵腺ガン由来細胞、乳腺ガン由来細胞、肝ガン由来細胞などが挙げられる。具体的には、Ｐａｎｃ１、Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２またはＭＣＦ７などが挙げられる。 The cancer cell used in the present invention means a cancer-derived cell. For example, pancreatic adenocarcinoma derived cells, mammary adenocarcinoma derived cells, liver cancer derived cells and the like can be mentioned. Specific examples include Panc1, Mia-Pa-Ca2, MCF7, and the like.
本発明に用いられる株化細胞とは、不死化した細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ；セルライン）を意味する。例えば、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞などが挙げられる。本発明の増殖抑制剤を用いることにより、無駄な継代を省くことができる。 The cell line used in the present invention means an immortalized cell line (cell line). Examples include STO cells and SNL cells. By using the growth inhibitor of the present invention, useless passage can be omitted.
本発明に用いられる初代培養細胞とは、生体から採取した組織や細胞を最初に播種して培養した細胞を意味する。本発明に用いられる有限細胞系とは、継代回数に制限（寿命）のある継代培養細胞を意味する。本発明の増殖抑制剤を用いることにより、性状の変化しやすい初代培養細胞や有限細胞系を、維持、保存することができる。 The primary cultured cells used in the present invention mean cells cultured by first seeding a tissue or cells collected from a living body. The finite cell system used in the present invention means a subcultured cell with a limited number of passages (lifetime). By using the growth inhibitor of the present invention, it is possible to maintain and preserve primary cultured cells and finite cell systems whose properties are easily changed.
本発明の増殖抑制剤は、生命活動を休止した状態での物質応答性試験や臨床検査に利用することが期待される。 The growth inhibitor of the present invention is expected to be used for substance responsiveness tests and clinical tests in a state where life activity is suspended.
本発明の一つの態様によれば、本発明の細胞増殖抑制剤を含んでなる、細胞培養用培地が提供される。 According to one aspect of the present invention, a cell culture medium comprising the cell growth inhibitor of the present invention is provided.
ここで「細胞培養用培地」とは、上記細胞の培養に適した培養用培地またはその組成物を意味し、細胞の生存に影響する重大な障害を与えることなく、その細胞の性状を保持したまま、細胞を一定数、一定期間生存させることを可能とするものである。細胞培養用培地は、粉末状であっても、液体状であってもよい。 Here, the “cell culture medium” means a culture medium suitable for culturing the cell or a composition thereof, and retains the properties of the cell without giving a serious obstacle affecting the survival of the cell. In this way, a certain number of cells can survive for a certain period. The cell culture medium may be in the form of powder or liquid.
本発明の細胞培養用培地におけるキシロースの含有量は特に制限はなく、培養する細胞の種類、培養目的、基礎培地の種類などに応じて、適宜変更することができる。培地におけるキシロースの含有量は、通常の基礎培地のグルコース量と同量であってもよく、好ましくは１．０〜１０．０ｇ／Ｌ、より好ましくは１．０〜５．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは３．０〜４．５ｇ／Ｌである。なお、本発明による培地中におけるキシロースの含有量が少量であっても、本発明は十分な効果を示すことができるが、キシロースは毒性がなく、水溶性にも優れるため、通常は多量に添加しても問題は実質的に生じない。 The xylose content in the cell culture medium of the present invention is not particularly limited and can be appropriately changed according to the type of cells to be cultured, the purpose of culture, the type of basal medium, and the like. The xylose content in the medium may be the same as the glucose amount in the normal basal medium, preferably 1.0-10.0 g / L, more preferably 1.0-5.0 g / L, Preferably it is 3.0-4.5 g / L. Even if the xylose content in the medium according to the present invention is small, the present invention can exhibit a sufficient effect. However, xylose is not toxic and is excellent in water solubility. However, there is virtually no problem.
本発明に用いられる培地は、従来の細胞培養に用いられる培地中のグルコースをキシロースに置換することにより得られる。具体的には、培地中のグルコースをキシロースに置換した基礎培地に、必要に応じて、血清または血清代替物または他の成分を添加することにより得られる。 The medium used in the present invention can be obtained by substituting glucose in the medium used for conventional cell culture with xylose. Specifically, it can be obtained by adding serum or a serum substitute or other components, if necessary, to a basal medium in which glucose in the medium is replaced with xylose.
ここで、基礎培地としては、例えば、培地中のグルコースをキシロースに置換したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＭＣＤＢ培地、フィッシャー培地、およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。 Here, examples of the basal medium include Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Eagle's minimum essential medium (MEM), Ham's F12 medium, MCDB medium, Fisher medium, and RPMI-1640 in which glucose in the medium is replaced with xylose. A culture medium is mentioned.
血清または血清代替物は、公知のものであればいずれのものも用いることができる。例えば、血清としては、ＦＢＳ、ＦＣＳなどが挙げられ、血清代替物としては、ＫＳＲなどが挙げられる。 Any known serum or serum substitute can be used. For example, examples of serum include FBS and FCS, and examples of serum substitutes include KSR.
他の成分としては、非必須アミノ酸、ｐＨ調整剤などが挙げられる。 Examples of other components include non-essential amino acids and pH adjusters.
基礎培地に添加する血清もしくは血清代替物または他の成分は、好ましくは、膜処理により糖質を除去したものである。膜処理は、例えば、透析膜 ３６／３２（エーディア株式会社製）を用いることにより行うことができる。 The serum or serum replacement or other components added to the basal medium are preferably those from which carbohydrates have been removed by membrane treatment. Membrane treatment can be performed, for example, by using a dialysis membrane 36/32 (manufactured by Adia Corporation).
また、本発明の一つの態様によれば、本発明の細胞増殖剤を含んでなる、多能性幹細胞維持用培地であって、キシロース以外の未分化維持因子を実質的に含まない多能性幹細胞維持用培地が提供される。 Moreover, according to one aspect of the present invention, there is provided a pluripotent stem cell maintenance medium comprising the cell proliferation agent of the present invention, which is substantially free of undifferentiated maintenance factors other than xylose. A medium for maintaining stem cells is provided.
ここで「多能性幹細胞維持用培地」とは、上記多能性幹細胞の培養に適した培養用培地またはその組成物を意味し、未分化の多能性幹細胞の未分化性と多能性とを保持しつつ、細胞を一定数のまま、一定期間生存可能とするものである。 Here, the “medium for maintaining pluripotent stem cells” means a culture medium suitable for culturing the pluripotent stem cells or a composition thereof, and the undifferentiated and pluripotent nature of undifferentiated pluripotent stem cells. While maintaining a constant number of cells, the cells can survive for a certain period.
本発明の多能性幹細胞用培地は、キシロースを有効成分とする細胞増殖抑制剤を含んでなるため、多能性幹細胞用培地に必須の成分とされているキシロース以外の未分化維持因子（例えば、ＬＩＦ、フィーダー細胞由来の未分化維持因子）を実質的に含まなくても、多能性幹細胞の未分化性と多能性とを保持することができる。 Since the medium for pluripotent stem cells of the present invention comprises a cell growth inhibitor containing xylose as an active ingredient, an undifferentiation maintenance factor other than xylose that is an essential component in the medium for pluripotent stem cells (for example, , LIF, feeder cell-derived undifferentiated maintenance factor) can be maintained without being differentiated and pluripotent in pluripotent stem cells.
本発明の一つの態様によれば、本発明の細胞培養用培地を使用して、細胞を維持することを含んでなる、細胞の増殖制御方法が提供される。 According to one aspect of the present invention, there is provided a method for controlling cell growth, comprising maintaining cells using the cell culture medium of the present invention.
ここで「細胞の増殖制御」とは、所望の時期に細胞の増殖能を停止させ、細胞の生存に影響する重大な障害を細胞に与えることなくその細胞濃度を維持させ、その後所望の時期に細胞の増殖を再開させることを意味する。具体的には、細胞の増殖制御は、本発明の細胞培養用培地と、通常の細胞培養用培地とを置換することによって行うことができる。ここで、細胞によっては、増殖再開後の増殖スピードを、通常培養と同レベル、またはそれ以上にすることができる。 Here, “cell growth control” means that the cell growth ability is stopped at a desired time, the cell concentration is maintained without giving the cell a serious obstacle affecting the survival of the cell, and then at the desired time. It means to resume cell growth. Specifically, cell growth control can be performed by replacing the cell culture medium of the present invention with a normal cell culture medium. Here, depending on the cells, the growth speed after resuming the growth can be set to the same level or higher than that in the normal culture.
細胞の増殖制御は、通常の細胞培養温度および環境条件で行ってもよい。 Cell growth control may be performed under normal cell culture temperature and environmental conditions.
細胞の増殖抑制期間は、培養する細胞の種類、培養目的、基礎培地の種類、培養温度などに応じて、適宜変更することができる。例えば、培地中のグルコースをキシロースに置換したＤＭＥＭを用いて通常の培養条件にて培養した場合、少なくとも１ヵ月は細胞の増殖を抑制することが期待でき、好ましくは少なくとも２６日間、より好ましくは少なくとも２１日間、さらに好ましくは少なくとも１４日間、さらにより好ましくは少なくとも８日間は、細胞の増殖を抑制することができる。 The cell growth inhibition period can be appropriately changed according to the type of cells to be cultured, the purpose of culture, the type of basal medium, the culture temperature, and the like. For example, when cultured under normal culture conditions using DMEM in which glucose in the medium is replaced with xylose, it can be expected to suppress cell growth for at least one month, preferably at least 26 days, more preferably at least Cell growth can be inhibited for 21 days, more preferably for at least 14 days, even more preferably for at least 8 days.
本発明の一つの態様によれば、本発明の多能性幹細胞未分化維持用培地を使用して細胞を維持することによって、多能性幹細胞の未分化性と多能性とを保持しつつ、細胞増殖を抑制することを含んでなる、多能性幹細胞の維持方法が提供される。 According to one aspect of the present invention, while maintaining cells using the pluripotent stem cell undifferentiated maintenance medium of the present invention, while maintaining the undifferentiated and pluripotency of pluripotent stem cells. There is provided a method for maintaining pluripotent stem cells, comprising inhibiting cell proliferation.
本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be described in detail by the following examples, but the present invention is not limited thereto.
例１：マウスＥＳ細胞での細胞増殖制御
（１）培地の調製
マウスＥＳ細胞（胚性幹細胞）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照ＥＳ培地（グルコースＥＳ培地）：
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１５容量％ ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、１００μＭ 非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１０３Ｕ／ｍＬ ＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、１００μＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明によるＥＳ培地（キシロースＥＳ培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１５容量％ ＫＳＲ（日水製薬株式会社より入手）、１００μＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液、１００μＭ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン
Example 1: Cell growth control using mouse ES cells (1) Preparation of medium The culture medium for mouse ES cell (embryonic stem cell) culture was prepared to have the following composition.
Control ES medium (glucose ES medium) :
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco BRL, Rockville, MD), 15 volume% KnockOut Serum Replacement (KSR; Invitorogen ), 100μM nonessential amino acids (Gibco BRL), 1mM sodium pyruvate solution (Gibco BRL), 10 3 U / ML LIF (Chemicon, Temecula, CA), 100 μM 2-mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
ES medium according to the present invention (xylose ES medium) :
Modified volume DMEM (M-DMEM, obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) in which glucose in DMEM is replaced with D-xylose, 15 volumes from which saccharides were removed by dialysis membrane (dialysis membrane 36/32, manufactured by Adia Corporation) % KSR (obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 100 μM non-essential amino acid, 1 mM sodium pyruvate solution, 100 μM 2-mercaptoethanol, 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin
（２）マウスＥＳ細胞の調製
マウスＥＳ細胞（１２９／ＳＶ系、Cell and Molecular Technologies, Philipsburg, NJ）は、０．１重量％ ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした細胞培養ディッシュ（６ウェルプレート、株式会社サンプラテックより入手）にて、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて不活性化させたＳＮＬフィーダー細胞（信州大学より入手）層上で、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養されたものを用いた。培地は、上記グルコースＥＳ培地を用い、培地交換を毎日行った。
(2) Preparation of mouse ES cells Mouse ES cells (129 / SV system, Cell and Molecular Technologies, Philipsburg, NJ) were cultured in a cell culture dish (6-well plate, Co., Ltd.) coated with 0.1 wt% gelatin (Sigma). What was cultured in the presence of 37%, 5% CO 2 on SNL feeder cells (obtained from Shinshu University) layer inactivated with mitomycin C (Sigma) Using. As the medium, the above-mentioned glucose ES medium was used, and the medium was changed every day.
（３）マウスＥＳ細胞の増殖抑制作用
ＥＳ細胞をＳＮＬフィーダー細胞上で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、マウスＥＳ細胞のコロニーのみを回収し、不活性化させたＳＮＬフィーダー細胞を播種した９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）上にＥＳ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、上記グルコースＥＳ培地を用いて２〜３日間培養し、再度コロニーを形成させた。
(3) Growth inhibitory action of mouse ES cells After culturing ES cells on SNL feeder cells, only a colony of mouse ES cells was recovered and inactivated using 0.1 wt% trypsin / 1 mM EDTA solution. ES cells were seeded on 96-well plates (obtained from AGC Techno Glass Co., Ltd.) seeded with SNL feeder cells, and cultured in the presence of 37 ° C. and 5% CO 2 for 2 to 3 days using the above glucose ES medium. And colonies were formed again.
コロニー形成後に、一方の培地を、キシロースＥＳ培地に置換して、培養した（「培養後０日目」とする）。 After colony formation, one medium was replaced with xylose ES medium and cultured (referred to as “day 0 after culture”).
培養後８日目に、キシロースＥＳ培地で培養したＥＳ細胞コロニーは、培地をグルコースＥＳ培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。 On the 8th day after the culture, ES cell colonies cultured in xylose ES medium were further cultured for 8 days by replacing the medium with glucose ES medium. Medium change was performed every day during the culture period.
培養後０、１、４、８日目およびグルコースＥＳ培地へ置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、それぞれの培地で培養したＥＳ細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ行った。 The viability of ES cells cultured in each medium on days 0, 1, 4, and 8 after culture and on days 1, 4, and 8 after replacement with glucose ES medium (days 9, 12, and 16) Measured by MTT assay. The MTT assay was performed 6 wells each time.
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて、製品マニュアルに従って測定した。具体的には、９６ウェルプレートで培養した細胞の培地１００μＬを新鮮な培地に交換し、これに対してＭＴＴ試薬を１０μＬ添加後４時間インキュベートした。その後、生細胞が生成するホルマザン色素（青色）を、可溶化液（０．０４Ｎ ＨＣｌ／イソプロパノール）を加えてピペッティングを数回行って溶解させ、プレートリーダーを用いて吸光波長５７０ｎｍとリファレンス波長６３０ｎｍを用いて測定した。生存率は、培養後０日目を１００％として、それぞれの平均値±標準偏差を算出した。結果を図１ＡおよびＢに示す。
MTT assay Measured using MTT Cell Growth Assay Kit (Chemicon) according to the product manual. Specifically, 100 μL of the cell culture medium cultured in a 96-well plate was replaced with a fresh medium, and 10 μL of MTT reagent was added thereto, followed by incubation for 4 hours. Thereafter, formazan dye (blue) produced by living cells is dissolved by adding a solubilizing solution (0.04N HCl / isopropanol) and pipetting several times, and using a plate reader, the absorption wavelength is 570 nm and the reference wavelength is 630 nm. It measured using. As for the survival rate, the average value ± standard deviation of each was calculated with the 0th day after the culture as 100%. The results are shown in FIGS. 1A and B.
（４）マウスＥＳ細胞の性状試験
上記（３）と同様に、マウスＥＳ細胞のコロニーのみを回収し、不活化させたＳＮＬフィーダー細胞を播種した６ウェルプレート（株式会社サンプラテックより入手）に、ＥＳ細胞を２．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、上記グルコースＥＳ培地を用いて２〜３日間培養し、再度コロニーを形成させた。コロニー形成後に、一方の培地をキシロースＥＳ培地に置換して、培養した（「培養後０日目」とする）。培地交換は毎日行った。
(4) Property test of mouse ES cells As in the above (3), only a colony of mouse ES cells was collected and inactivated SNL feeder cells were seeded on a 6-well plate (obtained from Samplertech Co., Ltd.). Cells were seeded at 2.0 × 10 4 cells / well and cultured for 2 to 3 days in the presence of 37 ° C. and 5% CO 2 in the above glucose ES medium to form colonies again. . After colony formation, one medium was replaced with xylose ES medium and cultured (referred to as “day 0 after culture”). The medium was changed every day.
それぞれのマウスＥＳ細胞コロニー形態の観察、遺伝子発現の解析（ＲＴ−ＰＣＲ）および蛍光免疫染色による分化傾向の確認を行った。 Each mouse ES cell colony morphology was observed, gene expression analysis (RT-PCR) and differentiation tendency were confirmed by fluorescent immunostaining.
コロニー形態の観察
培養後０日目、４日目、８日目のＥＳ細胞コロニーの形態を光学顕微鏡（ＩＸ７０、オリンパス株式会社製）で観察した。結果を図２に示す。
Observation of colony morphology The morphology of ES cell colonies on day 0, day 4, and day 8 after culture was observed with an optical microscope (IX70, manufactured by Olympus Corporation). The results are shown in FIG.
遺伝子発現の解析（ＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて抽出した。抽出したＲＮＡからＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡサンプルは、下記表１のプライマーの内Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｈｙｕｒｙ、Ｆｏｘａ２、β−ａｃｔｉｎを用いて、増幅した（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ、タカラバイオ株式会社製）。
Gene expression analysis (RT-PCR)
Total RNA was extracted using TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA). CDNA was prepared from the extracted RNA using Super Script II (Invitrogen). The cDNA sample was amplified using Oct3 / 4, Nanog, Rex-1, Nestin, Brahyury, Foxa2, and β-actin among the primers shown in Table 1 below (Thermal Cycler Dice, manufactured by Takara Bio Inc.).
結果を図３に示す。結果から明らかなように、未分化マーカーの発現が確認された。 The results are shown in FIG. As is clear from the results, the expression of undifferentiated markers was confirmed.
蛍光免疫染色
培養後８日目のＥＳ細胞を４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３０分間固定した。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳを用いて透過処理を行い、１．５％正常ロバ血清または正常ヤギ血清で処理した。その後、一次抗体として、マウス抗Ｏｃｔ３／４（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）およびウサギ抗Ｆｏｘａ２（１：８００,Ｃｅｌl Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、４℃で一晩反応させ、洗浄後、二次抗体として、フルオレセインまたはＴＲＩＴＣ接合ＩｇＧで染色した。その後、ＤＡＰＩを用いて核染色した。結果を図４に示す。
ES cells 8 days after the fluorescence immunostaining culture were fixed with 4% paraformaldehyde / phosphate buffer (PBS, pH 7.4) for 30 minutes. Permeabilization was performed with 0.1% Triton X-100 / PBS and treated with 1.5% normal donkey serum or normal goat serum. Thereafter, mouse anti-Oct3 / 4 (1: 100, Santa Cruz Biptechnology, Santa Cruz, CA) and rabbit anti-Foxa2 (1: 800, Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) were used as primary antibodies. The mixture was reacted overnight at 0 ° C., washed, and then stained with fluorescein or TRITC-conjugated IgG as a secondary antibody. Thereafter, nuclear staining was performed using DAPI. The results are shown in FIG.
（５）ＥＢの形成
マウスＥＢ（胚様体）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照ＥＢ培地（グルコースＥＢ培地）：
ＤＭＥＭ、２０容量％ ＦＢＳ、１００μＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液、１００μＭ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン
本発明によるＥＢ培地（キシロースＥＢ培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜により除去した２０容量％ ＦＢＳ、１００μＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム溶液、１００μＭ ２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン
(5) Formation of EB Each mouse EB (embryoid body) culture medium was prepared to have the following composition.
Control EB medium (glucose EB medium) :
DMEM, 20 vol% FBS, 100 μM non-essential amino acids, 1 mM sodium pyruvate solution, 100 μM 2-mercaptoethanol, 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin
EB medium according to the present invention (xylose EB medium) :
Modified DMEM in which glucose in DMEM is replaced with D-xylose (M-DMEM, obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 20% by volume FBS with carbohydrates removed by dialysis membrane, 100 μM non-essential amino acid, 1 mM sodium pyruvate Solution, 100 μM 2-mercaptoethanol, 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin
ＥＳ細胞をＳＮＬフィーダー細胞上で培養後、マウスＥＳ細胞コロニーのみを回収し、ハンギングドロップ法により、上記グルコースＥＢ培地およびキシロースＥＢ培地を用いて、ＥＢ（胚様体）を形成した。ここでグルコースＥＢ培地は、１０３Ｕ／ｍｌ ＬＩＦをさらに添加したグルコースＥＢ ＬＩＦ＋培地と、添加しないグルコースＥＢ ＬＩＦ−培地とを用いた。 After culturing ES cells on SNL feeder cells, only mouse ES cell colonies were collected and EBs (embryoid bodies) were formed by the hanging drop method using the glucose EB medium and xylose EB medium. Here, as the glucose EB medium, a glucose EB LIF + medium further added with 10 3 U / ml LIF and a glucose EB LIF- medium not added were used.
培養後５日目にＥＢを回収した。回収したＥＢは、各ＥＢ培地を満たしたゼラチンコート細胞培養プレートでさらに培養し、回収後２１日間（培養後２６日間）、ＥＢ形態の観察、遺伝子発現の解析（ＲＴ−ＰＣＲ）、蛍光免疫染色による分化傾向の確認を行った。 EBs were collected on the fifth day after culturing. The collected EBs are further cultured on gelatin-coated cell culture plates filled with each EB medium, and after collection for 21 days (26 days after culture), EB morphology observation, gene expression analysis (RT-PCR), fluorescent immunostaining The differentiation tendency was confirmed.
ＥＢ形態の観察
回収後０日目、４日目、８日目（培養後５日目、９日目、１３日目）のＥＢの形態を光学顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。結果に示されるように、グルコースＥＢ培地を用いたものは、伸展したが、キシロースＥＢ培地を用いたものは形態の変化が少なかった。
Observation of EB morphology The morphology of EBs on the 0th, 4th, and 8th days (5th, 9th, and 13th days after culture) was observed with an optical microscope. The results are shown in FIG. As shown in the results, those using the glucose EB medium stretched, but those using the xylose EB medium had little change in form.
遺伝子発現の解析（ＲＴ−ＰＣＲ）
回収後４日目、７日目、１４日目（培養後９日目、１２日目、１９日目）のＥＢについて、上記（４）に記載の方法と同様の方法で、上記表１のプライマーの内Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｂｒａｈｙｕｒｙ、Ｆｏｘａ２、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、β−ａｃｔｉｎを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を図６に示す。
Gene expression analysis (RT-PCR)
The EBs on the 4th, 7th, and 14th days after collection (9th, 12th, and 19th days after the culture) were obtained in the same manner as described in (4) above. RT-PCR was performed using Oct3 / 4, Nanog, Rex-1, Nestin, Googlesec, Brahury, Foxa2, AFP, GATA4, and β-actin among the primers. The results are shown in FIG.
蛍光免疫染色
回収後８日目、２１日目（培養後１３日目、２６日目）のＥＢについて、一次抗体として、マウス抗Ｏｃｔ３／４（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ウサギ抗Ｆｏｘａ２（１：８００,Ｃｅｌl Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ヤギ抗Ｓｏｘ１７（１：２００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、およびウサギ抗Ｎａｎｏｇ（１：２００，ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ Ｉｎｃ，横浜、日本）を用いる以外は、上記（４）に記載の方法と同様の方法で、蛍光免疫染色を行った。
（６）ＥＳ細胞の神経細胞への分化誘導試験
神経系細胞へ分化誘導するために、ＳＮＬフィーダー細胞上で培養したＥＳ細胞を、マイトマイシンＣ処理したＰＡ６フィーダー細胞（理研ＢＲＣより入手）上に播種し、ＬＩＦを含まない上記グルコースＥＳ培地またはキシロースＥＳ培地で２１日間培養した。
As the primary antibody for EBs on days 8 and 21 after collection of fluorescent immunostaining (13 days and 26 days after culture), mouse anti-Oct3 / 4 (1: 100, Santa Cruz Biptechnology, Santa Cruz, CA) Rabbit anti-Foxa2 (1: 800, Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), Goat anti-Sox17 (1: 200, Santa Cruz Biptechnology, Santa Cruz, CA), and Rabbit anti-Nanoc1: EL , Yokohama, Japan) was used for fluorescent immunostaining in the same manner as described in (4) above.
(6) Differentiation induction test of ES cells into neural cells In order to induce differentiation into neural cells, ES cells cultured on SNL feeder cells were seeded on PA6 feeder cells treated with mitomycin C (obtained from RIKEN BRC). Then, the cells were cultured in the above glucose ES medium or xylose ES medium not containing LIF for 21 days.
培養から４、７、１４日目に、上記（４）と同様の方法で、グルコースＥＳ培地およびキシロースＥＳ培地それぞれのＥＳ細胞の形態観察、遺伝子発現の解析（ＲＴ−ＰＣＲ）、蛍光免疫染色を行った。ここで、ＲＴ−ＰＣＲでは、上記表１のプライマーの内Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｐａｘ−６、β−ａｃｔｉｎを用いた。また蛍光免疫染色では、一次抗体として、マウス抗Ｏｃｔ３／４（１：１００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ウサギ抗Ｎａｎｏｇ（１：２００，ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ Ｉｎｃ，横浜、日本）、マウス抗神経クラスＩＩＩβ−チューブリン（クローンＴｕｊ１，１：５００，マウスＩｇＧ２ａ、Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｂｅｒｋｌｅｙ，ＣＡ）、およびウサギ抗ＭＡＰ２（１：１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を用いた。結果を図８〜１０に示す。結果に示されるように、キシロースＥＳ培地では、ＥＳ細胞は神経細胞へ分化誘導されなかった。 On the 4th, 7th, and 14th days after culture, in the same manner as in (4) above, morphological observation of each ES cell, analysis of gene expression (RT-PCR), and fluorescent immunostaining were performed in the glucose ES medium and xylose ES medium. went. Here, in RT-PCR, Oct3 / 4, Nanog, Rex-1, Nestin, Pax-6, and β-actin among the primers shown in Table 1 above were used. In fluorescent immunostaining, as primary antibodies, mouse anti-Oct3 / 4 (1: 100, Santa Cruz Biptechnology, Santa Cruz, CA), rabbit anti-Nanog (1: 200, ReproCELL Inc, Yokohama, Japan), mouse anti-neural class IIIβ-tubulin (clone Tuj1, 1: 500, mouse IgG2a, Covance, Berkley, CA) and rabbit anti-MAP2 (1: 100, Chemicon, Temecula, CA) were used. The results are shown in FIGS. As shown in the results, ES cells were not induced to differentiate into neurons in xylose ES medium.
例２：ヒトｉＰＳ細胞の細胞増殖制御
（１）培地の調製
ヒトｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコースｉＰＳ培地）：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、２０容量％ ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロースｉＰＳ培地）：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した２０容量％ ＫＳＲ（日水製薬株式会社より入手）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
Example 2: Cell growth control of human iPS cells (1) Preparation of medium The culture medium for human iPS cell (artificial pluripotent stem cells) was prepared so as to have the following composition, respectively.
Control medium (glucose iPS medium) :
DMEM / F12 (Gibco BRL, Rockville, MD), 20% by volume KSR (Invitrogen), 2 mM L-glutamine, 100 μM β-mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
Medium according to the present invention (xylose iPS medium) :
Modified DMEM / F12 (M-DMEM, obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) in which glucose in DMEM / F12 is replaced with D-xylose, and saccharides by dialysis membrane (dialysis membrane 36/32, manufactured by Adia Corporation) Removed 20% by volume KSR (obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 2 mM L-glutamine, 100 μM β-mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
（２）ヒトｉＰＳ細胞の調製
ヒトｉＰＳ細胞として、エーラスダンロス症候群患者由来の疾患ｉＰＳ細胞（信州大学より入手）（以下、「Ｐ−ｉＰＳ」という）を用いた。Ｐ−ｉＰＳ細胞は、０．１重量％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でコートした細胞培養ディッシュ（６ウェルプレート、サンプラテック株式会社より入手）にて、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて不活性化させたＭＥＦフィーダー細胞（オリエンタル酵母工業株式会社より入手）層上で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培地は、上記グルコースｉＰＳ培地を用い、培地交換を毎日行った。
(2) Preparation of human iPS cells Disease iPS cells (obtained from Shinshu University) (hereinafter referred to as “P-iPS”) derived from patients with Erasdanros syndrome were used as human iPS cells. P-iPS cells were MEF feeders inactivated with mitomycin C (Sigma) in a cell culture dish (6-well plate, obtained from Samplertech Co., Ltd.) coated with 0.1 wt% gelatin (Sigma). It was cultured on a cell (obtained from Oriental Yeast Co., Ltd.) layer in the presence of 37 ° C. and 5% CO 2 . The glucose iPS medium was used as the medium, and the medium was changed every day.
（３）ヒトｉＰＳ細胞の増殖抑制作用
Ｐ−ｉＰＳ細胞をＭＥＦフィーダー細胞上で培養後、０．２５重量％ トリプシンおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ IV（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｐ−ｉＰＳ細胞のコロニーのみを回収し、不活性化させたＭＥＦフィーダー細胞を播種した９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）上に、Ｐ−ｉＰＳ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、上記グルコースｉＰＳ培地を用いて４日間培養して再度コロニーを形成させた。
(3) Antiproliferative action of human iPS cells After culturing P-iPS cells on MEF feeder cells, colonies of P-iPS cells were used using 0.25 wt% trypsin and 0.1 mg / mL collagenase IV (Invitrogen). P-iPS cells were seeded on a 96-well plate (obtained from AGC Techno Glass Co., Ltd.) seeded with inactivated MEF feeder cells and collected at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . Then, the above-mentioned glucose iPS medium was cultured for 4 days to form colonies again.
コロニー形成後に、一方の培地をキシロースｉＰＳ培地に置換して培養した（「培養後０日目」とする）。 After colony formation, one medium was replaced with xylose iPS medium and cultured (referred to as “day 0 after culture”).
培養後８日目に、キシロースｉＰＳ培地で培養したＰ−ｉＰＳ細胞は、培地をグルコースｉＰＳ培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。 On the 8th day after culturing, P-iPS cells cultured in xylose iPS medium were further cultured for 8 days by replacing the medium with glucose iPS medium. Medium change was performed every day during the culture period.
培養後０、１、４、８日目およびグルコース培地置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ、上記例１（３）と同様の方法で行った。結果を図１１ＡおよびＢに示す。 Cell viability was measured by MTT assay on days 0, 1, 4, and 8 after culture and on days 1, 4, and 8 (9, 12, and 16 days after culture) after replacement of glucose medium. The MTT assay was performed in the same manner as in Example 1 (3), 6 wells each time. The results are shown in FIGS. 11A and B.
例３：ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｐａｎｃ１）の細胞増殖制御
（１）培地の調製
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｐａｎｃ１）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
Example 3: Cell growth control of human pancreatic adenocarcinoma-derived cells (Pancl) (1) Preparation of medium Human pancreatic adenocarcinoma-derived cell (Pancl) culture media were prepared to have the following composition.
Control medium (glucose medium) :
DMEM (Gibco BRL, Rockville, MD), 10 vol% FBS (Gibco BRL), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
Medium according to the invention (xylose medium) :
Modified volume DMEM (M-DMEM, obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) in which glucose in DMEM is replaced with D-xylose, 10 volumes from which carbohydrates were removed by dialysis membrane (dialysis membrane 36/32, manufactured by Adia Corporation) % FBS (obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
（２）ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｐａｎｃ１）の増殖抑制作用
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｐａｎｃ１）（信州大学より入手）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、Ｐａｎｃ１細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
(2) Growth-inhibiting action of human pancreatic adenocarcinoma-derived cells (Pancl) After culturing human pancreatic adenocarcinoma-derived cells (Pancl) (obtained from Shinshu University) in the above glucose medium, a 0.1 wt% trypsin / 1 mM EDTA solution was added. In this method, only Pancl cells were collected and seeded in a 96-well plate (obtained from AGC Techno Glass Co., Ltd.) coated with 0.1 wt% gelatin so as to be 1.0 × 10 4 cells / well. The cells were cultured at 5 ° C. in the presence of 5% CO 2 . As the medium, the glucose medium and the xylose medium were used.
培養後８日目に、キシロース培地で培養したＰａｎｃ１細胞は、培地をグルコース培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。 On day 8 after culturing, Pancl cells cultured in xylose medium were further cultured for 8 days by replacing the medium with glucose medium. Medium change was performed every day during the culture period.
培養後０、１、４、８日目およびグルコース培地置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ、上記例１（３）と同様の方法で行った。結果を図１２ＡおよびＢに示す。 Cell viability was measured by MTT assay on days 0, 1, 4, and 8 after culture and on days 1, 4, and 8 (9, 12, and 16 days after culture) after replacement of glucose medium. The MTT assay was performed in the same manner as in Example 1 (3), 6 wells each time. The results are shown in FIGS. 12A and B.
また、培養後３日目の形態を光学顕微鏡で観察した。結果を図１３に示す。 Further, the morphology on the third day after the culture was observed with an optical microscope. The results are shown in FIG.
例４：ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２）の細胞増殖制御
（１）培地の調製
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
Example 4: Cell growth control of human pancreatic adenocarcinoma-derived cells (Mia-Pa-Ca2) (1) Preparation of medium The culture medium for human pancreatic adenocarcinoma-derived cells (Mia-Pa-Ca2) has the following composition. Prepared.
Control medium (glucose medium) :
DMEM (Gibco BRL, Rockville, MD), 10 vol% FBS (Gibco BRL), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
Medium according to the invention (xylose medium) :
Modified volume DMEM (M-DMEM, obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) in which glucose in DMEM is replaced with D-xylose, 10 volumes from which carbohydrates were removed by dialysis membrane (dialysis membrane 36/32, manufactured by Adia Corporation) % FBS (obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
（２）ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２）の増殖抑制作用
ヒト膵腺ガン由来細胞（Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２）（信州大学より入手）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、Ｍｉａ−Ｐａ−Ｃａ２細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
(2) Growth inhibitory action of human pancreatic adenocarcinoma-derived cells (Mia-Pa-Ca2) After culturing human pancreatic adenocarcinoma-derived cells (Mia-Pa-Ca2) (obtained from Shinshu University) in the above glucose medium, 0.1 Using a wt% trypsin / 1 mM EDTA solution, only Mia-Pa-Ca2 cells were collected and coated with 0.1 wt% gelatin on a 96 well plate (obtained from AGC Techno Glass Co., Ltd.) at 1.0 × 10 The cells were seeded at 4 cells / well and cultured in the presence of 37 ° C. and 5% CO 2 . As the medium, the glucose medium and the xylose medium were used.
培養後８日目に、キシロース培地で培養したＭｉａ−Ｐａ−Ｃａ２細胞は、培地をグルコース培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。 On the 8th day after culturing, Mia-Pa-Ca2 cells cultured in a xylose medium were further cultured for 8 days by replacing the medium with a glucose medium. Medium change was performed every day during the culture period.
培養後０、１、４、８日目およびグルコース培地置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ、上記例１（３）と同様の方法で行った。結果を図１４ＡおよびＢに示す。 Cell viability was measured by MTT assay on days 0, 1, 4, and 8 after culture and on days 1, 4, and 8 (9, 12, and 16 days after culture) after replacement of glucose medium. The MTT assay was performed in the same manner as in Example 1 (3), 6 wells each time. The results are shown in FIGS. 14A and B.
例５：ヒト乳腺ガン由来細胞（ＭＣＦ７）の細胞増殖制御
（１）培地の調製
ヒト乳腺ガン由来細胞（ＭＣＦ７）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
Example 5: Cell growth control of human breast cancer-derived cells (MCF7) (1) Preparation of medium Human breast cancer-derived cell (MCF7) culture media were prepared to have the following formulations, respectively.
Control medium (glucose medium) :
DMEM (Gibco BRL, Rockville, MD), 10 vol% FBS (Gibco BRL), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
Medium according to the invention (xylose medium) :
Modified volume DMEM (M-DMEM, obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) in which glucose in DMEM is replaced with D-xylose, 10 volumes from which carbohydrates were removed by dialysis membrane (dialysis membrane 36/32, manufactured by Adia Corporation) % FBS (obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
（２）ヒト乳腺ガン由来細胞（ＭＣＦ７）の増殖抑制作用
ヒト乳腺ガン由来細胞（ＭＣＦ７細胞）（ＥＣＡＣＣ）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、ＭＣＦ７細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
(2) Growth inhibitory action of human breast cancer-derived cells (MCF7) After culturing human breast cancer-derived cells (MCF7 cells) (ECACC) in the above glucose medium, MCF7 was added using 0.1 wt% trypsin / 1 mM EDTA solution. Only the cells were collected and seeded in a 96-well plate (obtained from AGC Techno Glass Co., Ltd.) coated with 0.1% by weight gelatin so as to be 1.0 × 10 4 cells / well, 37 ° C., 5% Culturing was carried out in the presence of CO 2 . As the medium, the glucose medium and the xylose medium were used.
培養後８日目に、キシロース培地で培養したＭＣＦ７細胞は、培地をグルコース培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。 On the 8th day after culturing, MCF7 cells cultured in xylose medium were further cultured for 8 days by replacing the medium with glucose medium. Medium change was performed every day during the culture period.
培養後０、１、４、８日目およびグルコース培地置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ、上記例１（３）と同様の方法で行った。結果を図１５ＡおよびＢに示す。 Cell viability was measured by MTT assay on days 0, 1, 4, and 8 after culture and on days 1, 4, and 8 (9, 12, and 16 days after culture) after replacement of glucose medium. The MTT assay was performed in the same manner as in Example 1 (3), 6 wells each time. The results are shown in FIGS. 15A and B.
例６：マウス繊維芽細胞（ＳＮＬ）の細胞増殖制御
（１）培地の調製
マウス繊維芽細胞（ＳＮＬ）培養用培地はそれぞれ下記の配合となるように調製した。
対照培地（グルコース培地）：
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０容量％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
本発明による培地（キシロース培地）：
ＤＭＥＭ中のグルコースをＤ−キシロースに置換した変法ＤＭＥＭ（Ｍ−ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社より入手）、糖質を透析膜（透析膜 ３６／３２、エーディア株式会社製）により除去した１０容量％ ＦＢＳ（日水製薬株式会社より入手）、５０Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
Example 6: Control of cell growth of mouse fibroblasts (SNL) (1) Preparation of medium The culture medium for mouse fibroblast (SNL) was prepared so as to have the following composition.
Control medium (glucose medium) :
DMEM (Gibco BRL, Rockville, MD), 10 vol% FBS (Gibco BRL), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
Medium according to the invention (xylose medium) :
Modified volume DMEM (M-DMEM, obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) in which glucose in DMEM is replaced with D-xylose, 10 volumes from which carbohydrates were removed by dialysis membrane (dialysis membrane 36/32, manufactured by Adia Corporation) % FBS (obtained from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 50 U / mL penicillin, and 50 μg / mL streptomycin (Gibco BRL)
（２）マウス繊維芽細胞（ＳＮＬ）の増殖抑制作用
ＳＮＬ細胞（信州大学より入手）を上記グルコース培地で培養後、０．１重量％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて、ＳＮＬ細胞のみを回収し、０．１重量％ゼラチンでコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社より入手）に、１．０×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、培養した。培地は、上記グルコース培地とキシロース培地とを用いた。
(2) Inhibition of growth of mouse fibroblasts (SNL) After culturing SNL cells (obtained from Shinshu University) in the above glucose medium, only SNL cells were collected using 0.1 wt% trypsin / 1 mM EDTA solution. , Seeded in a 96-well plate (obtained from AGC Techno Glass Co., Ltd.) coated with 0.1% gelatin by 1.0 × 10 4 cells / well, in the presence of 37 ° C. and 5% CO 2. And cultured. As the medium, the glucose medium and the xylose medium were used.
培養後８日目に、キシロース培地で培養したＳＮＬ細胞は、培地をグルコース培地に置換して、さらに８日間培養した。培養期間中、培地交換を毎日行った。 On the 8th day after the culture, the SNL cells cultured in the xylose medium were further cultured for 8 days by replacing the medium with a glucose medium. Medium change was performed every day during the culture period.
培養後０、１、４、８日目およびグルコース培地置換後１、４、８日目（培養後９、１２、１６日目）に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴアッセイは、各回、６ウェルずつ、上記例１（３）と同様の方法で行った。結果を図１６ＡおよびＢに示す。 Cell viability was measured by MTT assay on days 0, 1, 4, and 8 after culture and on days 1, 4, and 8 (9, 12, and 16 days after culture) after replacement of glucose medium. The MTT assay was performed in the same manner as in Example 1 (3), 6 wells each time. The results are shown in FIGS. 16A and B.
Claims (7)
キシロース以外の未分化維持因子を実質的に含まない多能性幹細胞維持用培地。 A medium for maintaining pluripotent stem cells, comprising the cell growth inhibitor according to claim 2,
A medium for maintaining pluripotent stem cells substantially free of undifferentiated maintenance factors other than xylose.
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| JPN6016009595; 実験医学別冊 目的別で選べる細胞培養プロトコール , 20120320, ２１２, 株式会社羊土社 * |
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