JP2013220083A - Hepatic glucose-producing monitor mouse - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターすることが可能なトランスジェニック非ヒト動物およびそれを用いた肝糖産生をモニターする方法に関する。 The present invention relates to a transgenic non-human animal capable of easily and efficiently monitoring liver glucose production and a method for monitoring liver glucose production using the same.
今日、糖尿病患者の世界的増加を背景として、肝臓における糖産生（以下、「肝糖産生」と記載）を制御するのに有効な薬剤の探索・開発が求められている。 Today, against the background of the global increase in diabetes patients, there is a demand for the search and development of drugs effective in controlling the sugar production in the liver (hereinafter referred to as “liver sugar production”).
通常、このような薬剤の探索・開発においては、実験動物が用いられており、被験物質を投与された動物の肝糖産生の変化を指標にして、当該被験物質の効果が評価される。 Usually, in the search and development of such drugs, experimental animals are used, and the effect of the test substance is evaluated using the change in hepatic sugar production of the animal administered the test substance as an index.
従来的に、肝糖産生の評価に際しては、高インスリン正常血糖クランプ法、ピルビン酸負荷法、肝糖産生酵素量測定法が用いられている。 Conventionally, when evaluating hepatic glucose production, a high insulin normoglycemic clamp method, a pyruvate loading method, and a hepatic glucose producing enzyme amount measuring method are used.
しかしながら、高インスリン正常血糖クランプ法は、実験動物への静脈内カニューレの留置といった特殊技術を要すること、検査中血糖値を一定に保つために5〜10分ごとに採血を行わなければならず操作が煩雑であること、これらの操作により実験動物に多大なストレスを与えること、といった問題を有する。また、ピルビン酸負荷法は、精度が低くデータのばらつきが大きいこと、そのため正確な測定値を得るためには大量の実験動物を必要とすること、また、得られる結果が肝糖産生のみを反映するものではない、といった問題を有する。そして、肝糖産生酵素量測定法においては、被験物質の評価に際して実験動物の長期飼育が必要であること、肝糖産生に関与する酵素量を測定するに際して、肝臓の摘出が必要であり、同一個体で経時的に評価・検討することができないこと、またデータのばらつきが大きい、といった問題を有する。
したがって、当該分野においては、簡便かつ効率的な肝糖産生のモニター方法が求められていた。
However, the high insulin normoglycemic clamp method requires special techniques such as placement of an intravenous cannula in an experimental animal, and blood must be collected every 5 to 10 minutes to keep the blood glucose level constant during the test. Has a problem that it is complicated and that these operations give great stress to the experimental animal. In addition, the pyruvate loading method has low accuracy and large data variability, so that it requires a large amount of experimental animals to obtain accurate measurement values, and the results obtained reflect only liver glucose production. There is a problem of not doing. And, in the method for measuring the amount of liver glucose-producing enzyme, it is necessary to keep a laboratory animal for a long time when evaluating a test substance, and when measuring the amount of enzyme involved in liver glucose production, the liver must be excised. There are problems that the individual cannot be evaluated and examined over time, and that data variation is large.
Accordingly, there has been a need in the art for a simple and efficient method for monitoring liver glucose production.
本発明は、実験動物における肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターする方法を提供する。 The present invention provides a method for conveniently and efficiently monitoring hepatic glucose production in experimental animals.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されているトランスジェニック非ヒト動物を作製し、当該トランスジェニック非ヒト動物を用いることによって、簡便かつ効率的に肝糖産生をモニターできることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that a transgene in which a gene encoding a secretory reporter protein is introduced under the control of a glucose-6-phosphatase promoter in a liver-specific manner. By producing a transgenic non-human animal and using the transgenic non-human animal, it was found that hepatic glucose production can be monitored easily and efficiently, and the present invention has been completed.
本発明は以下を包含する。
［１］ グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に、2つの部位特異的組換え酵素の認識部位に挟まれたスタッファー配列、および分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が5’側よりこの順に含まれるDNAが導入されている第一の遺伝子組換え非ヒト動物またはその子孫と、肝臓特異的プロモーターの制御下に部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含むDNAが導入された、該第一の遺伝子組換え非ヒト動物と同種の第二の遺伝子組換え非ヒト動物またはその子孫を交配する工程を含む、肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下において分泌型のレポータータンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物の作出方法。
［２］ 分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子および部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子をホモまたはヘテロに有する動物をスクリーニングする工程をさらに含む、［１］の方法。
［３］ 肝臓において、スタッファー配列が除去されている動物をスクリーニングする工程をさらに含む、［１］または［２］の方法。
［４］ 得られたトランスジェニック非ヒト動物が、肝糖産生をモニターするために利用される、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ 部位特異的組換え酵素がCre酵素であり、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］ レポータータンパク質がルシフェラーゼである、［１］〜［５］のいずれかの方法。
［７］ 非ヒト動物がげっ歯類である、［１］〜［６］のいずれかの方法。
［８］ ［１］〜［７］のいずれかの方法により作出された、トランスジェニック非ヒト動物。
［９］ 肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されている、肝糖産生をモニターするためのトランスジェニック非ヒト動物。
［１０］ 肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下において分泌型のレポータータンパク質を発現する、［９］のトランスジェニック非ヒト動物。
［１１］ ［８］〜［１０］のいずれかのトランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプル中のレポータータンパク質の量を測定することを含む、該トランスジェニック非ヒト動物の肝糖産生をモニターする方法。
［１２］ トランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプルが血液である、［１１］の方法。
［１３］ ［８］〜［１０］のいずれかのトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与する工程、該トランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプル中のレポータータンパク質の量を測定する工程、該トランスジェニック非ヒト動物の肝糖産生をモニターして、該被験物質が肝糖産生に与える影響を評価する工程を含む、肝糖産生に影響を与える物質のスクリーニング方法。
［１４］ トランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプルが血液である、［１３］の方法。
The present invention includes the following.
[1] Under the control of the glucose-6-phosphatase promoter, a stuffer sequence sandwiched between the recognition sites of two site-specific recombinases and a gene encoding a secreted reporter protein are included in this order from the 5 'side. The first transgenic non-human animal or its progeny into which the DNA to be introduced is introduced, and the DNA containing the gene encoding the site-specific recombinant enzyme under the control of the liver-specific promoter, A liver-specific reporter protein under the control of a glucose-6-phosphatase promoter, comprising the step of mating a second genetically modified non-human animal of the same species with the transgenic non-human animal or a progeny thereof. A method for producing a transgenic non-human animal to be expressed.
[2] The method according to [1], further comprising a step of screening an animal having a gene encoding a secreted reporter protein and a gene encoding a site-specific recombinase homo or hetero.
[3] The method of [1] or [2], further comprising the step of screening an animal from which the stuffer sequence has been removed in the liver.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the obtained transgenic non-human animal is used for monitoring hepatic glucose production.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the site-specific recombinase is a Cre enzyme, and the recognition site of the site-specific recombinase is a loxP sequence.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the reporter protein is luciferase.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the non-human animal is a rodent.
[8] A transgenic non-human animal produced by the method according to any one of [1] to [7].
[9] A transgenic non-human animal for monitoring liver glucose production, wherein a gene encoding a secreted reporter protein is introduced under the control of a glucose-6-phosphatase promoter in a liver-specific manner.
[10] The transgenic non-human animal of [9], wherein the secretory reporter protein is expressed specifically under the control of a glucose-6-phosphatase promoter in the liver.
[11] A method for monitoring hepatic sugar production in a transgenic non-human animal, comprising measuring the amount of a reporter protein in a sample derived from the transgenic non-human animal according to any one of [8] to [10] .
[12] The method of [11], wherein the sample derived from the transgenic non-human animal is blood.
[13] A step of administering a test substance to the transgenic non-human animal of any of [8] to [10], a step of measuring the amount of reporter protein in a sample derived from the transgenic non-human animal, the trans A method for screening a substance that affects hepatic glucose production, comprising the step of monitoring the hepatic sugar production of a transgenic non-human animal and evaluating the influence of the test substance on hepatic sugar production.
[14] The method of [13], wherein the sample derived from the transgenic non-human animal is blood.
本発明によれば、実験動物における肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターする方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the method of monitoring the hepatic glucose production in an experimental animal simply and efficiently can be provided.
本発明における肝糖産生をモニターするためのトランスジェニック非ヒト動物は、肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼ（以下、「G6Pアーゼ」と記載）プロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されており、肝臓特異的に、G6Pアーゼプロモーターの制御下において分泌型のレポータータンパク質を発現する。 The transgenic non-human animal for monitoring hepatic glucose production in the present invention encodes a secreted reporter protein under the control of a glucose-6-phosphatase (hereinafter referred to as “G6Pase”) promoter in a liver-specific manner. And a secretory reporter protein is expressed under the control of the G6Pase promoter in a liver-specific manner.
本発明において「肝糖産生をモニターする」とは、肝糖産生量を測定および評価することを意味し、より詳細には、肝臓におけるG6Pアーゼプロモーターの活性を測定および評価することを意味する。肝糖産生は、肝臓におけるグリコーゲン分解と糖新生の主に二つの代謝経路からなり、最終的に両経路にて産生されたグルコース−6−リン酸がG6Pアーゼの働きにより脱リン酸化されてグルコースを生じ、血中へと分泌される（図１）。すなわち、グルコースの産生量（肝糖産生量）は、G6Pアーゼの活性および発現量によって制御されている。したがって、G6Pアーゼの発現を制御するG6Pアーゼプロモーターの活性を測定および評価することによって、肝糖産生量を間接的に測定および評価することができる。また、本発明においては、肝臓特異的に、G6Pアーゼプロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されており、これにより肝糖産生に関与するG6Pアーゼプロモーターの活性のみを特異的に測定および評価することができる。 In the present invention, “monitoring hepatic glucose production” means measuring and evaluating the amount of hepatic glucose production, and more specifically, measuring and evaluating the activity of the G6Pase promoter in the liver. Liver glucose production mainly consists of two metabolic pathways of glycogenolysis and gluconeogenesis in the liver. Finally, glucose-6-phosphate produced in both pathways is dephosphorylated by the action of G6Pase, and glucose is produced. And secreted into the blood (FIG. 1). That is, the production amount of glucose (liver sugar production amount) is controlled by the activity and expression level of G6Pase. Therefore, by measuring and evaluating the activity of the G6Pase promoter that controls the expression of G6Pase, the amount of hepatic sugar production can be indirectly measured and evaluated. In the present invention, a gene encoding a secretory reporter protein is introduced under the control of the G6Pase promoter in a liver-specific manner, whereby only the activity of the G6Pase promoter involved in hepatic glucose production is specifically detected. Can be measured and evaluated automatically.
本発明において「G6Pアーゼプロモーターの制御下」とは、G6Pアーゼプロモーターの3’側に連結された遺伝子が、当該プロモーターの活性に応じて、転写が駆動されることを意味する。前記トランスジェニック非ヒト動物においては、肝臓特異的に、G6Pアーゼプロモーターの3’側に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が連結されており、当該プロモーター活性に応じて、当該遺伝子の転写が駆動される。 In the present invention, “under the control of the G6Pase promoter” means that transcription of a gene linked to the 3 ′ side of the G6Pase promoter is driven according to the activity of the promoter. In the transgenic non-human animal, a gene encoding a secreted reporter protein is linked to the 3 ′ side of the G6Pase promoter in a liver-specific manner, and the transcription of the gene is driven according to the promoter activity. Is done.
「分泌型のレポータータンパク質」とは、細胞内で発現された後、トランスジェニック非ヒト動物の体液中に分泌または排泄されるレポータータンパク質を意味する。「体液」としては、血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、汗、尿、唾液など（これらに限定はされない）が挙げられ、好ましくは血液であり、さらに好ましくは血清である。「レポータータンパク質」は、免疫学的手法、比色反応、蛍光発光、化学発光などにより容易に検出できるものであれば良く、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられるがこれらに限定はされない。レポータータンパク質には必要に応じて、体液中に分泌または排泄されるために必要なシグナルペプチドを付加しても良い。また、分泌型のレポータータンパク質は市販のものを利用することができ、例えば、Cypridinaルシフェラーゼ、Gaussiaルシフェラーゼ、Metridiaルシフェラーゼ、Vargulaルシフェラーゼ、Oplophorusルシフェラーゼ、Pleuromammaルシフェラーゼなど（これらに限定はされない）を好適に利用することができる。 By “secreted reporter protein” is meant a reporter protein that is expressed in a cell and then secreted or excreted into the body fluid of a transgenic non-human animal. Examples of the “body fluid” include blood (whole blood, plasma, serum), lymph, sweat, urine, saliva and the like, preferably blood, and more preferably serum. The “reporter protein” is not limited as long as it can be easily detected by immunological techniques, colorimetric reaction, fluorescence emission, chemiluminescence, and the like, and examples thereof include luciferase, green fluorescent protein (GFP), alkaline phosphatase, and peroxidase. However, it is not limited to these. If necessary, a signal peptide necessary for secretion or excretion into the body fluid may be added to the reporter protein. In addition, commercially available secretory reporter proteins can be used, for example, Cypridina luciferase, Gaussia luciferase, Metridia luciferase, Vargula luciferase, Oplophorus luciferase, Pleuromamma luciferase, etc. (but not limited thereto) are preferably used. be able to.
「非ヒト動物」としては、ヒトを除く哺乳動物（ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなど）が挙げられ、好ましくはげっ歯類に属する哺乳動物である。げっ歯類に属する哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギなどが挙げられるがこれらに限定はされない。好ましくは、本発明において「非ヒト動物」はマウスである。 Examples of the “non-human animal” include mammals other than humans (pigs, sheep, dogs, cats, horses, cows, etc.), preferably mammals belonging to rodents. Mammals belonging to rodents include, but are not limited to, mice, rats, rabbits and the like. Preferably, in the present invention, the “non-human animal” is a mouse.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、公知のトランスジェニック非ヒト動物作製方法に基づいて作出することができる。以下、トランスジェニックマウスの作出方法について詳述するが、他の非ヒト動物についても同様の手法を用いて作出できることは当業者にとって明らかである。 The transgenic non-human animal of the present invention can be produced based on known transgenic non-human animal production methods. Hereinafter, a method for producing a transgenic mouse will be described in detail, but it will be apparent to those skilled in the art that other non-human animals can be produced using the same method.
本発明のトランスジェニックマウスは、以下の第一のトランスジェニックマウスまたはその子孫と第二のトランスジェニックマウスまたはその子孫とを交配することによって作出することができる。 The transgenic mouse of the present invention can be produced by crossing the following first transgenic mouse or its offspring with a second transgenic mouse or its offspring.
第一のトランスジェニックマウスは、G6Pアーゼプロモーターの制御下に、2つの部位特異的組換え酵素の認識部位に挟まれたスタッファー配列、および分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が5’側よりこの順に含まれるDNA断片が導入されている。第一のトランスジェニックマウスにおいては、スタッファー配列の存在により、G6Pアーゼプロモーターの制御下において、分泌型のレポータータンパク質の発現が阻害されている。 In the first transgenic mouse, the gene encoding the stuffer sequence sandwiched between the recognition sites of two site-specific recombinases and the secreted reporter protein is controlled from the 5 'side under the control of the G6Pase promoter. DNA fragments included in order are introduced. In the first transgenic mouse, the expression of the secreted reporter protein is inhibited under the control of the G6Pase promoter due to the presence of the stuffer sequence.
第二のトランスジェニックマウスは、肝臓特異的プロモーターの制御下に部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含むDNA断片が導入されており、当該トランスジェニックマウスの肝臓において特異的に部位特異的組換え酵素が発現されている。 In the second transgenic mouse, a DNA fragment containing a gene encoding a site-specific recombinant enzyme is introduced under the control of a liver-specific promoter, and the site-specific group is specifically expressed in the liver of the transgenic mouse. The replacement enzyme is expressed.
これらのトランスジェニックマウスを交配させることによって、肝臓特異的プロモーターの制御下に発現される部位特異的組換え酵素の働きにより、スタッファー配列が切り出され、肝臓特異的に、G6Pアーゼプロモーターの制御下において分泌型のレポータータンパク質を発現する仔を得ることができる。 By mating these transgenic mice, a stuffer sequence is excised by the action of a site-specific recombinase expressed under the control of a liver-specific promoter, and liver-specifically under the control of the G6Pase promoter. Pups expressing secreted reporter protein can be obtained.
用いるマウスは、限定されないが、例えば、C57Bl/6Nマウス、C57Bl/6Jマウス（B6マウス）、BALB/cマウス等が用いられる。 The mouse to be used is not limited, and for example, C57Bl / 6N mouse, C57Bl / 6J mouse (B6 mouse), BALB / c mouse and the like are used.
各トランスジェニックマウスは、公知の手法、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384(1980)に記載の方法により作出することができる。 Each transgenic mouse can be produced by a known method, for example, the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980).
すなわち、標的とする遺伝子導入部位周辺のゲノムDNA配列と相同な配列（相同組換え部位）中に、目的のDNA断片を含む、遺伝子組換えDNA構築物を作製する。 That is, a gene recombination DNA construct is prepared which contains the target DNA fragment in a sequence homologous to the genomic DNA sequence around the target gene introduction site (homology recombination site).
第一のトランスジェニックマウス作製においては、標的とするG6Pアーゼプロモーターより3’下流領域の塩基配列中に、2つの部位特異的組換え酵素の認識部位に挟まれたスタッファー配列、および分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子を5’側よりこの順に含んでなる、遺伝子組換えDNA構築物を作製する。 In the production of the first transgenic mouse, a stuffer sequence sandwiched between two site-specific recombinase recognition sites and a secreted reporter in the base sequence in the 3 ′ downstream region from the target G6Pase promoter A recombinant DNA construct comprising a gene encoding a protein in this order from the 5 ′ side is prepared.
少なくともG6Pアーゼプロモーターの3’下流領域を含む、マウス11番染色体のゲノムDNA配列は公知であり、公開されたデータベース（例えば、GenBank等）にNC_000077として登録されており、当該DNA構築物の作製においてはこれらの遺伝子情報を利用することができる。また、下記実施例にて詳述するとおり、当該DNA構築物の作製に際しては、少なくとも標的とするG6Pアーゼプロモーターの3’下流領域の塩基配列を含むBACクローンを利用することができる。このようなBACクローンは、当業者であれば上記公開されたデータベースに登録された遺伝子情報を利用して、ゲノムライブラリーより容易にクローニング・作製することが可能であるし、また、市販のものを利用しても良い。すなわち、BACクローン上のG6Pアーゼプロモーターの3’下流領域に、上記DNA断片を相同組換えにより導入し、得られた組換えBACクローンを含むBACベクターを、遺伝子組換えDNA構築物として利用することができる。 The genomic DNA sequence of mouse chromosome 11 containing at least the 3 'downstream region of the G6Pase promoter is known and registered as NC_000077 in public databases (eg, GenBank etc.). These genetic information can be used. In addition, as described in detail in the Examples below, when preparing the DNA construct, a BAC clone containing at least the base sequence of the 3 'downstream region of the target G6Pase promoter can be used. Such a BAC clone can be easily cloned from a genomic library by a person skilled in the art using gene information registered in the database disclosed above, or is commercially available. May be used. That is, the above-mentioned DNA fragment is introduced by homologous recombination into the 3 ′ downstream region of the G6Pase promoter on the BAC clone, and the resulting BAC vector containing the recombinant BAC clone can be used as a recombinant DNA construct. it can.
「2つの部位特異的組換え酵素の認識部位」とは、部位特異的組換え酵素によって認識され、その間に挟まれたスタッファー配列の切り出しを生じる機能を有する。このような部位特異的組換え酵素の認識部位としてはloxP配列が挙げられる。 The “recognition site of two site-specific recombinases” has a function of being recognized by a site-specific recombinase and causing excision of a stuffer sequence sandwiched between them. Such a site-specific recombinase recognition site includes a loxP sequence.
「スタッファー配列」は、その3’側に連結されたレポータータンパク質をコードする遺伝子の転写を阻止するために設けられた配列であり、当該スタッファー配列が部位特異的組換え酵素によって切り出されることによって、G6Pアーゼプロモーターの制御下に、分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が配置され、G6Pアーゼプロモーターの制御下に、分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子の転写が可能となる。スタッファー配列は特に限定されず、例えば、分泌型のレポータータンパク質とは異なるレポータータンパク質をコードする遺伝子や薬剤耐性遺伝子など（例えば、LacZ、GFP、CFP、YFP、Ｎeoなど）が挙げられる。スタッファー配列は必要に応じて、その3’末端にポリＡ配列を含んでも良い。 The “stuffer sequence” is a sequence provided to prevent transcription of a gene encoding a reporter protein linked to its 3 ′ side, and the stuffer sequence is excised by a site-specific recombination enzyme. A gene encoding a secretory reporter protein is placed under the control of the G6Pase promoter, and transcription of a gene encoding the secretory reporter protein is possible under the control of the G6Pase promoter. The stuffer sequence is not particularly limited, and examples thereof include a gene encoding a reporter protein different from the secreted reporter protein, a drug resistance gene, and the like (for example, LacZ, GFP, CFP, YFP, Neo, etc.). The stuffer sequence may optionally include a poly A sequence at its 3 'end.
「レポータータンパク質をコードする遺伝子」は、その3’末端が、G6Pアーゼをコードする遺伝子の5’上流領域にあっても良いし、G6Pアーゼをコードする遺伝子に接していても良く、あるいは、レポータータンパク質をコードする遺伝子の導入により、G6Pアーゼをコードする遺伝子の一部または全部が欠失されても良い。 The “gene encoding a reporter protein” may have a 3 ′ end located in the 5 ′ upstream region of a gene encoding G6Pase, may be in contact with a gene encoding G6Pase, or may be a reporter. Part or all of the gene encoding G6Pase may be deleted by introducing a gene encoding a protein.
第二のトランスジェニックマウス作製においては、標的とする遺伝子導入部位周辺のゲノムDNA配列中に、肝臓特異的プロモーターおよびその制御下に部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含んでなる、遺伝子組換えDNA構築物を作製する。 In the production of the second transgenic mouse, a gene group comprising a liver-specific promoter and a gene encoding a site-specific recombinase under its control in the genomic DNA sequence around the target gene introduction site. Make a replacement DNA construct.
「部位特異的組換え酵素」としては、上記部位特異的組換え酵素によって認識される配列にて、その間に挟まれたスタッファー配列を切り出すことが可能なものであれば特に限定されず、例えばGre酵素が挙げられる。 The “site-specific recombinase” is not particularly limited as long as it can cut out the stuffer sequence sandwiched between the sequences recognized by the site-specific recombinase, for example, Gre Enzymes.
「肝臓特異的プロモーター」としては、肝臓アルブミンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、α１−抗トリプシンプロモーター、トランスフェリントランスサイレチンプロモーター、血清アミロイドＡプロモーター、トランスチレチンプロモーター、肝細胞核因子６（ＨＮＦ−６）プロモーターなどが挙げられる。例えば、肝臓アルブミンプロモーターを好適に利用することができる。 Examples of the “liver-specific promoter” include liver albumin promoter, α-fetoprotein promoter, α 1 -antitrypsin promoter, transferrin transthyretin promoter, serum amyloid A promoter, transthyretin promoter, hepatocyte nuclear factor 6 (HNF-6) Examples include promoters. For example, the liver albumin promoter can be preferably used.
次いで、得られた各DNA構築物を、マウスの全能性細胞にそれぞれ導入する。
「全能性細胞」としては、受精卵、初期胚のほか、ES細胞（胚性幹細胞）などの多能性細胞が挙げられる。初期胚を用いる場合、８細胞期以前の胚が好ましい。
Subsequently, each obtained DNA construct is introduce | transduced into a mouse | mouth totipotent cell, respectively.
Examples of “totipotent cells” include fertilized eggs, early embryos, and pluripotent cells such as ES cells (embryonic stem cells). When an early embryo is used, an embryo before the 8-cell stage is preferred.
DNA構築物の細胞への導入方法は、限定されないが、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE−デキストラン法等により行うことができる。この中でもマウス受精卵の雄性前核へのマイクロインジェクションが好ましい。 The method for introducing the DNA construct into the cell is not limited, and can be carried out by the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method and the like. Among these, microinjection into the male pronucleus of a fertilized mouse egg is preferable.
続いて、DNA構築物を導入した細胞を、レシピエントマウスの卵管に移植する。レシピエントマウスとしては、好ましくは精管を切断したオスと交配させて偽妊娠状態としたメスが利用される。
そして、この細胞を個体へと発生させる。
Subsequently, the cells into which the DNA construct has been introduced are transplanted into the oviduct of a recipient mouse. As the recipient mouse, a female that has been mated with a male whose vas deferens has been cut into a pseudopregnant state is preferably used.
Then, this cell is generated into an individual.
次いで、発生した個体から、体細胞及び生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別する。得られたマウスを野生型マウスと交配し、F1マウスを得る。ヘテロ接合体の選択は、例えば、F1動物の尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることにより検定できる。 Next, an individual in which the transgene is incorporated into somatic cells and germ cells is selected from the individuals that have developed. The obtained mouse is mated with a wild type mouse to obtain an F1 mouse. The selection of the heterozygote can be assayed, for example, by screening chromosomal DNA separated and extracted from the tail of the F1 animal by Southern hybridization or PCR.
得られた第一および第二のトランスジェニックマウスのヘテロ接合体同士を交配させ、分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子および部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子をホモまたはヘテロに有する動物ならびに／あるいは肝臓において、スタッファー配列が除去されている動物を、上記手法によりスクリーニングする。 An animal having a gene encoding a secreted reporter protein and a gene encoding a site-specific recombinase homozygously or heterozygously obtained by mating heterozygotes of the obtained first and second transgenic mice, and / or Alternatively, animals from which the stuffer sequence has been removed in the liver are screened by the above method.
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、当該非ヒト動物における肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターすることができる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物においては、G6Pアーゼプロモーターの活性に応じて、分泌型のレポータータンパク質が体液中に分泌または排泄される。したがって、体液中に含まれるレポータータンパク質量を測定・評価することによって、G6Pアーゼプロモーターの活性を測定・評価することができ、すなわち、肝糖産生量を間接的に測定・評価することができる。 The transgenic non-human animal of the present invention can easily and efficiently monitor hepatic sugar production in the non-human animal. In the transgenic non-human animal of the present invention, a secreted reporter protein is secreted or excreted in body fluids according to the activity of the G6Pase promoter. Therefore, by measuring and evaluating the amount of the reporter protein contained in the body fluid, the activity of the G6Pase promoter can be measured and evaluated, that is, the amount of hepatic sugar production can be indirectly measured and evaluated.
「体液」としては、上記定義のものが挙げられ、好ましくは血液（全血、血漿、血清）、より好ましくは血清である。測定・評価に付される血液量は少なくとも1〜15μＬ、好ましくは5〜10μＬの量で十分であり、当該非ヒト動物に与えるストレスを最小限に留めることができる。また、血液は、尾静脈または眼窩静脈叢から容易に採取することができる。 Examples of the “body fluid” include those defined above, preferably blood (whole blood, plasma, serum), more preferably serum. The amount of blood to be subjected to measurement / evaluation is at least 1 to 15 μL, preferably 5 to 10 μL, and the stress applied to the non-human animal can be minimized. In addition, blood can be easily collected from the tail vein or the orbital venous plexus.
レポータータンパク質量の測定・評価方法は、用いたレポータータンパク質に応じて適宜選択することができ、その量または活性を定量的に測定・評価することができる。用いたレポータータンパク質がルシフェラーゼであれば、採取した体液にルシフェラーゼの基質を添加して、生じた発光をルミノメーターで測定すればよく、煩雑な操作を必要としない。 The method for measuring and evaluating the amount of reporter protein can be appropriately selected according to the reporter protein used, and the amount or activity can be quantitatively measured and evaluated. If the reporter protein used is luciferase, a luciferase substrate may be added to the collected body fluid, and the resulting luminescence may be measured with a luminometer, and no complicated operation is required.
上記のとおり本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターすることができることから、被験物質が肝糖産生に与える影響を評価するための実験動物として利用することができる。 As described above, the transgenic non-human animal of the present invention can be easily and efficiently monitored for hepatic glucose production, so that it can be used as an experimental animal for evaluating the influence of a test substance on hepatic glucose production. it can.
すなわち、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与し、被験物質が肝糖産生に与える影響を評価することができる。被験物質は、トランスジェニック非ヒト動物に対して経口投与または非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与など）することができる。被験物質投与前後のトランスジェニック非ヒト動物より体液（例えば、血液）サンプルを採取して、体液中に含まれるレポータータンパク質の増減を指標として、当該被験物質の効果を評価することができる。例えば、被験物質の投与により、体液中に含まれるレポータータンパク質の量が低減した場合には、当該被験物質は肝糖産生を抑制する効果を有すると判断することができ、逆に、体液中に含まれるレポータータンパク質の量が増大した場合には、当該被験物質は肝糖産生を促進する効果を有すると判断することができる。 That is, the test substance can be administered to the transgenic non-human animal of the present invention, and the influence of the test substance on hepatic glucose production can be evaluated. The test substance can be administered orally or parenterally (intravenous, intramuscular, subcutaneous, transdermal, nasal, pulmonary, etc.) to the transgenic non-human animal. A body fluid (eg, blood) sample is collected from a transgenic non-human animal before and after administration of the test substance, and the effect of the test substance can be evaluated using the increase or decrease in the reporter protein contained in the body fluid as an index. For example, when the amount of reporter protein contained in a body fluid is reduced by administration of a test substance, it can be determined that the test substance has an effect of suppressing hepatic glucose production. When the amount of the reporter protein contained is increased, it can be determined that the test substance has an effect of promoting hepatic glucose production.
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、これらの実施例によって制限されるものではない。 The present invention is more specifically described by the following examples. However, the present invention is not limited by these examples.
実施例１：肝臓におけるG6Pアーゼの発現量
正常マウスおよび2型糖尿病モデルマウス（C57BLKSJ db/dbマウス）を随時摂食下で肝臓40ｍｇを採取し、当該組織に含まれるG6PアーゼmRNA量を、G6PアーゼのＰ32で放射線ラベルしたcDNAプローブを用いて、ノーザンブロット法により検出した。
Example 1: Expression level of G6Pase in liver 40 mg of liver was collected from normal mice and
結果を図２（Ａ）に示す。
図２（Ａ）より明らかな通り、肝糖産生量が過剰な2型糖尿病状態においてはG6Pアーゼの発現量が正常状態に比べて顕著に高いことが明らかとなった。
The results are shown in FIG.
As is clear from FIG. 2 (A), it was revealed that the expression level of G6Pase was significantly higher in the
次に、16時間絶食させた2型糖尿病モデルマウス（C57BLKSJ db/dbマウス）における、インスリン投与の有無におけるG6Pアーゼの発現量の変化を調べた。インスリン投与群には、インスリン（10 mU/kg体重/分）を投与し、対象には生理食塩水を同様に投与した。上記同様に、肝組織をそれぞれ採取した後、当該組織に含まれるG6PアーゼmRNA量を上記ノーザンブロット法により検出した。
Next, changes in the expression level of G6Pase in the presence or absence of insulin administration in
結果を図２（Ｂ）に示す。
図２（Ｂ）より明らかな通り、肝糖産生を抑制するインスリン投与により、G6Pアーゼの発現量が顕著に減少することが明らかとなった。
これらの結果は、肝糖産生量とG6Pアーゼの発現量との間には相関関係があることを示す。
The results are shown in FIG.
As is clear from FIG. 2 (B), it was revealed that the amount of G6Pase expressed markedly decreased by insulin administration that suppresses hepatic glucose production.
These results indicate that there is a correlation between the amount of hepatic glucose produced and the amount of G6Pase expressed.
実施例２：肝糖産生モニターマウスの作製
BACクローン（RP24-183A19）(BACPAC Resources Center, Children's Hospital Oakland Research Institute)は、マウスG6PC遺伝子座とともに、5’上流の89.4 kbのゲノム配列、および3’下流の75.3 kbのゲノム配列を含む、11番染色体の174.8 kbをカバーしている。
Example 2: Production of liver glucose production monitor mouse
The BAC clone (RP24-183A19) (BACPAC Resources Center, Children's Hospital Oakland Research Institute) contains, along with the mouse G6PC locus, an 89.4 kb genomic sequence 5 ′ upstream and a 75.3 kb
Red/ET組み換え法により、RP24-183A19上にloxP-YFP-loxP-GLuc配列を含むDNA断片を挿入し、ターゲッティングベクターを構築した(図３)。 A DNA fragment containing the loxP-YFP-loxP-GLuc sequence was inserted on RP24-183A19 by the Red / ET recombination method to construct a targeting vector (FIG. 3).
図３に示す通り、ターゲッティングベクターには、マウスG6PC遺伝子のエキソン１に存在する翻訳開始コドンの直前に翻訳開始コドンをつぶす形でGaussia ルシフェラーゼ(GLuc)遺伝子を挿入した。
As shown in FIG. 3, the Gaussia luciferase (GLuc) gene was inserted into the targeting vector in such a manner that the translation initiation codon was crushed immediately before the translation initiation codon present in
当該ターゲッティングベクターを用いて、G6Pアーゼの内因性プロモーターの下流に、LoxP配列で挟まれたYFPと、さらにその下流に分泌型ルシフェラーゼ（Gaussia Luciferase）を有したトランスジェニックマウスを作製した（フェニックスバイオ社に委託）。 Using this targeting vector, a transgenic mouse having YFP sandwiched between LoxP sequences downstream of the endogenous promoter of G6Pase and a secreted luciferase downstream of it was prepared (Phoenix Bio Inc.) Consigned to).
次いで、得られたトランスジェニックマウスと、肝臓アルブミンプロモーターの制御下においてCre組み換え酵素を発現するトランスジェニックマウス(Division of Endocrinology, Diabetes and Bone Diseases, Department of Medicine, Mt.Sinai School of Medicine, Dr. Derek LeRoithよりご分与いただいたもの）を交配させ、分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子およびCre組み換え酵素をコードする遺伝子を指標にして、これら遺伝子をヘテロに有するマウスを選択した。遺伝子型の識別は、従来公知の手法に従って行い、子マウスの尾よりゲノムDNAを抽出し、各遺伝子に特異的な配列を含むプライマーを用いたゲノムPCR法により行った。 Next, the obtained transgenic mice and transgenic mice expressing Cre recombinase under the control of the liver albumin promoter (Division of Endocrinology, Diabetes and Bone Diseases, Department of Medicine, Mt. Sinai School of Medicine, Dr. Derek Mice that were distributed by LeRoith) were crossed, and using a gene encoding a secretory luciferase and a gene encoding a Cre recombinase as an index, mice having these genes heterozygously were selected. Genotype identification was performed according to a conventionally known method, and genomic DNA was extracted from the tail of a pup, and genomic PCR was performed using primers containing sequences specific to each gene.
実施例３：GLuc活性の測定
実施例２で得られたトランスジェニックマウスを24時間絶食させ、8時間〜24時間の各時点で、血液サンプルを尾静脈より採取した。また、実施例２で得られたトランスジェニックマウスを24時間絶食させ、再食させた後、6時間〜24時間の各時点で、血液サンプルを尾静脈より採取した。
Example 3: Measurement of GLuc activity The transgenic mice obtained in Example 2 were fasted for 24 hours, and blood samples were collected from the tail vein at each time point of 8 hours to 24 hours. In addition, the transgenic mice obtained in Example 2 were fasted for 24 hours and refeeded, and then blood samples were collected from the tail vein at each time point of 6 hours to 24 hours.
一方、野生型マウスを同様に、24時間絶食させ、8時間〜24時間の各時点で、屠殺して肝臓を採取し、各サンプルより従来公知の手法に従って行いmRNAを抽出してcDNAを合成した。また、野生型マウスを上記同様に、24時間絶食させ、再食させた後、6時間〜24時間の各時点で、屠殺して肝臓を採取し、各サンプルより従来公知の手法に従って行いmRNAを抽出してcDNAを合成した。 On the other hand, wild-type mice were similarly fasted for 24 hours and sacrificed at 8 to 24 hours to collect livers, and mRNA was extracted from each sample according to a conventionally known method to synthesize cDNA. . In addition, after wild-type mice were fasted for 24 hours and re-eated, the livers were collected at each time point of 6 to 24 hours, and mRNA was collected from each sample according to a conventionally known method. Extraction was performed to synthesize cDNA.
上記トランスジェニックマウスより得られた血液サンプルを用いて、各サンプル中のGLuc活性を測定した。GLuc活性の測定は、製造元のプロトコルに従って、Gaussia Luciferase Assay Kit(New England BioLabs社製)を使用し、ルミノメーター（Berthold社製TristarLB941）を用いて測定した。
結果、絶食時間の経過に伴い、GLuc活性の増大が観察された（図４（Ａ））。
Using a blood sample obtained from the transgenic mouse, the GLuc activity in each sample was measured. The GLuc activity was measured using a Gaussia Luciferase Assay Kit (New England BioLabs) according to the manufacturer's protocol, and using a luminometer (Berthold Tristar LB941).
As a result, an increase in GLuc activity was observed with the lapse of fasting time (FIG. 4A).
一方、上記野生型マウスより得られた各cDNAを鋳型として、G6Pアーゼをコードする遺伝子に特異的な配列を含むプライマーを用いたPCR法を行い、各サンプルにおけるG6Pアーゼの発現量を定量した。
結果、絶食時間の経過に伴い、G6PアーゼをコードするmRNA量の増大が観察された（図４（Ｂ））。
On the other hand, PCR was carried out using each cDNA obtained from the wild type mouse as a template and a primer containing a sequence specific to the gene encoding G6Pase, and the expression level of G6Pase in each sample was quantified.
As a result, an increase in the amount of mRNA encoding G6Pase was observed with the passage of fasting time (FIG. 4B).
これらの結果は、肝糖産生の制御に関与するG6Pアーゼの発現量と、トランスジェニックマウスより得られた血液サンプルを用いて測定されたGLuc活性との間の相関関係を示す。一般的に、絶食時においては肝糖産生量が増大することが知られている。トランスジェニックマウスにおいて測定されたGLuc活性の増大は、絶食時における肝糖産生量の増大を反映するものである。 These results show a correlation between the expression level of G6Pase involved in the control of hepatic glucose production and the GLuc activity measured using a blood sample obtained from a transgenic mouse. In general, it is known that the amount of hepatic sugar production increases during fasting. An increase in GLuc activity measured in transgenic mice reflects an increase in hepatic glucose production during fasting.
再食時の結果についても、野生型マウスに由来するG6PアーゼをコードするmRNA量と、トランスジェニックマウスに由来するGLuc活性との間に相関関係が見られ、再食により、両者の値は共に低下した（図４）。一般的に、摂食時においては肝糖産生量が低下することが知られている。トランスジェニックマウスにおいて測定されたGLuc活性の低下は、摂食時における肝糖産生量の低下を反映するものである。 There was also a correlation between the amount of mRNA encoding G6Pase derived from wild-type mice and the GLuc activity derived from transgenic mice. It decreased (FIG. 4). In general, it is known that the amount of hepatic sugar production decreases when eating. The decrease in GLuc activity measured in transgenic mice reflects the decrease in hepatic glucose production during feeding.
上記実施例の結果は、トランスジェニックマウスより得られた血液サンプル中のGLuc活性を用いて、当該マウスの肝糖産生の挙動を評価できることを示す。 The results of the above Examples show that the behavior of liver glucose production in the mouse can be evaluated using the GLuc activity in the blood sample obtained from the transgenic mouse.
実施例４：肝糖産生に影響を与える物質の評価
フォルスコリンは、アデニル酸サイクラーゼを活性化する作用をもち、cAMP産生を増大させ、肝臓におけるグルコース産生を促進することが知られている（Nature 437(7062):1109-1111(2005)）。
Example 4 Evaluation of Substances Affecting Liver Glucose Production Forskolin has an effect of activating adenylate cyclase, and is known to increase cAMP production and promote glucose production in the liver (Nature 437 (7062): 1109-1111 (2005)).
実施例２で得られたトランスジェニックマウスに、フォルスコリンを10mg/kg体重にて腹腔内に投与した。 Forskolin was administered intraperitoneally at 10 mg / kg body weight to the transgenic mice obtained in Example 2.
３時間後、当該トランスジェニックマウスより血液サンプルを採取して、サンプル中のGLuc活性を実施例３と同様に測定した。
結果、フォルスコリンを投与したトランスジェニックマウスにおいては、GLuc活性が増大した（最大10.4倍に増加した）。
Three hours later, a blood sample was collected from the transgenic mouse, and the GLuc activity in the sample was measured in the same manner as in Example 3.
As a result, GLuc activity was increased in transgenic mice administered with forskolin (up to 10.4 times maximum).
上記実施例の結果は、トランスジェニックマウスより得られた血液サンプル中のGLuc活性が、肝糖産生に対する投与物質の効果を反映することを示す。 The results of the above examples show that GLuc activity in blood samples obtained from transgenic mice reflects the effect of the administered substance on hepatic glucose production.
本発明によれば、肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されているトランスジェニック非ヒト動物を提供することができる。当該トランスジェニック非ヒト動物においては、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの活性に応じて、レポータータンパク質が体液中へと分泌されるために、体液中のレポータータンパク質量を測定することによって簡便かつ効率的に肝糖産生をモニターできる。また、本発明によれば、肝糖産生を一匹から経時的にモニターすることができ、個体差を考慮せずにより正確な評価を得ることができる。したがって、本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物は、肝糖産生に対する被験物質の評価系として利用することができ、薬剤開発等の分野において貢献することが期待される。 According to the present invention, it is possible to provide a transgenic non-human animal into which a gene encoding a secreted reporter protein is introduced under the control of a glucose-6-phosphatase promoter in a liver-specific manner. In the transgenic non-human animal, since the reporter protein is secreted into the body fluid according to the activity of the glucose-6-phosphatase promoter, the amount of the reporter protein in the body fluid is measured easily and efficiently. Hepatic glucose production can be monitored. Moreover, according to the present invention, hepatic glucose production can be monitored over time from one animal, and a more accurate evaluation can be obtained without considering individual differences. Therefore, the transgenic non-human animal in the present invention can be used as a test substance evaluation system for hepatic glucose production, and is expected to contribute in the field of drug development and the like.
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6016010199; 神戸大学医学部紀要 Ｖｏｌ．６２，, 2002, ｐ．１１１-１１７ * |
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