JP2013185944A - Lower alcohol detection reagent and lower alcohol detection method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規な非酵素系の低級アルコール検出試薬及びそれを用いた低級アルコール検出方法に関する。更に詳しくは、本発明は、目的物である低級アルコールが低濃度であっても、呈色反応を用いることにより、簡易且つ確実に目的物を検出可能である非酵素系の低級アルコール検出試薬及びそれを用いた低級アルコール検出方法に関する。 The present invention relates to a novel non-enzymatic lower alcohol detection reagent and a lower alcohol detection method using the same. More specifically, the present invention relates to a non-enzymatic lower alcohol detection reagent capable of easily and reliably detecting a target product by using a color reaction even if the target target lower alcohol has a low concentration. The present invention relates to a lower alcohol detection method using the same.
従来より、被検液中における目的物の検出や濃度の測定において、呈色反応を利用する種々の検出試薬やそれを用いた検出方法が知られている。
例えば、目的物がアルコール（エタノール）である場合には、次の方法が知られている。エタノール含有試料（被検液）を、酸素、水及びアルコールオキシターゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させる。そして、この過酸化水素と、４−アミノアンチピリン及びフェノールを、ペルオキシターゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させるエタノール測定方法等が知られている（特許文献１参照）。
Conventionally, various detection reagents using a color reaction and detection methods using the same are known for detection of a target substance in a test solution and measurement of concentration.
For example, when the target product is alcohol (ethanol), the following method is known. Hydrogen peroxide is generated by enzymatic reaction of an ethanol-containing sample (test solution) in the presence of oxygen, water and alcohol oxidase. And the ethanol measurement method etc. which color-develop a red quinone pigment | dye are known by making this hydrogen peroxide, 4-aminoantipyrine, and phenol react with enzyme in presence of peroxidase (refer patent document 1).
しかしながら、従来のアルコール検出試薬は酵素系の試薬であるために、検出条件が限定されやすいうえ、劣化が起こりやすく長期の保存が困難であるという問題点がある。そのため、酵素を含有せず、劣化の起こりにくい非酵素系の検出試薬が求められている。 However, since the conventional alcohol detection reagent is an enzyme-based reagent, there are problems in that detection conditions are likely to be limited and that deterioration is likely to occur and long-term storage is difficult. Therefore, a non-enzymatic detection reagent that does not contain an enzyme and hardly deteriorates is desired.
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、新規な非酵素系の低級アルコール検出試薬及びそれを用いた低級アルコール検出方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a novel non-enzymatic lower alcohol detection reagent and a lower alcohol detection method using the same.
上記問題点を解決するために、請求項１に記載の発明は、呈色反応を用いることにより、低級アルコールを検出するための低級アルコール検出試薬であって、
塩基性フクシンと、亜硫酸水素ナトリウムと、塩化水素と、水と、を含有することを要旨とする。
In order to solve the above problems, the invention according to
The gist is to contain basic fuchsin, sodium bisulfite, hydrogen chloride, and water.
請求項２に記載の発明は、請求項１において、前記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、
前記亜硫酸水素ナトリウムの含有割合が５０〜４００質量部であり、
前記塩化水素の含有割合が５０〜４００質量部であることを要旨とする。
The invention according to claim 2 is the invention according to
The content ratio of the sodium hydrogen sulfite is 50 to 400 parts by mass,
The gist is that the content ratio of the hydrogen chloride is 50 to 400 parts by mass.
請求項３に記載の発明は、低級アルコール検出方法であって、請求項１又は２に記載の低級アルコール検出試薬を用いることを要旨とする。 The invention according to claim 3 is a method for detecting a lower alcohol, and uses the lower alcohol detection reagent according to claim 1 or 2 as a gist.
請求項４に記載の発明は、請求項３において、リン酸緩衝液中の低級アルコールを検出することを要旨とする。 The gist of the invention described in claim 4 is to detect the lower alcohol in the phosphate buffer in claim 3.
本発明の低級アルコール検出試薬は、非酵素系の試薬であるため、検出条件を幅広く設定することができると共に、既存の酵素系試薬に比べて劣化の心配が少なく、長期の保存が可能である。また、本発明の検出試薬は、特定の成分により試薬が構成されているため、目的物である低級アルコールが低濃度であっても、呈色反応を用いることにより、簡易且つ確実に目的物を検出することができる。
本発明の低級アルコール検出方法は、新規な非酵素系の低級アルコール検出試薬を用いており、目的物である低級アルコールが低濃度であっても、呈色反応を用いることにより、簡易且つ確実に目的物を検出することができる。そのため、バイオエタノールやバイオプロパノールを生産する酵素又は微生物の改良や新規探索分野において好適に利用することができる。また、リン酸緩衝液中の低級アルコールの検出に優れるため、リン酸緩衝液下で安定な酵素等の探索に好適に用いることができる。更には、大規模な酵素等の探索にかかるコストを従来の酵素系試薬を用いた場合よりも大幅に低減することができる。
Since the lower alcohol detection reagent of the present invention is a non-enzymatic reagent, detection conditions can be set widely, and there is less fear of deterioration than existing enzyme reagents, and long-term storage is possible. . In addition, since the detection reagent of the present invention is composed of specific components, the target product can be easily and reliably obtained by using a color reaction even when the target lower alcohol has a low concentration. Can be detected.
The lower alcohol detection method of the present invention uses a novel non-enzymatic lower alcohol detection reagent, and even if the target lower alcohol has a low concentration, it is simple and reliable by using a color reaction. The object can be detected. Therefore, it can utilize suitably in the improvement of the enzyme or microorganisms which produce bioethanol and biopropanol, and the novel search field. Moreover, since it is excellent in the detection of the lower alcohol in a phosphate buffer solution, it can be suitably used for searching for enzymes and the like that are stable under a phosphate buffer solution. Furthermore, the cost for searching for a large-scale enzyme or the like can be significantly reduced as compared with the case where a conventional enzyme reagent is used.
ここで示される事項は例示的なものおよび本発明の実施形態を例示的に説明するためのものであり、本発明の原理と概念的な特徴とを最も有効に且つ難なく理解できる説明であると思われるものを提供する目的で述べたものである。 The items shown here are exemplary and illustrative of the embodiments of the present invention, and are the most effective and easy-to-understand explanations of the principles and conceptual features of the present invention. It is stated for the purpose of providing what seems to be.
以下、本発明を詳しく説明する。
［１］低級アルコール検出試薬
本発明の低級アルコール検出試薬は、呈色反応を用いることにより、低級アルコールを検出するための試薬である。そして、この低級アルコール検出試薬は、塩基性フクシンと、亜硫酸水素ナトリウムと、塩化水素と、水と、を含有することを特徴とする。
The present invention will be described in detail below.
[1] Lower alcohol detection reagent The lower alcohol detection reagent of the present invention is a reagent for detecting a lower alcohol by using a color reaction. The lower alcohol detection reagent contains basic fuchsin, sodium bisulfite, hydrogen chloride, and water.
上記低級アルコール検出試薬は、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、塩化水素及び水を主成分とする。そして、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、塩化水素及び水の含有割合の合計は、検出試薬全体を１００質量％とした場合に、通常８０〜１００質量％、好ましくは９０〜１００質量％、より好ましくは９５〜１００質量％である。 The lower alcohol detection reagent is mainly composed of basic fuchsin, sodium hydrogen sulfite, hydrogen chloride and water. The total content of basic fuchsin, sodium bisulfite, hydrogen chloride and water is usually 80 to 100% by mass, preferably 90 to 100% by mass, more preferably 100% by mass when the entire detection reagent is 100% by mass. Is 95 to 100% by mass.
低級アルコール検出試薬における上記亜硫酸水素ナトリウムの含有割合は、上記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、５０〜４００質量部であることが好ましく、より好ましくは５０〜２００質量部、更に好ましくは５０〜１００質量部である。
上記塩化水素の含有割合は、上記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、５０〜４００質量部であることが好ましく、より好ましくは５０〜２００質量部、更に好ましくは５０〜１００質量部である。
上記水の含有割合は、上記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、８０００〜４００００質量部であることが好ましく、より好ましくは９０００〜３３０００質量部、更に好ましくは９７００〜３１６００質量部である。
The content ratio of the sodium bisulfite in the lower alcohol detection reagent is preferably 50 to 400 parts by mass, more preferably 50 to 200 parts by mass, further preferably 100 parts by mass when the basic fuchsin is 100 parts by mass. It is 50-100 mass parts.
The content ratio of the hydrogen chloride is preferably 50 to 400 parts by mass, more preferably 50 to 200 parts by mass, and still more preferably 50 to 100 parts by mass, when the basic fuchsin is 100 parts by mass. is there.
The content ratio of the water is preferably 8000 to 40000 parts by mass, more preferably 9000 to 33000 parts by mass, further preferably 9700 to 31600 parts by mass when the basic fuchsin is 100 parts by mass. .
本発明の低級アルコール検出試薬には、上記塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、塩化水素及び水以外にも、本発明の効果を阻害しない範囲において、他の成分を含有させてもよい。他の成分としては、例えば、リン酸等が挙げられる。これらは、１種のみ含有されていてもよいし、２種以上含有されていてもよい。
低級アルコール検出試薬がリン酸を含有する場合、その含有割合は、上記塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、１〜２０００質量部であることが好ましく、より好ましくは１００〜１５００質量部、更に好ましくは１００〜１１００質量部である。
The lower alcohol detection reagent of the present invention may contain other components in addition to the basic fuchsin, sodium bisulfite, hydrogen chloride and water as long as the effects of the present invention are not impaired. Examples of other components include phosphoric acid. One of these may be contained, or two or more thereof may be contained.
When the lower alcohol detection reagent contains phosphoric acid, the content is preferably 1 to 2000 parts by mass, more preferably 100 to 1500 parts by mass, when the basic fuchsin is 100 parts by mass. More preferably, it is 100-1100 mass parts.
特に、本発明の低級アルコール検出試薬は、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、塩化水素及び水からなり、塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、亜硫酸水素ナトリウムの含有割合が５０〜４００質量部（特に５０〜２００質量部、更には５０〜１００質量部）、塩化水素の含有割合が５０〜４００質量部（特に５０〜２００質量部、更には５０〜１００質量部）、水の含有割合が８０００〜９９００質量部（特に９０００〜９９００質量部、更には９７００〜９８５０質量部）であるものとすることができる。
更には、本発明の低級アルコール検出試薬は、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、塩化水素、リン酸及び水からなり、塩基性フクシンを１００質量部とした場合に、亜硫酸水素ナトリウムの含有割合が５０〜４００質量部（特に５０〜２００質量部、更には５０〜１００質量部）、塩化水素の含有割合が５０〜４００質量部（特に５０〜２００質量部、更には５０〜１００質量部）、リン酸の含有割合が１〜２０００質量部（特に１００〜１５００質量部、更には１００〜１１００質量部）、水の含有割合が８０００〜４００００質量部（特に３００００〜３３０００質量部、更には３１０００〜３１６００質量部）であるものとすることができる。
In particular, the lower alcohol detection reagent of the present invention comprises basic fuchsin, sodium bisulfite, hydrogen chloride and water, and when the basic fuchsin is 100 parts by mass, the content of sodium bisulfite is 50 to 400 parts by mass. (Particularly 50 to 200 parts by mass, more preferably 50 to 100 parts by mass), hydrogen chloride content 50 to 400 parts by mass (particularly 50 to 200 parts by mass, furthermore 50 to 100 parts by mass), water content It can be 8000-9900 mass parts (especially 9000-9900 mass parts, Furthermore, 9700-9850 mass parts).
Furthermore, the lower alcohol detection reagent of the present invention comprises basic fuchsin, sodium hydrogen sulfite, hydrogen chloride, phosphoric acid and water, and when the basic fuchsin is 100 parts by mass, the content ratio of sodium bisulfite is 50. To 400 parts by weight (especially 50 to 200 parts by weight, more preferably 50 to 100 parts by weight), hydrogen chloride content of 50 to 400 parts by weight (particularly 50 to 200 parts by weight, further 50 to 100 parts by weight), phosphorus The acid content is 1 to 2000 parts by mass (especially 100 to 1500 parts by mass, more preferably 100 to 1100 parts by mass), and the water content is 8000 to 40000 parts by mass (particularly 30000 to 33000 parts by mass, further 31000 to 31600). Part by mass).
本発明における低級アルコール検出試薬により検出を行う低級アルコールは、炭素数１〜１０（特に１〜６、更には２〜４）のアルコールとすることができる。
また、低級アルコール検出試薬により検出可能な、被検液における低級アルコールの濃度は、０．０３質量％以上、特に０．０５〜１００質量％とすることができる。
The lower alcohol to be detected by the lower alcohol detection reagent in the present invention can be an alcohol having 1 to 10 carbon atoms (particularly 1 to 6, more preferably 2 to 4).
In addition, the concentration of the lower alcohol in the test solution that can be detected by the lower alcohol detection reagent can be 0.03% by mass or more, particularly 0.05 to 100% by mass.
尚、本発明の低級アルコール検出試薬の調製方法は特に限定されない。例えば、上述の各成分を、所定の割合となるように混合することで調製することができる。また、調製時における各成分の形態は特に限定されず、水溶液の形態で調製に用いてもよい。 In addition, the preparation method of the lower alcohol detection reagent of this invention is not specifically limited. For example, it can prepare by mixing each above-mentioned component so that it may become a predetermined ratio. Moreover, the form of each component at the time of preparation is not specifically limited, You may use for preparation with the form of aqueous solution.
［２］低級アルコール検出方法
本発明の低級アルコール検出方法は、上述の本発明の低級アルコール検出試薬を用いることを特徴とする。尚、低級アルコール検出試薬については、上述の説明をそのまま適用することができる。
[2] Lower alcohol detection method The lower alcohol detection method of the present invention is characterized by using the above-described lower alcohol detection reagent of the present invention. For the lower alcohol detection reagent, the above description can be applied as it is.
本発明を用いた低級アルコールの検出は、被検液と低級アルコール検出試薬とを混合し、検出試薬が混合された被検液が発色した場合に、低級アルコールが含有されていると判定されるものである。 In the detection of lower alcohol using the present invention, a test liquid and a lower alcohol detection reagent are mixed, and when the test liquid mixed with the detection reagent is colored, it is determined that the lower alcohol is contained. Is.
低級アルコール検出試薬と被検液との混合比［検出試薬の質量：被検液の質量］は、発色が確認できる量比であれば特に限定されない。具体的には、例えば、１：（５〜２０）であることが好ましく、より好ましくは１：（５〜１５）、更に好ましくは１：（９〜１１）である。この混合比が上記範囲である場合、低級アルコールをより確実に検出することができる。 The mixing ratio of the lower alcohol detection reagent and the test solution [the mass of the detection reagent: the mass of the test solution] is not particularly limited as long as color development can be confirmed. Specifically, for example, it is preferably 1: (5-20), more preferably 1: (5-15), and still more preferably 1: (9-11). When the mixing ratio is in the above range, lower alcohol can be detected more reliably.
低級アルコール検出試薬と被検液との混合時間は特に限定されないが、呈色反応を十分に進行させるという観点、及び、迅速に目的物を検出するという観点から、２４時間以下（特に１時間以下、更には２〜３０分間）とすることができる。 The mixing time of the lower alcohol detection reagent and the test solution is not particularly limited, but is 24 hours or less (especially 1 hour or less) from the viewpoint of sufficiently proceeding the color reaction and detecting the target product quickly. And 2 to 30 minutes).
本発明の検出方法に用いられる被検液のｐＨは特に限定されないが、例えば、ｐＨ６．３〜８．３であることが好ましく、より好ましくはｐＨ６．８〜７．８、更に好ましくはｐＨ７．０〜７．６である。 The pH of the test solution used in the detection method of the present invention is not particularly limited, but is preferably, for example, pH 6.3 to 8.3, more preferably pH 6.8 to 7.8, and still more preferably pH 7. 0-7.6.
また、本発明の低級アルコール検出方法においては、呈色反応を十分に進行させるという観点から、検出試薬が混合された被検液を加熱する工程を備えていてもよい。
加熱温度は特に限定されないが、例えば、５０℃以下（特に２０〜４０℃）とすることができる。
加熱時間は特に限定されないが、例えば、２４時間以下（特に１時間以下、更には２〜３０分間）とすることができる。
The lower alcohol detection method of the present invention may further include a step of heating the test solution mixed with the detection reagent from the viewpoint of sufficiently proceeding the color reaction.
Although heating temperature is not specifically limited, For example, it can be 50 degrees C or less (especially 20-40 degreeC).
Although heating time is not specifically limited, For example, it can be set to 24 hours or less (especially 1 hour or less, Furthermore, 2 to 30 minutes).
本発明における呈色反応による発色の確認方法としては、目視による確認の他、分光光度計を用いた方法が挙げられる。
分光光度計を用いる場合は、例えば、５４０〜５５０ｎｍの波長について吸光度を測定することにより、低級アルコールの有無を確認することができる。この際、アルコール濃度と吸光度の関係を示す検量線を予め求めておくことにより、未知の濃度の目的物における濃度を測定することができる。
更に、吸光度測定の際には、プレートリーダーを用いて行うことが好ましい。この場合、複数の被検液について連続して吸光度測定を行うことができ、目的物の検出や濃度測定を簡易且つ迅速に行うことができる。
Examples of the method for confirming color development by the color reaction in the present invention include a method using a spectrophotometer in addition to visual confirmation.
When using a spectrophotometer, the presence or absence of a lower alcohol can be confirmed by measuring the absorbance at a wavelength of 540 to 550 nm, for example. At this time, by obtaining in advance a calibration curve showing the relationship between the alcohol concentration and the absorbance, the concentration of the target at an unknown concentration can be measured.
Furthermore, the absorbance measurement is preferably performed using a plate reader. In this case, the absorbance measurement can be continuously performed for a plurality of test solutions, and the detection of the target object and the concentration measurement can be performed easily and quickly.
また、本発明の検出方法においては、被検液の溶媒にリン酸緩衝液が含まれている場合には、溶媒が水のみであって、同濃度の目的物（低級アルコール）が含まれる被検液と比べて、得られる発色の程度の差（即ち吸光度の差）が大きくなる傾向にある。そのため、本発明の低級アルコール検出方法は、リン酸緩衝液下で安定な酵素等の探索に好適に用いることができる。
尚、溶媒として用いられるリン酸緩衝液のｐＨは特に限定されないが、例えば、ｐＨ６．３〜８．３であることが好ましく、より好ましくはｐＨ６．８〜７．８、更に好ましくはｐＨ７．０〜７．６である。
In the detection method of the present invention, when a phosphate buffer is included in the solvent of the test solution, the solvent is only water and the target solution (lower alcohol) having the same concentration is included. Compared with the test solution, the difference in the degree of color development (that is, the difference in absorbance) tends to be large. Therefore, the lower alcohol detection method of the present invention can be suitably used for searching for enzymes and the like that are stable under a phosphate buffer.
The pH of the phosphate buffer used as the solvent is not particularly limited, but is preferably, for example, pH 6.3 to 8.3, more preferably pH 6.8 to 7.8, and still more preferably pH 7.0. ~ 7.6.
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。ここで、「部」及び「％」は、特記しない限り質量基準である。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. Here, “part” and “%” are based on mass unless otherwise specified.
［１］低級アルコール検出試薬（実施例１）の調製
塩基性フクシン１００部と、亜硫酸水素ナトリウム１００部と、塩化水素１００部と、水９７００部とを混合することにより、実施例１の検出試薬を調製した。
[1] Preparation of lower alcohol detection reagent (Example 1) 100 parts of basic fuchsin, 100 parts of sodium hydrogen sulfite, 100 parts of hydrogen chloride, and 9700 parts of water were mixed to detect the detection reagent of Example 1. Was prepared.
［２］吸光度測定（ａ）
以下に示す被検液と参照液を用いて、下記の吸光度測定を行った。
＜被検液及び参照液＞
被検液ａ（アルコール濃度：３％）；蒸留水と１−プロパノールとの混合液
参照液ａ（アルコール濃度：０％）；蒸留水
＜吸光度測定＞
上記［１］で調製した実施例１の検出試薬と、被検液（又は参照液）とを質量比（検出試薬：被検液）で１：１０となるように混合した後、２０℃×１０分間（又は２０分間）の条件にて、呈色反応を進行させた。その後、分光光度計（テカンジャパン社製、型名「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ」）により、波長５４６ｎｍの吸光度を測定し、その結果を表１及び図１（呈色反応の時間と吸光度の関係を示すグラフ）に示した。尚、この吸光度は、上記測定を５回行った際の平均値である。
[2] Absorbance measurement (a)
The following absorbance measurement was performed using the following test solution and reference solution.
<Test solution and reference solution>
Test solution a (alcohol concentration: 3%); mixed solution of distilled water and 1-propanol Reference solution a (alcohol concentration: 0%); distilled water <absorbance measurement>
The detection reagent of Example 1 prepared in [1] above and the test solution (or reference solution) were mixed at a mass ratio (detection reagent: test solution) of 1:10, and then 20 ° C. × The color reaction was allowed to proceed under conditions of 10 minutes (or 20 minutes). Thereafter, the absorbance at a wavelength of 546 nm was measured with a spectrophotometer (manufactured by Tecan Japan, model name “Infinite M200 Pro”), and the results are shown in Table 1 and FIG. )Pointing out toungue. In addition, this light absorbency is an average value when the said measurement is performed 5 times.
表１及び図１によれば、呈色反応時間が１０分間の場合、アルコール０％の参照液ａの吸光度は０．３９であり、３％のプロパノールを含有する被検液ａの吸光度は０．６１であり、その差が０．２２であった。
また、呈色反応時間が２０分間の場合、アルコール０％の参照液ａの吸光度は０．４８であり、３％のプロパノールを含有する被検液ａの吸光度は０．９２であり、その差が０．４４であった。
この結果、アルコールの含有の有無によって吸光度に顕著な差が生じることが確認できた。また、呈色反応時間が１０分間の場合よりも、２０分間の場合の方が吸光度の差が大きくなることが確認できた。
そして、実施例１の低級アルコール検出試薬を用いて呈色反応させることにより、被検液中の低濃度アルコールの有無を十分に検出できることが確認できた。尚、分光光度計を用いた目的物の検出には、吸光度の差が通常０．０５（特に０．１）以上あれば十分である。
According to Table 1 and FIG. 1, when the color reaction time is 10 minutes, the absorbance of the reference solution a containing 0% alcohol is 0.39, and the absorbance of the test solution a containing 3% propanol is 0. .61, and the difference was 0.22.
When the color reaction time is 20 minutes, the absorbance of the reference solution a containing 0% alcohol is 0.48, and the absorbance of the test solution a containing 3% propanol is 0.92. Was 0.44.
As a result, it was confirmed that there was a significant difference in absorbance depending on the presence or absence of alcohol. Further, it was confirmed that the difference in absorbance was larger when the color reaction time was 20 minutes than when the color reaction time was 10 minutes.
It was confirmed that the presence or absence of low-concentration alcohol in the test liquid can be sufficiently detected by performing a color reaction using the lower alcohol detection reagent of Example 1. It should be noted that a difference in absorbance of 0.05 (particularly 0.1) or more is usually sufficient for detecting a target object using a spectrophotometer.
［３］低級アルコール検出試薬（実施例２）の調製
塩基性フクシン１００部と、亜硫酸水素ナトリウム４００部と、塩化水素４００部と、リン酸１１００部と、水３１３００部とを混合することにより、実施例２の検出試薬を調製した。
[3] Preparation of lower alcohol detection reagent (Example 2) By mixing 100 parts of basic fuchsin, 400 parts of sodium bisulfite, 400 parts of hydrogen chloride, 1100 parts of phosphoric acid, and 31300 parts of water, The detection reagent of Example 2 was prepared.
［４］吸光度測定（ｂ）
以下に示す被検液と参照液を用いて、下記の吸光度測定を行った。
＜被検液及び参照液＞
被検液（アルコール３％）
ａ；蒸留水と１−プロパノールとの混合液
ｂ；１２．５ｍＭリン酸緩衝液と１−プロパノールとの混合液
ｃ；２５ｍＭリン酸緩衝液と１−プロパノールとの混合液
参照液（アルコール０％）
ａ；蒸留水
ｂ；１２．５ｍＭリン酸緩衝液
ｃ；２５ｍＭリン酸緩衝液
＜吸光度測定＞
上記［３］で調製した実施例２の検出試薬と、上記各被検液（又は参照液）とを質量比（検出試薬：被検液）で１：１０となるように混合した後、４０℃×２．５時間の条件にて、呈色反応を進行させた。その後、分光光度計（テカンジャパン社製、型名「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ」）により、波長５４６ｎｍの吸光度を測定し、その結果を表２及び図２（リン酸緩衝液の濃度と吸光度の関係を示すグラフ）に示した。尚、この吸光度は、上記測定を５回行った際の平均値である。
[4] Absorbance measurement (b)
The following absorbance measurement was performed using the following test solution and reference solution.
<Test solution and reference solution>
Test solution (alcohol 3%)
a: mixed solution of distilled water and 1-propanol b; mixed solution of 12.5 mM phosphate buffer and 1-propanol c; mixed solution of 25 mM phosphate buffer and 1-propanol Reference solution (
a; distilled water b; 12.5 mM phosphate buffer c; 25 mM phosphate buffer <absorbance measurement>
After mixing the detection reagent of Example 2 prepared in [3] above and each test solution (or reference solution) so as to have a mass ratio (detection reagent: test solution) of 1:10, 40 The color reaction was allowed to proceed under the conditions of ° C x 2.5 hours. Thereafter, the absorbance at a wavelength of 546 nm was measured with a spectrophotometer (manufactured by Tecan Japan, model name “Infinite M200 Pro”), and the results are shown in Table 2 and FIG. 2 (relationship between phosphate buffer concentration and absorbance). Graph). In addition, this light absorbency is an average value when the said measurement is performed 5 times.
表２及び図２によれば、リン酸緩衝液の濃度が０ｍＭの場合、アルコール０％の参照液の吸光度は０．１３であり、３％のプロパノールを含有する被検液の吸光度は０．１７であり、その差が０．０４であった。
また、リン酸緩衝液の濃度が１２．５ｍＭの場合、アルコール０％の参照液の吸光度は０．２４であり、３％のプロパノールを含有する被検液の吸光度は０．５２であり、その差が０．２８であった。
更に、リン酸緩衝液の濃度が２５ｍＭの場合、アルコール０％の参照液の吸光度は０．５３であり、３％のプロパノールを含有する被検液の吸光度は１．１８であり、その差が０．６５であった。
この結果、リン酸緩衝液中におけるアルコールの含有の有無によって吸光度に顕著な差が生じることが確認できた。また、リン酸緩衝液の濃度が大きいほど、吸光度の差が大きくなることが確認できた。
そして、実施例２の低級アルコール検出試薬を用いて呈色反応させることにより、リン酸緩衝液中の低濃度アルコールの有無を十分に検出できることが確認できた。
According to Table 2 and FIG. 2, when the concentration of the phosphate buffer is 0 mM, the absorbance of the reference solution containing 0% alcohol is 0.13, and the absorbance of the test solution containing 3% propanol is 0. 0. 17 and the difference was 0.04.
Further, when the concentration of the phosphate buffer is 12.5 mM, the absorbance of the reference solution containing 0% alcohol is 0.24, and the absorbance of the test solution containing 3% propanol is 0.52. The difference was 0.28.
Further, when the concentration of the phosphate buffer is 25 mM, the absorbance of the reference solution containing 0% alcohol is 0.53, and the absorbance of the test solution containing 3% propanol is 1.18. It was 0.65.
As a result, it was confirmed that there was a significant difference in absorbance depending on the presence or absence of alcohol in the phosphate buffer. Moreover, it has confirmed that the difference in a light absorbency became large, so that the density | concentration of a phosphate buffer solution was large.
It was confirmed that the presence or absence of low-concentration alcohol in the phosphate buffer can be sufficiently detected by performing a color reaction using the lower alcohol detection reagent of Example 2.
［４］実施例の効果
以上のことから、実施例１及び２の低級アルコール検出試薬は、低級アルコールの検出能力に優れており、目的物である低級アルコールが低濃度であっても、呈色反応を用いることにより、簡易且つ確実に目的物を検出可能であることが分かった。また、本実施例１及び２の検出試薬は、酵素を含まない非酵素系の試薬であるため、既存の酵素系試薬に比べて検出条件を幅広く設定することができると共に、劣化の心配が少なく長期の保存が可能である。更に、本実施例の低級アルコール検出試薬は、リン酸緩衝液中の低級アルコールの検出に優れているため、リン酸緩衝液下で安定な酵素等の探索に好適に用いることができる。
尚、被検液におけるアルコール濃度が未知である場合には、予めアルコール濃度と吸光度の関係を示す検量線を求めておくことにより、その濃度を測定することができる。
[4] Effects of Examples From the above, the lower alcohol detection reagents of Examples 1 and 2 are excellent in the ability to detect lower alcohols, and even if the target lower alcohol has a low concentration, it is colored. It was found that the target product can be detected easily and reliably by using the reaction. In addition, since the detection reagents of Examples 1 and 2 are non-enzymatic reagents that do not contain enzymes, detection conditions can be set wider than existing enzyme reagents, and there is less risk of deterioration. Long-term storage is possible. Furthermore, since the lower alcohol detection reagent of this example is excellent in the detection of lower alcohol in a phosphate buffer, it can be suitably used for searching for an enzyme or the like that is stable in the phosphate buffer.
When the alcohol concentration in the test solution is unknown, the concentration can be measured by obtaining a calibration curve indicating the relationship between the alcohol concentration and the absorbance in advance.
前述の例は単に説明を目的とするものでしかなく、本発明を限定するものと解釈されるものではない。本発明を典型的な実施形態の例を挙げて説明したが、本発明の記述および図示において使用された文言は、限定的な文言ではなく説明的および例示的なものであると理解される。ここで詳述したように、その形態において本発明の範囲または精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が可能である。ここでは、本発明の詳述に特定の構造、材料および実施例を参照したが、本発明をここにおける開示事項に限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明は添付の特許請求の範囲内における、機能的に同等の構造、方法、使用の全てに及ぶものとする。 The foregoing examples are for illustrative purposes only and are not to be construed as limiting the invention. Although the invention has been described with reference to exemplary embodiments, it is to be understood that the language used in the description and illustration of the invention is illustrative and exemplary rather than limiting. As detailed herein, changes may be made in its form within the scope of the appended claims without departing from the scope or spirit of the invention. Although specific structures, materials and examples have been referred to in the detailed description of the invention herein, it is not intended to limit the invention to the disclosure herein, but rather, the invention is claimed. It covers all functionally equivalent structures, methods and uses within the scope.
本発明は上記で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形または変更が可能である。 The present invention is not limited to the embodiments described in detail above, and various modifications or changes can be made within the scope of the claims of the present invention.
本発明の低級アルコール検出試薬及びそれを用いた低級アルコール検出方法は、バイオエタノールやバイオプロパノールを生産する微生物又は酵素の改良や新規探索分野において好適に利用することができる。特に、リン酸緩衝液下での吸光度の差が顕著になることから、リン酸緩衝液下で安定な酵素等の探索に有効と考えられる。 The lower alcohol detection reagent and the lower alcohol detection method using the same of the present invention can be suitably used in the improvement of microorganisms or enzymes that produce bioethanol or biopropanol or in the field of new search. In particular, since the difference in absorbance under the phosphate buffer becomes significant, it is considered effective for searching for enzymes and the like that are stable under the phosphate buffer.
Claims (4)
塩基性フクシンと、亜硫酸水素ナトリウムと、塩化水素と、水と、を含有することを特徴とする低級アルコール検出試薬。 A lower alcohol detection reagent for detecting lower alcohol by using a color reaction,
A lower alcohol detection reagent comprising basic fuchsin, sodium bisulfite, hydrogen chloride, and water.
前記亜硫酸水素ナトリウムの含有割合が５０〜４００質量部であり、
前記塩化水素の含有割合が５０〜４００質量部である請求項１に記載の低級アルコール検出試薬。 When the basic fuchsin is 100 parts by mass,
The content ratio of the sodium hydrogen sulfite is 50 to 400 parts by mass,
The lower alcohol detection reagent according to claim 1, wherein the hydrogen chloride content is 50 to 400 parts by mass.
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