JP2013184903A - Differentiation-inducing promoter, gene expression enhancer, differentiation-inducing promotion method, and gene expression-enhancing method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分化誘導促進剤、遺伝子発現亢進剤、分化誘導促進方法及び遺伝子発現亢進方法に関する。 The present invention relates to a differentiation induction promoter, a gene expression enhancer, a differentiation induction promotion method, and a gene expression enhancement method.
サイトカイン遺伝子のノックアウトマウスやＴ細胞受容体の変異マウスでは、自然発生的な大腸炎が観察される（非特許文献１〜２参照）。これらのことから、異物に対する免疫反応は、Ｔｈ１／Ｔｈ２などの異なるヘルパーＴ細胞のバランスにより調節されていることが示唆されている。
ヘルパーＴ細胞のうち、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫反応を抑制することで、免疫寛容の維持や炎症の抑制に重要な役割を果たしている。従って、Ｔｒｅｇを分化誘導する技術は、炎症性疾患や自己免疫性疾患など、免疫の過剰反応が原因である疾患の治療に役立つことが期待される。
これまで、Ｔｒｅｇを分化誘導する物質として、ＴＧＦ−βやニコチン・スタチンなどが知られている（非特許文献３〜４参照）。in vivoでは、ラクトバチルス・プランタラムやラクトバチルス・ロイテリを摂取することによって、リンパ球におけるＴｒｅｇの割合が増加することが知られている（非特許文献５〜６参照）。
Spontaneous colitis is observed in cytokine gene knockout mice and T cell receptor mutant mice (see Non-Patent Documents 1 and 2). These facts suggest that the immune response to foreign substances is regulated by the balance of different helper T cells such as Th1 / Th2.
Among helper T cells, regulatory T cells (Treg) play an important role in maintaining immune tolerance and suppressing inflammation by suppressing immune responses. Therefore, the technique for inducing differentiation of Treg is expected to be useful for the treatment of diseases caused by excessive immune responses such as inflammatory diseases and autoimmune diseases.
Until now, TGF-β, nicotine statin, and the like are known as substances that induce differentiation of Treg (see Non-Patent Documents 3 to 4). In vivo, it is known that the ratio of Treg in lymphocytes is increased by ingesting Lactobacillus plantarum or Lactobacillus reuteri (see Non-Patent Documents 5 to 6).
本発明は、未分化Ｔ細胞に対し、制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進する新規分化誘導促進方法及び新規分化誘導促進剤、並びにｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｐ３(Ｆｏｘｐ３)遺伝子発現亢進剤及びＦｏｘｐ３遺伝子発現亢進方法を提供することを目的とする。 The present invention relates to a novel differentiation induction promoting method, a novel differentiation induction promoting agent, a forkhead box P3 (Foxp3) gene expression enhancer, and a Foxp3 gene expression enhancing agent that promote differentiation of undifferentiated T cells into regulatory T cells. It aims to provide a method.
本発明の一実施態様は、未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進するための分化誘導促進剤であって、ラクトフェリンを有効成分として含有するものである。 One embodiment of the present invention is a differentiation induction promoter for promoting differentiation induction from undifferentiated T cells to regulatory T cells, and contains lactoferrin as an active ingredient.
本発明の他の一実施態様は、未分化Ｔ細胞において、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現を亢進させるための遺伝子発現亢進剤であって、ラクトフェリンを有効成分として含有するものである。 Another embodiment of the present invention is a gene expression enhancer for enhancing the expression of Foxp3 gene in undifferentiated T cells, which contains lactoferrin as an active ingredient.
本発明のさらに他の一実施態様は、前記分化誘導促進剤、前記遺伝子発現亢進剤を有効成分として含有することを特徴とする、免疫抑制剤である。 Yet another embodiment of the present invention is an immunosuppressive agent comprising the differentiation induction promoter and the gene expression enhancer as active ingredients.
本発明のさらなる一実施態様は、未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進する分化誘導促進方法であって、前記制御性Ｔ細胞に分化することができる未分化Ｔ細胞を、ラクトフェリンの存在下で分化誘導することを特徴とする方法である。 A further embodiment of the present invention is a differentiation induction promoting method for promoting differentiation induction from undifferentiated T cells to regulatory T cells, wherein the undifferentiated T cells capable of differentiating into regulatory T cells are: It is a method characterized by inducing differentiation in the presence of lactoferrin.
本発明のさらなる一実施態様は、未分化Ｔ細胞において、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現を亢進させる遺伝子発現亢進方法であって、前記未分化Ｔ細胞に、ラクトフェリンを投与することを特徴とする方法である。 A further embodiment of the present invention is a gene expression enhancing method for enhancing Foxp3 gene expression in undifferentiated T cells, wherein lactoferrin is administered to the undifferentiated T cells.
これらの方法において、ヒト個体中で分化誘導する場合を除いてもよい。
なお、前記未分化Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陰性、ＣＤ６２Ｌ陽性の細胞であることが好ましい。
In these methods, the case of inducing differentiation in a human individual may be excluded.
The undifferentiated T cells are preferably CD4 positive, CD25 negative, and CD62L positive cells.
本発明によって、未分化Ｔ細胞に対し、制御性Ｔ細胞への分化を誘導する新規分化誘導促進方法及び新規分化誘導促進剤、並びにＦｏｘｐ３遺伝子の発現を亢進するための遺伝子発現亢進剤及び遺伝子発現亢進方法を提供することとなった。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a novel differentiation induction promoting method and a novel differentiation induction promoting agent for inducing differentiation into regulatory T cells relative to undifferentiated T cells, and a gene expression enhancing agent and gene expression for enhancing the expression of Foxp3 gene It provided an enhancement method.
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.; J. S. Bonifacino, M. Dasso, J. B. Harford, J. Lippincott-Schwartz, K. M. Yamada (Ed.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを改変した方法を用いた。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合、特に説明が無い場合にはそれらに添付のプロトコールを用いた。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to examples. Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd .; JS Bonifacino, M Dasso, JB Harford, J. Lippincott-Schwartz, KM Yamada (Ed.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons Ltd. Using. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them were used.
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施の形態を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾できることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. . The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for illustration or explanation. It is not limited to. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
本発明によると、未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化を誘導する際、ラクトフェリンの存在下で分化誘導を促進することができる。この未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導促進は、in vivoで行なってもin vitroで行なってもよい。 According to the present invention, when inducing differentiation from undifferentiated T cells to regulatory T cells, differentiation induction can be promoted in the presence of lactoferrin. The promotion of differentiation induction from undifferentiated T cells to regulatory T cells may be performed in vivo or in vitro.
分化誘導促進をin vivoで行なう場合、動物個体にラクトフェリンを含有する分化誘導促進剤を投与する。投与方法は特に限定されず、経口投与であっても非経口投与であっても構わない。投与する対象の動物は特に限定されず、ヒトであっても、ヒト以外の動物であっても構わない。投与量は、その動物の年齢、性別、身長、体重などによって、投与者が、適宜決定することができる。 When differentiation induction is promoted in vivo, a differentiation induction promoter containing lactoferrin is administered to an animal individual. The administration method is not particularly limited, and it may be oral administration or parenteral administration. The animal to be administered is not particularly limited, and it may be a human or a non-human animal. The dose can be appropriately determined by the administra- tor according to the age, sex, height, weight, etc. of the animal.
このようなラクトフェリンを含有する分化誘導促進剤の剤形は、特に限定されず、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤；坐剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。この製剤化は、従来使用されている製剤添加物を用いて、常法で行うことができる。製剤添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤などの既存の添加物を用いることができる。 The dosage form of such a differentiation-inducing promoter containing lactoferrin is not particularly limited, and various dosage forms such as tablets, capsules, powders, granules, pills, liquids for oral administration, Emulsions, suspensions, solutions, spirits, syrups, extracts, and elixirs can be used. Examples of parenteral agents include injections such as subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections; transdermal administration or patches, ointments or lotions; sublingual agents for buccal administration Oral aerosol; as well as aerosols for nasal administration; suppositories, but not limited to. These preparations can be produced by known methods usually used in the preparation process. This formulation can be performed by a conventional method using conventionally used formulation additives. Examples of formulation additives include excipients, disintegrants, diluents, lubricants, flavoring agents, coloring agents, sweeteners, corrigents, suspending agents, wetting agents, emulsifiers, dispersants, and auxiliary agents. , Existing additives such as preservatives, buffers, binders, stabilizers, coating agents and the like can be used.
こうして、ラクトフェリンを含有する分化誘導促進剤を投与することによって、動物個体内で未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進することができる。従って、ラクトフェリンを含有する分化誘導促進剤は、その動物個体内で免疫反応を抑制する免疫抑制剤として用いることができる。このような免疫抑制剤は、体内の免疫を抑制することにより治療することができる疾患、例えば、炎症、自己免疫病、膠原病、全身性エリテマトーデス、リウマチ、各種のアレルギー、などの治療や、拒絶反応の抑制などに、用いることができる。また、他の免疫抑制剤とともに、動物個体に投与されてもよい。 Thus, by administering a differentiation induction promoter containing lactoferrin, differentiation induction from undifferentiated T cells to regulatory T cells can be promoted within an animal individual. Therefore, the differentiation-inducing promoter containing lactoferrin can be used as an immunosuppressive agent that suppresses the immune response within the animal individual. Such immunosuppressants can treat diseases that can be treated by suppressing immunity in the body, such as inflammation, autoimmune diseases, collagen diseases, systemic lupus erythematosus, rheumatism, various allergies, and rejection. It can be used to suppress the reaction. Moreover, you may administer to an animal individual with another immunosuppressive agent.
分化誘導促進をin vitroで行なう場合、未分化Ｔ細胞を培養している培養液にラクトフェリンを含有する分化誘導促進剤を添加し、細胞を分化誘導条件下において、分化誘導すればよい。分化誘導促進剤の添加量は特に限定されないが、１μＭ以上であることが好ましく、１０μＭ以上であることがより好ましい。分化誘導条件は、当業者に周知の条件を選択すればよく、例えば、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激であってもよい。 When differentiation induction is promoted in vitro, a differentiation induction promoter containing lactoferrin may be added to a culture medium in which undifferentiated T cells are cultured, and the cells may be induced to differentiate under differentiation induction conditions. The addition amount of the differentiation induction promoter is not particularly limited, but is preferably 1 μM or more, and more preferably 10 μM or more. Differentiation induction conditions may be selected from conditions well known to those skilled in the art. For example, stimulation with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody may be used.
（１）未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７−１０週齢）から脾臓を抽出し、圧迫により破砕することで細胞懸濁液を調製した。懸濁液をセルストレイナー（ＢＤバイオサイエンス社）に通し非破砕組織断片を除去した後、ＡＣＫ緩衝液に懸濁して溶血させ、ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ・アルドリッチ社）で希釈し、遠心して細胞を回収した。細胞を０．５％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含有するリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、ＣＤ４陽性−ＣＤ６２Ｌ陽性細胞をＭＡＣＳビーズ（ミルテニーバイオテク社）で単離し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、未分化Ｔ細胞とした。
抗ＣＤ３ｅ抗体（２μｇ／ｍＬ）（イーバイオサイエンス社）でコートした２４ウエルの細胞培養用プレートに１×１０６個の未分化Ｔ細胞を播種し、抗ＣＤ２８抗体（最終濃度２μｇ／ｍＬ）（イーバイオサイエンス社）を添加した。同時に、ウシ・ラクトフェリン（フォンテラ・ジャパン社）を最終濃度０．１、１、１０μＭになるように添加し、７２時間培養した。なお、陰性対照として、ウシ・ラクトフェリンを含まない培地を用い、陽性対照として、組換えヒトＴＧＦ−β１（２ｎｇ／ｍＬ：Ｒ＆Ｄシステム社）を含有した培地を用いて培養を行なった。
(1) Differentiation induction from undifferentiated T cells to regulatory T cells A cell suspension was prepared by extracting the spleen from BALB / c mice (female, 7-10 weeks old) and crushing them by compression. The suspension was passed through a cell strainer (BD Bioscience) to remove non-disrupted tissue fragments, then suspended in ACK buffer, hemolyzed, diluted with RPMI 1640 medium (Sigma Aldrich), and centrifuged to recover the cells. did. The cells were suspended in phosphate buffered saline containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid, CD4 positive-CD62L positive cells were isolated with MACS beads (Miltenyi Biotech), and 10% FBS was isolated. Suspended in the contained RPMI 1640 medium to prepare undifferentiated T cells.
1 × 10 6 undifferentiated T cells are seeded on a 24-well cell culture plate coated with an anti-CD3e antibody (2 μg / mL) (EBioscience), and an anti-CD28 antibody (final concentration 2 μg / mL) ( EBioscience) was added. At the same time, bovine lactoferrin (Fontera Japan) was added to a final concentration of 0.1, 1, 10 μM and cultured for 72 hours. In addition, it culture | cultivated using the culture medium which does not contain bovine lactoferrin as a negative control, and the culture medium containing recombinant human TGF-β1 (2 ng / mL: R & D system) as a positive control.
（２）Ｆｏｘｐ３タンパク質をマーカーとした解析
（１）に従って分化誘導した細胞を回収し、フィコエリスリン標識抗Ｆｏｘｐ３抗体（イーバイオサイエンス社）およびＦｏｘｐ３染色セット（イーバイオサイエンス社）を用いて染色した。染色後、フローサイトメーター（ガリオス：ベックマンコールター社）を用いて、Ｆｏｘｐ３陽性細胞の割合を測定した。なお、Ｆｏｘｐ３は、制御性Ｔ細胞分化のマスター因子であり、広く認められた制御性Ｔ細胞のマーカーである。
その結果、図１に示すように、１０μＭのウシ・ラクトフェリンを含有した培地では、Ｆｏｘｐ３陽性細胞が約６−７倍に増加していた。このように、ウシ・ラクトフェリンには、未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進する作用がある。
(2) Analysis using Foxp3 protein as a marker Cells differentiated according to (1) were collected and stained using a phycoerythrin-labeled anti-Foxp3 antibody (EBioscience) and Foxp3 staining set (EBioscience). . After staining, the ratio of Foxp3-positive cells was measured using a flow cytometer (Galios: Beckman Coulter). Foxp3 is a master factor of regulatory T cell differentiation and a widely recognized marker of regulatory T cells.
As a result, as shown in FIG. 1, Foxp3 positive cells increased about 6-7 times in the medium containing 10 μM bovine lactoferrin. Thus, bovine lactoferrin has an action of promoting differentiation induction from undifferentiated T cells to regulatory T cells.
（３）Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡをマーカーとした解析
（１）に従って分化誘導した細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社）を用いてＲＮＡを抽出した。スーパースクリプトIII（ライフテクノロジーズ社）を用いてｃＤＮＡを合成し、ライトサイクラー（ロッシュ・ダイアクノスティクス社）を用いたリアルタイムＰＣＲ法により遺伝子発現を定量した。Ｆｏｘｐ３の発現解析には、
フォワードプライマー：5’―TACTTCAAGTTCCACAACATGCGACC―3’（配列番号１）
リバーズプライマー：5’―CGCACAAAGCACTTGTGCAGACTCAG―3’（配列番号２）
を用い、内部標準としてのヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の発現解析には、
フォワードプライマー：5’―AGCCTAAGATGAGCGCAAGT―3’（配列番号３）
リバーズプライマー：5’―TTACTAGGCAGATGGCCACA―3’（配列番号４）
を用いた。そして、陰性対照におけるＦｏｘｐ３ｍＲＮＡの発現を１とした時の、発現の相対量を算出した。
その結果、図２に示すように、１０μＭのウシ・ラクトフェリンを含有した培地では、Ｆｏｘｐ３のｍＲＮＡ発現量が約６０−７０倍に増加した。このように、ウシ・ラクトフェリンには、未分化Ｔ細胞に対し、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現を促進する作用がある。
(3) Analysis using Foxp3 mRNA as a marker Cells differentiated according to (1) were collected, and RNA was extracted using an RNeasy mini kit (Qiagen). CDNA was synthesized using Superscript III (Life Technologies), and gene expression was quantified by a real-time PCR method using a light cycler (Roche Dyaconics). For Foxp3 expression analysis,
Forward primer: 5'-TACTTCAAGTTCCACAACATGCGACC-3 '(SEQ ID NO: 1)
Rivers primer: 5'-CGCACAAAGCACTTGTGCAGACTCAG-3 '(SEQ ID NO: 2)
For the expression analysis of hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) as an internal standard,
Forward primer: 5'-AGCCTAAGATGAGCGCAAGT-3 '(SEQ ID NO: 3)
Rivers primer: 5'-TTACTAGGCAGATGGCCACA-3 '(SEQ ID NO: 4)
Was used. Then, the relative amount of expression was calculated when the expression of Foxp3 mRNA in the negative control was 1.
As a result, as shown in FIG. 2, the expression level of Foxp3 mRNA increased about 60-70 times in the medium containing 10 μM bovine lactoferrin. Thus, bovine lactoferrin has the effect of promoting Foxp3 gene expression on undifferentiated T cells.
（４）分化誘導された制御性Ｔ細胞の機能評価
（１）に従って分化誘導した細胞を回収した。この細胞が、制御性Ｔ細胞として機能することを確認するため、ＣＤ４陽性−ＣＤ６２Ｌ陽性細胞をレスポンダー細胞とし、分化誘導した細胞とレスポンダー細胞を様々な割合で混合して、レスポンダー細胞の増殖応答に対する抑制活性を評価した。
(4) Functional evaluation of differentiation-induced regulatory T cells According to (1), the differentiation-induced cells were collected. In order to confirm that these cells function as regulatory T cells, CD4 positive-CD62L positive cells are used as responder cells, and differentiation-induced cells and responder cells are mixed at various ratios to respond to the proliferation response of the responder cells. Inhibitory activity was evaluated.
まず、ＢＡＬＢ/ｃマウスより調製した脾臓細胞から、ＣＤ４陽性細胞をＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）により除いた後、２０μｇ/ｍＬマイトマイシンＣ（ナカライテスク社）および１０％ウシ胎児血清を含有したＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ・アルドリッチ社）で１時間、３７℃で処理した。１０％ウシ胎児血清を含有した ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、同培地に懸濁後、抗原提示細胞として、２×１０５ずつ９６ウエルの丸底プレートに播種した。次に、（１）と同様にＣＤ４陽性−ＣＤ６２Ｌ陽性細胞を単離し、レスポンダー細胞として５×１０４ずつ加えた。さらに（１）の方法で分化誘導した細胞を、レスポンダー細胞に対し１：１〜１：８の割合となるように加えた。抗ＣＤ３ｅ抗体（終濃度２μｇ／ｍＬ：イーバイオサイエンス社）、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で７２時間、３７℃で培養した後、トリチウムチミジンを終濃度９２．５ｋＢｑ／ｍＬで添加し、さらに１８時間培養した。細胞を回収し、トリチウムの取り込みを液体シンチレーションカウンター（Ｔｒｉ−ｃａｒｂ３１００ＴＲ・パーキンエルマー社）により測定した。なお、陰性対照として、レスポンダー細胞だけを培養したもの、およびウシ・ラクトフェリン非存在下で分化誘導した細胞と、レスポンダー細胞を混合培養したものを用いた。また、陽性対照として組換えヒトＴＧＦ−β１を添加して分化誘導した細胞とレスポンダー細胞を混合培養したものを用いた。 First, CD4 positive cells were removed from spleen cells prepared from BALB / c mice by MACS (Miltenyi Biotech), and then RPMI1640 medium containing 20 μg / mL mitomycin C (Nacalai Tesque) and 10% fetal bovine serum. (Sigma Aldrich) for 1 hour at 37 ° C. The plate was washed three times with RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum, suspended in the same medium, and then seeded as antigen-presenting cells in a 96-well round-bottom plate in an amount of 2 × 10 5 . Next, CD4 positive-CD62L positive cells were isolated in the same manner as in (1), and 5 × 10 4 cells were added as responder cells. Furthermore, the cells induced to differentiate by the method (1) were added to the responder cells at a ratio of 1: 1 to 1: 8. Anti-CD3e antibody (final concentration 2 μg / mL: eBioscience), cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FBS for 72 hours at 37 ° C., tritiated thymidine was added at a final concentration of 92.5 kBq / mL, Cultured for 18 hours. Cells were collected, and tritium uptake was measured with a liquid scintillation counter (Tri-carb3100TR, PerkinElmer). In addition, as a negative control, those in which only responder cells were cultured, and cells in which differentiation was induced in the absence of bovine lactoferrin and responder cells were used. In addition, as a positive control, a cell obtained by adding recombinant human TGF-β1 and inducing differentiation and a responder cell were used.
その結果、図３に示すように、ラクトフェリンを含有した分化誘導培地で得られた細胞は、ラクトフェリンを含有しない分化誘導培地で得られた細胞に比べ、レスポンダー細胞の増殖に対するより強力な抑制作用を有していた。このように、ラクトフェリン存在下で分化誘導した細胞は、制御性Ｔ細胞としての性質を有する。 As a result, as shown in FIG. 3, the cells obtained with the differentiation-inducing medium containing lactoferrin exhibited a stronger suppressive action on the proliferation of responder cells than the cells obtained with the differentiation-inducing medium containing no lactoferrin. Had. Thus, cells induced to differentiate in the presence of lactoferrin have properties as regulatory T cells.
（５）ラクトフェリン存在下で分化誘導されたＴ細胞による大腸炎症状の緩和
７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバー・ジャパン社）に、（１）と同様に、ラクトフェリン存在下で分化誘導したＴ細胞（ＬＦＴｒｅｇ）を、１匹あたり２×１０６個、マウスの尾静脈に注射して移入した。１時間後に、２０ｍｇ／ｍＬのトリニトロベンゼンスルフォン酸（ＴＮＢＳ：和光純薬）１００μＬを、アニマルフィーディングニードルを装着した注射器を用いて直腸に注入することにより、炎症性腸疾患を誘発した。なお、各群の個体数は１２から１５であり、陰性対照はＴＮＢＳに代わって５０％エタノールを直腸に注入したマウスである。ＴＮＢＳ投与４日後、大腸の長さを測定した。
(5) Relief of colon inflammation by T cells induced to differentiate in the presence of lactoferrin Induction of differentiation in the presence of lactoferrin in 7-week-old female BALB / c mice (Charles River Japan) in the same manner as (1) T cells (LFTreg) were transferred by injection into the tail vein of mice at 2 × 10 6 cells per mouse. One hour later, inflammatory bowel disease was induced by injecting 100 μL of 20 mg / mL trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS: Wako Pure Chemical Industries) into the rectum using a syringe equipped with an animal feeding needle. The number of individuals in each group is 12 to 15, and the negative control is a mouse injected with 50% ethanol into the rectum instead of TNBS. Four days after administration of TNBS, the length of the large intestine was measured.
図４Ａに、切除した大腸の外見の様子を示す。図４Ｂは、切除した大腸の長さを比較したグラフである。このように、ＬＦＴｒｅｇを移入したマウスでは、ＴＮＢＳを単独で投与したマウスと比較して、大腸の長さが有意に（ｐ＜０．０５）長かった。（統計量の比較には、スチューデントのｔ検定を用いた。）大腸の短縮の程度は、大腸粘膜の肥厚の程度を反映し、大腸炎の指標として利用されることから、ＬＦＴｒｅｇの移入により、大腸炎の症状が緩和されたことがわかる。 FIG. 4A shows the appearance of the excised large intestine. FIG. 4B is a graph comparing lengths of excised large intestine. Thus, in the mice transferred with LFTreg, the length of the large intestine was significantly (p <0.05) longer than that of the mice administered with TNBS alone. (Student's t-test was used to compare the statistics.) The degree of shortening of the large intestine reflects the degree of thickening of the mucosa of the large intestine and is used as an indicator of colitis, so by the transfer of LFTreg, It can be seen that the symptoms of colitis were alleviated.
一方、ＴＮＢＳ注入後２日目に、各群のマウスの糞便の状態を肉眼で観察し、正常便を（１）、軟便を（２）、下痢便を（３）、水様便を（４）としたスコアで評価し、各群ごとに、そのスコアをグラフにプロットした。図４Ｃに示すように、ＬＦＴｒｅｇの移入により下痢の症状が有意に（ｐ＜０．０５）緩和された。（統計量の比較には、マン・ホイットニーのＵ検定を用いた。）
このように、ラクトフェリン存在下で分化誘導したＴ細胞は、抗炎症効果を有する。
On the other hand, on the second day after the injection of TNBS, the stool state of each group of mice was observed with the naked eye. ) And scored on a graph for each group. As shown in FIG. 4C, LFTreg transfer significantly relieved the symptoms of diarrhea (p <0.05). (Mann-Whitney U test was used for comparison of statistics.)
Thus, T cells induced to differentiate in the presence of lactoferrin have an anti-inflammatory effect.
Claims (8)
ラクトフェリンを有効成分として含有する分化誘導促進剤。 A differentiation-inducing promoter for promoting differentiation induction from undifferentiated T cells to regulatory T cells,
A differentiation induction promoter containing lactoferrin as an active ingredient.
ラクトフェリンを有効成分として含有する遺伝子発現亢進剤。 A gene expression enhancer for enhancing the expression of Foxp3 gene in undifferentiated T cells,
A gene expression enhancer containing lactoferrin as an active ingredient.
前記制御性Ｔ細胞に分化することができる未分化Ｔ細胞を、ラクトフェリンの存在下で分化誘導することを特徴とする、方法（ヒト個体中で分化誘導する場合を除く。）。 A method for promoting differentiation induction, which promotes differentiation induction from undifferentiated T cells to regulatory T cells,
A method (unless differentiation is induced in a human individual), characterized by inducing differentiation of undifferentiated T cells capable of differentiating into the regulatory T cells in the presence of lactoferrin.
前記未分化Ｔ細胞に、ラクトフェリンを投与することを特徴とする、方法（ヒト個体中で分化誘導する場合を除く。）。 A gene expression enhancing method for enhancing the expression of Foxp3 gene in undifferentiated T cells, comprising:
A method (except for the case of inducing differentiation in a human individual), wherein lactoferrin is administered to the undifferentiated T cells.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101785921B1 (en) * | 2016-02-01 | 2017-10-17 | 강원대학교 산학협력단 | The promoting method for the differentiation of regulatory T cell by lactoferrin and TGF-β, Composition with lactoferrin and TGF-β for the differentiation of regulatory T cell |
-
2012
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| KR101785921B1 (en) * | 2016-02-01 | 2017-10-17 | 강원대학교 산학협력단 | The promoting method for the differentiation of regulatory T cell by lactoferrin and TGF-β, Composition with lactoferrin and TGF-β for the differentiation of regulatory T cell |
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