JP2013183725A - Method for predicting responsiveness of anticancer drug and for prognosis based on classifying disease types of colon cancer by analysis of gene expression - Google Patents

Method for predicting responsiveness of anticancer drug and for prognosis based on classifying disease types of colon cancer by analysis of gene expression Download PDF

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for integrally analyzing mutation of genes or the like corresponding to carcinogenesis of colon cancer based on comprehensive analysis of gene expressions of colon cancer.SOLUTION: There are provided a method for predicting responsiveness of an anti EGFR antibody or anticancer drug of a colon cancer patient comprising a process (1) of measuring expressions of cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene, (2) a process of obtaining the coefficient of correlation between individual expression profiles of individual clusters obtained from the expressions and mean expression profile of the previously obtained individual clusters, and (3) a process of relegating the sample to a cluster having a larger coefficient of correlation between the average expression profile and cluster A and between the average expression profile and cluster B, and to a cluster having a larger coefficient of correlation between the average expression profile and cluster 1 and between the average expression profile and cluster 2.

Description

本発明は、本発明者によって初めて、教師なし階層クラスター解析により分類された4つのクラスター間の分子生物学的および臨床病理組織学的特徴における相違に基づき、大腸癌組織又は大腸癌細胞の抗がん剤及び抗EGFR抗体に対する応答性を予測する方法、及びそれらの方法に使用し得るキット等に関する。   The present invention is based on the difference in molecular biology and clinicopathologic characteristics between four clusters classified by unsupervised hierarchical cluster analysis for the first time by the present inventor. The present invention relates to methods for predicting responsiveness to cancer drugs and anti-EGFR antibodies, kits that can be used in those methods, and the like.

大腸癌は肺癌、乳癌および前立腺癌とともに、近年、罹患数の増加が顕著な癌のひとつである。「地域がん登録」研究班の全国がん罹患率に基づき行われた将来予測によると、2020年の罹患者数は15.4万人に達し、最も罹患数が多い癌になると推測されている1。一方、切除不能進行再発大腸癌の予後は、この20年で著しく改善してきた。生存期間の中央値は1990年代には14.2ヵ月であったものが2000年には18.0ヵ月、2006年には29.3ヵ月になったと報告されている2。2000年頃の生存期間の延長は積極的な肝転移切除の導入によるものであり、それ以後の延びは薬物療法の進歩の結果であるとされる。特に2000年以降の生存期間の延長は著しく、薬物療法の進歩がめざましいことを示している。大腸癌に対する薬物療法のキードラッグは、オキサリプラチン (oxaliplatin: l-OHP)、塩酸イリノテカン (irinotecan: CPT-11)、5-FU、S-1、カペシタビン (capecitabine)、ロイコボリン (leucovorin: LV)である。これらの薬剤を併用した標準化学療法としてl-OHPを含んだレジメンのFOLFOX (l-OHP+5-FU+ロイコボリン)3やCapeOX (カペシタビン+オキザリプラチン)4、CPT-11を含んだレジメンのFOLFIRI (イリノテカン+5-FU+ロイコボリン)5やIRIS (S-1+イリノテカン)6がある。さらにVEGFに対するモノクローナル抗体であるベバシズマブやEGFRに対するモノクローナル抗体のセツキシマブやパニツムマブなどの分子標的治療薬が導入されるようになった。 In addition to lung cancer, breast cancer, and prostate cancer, colorectal cancer is one of the cancers that have been increasing in number in recent years. According to the "regional cancer registries" on the basis of the national cancer incidence of the research team carried out a future prediction, it sufferers number of 2020 reached 15.4 million people, it is estimated that most affected the number becomes the most common cancer 1 . On the other hand, the prognosis of unresectable advanced recurrent colorectal cancer has improved significantly over the past 20 years. The median survival was reported to have been 14.2 months in the 1990s but 18.0 months in 2000 and 29.3 months in 2006 2 . The prolongation of survival around 2000 is due to the introduction of aggressive resection of liver metastases, and the subsequent extension is considered to be the result of advances in drug therapy. In particular, the prolongation of the survival period after 2000 is remarkable, indicating that the progress of pharmacotherapy is remarkable. Key drugs for pharmacotherapy for colorectal cancer are oxaliplatin (l-OHP), irinotecan hydrochloride (irinotecan: CPT-11), 5-FU, S-1, capecitabine, and leucovorin (LV). is there. Standard chemotherapy with these drugs is FOLFOX (l-OHP + 5-FU + leucovorin) 3 in regimens containing l-OHP 3 or Capexine (capecitabine + oxaliplatin) 4 , FOLFIRI (irinotecan) in regimens containing CPT-11 + 5-FU + leucovorin) 5 and IRIS (S-1 + irinotecan) 6 . Furthermore, molecular targeted therapeutics such as bevacizumab, a monoclonal antibody against VEGF, and cetuximab and panitumumab, monoclonal antibodies against EGFR, have been introduced.

大腸癌の発がんメカニズムは遺伝子、染色体不安定性およびエピジェネティクスの視点から、染色体不安定性 (CIN: chromosomal instability)、マイクロサテライト不安定性 (MSI: microsatellite instability)およびCpG island methylator phenotype (CIMP)の3つに分類され、それぞれ大腸癌の約60%、約15％および約20％に認められる7。CINは染色体の異数性や構造異常が特徴である8。MSIは、マイクロサテライトの1〜数塩基の繰り返し配列で繰り返し数に変化が生じるものであり、その原因はミスマッチ修復遺伝子の発現抑制や変異である。MSIはBAT25、BAT26、D2S123、D5S346およびD17S250の繰り返し配列の不安定性の視点から、MSS (stable)、MSI-L (low)、MSI-H (high)に分類される9。CIMPではプロモーター領域のCpG部位でメチル化が起こることにより種々の遺伝子の転写が抑制される10, 11。KRAS、APC、TP53など個々の癌関連遺伝子の変異の蓄積は、これらの発がん機構の過程に生じると考えられている。 There are three carcinogenic mechanisms in colorectal cancer: chromosomal instability (CIN), microsatellite instability (MSI), and CpG island methylator phenotype (CIMP) from the viewpoint of gene, chromosomal instability and epigenetics. 7 and are found in about 60%, about 15% and about 20% of colorectal cancer, respectively. CIN is aneuploidy or structural abnormality characteristic of chromosome 8. MSI is a repetitive sequence of 1 to several bases of microsatellite and changes in the number of repeats, and the cause thereof is suppression of expression or mutation of mismatch repair gene. MSI is classified into MSS (stable), MSI-L (low), and MSI-H (high) from the viewpoint of the instability of the repeated sequences of BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, and D17S250 9 . In CIMP, transcription of various genes is repressed by methylation at the CpG site of the promoter region 10, 11 . Accumulation of mutations in individual cancer-related genes such as KRAS, APC, and TP53 is thought to occur in the process of these carcinogenic mechanisms.

大腸癌ではEGFRシグナル伝達経路、Wnt-β-カテニンシグナル伝達経路、TGF-βシグナル伝達経路など細胞増殖制御に関わる複数のシグナル伝達経路が活性化している12。EGFRのリガンドとしてEGF、EREG、AREG、TGFA、HBEGF、BTCおよびEPGNがある13。さらにEGFRシグナルの伝達経路の下流には、Ras/Raf/MAPK経路およびPI3K/Akt経路があり、このうち、Ras/Raf/MAPK経路は主に細胞増殖、運動などの制御を担う14。一方、PI3K/Akt経路は主に抗アポトーシスや生存に関わる複数のシグナル伝達経路を制御し、主に細胞生存への役割を担う。 In colorectal cancer, multiple signal transduction pathways related to cell growth control such as EGFR signaling pathway, Wnt-β-catenin signaling pathway, and TGF-β signaling pathway are activated 12 . EGFR ligands include EGF, EREG, AREG, TGFA, HBEGF, BTC and EPGN 13 . Downstream of further EGFR signal transduction pathway, there are Ras / Raf / MAPK pathway and PI3K / Akt pathway, these, Ras / Raf / MAPK pathway plays a predominantly cell growth, control of such motion 14. On the other hand, the PI3K / Akt pathway regulates multiple signal transduction pathways mainly related to anti-apoptosis and survival, and plays a role mainly in cell survival.

大腸癌においては約40％の頻度でKRAS遺伝子の活性型変異が検出される。そのうち約90％がコドン12および13に認められるが、コドン61など他の部位にも低頻度に認められる。コドン12、13および61以外の変異は下流へのシグナルの影響は小さいとされる15。KRAS遺伝子の活性型変異は大腸癌以外でも肺癌、膵癌など多くの癌に高頻度に見つかり、発癌過程において重要な役割を担っている16。すなわち、KRAS遺伝子に活性型変異が起きると、K-RasのGTPase活性が低下し、K-RasのGTP結合型がGDP結合型に対して優位になるため、下流への細胞増殖シグナルが恒常的に持続する17。K-Rasの下流に位置するB-Rafはセリン・スレオニンキナーゼであり、N-末端側にRas結合部位、C-末端側にキナーゼ部位が存在する。B-Rafには活性化したK-Rasが直接結合し、そのキナーゼ活性によりシグナルをMEKとその下流に伝達する。 In colorectal cancer, an active mutation of the KRAS gene is detected with a frequency of about 40%. About 90% of these are found in codons 12 and 13, but are also found in other sites, such as codon 61, at a low frequency. Mutations other than codons 12, 13, and 61 are considered to have a small downstream signal effect 15 . 16 activating mutations of KRAS gene lung other than colorectal cancer, found frequently in many cancers such as pancreatic cancer, which plays an important role in carcinogenesis. In other words, when an active mutation occurs in the KRAS gene, the GTPase activity of K-Ras decreases, and the GTP-bound form of K-Ras is superior to the GDP-bound form, so the downstream cell proliferation signal is constant. 17 to last. B-Raf located downstream of K-Ras is a serine / threonine kinase, and has a Ras binding site on the N-terminal side and a kinase site on the C-terminal side. Activated K-Ras directly binds to B-Raf, and its kinase activity transmits a signal to MEK and its downstream.

BRAF遺伝子変異は甲状腺癌、悪性黒色腫、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌などで報告され18、その80％以上はキナーゼ部位の1アミノ酸置換を生ずる活性型変異V600Eである19。一方、PI3KはRasや受容体型チロシンキナーゼにより活性化されるキナーゼであり、その下流のAkt経路の活性化を介して細胞死を抑制する。PI3Kの触媒サブユニットのp110をコードするPIK3CA遺伝子には乳癌、子宮癌、大腸癌、頭頸部癌などで比較的高頻度にエクソン9と20のミスセンス変異が認められるため、KRAS変異同様に発がん過程において重要な役割を担うと考えられる20-22。 BRAF gene mutations have been reported in thyroid cancer, malignant melanoma, colorectal cancer, ovarian cancer, prostate cancer, etc. 18 and more than 80% of these are active mutations V600E that cause a single amino acid substitution at the kinase site 19 . PI3K, on the other hand, is a kinase that is activated by Ras or a receptor tyrosine kinase, and suppresses cell death through activation of the downstream Akt pathway. The PIK3CA gene, which encodes the PI3K catalytic subunit p110, has relatively high frequency of missense mutations in exons 9 and 20 in breast cancer, uterine cancer, colon cancer, head and neck cancer, etc. 20-22 considered to play an important role in

大腸癌の分子標的治療薬として、ベバシズマブ、セツキシマブおよびパニツムマブの3薬が承認され、既に臨床に導入されている。ベバシズマブは、血管内皮成長因子 (vascular endothelial growth factor : VEGF)に対するヒト化モノクローナル抗体である。VEGFRにそのリガンドのVEGFが結合すると、血管内皮の増殖・遊走作用、未成熟な内皮細胞の生存、血管透過性の亢進が起こる。ベバシズマブは、このVEGFに結合してその作用を中和し、その結果、腫瘍の血管新生の阻害と腫瘍血管透過性の改善による腫瘍内間質圧の低下をもたらすと考えられている23。l-OHPやCPT-11を含むレジメンにベバシズマブを併用すると治療効果に上乗せ効果があることが報告されている24, 25。セツキシマブとパニツムマブはEGFRに対するモノクローナル抗体で、セツキシマブはヒト/マウスのキメラ型、パニツムマブは完全ヒト型モノクローナル抗体である。これらの抗体薬がEGFRに結合するとEGFRの下流へのシグナル伝達が阻害され抗腫瘍効果を発揮すると考えられている26-28。しかし、前述のようにEGFRの下流のKRAS遺伝子に変異がある場合、EGFRを阻害しても下流へのシグナル伝達が阻害されず、抗EGFR抗体薬は無効であることが基礎および臨床研究で明らかにされている。このため、抗EGFR抗体薬はKRAS遺伝子が野生型の症例に限り投与が推奨されている29, 30。しかし、KRAS遺伝子に変異がない場合においても抗EGFR抗体が有効なのは一部であり、KRAS変異以外にも抗EGFR抗体の感受性に関連する因子が存在すると考えられる。その具体例として、前述のようにKRAS遺伝子の下流に位置するPIK3CA遺伝子変異やPTENの欠失などが挙げられる。さらに、これらの遺伝子に変異を認めない場合でも、FOLFOXやFOLFIRI療法などの化学療法に抵抗性となった症例における抗EGFR抗体薬の奏効率は、抗EGFR抗体単独治療の場合では12〜17％であり、抗癌剤を併用した場合でも約40％と報告されている31。また、EGFRのリガンドをコードしている遺伝子であるEREGとAREGの発現亢進が、抗EGFR抗体薬の有効性に相関することが報告されている32。この研究では、抗EGFR抗体薬は、EGFR経路の活性化がリガンド依存性である場合に有効であり、KRAS遺伝子変異などによってリガンド非依存性にEGFR経路の活性化起こっている場合には無効であると報告している。 Three drugs, bevacizumab, cetuximab, and panitumumab, have been approved as molecular targeted therapeutics for colorectal cancer and have already been clinically introduced. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody against vascular endothelial growth factor (VEGF). When VEGF, the ligand, binds to VEGFR, vascular endothelium proliferates and migrates, immature endothelial cells survive, and vascular permeability increases. Bevacizumab, the VEGF binding to neutralize its action, as a result, is believed to result in a reduction in tumor Uchima quality pressure by improving angiogenesis inhibition and tumor vascular permeability of tumor 23. It has been reported that when bevacizumab is combined with a regimen containing l-OHP or CPT-11, the therapeutic effect is added 24, 25 . Cetuximab and panitumumab are monoclonal antibodies against EGFR, cetuximab is a human / mouse chimeric antibody, and panitumumab is a fully human monoclonal antibody. It is thought that when these antibody drugs bind to EGFR, signal transduction downstream of EGFR is inhibited and an antitumor effect is exerted 26-28 . However, as mentioned above, when there is a mutation in the KRAS gene downstream of EGFR, basic signaling and clinical studies reveal that anti-EGFR antibody drugs are ineffective even if EGFR is inhibited. Has been. Therefore, anti-EGFR antibody drugs are recommended for use only in cases where the KRAS gene is wild-type 29, 30 . However, even when there is no mutation in the KRAS gene, the anti-EGFR antibody is only partially effective, and it is considered that there are factors related to the sensitivity of the anti-EGFR antibody in addition to the KRAS mutation. Specific examples thereof include a PIK3CA gene mutation located downstream of the KRAS gene and a PTEN deletion as described above. Furthermore, even in cases where no mutation is found in these genes, the response rate of anti-EGFR antibody in patients who have become resistant to chemotherapy such as FOLFOX or FOLFIRI therapy is 12-17% in the case of anti-EGFR antibody alone treatment However, even with anti-cancer drugs, it is reported to be about 40% 31 . Furthermore, it has been reported that increased expression of EREG and AREG, which are genes encoding EGFR ligands, correlates with the effectiveness of anti-EGFR antibody drugs 32 . In this study, anti-EGFR antibody drugs are effective when activation of the EGFR pathway is ligand-dependent, and ineffective when activation of the EGFR pathway occurs in a ligand-independent manner, such as by KRAS gene mutation. It is reported that there is.

近年、大腸癌研究ではマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析により、抗癌剤感受性および予後の予測をするバイオマーカーを探索する研究が行われている33, 34。さらに以前では解析が困難であった、ホルマリン固定パラフィン包埋 (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded : FFPE)組織から抽出したRNAを用いてDNAマイクロアレイ解析を行う網羅的遺伝子発現解析も可能になった35, 36。FFPE組織は、病理部門を有する世界中のほとんどの医療機関において、病理組織学的診断のために保存されており、日常臨床で入手および保管が容易である為に、多数の症例の長期観察データを後ろ向きに解析することが出来る利点がある。 Recently, a comprehensive gene expression analysis using microarray in colorectal cancer research, 33 studies to explore the biomarker has been performed to the prediction of chemosensitivity and prognosis, 34. In addition, comprehensive gene expression analysis using DNA extracted from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues, which was difficult to analyze previously, has become possible35 , 36 . FFPE tissue is stored for histopathological diagnosis in most medical institutions around the world with a pathology department, and is easy to obtain and store in daily clinical practice. There is an advantage that can be analyzed backward.

網羅的遺伝子発現解析に基づくバイオマーカーの開発は、乳癌において最も研究が進んでいる。van’t Veerらは70遺伝子の発現プロファイルにより早期乳癌の再発を予測することが可能であることを示し、この研究の応用開発によりMammaPrint（登録商標）が開発され実用化されている37。また、教師なしクラスター解析を用いた網羅的遺伝子発現解析により、乳癌は5つのサブタイプ (luminal A、luminal B、HER2 enrich、basal likeおよびnormal like)に分類されることが示され、乳癌のheterogeneityを遺伝子発現プロファイルの視点から示した38。これらのサブタイプが乳癌の臨床病理組織学的特徴や臨床像と良く対応するため、乳癌の分子生物学的背景の理解が大きく進歩した。 The development of biomarkers based on comprehensive gene expression analysis is the most studied in breast cancer. van't Veer et al. 70 the expression profiles of genes indicates that it is possible to predict the recurrence of early breast cancer, 37 MammaPrint (R) has been developed and put into practical use by developing applications of this study. In addition, comprehensive gene expression analysis using unsupervised cluster analysis showed that breast cancer is classified into five subtypes (luminal A, luminal B, HER2 enrichment, basal like, and normal like). 38 from a gene expression profile perspective. Because these subtypes corresponded well to the clinicopathologic features and clinical features of breast cancer, a great advance in understanding the molecular biological background of breast cancer.

これまでに、大腸癌患者の抗EGFR抗体の応答性を予測する方法として、Kras遺伝子の変異の有無を確認することやEGFR遺伝子のコピー数で判断する技術が開発されている（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、既に照会したように、Kras遺伝子に変異がない場合においても抗EGFR抗体が有効なのは一部であり、KRAS変異以外にも抗EGFR抗体の感受性に関連する因子が存在すると考えられる。
更に、患者から得たサンプルの遺伝子発現プロファイルからp53遺伝子の変異の有無を検出する方法（特許文献３）や、遺伝子発現プロファイルをクラスター解析することで急性骨髄性白血病の分類、診断、予後を決定する技術（特許文献４）が開発されている。 So far, as a method for predicting the responsiveness of anti-EGFR antibodies in colorectal cancer patients, a technique for confirming the presence or absence of a Kras gene mutation or judging by the copy number of the EGFR gene has been developed (Patent Document 1, Patent Document 2). However, as already inquired, even when there is no mutation in the Kras gene, the anti-EGFR antibody is only partially effective, and it is considered that there are factors related to the sensitivity of the anti-EGFR antibody in addition to the KRAS mutation.
Furthermore, the method of detecting the presence or absence of mutations in the p53 gene from the gene expression profile of a sample obtained from a patient (patent document 3), and cluster analysis of the gene expression profile determines the classification, diagnosis, and prognosis of acute myeloid leukemia A technique (Patent Document 4) has been developed.

特表2008-536493号公報Special table 2008-536493 特表2008-535508号公報Special table 2008-535508 gazette 特許第4370409号Patent No. 4370409 特表2007-527238号公報Special Table 2007-527238

網羅的遺伝子発現解析により大腸癌がいくつかのサブグループに分類され、heterogeneityが説明され、そのサブグループが臨床病理組織学的特徴と対応が見られていれば、大腸癌に対する分子生物学的理解が深まるとともに、治療法選択のバイオマーカーの開発や、それぞれの分子生物学的特徴に応じた新規分子標的薬の開発につながると期待される。 Comprehensive gene expression analysis classifies colorectal cancer into several subgroups, explains heterogeneity, and understands the molecular biology for colorectal cancer if the subgroups show correspondence with clinicopathological features It is expected that this will lead to the development of biomarkers for the selection of therapeutic methods and the development of new molecular targeted drugs according to their respective molecular biological characteristics.

本発明者は、上記の問題点を解決すべく鋭意研究の結果、切除不能進行再発大腸癌のFFPE組織を用いて、網羅的遺伝子発現解析と大腸癌発がんに関連する遺伝子の変異解析およびMLH1タンパク質の免疫組織染色を統合的に解析することにより、大腸癌のheterogeneityの存在と、その分子生物学的特徴を明らかにすることに成功した。 As a result of earnest research to solve the above problems, the present inventor has used FFPE tissue of unresectable advanced recurrent colorectal cancer, comprehensive gene expression analysis, mutation analysis of genes related to colorectal cancer carcinogenesis, and MLH1 protein We succeeded in clarifying the existence and molecular biological characteristics of colorectal cancer heterogeneity by comprehensively analyzing the immunohistochemical staining.

即ち、本発明者によって初めて、教師なし階層クラスター解析の結果、大腸癌が2軸よって分けられる4つのクラスター (A1、A2、B1およびB2)に分類され、各クラスター間において分子生物学的及び臨床病理組織学的特徴に差が認められることが明らかとなった。また、クラスターAとBを分ける発がん経路としてEGFR経路の活性化様式の違いがあることが示され、更に、クラスター1と2ではl-OHP、CPT-11および5-FUなどの古典的抗がん剤の併用療法の感受性が異なっていた。更に、各クラスター間に抗ＥＧＦＲ抗体に対する感受性（予後）に有意な差が見出された。本発明は、これらの新規な知見に基づき成されたものである。 That is, for the first time by the present inventor, as a result of unsupervised hierarchical cluster analysis, colorectal cancer was classified into four clusters (A1, A2, B1 and B2) divided by two axes, and molecular biology and clinical It was revealed that there were differences in histopathological features. In addition, it is shown that there is a difference in the activation pattern of the EGFR pathway as a carcinogenic pathway that separates clusters A and B. Furthermore, in clusters 1 and 2, classical anti-cancer agents such as l-OHP, CPT-11 and 5-FU The sensitivity of the combination therapy was different. Furthermore, a significant difference was found in the sensitivity (prognosis) to anti-EGFR antibody between each cluster. The present invention has been made based on these novel findings.

本発明は、上記の知見に基づいてなされたものであり、以下のとおりである。
すなわち、本発明の第一の態様は以下のとおりである。
（１）被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
（２）前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
（３）クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
抗ＥＧＦＲ抗体投薬治療において、クラスターA2 に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスターB2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗EGFR抗体に対する応答性を予測する方法。 This invention is made | formed based on said knowledge, and is as follows.
That is, the first aspect of the present invention is as follows.
(1) measuring the expression levels of cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene in a sample obtained from a subject's colon cancer tissue or colon cancer cells;
(2) a step of obtaining a correlation coefficient between the individual expression profile of each cluster obtained from the expression level and the average expression profile of each cluster obtained in advance, and (3) either cluster A or cluster B Assign the specimen to the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of and the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of either cluster 1 or cluster 2. Consisting of processes,
In the anti-EGFR antibody dosing treatment, the anti-hate survival time of the subject who provided the specimen belonging to cluster A2 was longer than that of the subject who provided the specimen belonging to cluster B2, A method for predicting responsiveness to an EGFR antibody.

更に、本発明の第２の態様は以下の通りである。
（１）被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
（２）前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
（３）クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
オキサリプラチン (oxaliplatin: l-OHP)を含む１次治療において、クラスターB1に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスターA2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗癌剤に対する応答性を予測する方法。 Furthermore, the second aspect of the present invention is as follows.
(1) measuring the expression levels of cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene in a sample obtained from a subject's colon cancer tissue or colon cancer cells;
(2) a step of obtaining a correlation coefficient between the individual expression profile of each cluster obtained from the expression level and the average expression profile of each cluster obtained in advance, and (3) either cluster A or cluster B Assign the specimen to the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of and the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of either cluster 1 or cluster 2. Consisting of processes,
In first-line treatment with oxaliplatin (l-OHP), subjects who provided specimens belonging to cluster B1 had a longer progression-free survival compared to those who received specimens belonging to cluster A2 A method for predicting responsiveness to an anticancer agent of a colorectal cancer patient based on a standard.

本発明の第三の態様は以下の通りである。
（１）被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
（２）前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
（３）クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
オキサリプラチン (oxaliplatin: l-OHP)を含む１次治療において、クラスター1に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスター2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗癌剤に対する応答性を予測する方法。 The third aspect of the present invention is as follows.
(1) measuring the expression levels of cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene in a sample obtained from a subject's colon cancer tissue or colon cancer cells;
(2) a step of obtaining a correlation coefficient between the individual expression profile of each cluster obtained from the expression level and the average expression profile of each cluster obtained in advance, and (3) either cluster A or cluster B Assign the specimen to the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of and the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of either cluster 1 or cluster 2. Consisting of processes,
In first-line treatment with oxaliplatin (l-OHP), subjects who provided specimens belonging to cluster 1 had a longer progression-free survival compared to those who received specimens belonging to cluster 2 A method for predicting responsiveness to an anticancer agent of a colorectal cancer patient based on a standard.

本発明の第四の態様として、クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に含まれる各遺伝子の少なくとも一部の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法に用いることが出来るキット。 The fourth aspect of the present invention includes a polynucleotide or an oligonucleotide consisting of at least a part of the base sequence of each gene included in cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene. The kit which can be used for the method as described in any one of -9.

本発明によって、教師なし階層クラスター解析の結果、大腸癌は2軸よって分けられる4つのクラスター (A1、A2、B1およびB2)に分類されることが分かった。各クラスター間において分子生物学的および臨床病理組織学的特徴に差が認められた。更に、各クラスター間において、l-OHP、CPT-11および5-FUなどの古典的抗がん剤を含む１次の治療における当該薬剤に対する応答性（感受性）が異なっていることが確認された。更に、抗ＥＧＦＲ抗体薬による治療においても、各クラスター間において、抗ＥＧＦＲ抗体薬に対する感受性に優位な差が見られることが実証され た。これらの結果から、乳癌と同様に大腸癌においてもheterogeneityの存在が示唆された。 According to the present invention, as a result of unsupervised hierarchical cluster analysis, it was found that colorectal cancer is classified into four clusters (A1, A2, B1, and B2) divided by two axes. Differences in molecular biology and clinicopathologic characteristics were observed between each cluster. Furthermore, it was confirmed that each cluster has different responsiveness (sensitivity) to the drug in the primary treatment including classic anticancer drugs such as l-OHP, CPT-11 and 5-FU. . Furthermore, it has been demonstrated that there is a difference in sensitivity to anti-EGFR antibody drugs between the clusters in the treatment with anti-EGFR antibody drugs. These results suggested the presence of heterogeneity in colorectal cancer as well as breast cancer.

クラスター (A1、A2、B1およびB2)間における全生存期間の比較。(a)全サンプル、(b)KRAS野生型サンプル、(c)KRAS変異型サンプル。Comparison of overall survival between clusters (A1, A2, B1 and B2). (a) All samples, (b) KRAS wild type sample, (c) KRAS mutant type sample. クラスター (AとB、1と2)間における全生存期間の比較。(a)全サンプル、(b)KRAS野生型サンプル、(c)KRAS変異型サンプル。Comparison of overall survival between clusters (A and B, 1 and 2). (a) All samples, (b) KRAS wild type sample, (c) KRAS mutant type sample. クラスター間のl-OHPを含む1次治療に対するPFSの比較。(a) クラスター (A1、A2、B1およびB2)間の比較、(b) クラスター (AとB、1と2)間の比較。Comparison of PFS for first-line treatment with l-OHP between clusters. (a) Comparison between clusters (A1, A2, B1 and B2), (b) Comparison between clusters (A and B, 1 and 2). クラスター間のCPT-11を含む1次治療に対するPFSの比較。(a) クラスター (A1、A2、B1およびB2)間の比較、(b) クラスター (AとB、1と2)間の比較。Comparison of PFS for first line treatment including CPT-11 between clusters. (a) Comparison between clusters (A1, A2, B1 and B2), (b) Comparison between clusters (A and B, 1 and 2). クラスター間のl-OHPまたはCPT-11を含む1次治療に対するPFSの比較。(a) クラスター (A1、A2、B1およびB2)間の比較、(b) クラスター (AとB、1と2)間の比較。Comparison of PFS for first line treatment with l-OHP or CPT-11 between clusters. (a) Comparison between clusters (A1, A2, B1 and B2), (b) Comparison between clusters (A and B, 1 and 2). クラスター(A1、A2、B1およびB2)間の抗EGFR抗体薬に対するPFSの比較。 (a) 全症例、(b) KRAS野生型症例。Comparison of PFS for anti-EGFR antibody drugs between clusters (A1, A2, B1 and B2). (a) All cases, (b) KRAS wild type cases. クラスター(AとB、1と2)間の抗EGFR抗体薬に対するPFSの比較。 (a) 全症例、(b) KRAS野生型症例。Comparison of PFS for anti-EGFR antibody drugs between clusters (A and B, 1 and 2). (a) All cases, (b) KRAS wild type cases. 全サンプルの教師なしクラスター解析と樹形図。Unsupervised cluster analysis and dendrogram of all samples.

本発明の第一〜第三の態様である予測方法においては、被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た各検体に関して、クラスターAを特徴づける2,899個の遺伝子（「クラスターA遺伝子」という）、クラスターBを特徴づける3,115個の遺伝子（「クラスターB遺伝子」という）、クラスター1を特徴づける471個の遺伝子（「クラスター1遺伝子」という）、及び、クラスター2を特徴づける1,703個の遺伝子（「クラスター2遺伝子」という）)の発現量を測定することによって得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求め、その後、クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させることによって、各検体をA1, A2, B1 及びB2の４つのクラスターのいずれかに帰属させる。その後、症例背景又は臨床経緯における統計解析により得られる各クラスター間の傾向の相違に基づく基準に従い、l-OHP、CPT-11及び5-FUなどの古典的抗がん剤を含む１次の治療における当該薬剤、若しくは、抗ＥＧＦＲ抗体薬による治療における抗ＥＧＦＲ抗体に対する応答性（感受性）を予測するものである In the prediction method according to the first to third aspects of the present invention, 2,899 genes that characterize cluster A (referred to as “cluster A gene”) for each specimen obtained from the colon cancer tissue or colon cancer cells of the subject. , 3,115 genes that characterize cluster B (referred to as “cluster B gene”), 471 genes that characterize cluster 1 (referred to as “cluster 1 gene”), and 1,703 genes that characterize cluster 2 (“ A cluster 2 gene ”)))), the correlation coefficient between the individual expression profile of each cluster obtained by measuring the expression level and the average expression profile of each cluster determined in advance, The cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profiles of either cluster B, and cluster 1 or cluster 2 Each sample is assigned to one of the four clusters of A1, A2, B1 and B2 by assigning the sample to the cluster having the larger correlation coefficient with any of the mean expression profiles. Subsequently, first-line treatment with classic anticancer drugs such as l-OHP, CPT-11 and 5-FU, according to criteria based on differences in trends between clusters obtained by statistical analysis of case background or clinical history Predicts responsiveness (sensitivity) to anti-EGFR antibody in treatment with the drug or anti-EGFR antibody drug

各クラスターの平均発現プロファイルは、本明細書中で詳述されているように、一定数の検体（学習セット）を用いて、教師なし階層クラスター解析において各クラスターに分類された検体（サンプル）の各々について其々のクラスターを特徴づける遺伝子のマイクロアレイ解析における発現のシグナル値からなる発現プロファイルを求め、更にそれらシグナル値の平均値から当該クラスターを特徴付ける発現プロファイルとして求めることができる。 The average expression profile of each cluster is the number of specimens (samples) classified in each cluster in an unsupervised hierarchical cluster analysis using a fixed number of specimens (learning set), as detailed herein. It is possible to obtain an expression profile composed of signal values of expression in microarray analysis of genes that characterize each cluster for each, and further obtain an expression profile characterizing the cluster from the average value of the signal values.

更に、本発明の各予測方法においては、クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子又はクラスター2遺伝子の各遺伝子集団に含まれるすべての遺伝子の発現量を測定する必要はない。即ち、本明細書中の実施例に記載されているように、例えば、各クラスター遺伝子の中から、其々、任意の３個（３種類）の遺伝子セット（10パターン）、５個（５種類）の遺伝子セット（10パターン）、１０個（１０種類）の遺伝子セット（5パターン）、及び、２０個（２０種類）の遺伝子セット（5パターン）を無作為に選択し、これらの任意に選択された遺伝子のマイクロアレイ解析における発現のシグナル値の平均値に基づく発現プロファイルを上記の各クラスターを特徴付ける平均発現プロファイルとして使用することによっても、全遺伝子で行った場合と同様の高い精度で正確な予測が可能であることが確認されている。   Furthermore, in each prediction method of the present invention, it is not necessary to measure the expression levels of all the genes included in each gene group of cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene or cluster 2 gene. That is, as described in the examples in the present specification, for example, from among each cluster gene, any three (three types) gene sets (10 patterns), five (five types) ) Gene sets (10 patterns), 10 (10 types) gene sets (5 patterns), and 20 (20 types) gene sets (5 patterns) are selected at random. By using an expression profile based on the average value of the signal value of expression in the microarray analysis of the identified gene as the average expression profile characterizing each cluster above, accurate prediction with high accuracy similar to that performed for all genes It has been confirmed that this is possible.

従って、本発明の各予測方法は、クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子中の各遺伝子集団から、夫々任意に選択した、３個、５個、１０個又は２０個以上の遺伝子からなる遺伝子セットを使用することによって実施することも出来る。好ましくは、該遺伝子セットは、少なくとも本明細書の表８〜１２において具体的に記載された遺伝子セットの各パターンに含まれる全ての遺伝子（夫々、３個、５個、１０個又は２０個）を含む。迅速性、及び経済性等の点では、このように、各遺伝子集団から、夫々任意に選択した遺伝子セットを使用することが好ましい。 Therefore, each prediction method of the present invention is 3, 5, 10, or 20 arbitrarily selected from each gene group in cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene. It can also be carried out by using a gene set consisting of the above genes. Preferably, the gene set is at least all genes (3, 5, 10, or 20 respectively) included in each pattern of the gene set specifically described in Tables 8-12 herein. including. In terms of rapidity and economy, it is preferable to use a gene set arbitrarily selected from each gene group.

本発明方法において検体として使用される、被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞の属性・種類等に特に制限はない。通常、手術によって大腸癌患者である被験者から切除された大腸癌組織又は大腸癌細胞を使用する。又、入手容易性及び利便性等の観点から、ホルマリン固定パラフィン包埋 (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded : FFPE)組織であることが好ましい。 There are no particular limitations on the attributes / types of the colon cancer tissue or colon cancer cells of the subject used as a specimen in the method of the present invention. Usually, colon cancer tissue or colon cancer cells excised from a subject who is a colon cancer patient by surgery are used. Further, from the viewpoint of availability and convenience, a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue is preferable.

遺伝子の発現とは、遺伝子自身がもつ情報をＲＮＡ又はタンパク質という機能を有する遺伝子産物を産生することである。従って、遺伝子の発現量は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、又は該ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の量を測定することによって行うことが出来る。本発明方法においてこのような、腫瘍組織／腫瘍細胞における遺伝子の発現量は、当業者に公知の任意の方法・手段で測定することが出来る。 Gene expression refers to the production of a gene product having the function of RNA or protein based on information held by the gene itself. Therefore, the expression level of a gene can be determined by measuring the amount of mRNA transcribed from the gene or the protein translated from the mRNA. In the method of the present invention, the expression level of the gene in the tumor tissue / tumor cell can be measured by any method / means known to those skilled in the art.

例えば、発現されたｍＲＮＡ量の測定としては、DNAマイクロアレイ（又は、ＤＮＡチップ）、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ノーザンブロッティング（ノーザンハイブリダイゼーション）、インサイチューハイブリダイゼーション、RNA分解酵素プロテクションアッセイ、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）等を用いることが出来る。一方、タンパク質量の測定としては、ウェスタンブロッティング、ELISAアッセイ、タンパク質アレイ、免疫組織染色、及びイーストツーハイブリッド（Yeast Two Hybrid）等を挙げることができる。 For example, measurement of the amount of mRNA expressed includes DNA microarray (or DNA chip), oligonucleotide microarray, Northern blotting (Northern hybridization), in situ hybridization, RNase protection assay, and reverse transcription polymerase chain reaction ( RT-PCR) and the like can be used. On the other hand, examples of the protein amount measurement include Western blotting, ELISA assay, protein array, immunohistochemical staining, and Yeast Two Hybrid.

本発明方法にあっては、遺伝子の発現量を該遺伝子から転写されたRNAをDNAマイクロアレイにより測定することが好ましい。発現レベルの解析はDNAマイクロアレイの測定におけるシグナル強度の比較によって行う。これには「検査試料中の遺伝子の発現強度」対「対照試料中の遺伝子の発現強度」の比率行列を生成させるのが最善である。 In the method of the present invention, it is preferable to measure the expression level of a gene by RNA transcribed from the gene using a DNA microarray. The expression level is analyzed by comparing the signal intensity in the DNA microarray measurement. It is best to generate a ratio matrix of “expression intensity of gene in test sample” versus “expression intensity of gene in control sample”.

遺伝子発現プロファイルは、様々な方法で表示することができる。最も一般的な方法は、列が検査試料を、そして行が遺伝子をそれぞれ示すグラフィカル・デンドグラム（graphical dendogram)に、比率行列を配列させる方法である。データは、類似の発現プロファイルを示す遺伝子が互いに近接するように配列される。各遺伝子の発現比率は色で視覚化される。たとえば１未満の比率（下方調節を示す）はスペクトルの青色部分に、また１を超える（上方調節を示す）比率はスペクトルの赤色部分に、それぞれ現れるようにしてもよい。そうしたデータ表示には商業上利用可能なコンピュータソフトウェアたとえばSilicon Genetics, Inc.の“GENESPRING”、およびPartek, Inc.の“DISCOVERY”や“INFER”などを利用できる。 Gene expression profiles can be displayed in various ways. The most common method is to arrange the ratio matrix into a graphical dendogram where the columns represent the test sample and the rows represent the genes. The data is arranged so that genes showing similar expression profiles are in close proximity to each other. The expression ratio of each gene is visualized by color. For example, a ratio less than 1 (indicating down-regulation) may appear in the blue portion of the spectrum, and a ratio greater than 1 (indicating up-regulation) may appear in the red portion of the spectrum. Such data can be displayed using commercially available computer software such as “GENESPRING” from Silicon Genetics, Inc. and “DISCOVERY” and “INFER” from Partek, Inc.

従って、本発明のキットは、腫瘍組織／腫瘍細胞における遺伝子及び／又は該遺伝子がコードするタンパク質の発現量を測定する方法・手段に応じて、適当な構成をとることが出来る。例えば、本発明キットに含まれるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に含まれる各遺伝子の少なくとも一部の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの長さは数十塩基対とすること出来る。これら各遺伝子の全配列は、例えば、各遺伝子に付与された「EntrezGeneID」及び「GeneSymbol」に基づき、「National Center for Biotechnology Information (NCBI), U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA」のデータベース等の各種のデータベースから容易に入手でき、更に、それらの具体的な部分（塩基配列）はこれらの情報に基き、又は当業者が適宜、選択・設計し調製することが出来る。
上記の各遺伝子又の少なくとも一部の塩基配列の具体例としては、例えば、アジレントテクノロジー社のeArray (https://earray.chem.agilent.com/earray/)のサイトからダウンロードすることができる、各遺伝子の全配列の一部(60塩基配列)を挙げることが出来る。 Therefore, the kit of the present invention can take an appropriate configuration according to the method / means for measuring the expression level of the gene and / or the protein encoded by the gene in the tumor tissue / tumor cell. For example, the length of the polynucleotide or oligonucleotide consisting of at least a part of the base sequence of each gene contained in the cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene contained in the kit of the present invention is several tens of bases Can be paired. The entire sequence of each of these genes is based on, for example, `` EntrezGeneID '' and `` GeneSymbol '' given to each gene, `` National Center for Biotechnology Information (NCBI), US National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA The specific portion (base sequence) can be selected based on this information, or can be appropriately selected, designed, and prepared by those skilled in the art.
As a specific example of the nucleotide sequence of each gene or at least a part of the above, for example, it can be downloaded from the site of Agilent Technologies eArray (https://earray.chem.agilent.com/earray/), A part (60 base sequence) of the entire sequence of each gene can be mentioned.

上記の各遺伝子又はそれらの少なくとも一部の塩基配列はＤＮＡチップ又はノーザンブロッティングにおけるプロ−ブ、ＰＣＲにおけるプライマー等の形態で使用することが出来る。更に、必要に応じて、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは当業者に公知の放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。
上記キットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。 Each of the above genes or at least a part of the base sequences thereof can be used in the form of a DNA chip or a probe in Northern blotting, a primer in PCR or the like. Furthermore, if necessary, the polynucleotide or oligonucleotide may be labeled with an appropriate labeling substance known to those skilled in the art, such as a radioactive substance, a fluorescent substance, and a dye.
The kit includes other elements or components known to those skilled in the art, such as various reagents, enzymes, buffers, reaction plates (containers), and the like, depending on the configuration and purpose of use.

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は当業者に公知の標準的な方法で行われ、又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, the technical scope of this invention is limited and is not interpreted at all by description of a following example. Further, unless otherwise specified, the following examples are carried out by standard methods known to those skilled in the art, and the contents of the references cited in the present specification are the contents of the disclosure of the present specification. Part of it.

［研究材料および研究方法］
1．研究対象
研究対象は2005年から2010年までに切除不能進行再発大腸癌の診断でがん薬物療法を施行した症例100例である。このうち、90症例を学習セット、10症例を検証セットとして用いた。対象症例は原発巣が切除され、そのFFPE組織が入手可能であることを条件とした。東北大学医学部医学系研究科倫理委員会で承認を受けた「大腸癌の分子診断法に関する研究」(承認番号2008-238)に基づいてインフォームド・コンセントを得た。また、同じく承認を受けた「大腸癌における治療法選択のための分子マーカー開発に関する研究」(承認番号2005-218)の対象症例でヒトゲノム遺伝子解析について包括的同意が得られている症例で、患者の死亡などにより本研究の同意が得られない症例はB群検体として本研究の対象患者に含めた。 [Research materials and methods]
1． The subjects of the study were 100 patients who underwent cancer drug therapy for the diagnosis of unresectable advanced recurrent colorectal cancer from 2005 to 2010. Of these, 90 cases were used as a learning set and 10 cases were used as a verification set. The subject cases were subject to the removal of the primary lesion and the availability of its FFPE tissue. Informed consent was obtained based on the “Research on Molecular Diagnosis of Colorectal Cancer” (approval number 2008-238) approved by the Ethics Committee of Tohoku University School of Medicine. In addition, patients who have received comprehensive consent for human genome gene analysis in the subject cases of “Research on molecular marker development for treatment selection in colorectal cancer” (Approval No. 2005-218) Cases for which consent from this study could not be obtained due to death, etc. were included in the subject patients as group B specimens.

2．大腸癌FFPE組織の採取
手術にて切除された100症例の大腸癌原発巣のFFPE組織を収集し、連結可能匿名化を行った。FFPE組織を、ミクロトームを用いて組織染色用に3μm、RNAまたはDNA抽出用に5μmまたは10μmの厚さに薄切し、病理組織診断用のスライドグラスに貼り付けた。 2． We collected 100 cases of FFPE tissue from the colon cancer primary lesions resected by surgery to collect colorectal cancer FFPE tissue and anonymized them for connection. The FFPE tissue was sliced to a thickness of 3 μm for tissue staining and 5 μm or 10 μm for RNA or DNA extraction using a microtome and attached to a slide glass for histopathological diagnosis.

3．マクロダイセクション
上記スライドグラス1枚をHE染色し、顕微鏡で腫瘍部分を確認後、未染標本から腫瘍部分を採取した。RNA抽出用として5μmを4枚または10μmを2枚、DNA抽出用として5μmを2枚または10μmを1枚用いた。 3． Macrodissection One slide glass as described above was stained with HE, and after confirming the tumor with a microscope, the tumor was collected from an unstained specimen. Four pieces of 5 μm or two pieces of 10 μm were used for RNA extraction, and two pieces of 5 μm or one piece of 10 μm were used for DNA extraction.

4．核酸抽出
マクロダイセクションで採取したFFPE組織からAbsolutely RNA FFPE Kit (Agilent Technologies 社)を用いて、1検体当たり0.5〜10μgのRNAを抽出した。また、QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN 社)を用いて、1検体当たり5〜20μgのDNAを抽出した。 Four. Nucleic acid extraction From FFPE tissue collected by macrodissection, 0.5 to 10 µg of RNA per sample was extracted using Absolutely RNA FFPE Kit (Agilent Technologies). In addition, 5 to 20 μg of DNA was extracted per specimen using QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN).

5．DNAシークエンス法による遺伝子変異解析
TP53遺伝子のエクソン5、6、7および8、KRAS遺伝子のコドン12、13および61、BRAF遺伝子のコドン600、PIK3CA遺伝子のエクソン9および20に対してDNAダイレクトシークエンス法による遺伝子変異解析を行った。PCRによるDNAの増幅にはTaKaRa EX Taq (タカラバイオ株式会社)を使用した。TP53のPCRプライマーとPCR条件は表１と表２の通りである。その他の遺伝子は添田ら39が報告した方法で解析した。 Five. Gene mutation analysis by DNA sequencing
Genetic mutation analysis was performed by DNA direct sequencing on exons 5, 6, 7 and 8 of the TP53 gene, codons 12, 13 and 61 of the KRAS gene, codon 600 of the BRAF gene, and exons 9 and 20 of the PIK3CA gene. TaKaRa EX Taq (Takara Bio Inc.) was used for amplification of DNA by PCR. TP53 PCR primers and PCR conditions are shown in Tables 1 and 2. Other gene was analyzed by the method reported by Soeda et al. 39.

6．MLH1タンパク質の免疫組織染色 (IHC; immunohistochemistry)
MLH1タンパク質のIHCは、anti-MLH1 monoclonal antibody (BD bioscience)を用いて東北大学病院病理部で行われた。MLH1はリンパ球などの正常細胞の核が染色されるため、これをポジティブコントロールとして、腫瘍細胞の核が染色されない場合を陰性と診断することとし、病理専門医が診断した。 6． Immunohistochemistry (IHC) of MLH1 protein
MLH1 protein IHC was performed at the Department of Pathology, Tohoku University Hospital using anti-MLH1 monoclonal antibody (BD bioscience). Since MLH1 stains the nuclei of normal cells such as lymphocytes, it was diagnosed as negative when tumor cells were not stained as a positive control, and was diagnosed by a pathologist.

7．マイクロアレイ
(1) 全トランスクリプトーム増幅
TransPlex（登録商標）Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (Sigma-Aldrich 社)を用いて、抽出したRNA 150〜300ngをcDNAに逆転写し、PCRで増幅した。QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN 社)を用いて増幅したcDNAを精製した。その結果、6〜15μgのcDNAが得られた。
(2) cDNA標識
Genomic DNA ULS Labeling Kit (Agilent Technologies 社)を用いて、増幅したcDNAを蛍光標識した。cDNA 1.5μgをヌクレアーゼフリー水で溶解して16.5μlとし、ULSTM-CyTM3 Reagent を1.5μl、10×Labeling Solutionを2μl加えて、総量を20μlにした。この反応液を85℃で30分間インキュベーションし、氷上で冷却した。KREApureTM purification column (Genomic DNA ULS Labeling Kitの付属品)で未標識の蛍光色素を除去した。吸光度計を用いて、標識されたcDNAの蛍光色素の取り込み効率を測定し、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションに適切な1.5〜3.0%の範囲にあることを確認した。
(3) マイクロアレイのハイブリダイゼーション・洗浄・蛍光シグナルの画像化とシグナルの数値化
Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies 社)を用いてハイブリダイゼーションを行った。標識されたcDNA 19μlに100×Blocking Agentを1.1μl、ヌクレアーゼフリー水を7.9μl、2×HI-RPMを55μl加えて、95℃で3分間インキュベーションし、氷上で冷却した。反応液にAgilent CGH-Block (Genomic DNA ULS Labeling Kitの試薬)を27μl加え、総量を110μlとした。そのうち100μlをWhole Human Genome Oligo Microarray Kit (4×44K) (Agilent Technologies 社)にハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションオーブンを65℃に設定し、10rpmで回転させながら17時間のハイブリダイゼーションを行ったのちに、マイクロアレイをGene Expression Wash Pack (Agilent Technologies 社)のWash Buffer 1で1分間、37℃に加温したWash Buffer 2で1分間洗浄した。Agilent DNA マイクロアレイスキャナ(Agilent Technologies 社)を使用して洗浄したマイクロアレイを画像化した。Agilent Feature Extraction ソフトウェア (Agilent Technologies 社)を使用してマイクロアレイの画像を数値化した。 7． Microarray
(1) All transcriptome amplification
Using TransPlex (registered trademark) Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (Sigma-Aldrich), 150-300 ng of extracted RNA was reverse transcribed into cDNA and amplified by PCR. The amplified cDNA was purified using QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). As a result, 6-15 μg of cDNA was obtained.
(2) cDNA labeling
The amplified cDNA was fluorescently labeled using Genomic DNA ULS Labeling Kit (Agilent Technologies). 1.5 μg of cDNA was dissolved in nuclease-free water to 16.5 μl, 1.5 μl of ULS ™ -Cy ™ 3 Reagent and 2 μl of 10 × Labeling Solution were added to make a total volume of 20 μl. The reaction was incubated at 85 ° C. for 30 minutes and cooled on ice. Unlabeled fluorescent dye was removed with KREApure ™ purification column (accessory of Genomic DNA ULS Labeling Kit). Using a spectrophotometer, the fluorescent dye uptake efficiency of the labeled cDNA was measured, and it was confirmed that it was in the range of 1.5 to 3.0% suitable for hybridization to the microarray.
(3) Microarray hybridization, washing, fluorescence signal imaging and signal digitization
Hybridization was performed using Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies). 1.1 μl of 100 × Blocking Agent, 7.9 μl of nuclease-free water, and 55 μl of 2 × HI-RPM were added to 19 μl of labeled cDNA, incubated at 95 ° C. for 3 minutes, and cooled on ice. 27 μl of Agilent CGH-Block (Genomic DNA ULS Labeling Kit reagent) was added to the reaction solution to make the total volume 110 μl. Of these, 100 μl was hybridized to Whole Human Genome Oligo Microarray Kit (4 × 44K) (Agilent Technologies). Set the hybridization oven to 65 ° C and perform the hybridization for 17 hours while rotating at 10 rpm. Then, warm the microarray to 37 ° C for 1 minute with Wash Buffer 1 from Gene Expression Wash Pack (Agilent Technologies). Washed with Wash Buffer 2 for 1 minute. The washed microarray was imaged using an Agilent DNA microarray scanner (Agilent Technologies). Microarray images were digitized using Agilent Feature Extraction software (Agilent Technologies).

8．網羅的遺伝子発現解析
GeneSpring version 11.5.1 (Agilent Technologies 社)を使用して遺伝子発現のデータ解析を行った。各サンプルのシグナル分布を75パーセンタイルでそろえ、遺伝子発現データの標準化を行った40。その後、各遺伝子のシグナルの中央値が0になるようにベースラインシフトを行った。シグナルがスキャナーで検出できない遺伝子は解析対象から除外した。この結果、44,000遺伝子から40,914遺伝子が採用された。さらにサンプル間でシグナル値変化の大きい遺伝子、すなわちシグナル値のばらつきが大きい遺伝子を抽出するため、シグナル分布の標準偏差が1.0以上となる遺伝子を採用した。結果、40,914遺伝子から25,454遺伝子が抽出された。以後、この25,454遺伝子を統計学的解析の対象とした。教師なし階層クラスター解析は、類似度をピアソン相関係数、クラスター間の距離を最遠距離法に設定して行われた。 8． Comprehensive gene expression analysis
Gene expression data analysis was performed using GeneSpring version 11.5.1 (Agilent Technologies). Align the signal distribution of each sample at 75 percentile, was performed to standardize the gene expression data 40. Thereafter, a baseline shift was performed so that the median signal of each gene was zero. Genes whose signals could not be detected by the scanner were excluded from the analysis. As a result, 44,000 to 40,914 genes were adopted. Furthermore, in order to extract genes with large signal value changes between samples, that is, genes with large signal value variations, genes having a standard deviation of signal distribution of 1.0 or more were employed. As a result, 25,454 genes were extracted from 40,914 genes. Thereafter, these 25,454 genes were subjected to statistical analysis. Unsupervised hierarchical cluster analysis was performed using the Pearson correlation coefficient as the similarity and the farthest distance method between the clusters.

9．統計解析
症例背景および臨床経過の統計解析にはマイクロソフトエクセルとそのアドインソフトStatMate IV(株式会社アトムス)を使用した。症例背景において有意差検定のためにカイ二乗検定を行った。生存曲線はKaplan-Meier法で作成され、Logrank法にて差の検定を行った。 9． Statistical analysis Microsoft Excel and its add-in software StatMate IV (Atoms Inc.) were used for statistical analysis of case background and clinical course. Chi-square test was performed for the test of significance in case background. Survival curves were created by the Kaplan-Meier method and tested for differences by the Logrank method.

10．腫瘍縮小効果
腫瘍縮小効果の判定にはRECIST ver1.0 (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors; 固形癌の治療効果判定基準)を用い、完全奏効 (Complete Response ; CR)、部分奏効 (Partial Response ; PR)、安定 (Stable Disease ; SD)、増悪 (Progression Disease ; PD)で評価した。奏効率 (Response Rate ; RR)はCRとPR症例の合計を全症例数で割ることで算出された。 Ten. Tumor shrinkage effect RECIST ver1.0 (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) was used to determine the tumor shrinkage effect. Complete response (CR), partial response (PR) Stable disease (SD) and progression disease (PD). Response rate (RR) was calculated by dividing the sum of CR and PR cases by the total number of cases.

11．無増悪生存期間 (Progression Free Survival ; PFS)
治療を開始した日から、画像診断または臨床的に増悪と判定した日までの期間を無増悪生存期間とした。 11． Progression Free Survival (PFS)
The period from the day of starting treatment to the day of image diagnosis or clinically determined to be exacerbated was defined as progression free survival.

12．全生存期間 (Overall Survival ; OS)
転移性大腸癌または切除不能進行再発大腸癌として、1次治療を開始した日から、患者が死亡した日までの期間を全生存期間とした。 12． Overall survival (OS)
As metastatic colorectal cancer or unresectable advanced recurrent colorectal cancer, the period from the day when the first treatment was started to the day when the patient died was defined as the overall survival period.

13．抗がん剤又は抗ＥＧＦＲ抗体薬を含むレジュメ
l-OHP及びCPT-11などの古典的抗がん剤又は抗ＥＧＦＲ抗体薬を含む治療は表３〜７に示されるレジュメに従って実施した。 13. Resumes containing anticancer drugs or anti-EGFR antibody drugs
Treatments involving classic anticancer drugs or anti-EGFR antibody drugs such as l-OHP and CPT-11 were performed according to the regimens shown in Tables 3-7.

［結果］
1．網羅的遺伝子発現データの教師なしクラスター解析
大腸癌細胞又は組織由来の25,454遺伝子を対象とした網羅的遺伝子発現データを用いて教師なしクラスター解析を行った結果、大腸癌は階層的に大きく2つのクラスターに分けられ、それぞれクラスターAとBと名付けた。そして、さらにそれぞれが2つに分かれ、計4つサブグループを形成し、クラスターA1、A2、B1およびB2と名付けた (図８)。 [result]
1． Unsupervised cluster analysis of comprehensive gene expression data As a result of unsupervised cluster analysis using 25,454 genes from colorectal cancer cells or tissues, colon cancer is divided into two clusters. They were named Clusters A and B, respectively. Each was further divided into two, forming a total of four subgroups, named clusters A1, A2, B1 and B2 (FIG. 8).

5. 遺伝子セットによるクラスター予測の正確性について
マイクロアレイ解析の結果に基づき、以下に示されるように、クラスターAとBを分ける6,014遺伝子 (クラスターAを特徴づける2,899遺伝子（「クラスターA遺伝子」という）＋クラスターBを特徴づける3,115遺伝子（「クラスターB遺伝子」という））と、クラスター1と2を分ける2,174遺伝子 (クラスター1を特徴づける471遺伝子（「クラスター1遺伝子」という）＋クラスター2を特徴づける1,703遺伝子（「クラスター2遺伝子」という）)を抽出した 。 5. Accuracy of cluster prediction by gene set Based on the results of microarray analysis, as shown below, 6,014 genes that divide clusters A and B (2,899 genes that characterize cluster A ("cluster A gene ) + 3,115 genes that characterize cluster B (called “cluster B gene”)) and 2,174 genes that divide clusters 1 and 2 (471 genes that characterize cluster 1 (called “cluster 1 gene”) + cluster 2 1,703 genes to be characterized (referred to as “cluster 2 genes”) were extracted.

次に、90症例の学習セットを用いて、教師なし階層クラスター解析においてクラスターAに分類された検体（サンプル）の各々について上記のクラスターAを特徴づける遺伝子(2,899遺伝子)のマイクロアレイ解析における発現のシグナル値からなる発現プロファイル（「クラスターA個別発現プロファイル」という）を求め、更にそれらシグナル値の平均値からクラスターAを特徴付ける発現プロファイル（「クラスターA平均発現プロファイル」という）を求めた。同様に、クラスターB、クラスター1及びクラスター2に分類されたサンプルについても、各クラスターを特徴づける遺伝子(夫々、3,155遺伝子、471遺伝子、及び1,703遺伝子) のマイクロアレイ解析における発現のシグナル値から、各クラスターに属する個々の遺伝子の個別発現プロファイルを求め、それらシグナル値の平均値から、各クラスターの平均発現プロファイルを求めた。 Next, using the learning set of 90 cases, the expression signal in the microarray analysis of the gene (2,899 genes) that characterizes the cluster A for each of the specimens (samples) classified as cluster A in the unsupervised hierarchical cluster analysis An expression profile composed of values (referred to as “cluster A individual expression profile”) was determined, and an expression profile (referred to as “cluster A average expression profile”) that characterizes cluster A was determined from the average value of these signal values. Similarly, for samples classified into cluster B, cluster 1 and cluster 2, each cluster is determined from the signal value of expression in the microarray analysis of the genes that characterize each cluster (3,155 genes, 471 genes, and 1,703 genes, respectively). An individual expression profile of each gene belonging to the gene was obtained, and an average expression profile of each cluster was obtained from an average value of the signal values.

各サンプルについて、こうして得られたクラスターAの平均発現プロファイルと当該サンプルのクラスターA個別発現プロファイル、クラスターBの平均発現プロファイルと当該サンプルのクラスターB個別発現プロファイルとのピアソン相関係数を各々計算し、相関係数のより大きいクラスターに当該サンプルを分類した。クラスター1と2についても同様に行った。その結果、クラスターA（４４症例）とクラスターB（４６症例）、クラスター1（４２症例）とクラスター2（４８症例）に分類した結果、学習セットの90症例はクラスターA1、クラスターA2、クラスターB1およびクラスターB2の4つのサブグループに分類されるので、これをもとに患者背景、分子生物学的背景および臨床経過について再度まとめ直した。
同様に、検証セットの10例について、学習セットより得られた平均的なクラスターA、B、1及び2を特徴づける上記の全遺伝子セットを用いて、検証セットの10例を4つのクラスターに分類した。
従って、図１〜図７に示された各クラスターへの分類は、以上の結果に基づくものである。 For each sample, calculate the average expression profile of cluster A thus obtained and the cluster A individual expression profile of the sample, the Pearson correlation coefficient between the average expression profile of cluster B and the cluster B individual expression profile of the sample, The samples were classified into clusters with higher correlation coefficients. The same was done for clusters 1 and 2. As a result, cluster A (44 cases), cluster B (46 cases), cluster 1 (42 cases), and cluster 2 (48 cases) were classified. As a result, 90 cases in the learning set were cluster A1, cluster A2, cluster B1, and Since it is classified into four subgroups of cluster B2, the patient background, molecular biological background, and clinical course were recompiled based on this.
Similarly, for 10 cases in the validation set, using the whole gene set that characterizes the average clusters A, B, 1 and 2 obtained from the training set, 10 cases in the validation set are classified into 4 clusters. did.
Therefore, the classification into the clusters shown in FIGS. 1 to 7 is based on the above results.

次に、上記の各クラスターを特徴づける遺伝子(クラスターA: 2,899遺伝子、クラスターB: 3,115遺伝子、クラスター1: 471遺伝子、クラスター2: 1,703遺伝子)の集団より無作為に、3種類（10パターン）、5種類（10パターン）、10種類（5パターン）及び２0種類（5パターン）の遺伝子（表８〜表１２）を選択し、これら選択した遺伝子セットの発現シグナル値からなる各クラスターの平均発現プロファイル及び当該サンプルの個別発現プロファイルに基づき、全遺伝子を使用した時と同じクラスターに分類されるかを検証した結果、その頑健性を証明された。 Next, three types (10 patterns) are randomly selected from the group of genes that characterize each of the above clusters (cluster A: 2,899 genes, cluster B: 3,115 genes, cluster 1: 471 genes, cluster 2: 1,703 genes), Average expression profile of each cluster consisting of expression signal values of 5 types (10 patterns), 10 types (5 patterns) and 20 types (5 patterns) of genes (Tables 8 to 12). And based on the individual expression profile of the sample, it was verified whether it was classified into the same cluster as when all genes were used, and its robustness was proved.

即ち、各クラスターの遺伝子集団から無作為に選択された3種類〜20種類より成る各遺伝子セットについての各クラスターの平均発現プロファイル及び当該サンプルの個別発現プロファイルに基づき各々ピアソン相関係数を算出し分類を行っても、各クラスターの遺伝子集団に属する全ての遺伝子を使用して分類した場合と比較し、学習セットでは83〜96％、検証セットでは70〜100％の高い精度で同じクラスターに分類されることが示された (表１３)。従って、少なくとも本明細書の表８〜１２において具体的に記載された遺伝子セットの各パターンに含まれる全ての遺伝子（夫々、３個、５個、１０個又は２０個）を含む遺伝子セットの遺伝子のマイクロアレイ解析における発現のシグナル値の平均値に基づく発現プロファイルを上記の各クラスターを特徴付ける平均発現プロファイルとして使用することによっても、全遺伝子で行った場合と同様の高い精度で正確な予測が可能であることが確認された。
尚、表１４〜１９には、個別発現プロファイルの実測値の例として、3種類〜20種類より成る各遺伝子セットの中から選択した一つのパターンにおける検証セット（各２例）についての実際の発現シグナル値を示した。 That is, Pearson correlation coefficients are calculated and classified based on the average expression profile of each cluster and the individual expression profile of the sample for each gene set consisting of 3 to 20 genes randomly selected from the gene population of each cluster. Even if it is performed, it is classified into the same cluster with a high accuracy of 83 to 96% in the learning set and 70 to 100% in the verification set, compared with the case of classifying using all genes belonging to the gene population of each cluster. (Table 13). Therefore, genes of a gene set including at least all genes (3, 5, 10, or 20 respectively) included in each pattern of the gene set specifically described in Tables 8 to 12 of the present specification. By using the expression profile based on the average value of the signal value of the expression in the microarray analysis as the average expression profile characterizing each cluster above, it is possible to make an accurate prediction with the same high accuracy as in the case of all genes. It was confirmed that there was.
Tables 14 to 19 show actual expression of the verification set (2 examples each) in one pattern selected from 3 to 20 gene sets as examples of actual measurement values of individual expression profiles. Signal values are shown.

3．クラスター間の症例背景の比較
対象患者90人の年齢は36-84歳 (中央値: 64歳)であり、性別は男性57名 (63%)、女性33名 (37%)であった。原発巣は直腸が33人 (37%)と最も多かった。臨床病期はIV期が48人 (53%)と最も多く、次いでIII期が33人 (37％)であった (表１０３)。各クラスターにおける患者背景について、性別、年齢、原発巣、未分化組織の有無、病期で比較した。クラスターA2は病期において他のクラスターと比較し有意に早期症例が多く認められた (p=0.02)。性別、年齢、原発巣および未分化組織の有無では有意差を認めなかった。また、クラスター間での治療内容には有意差を認めなかった。 3． Comparison of case background between clusters The age of 90 patients to be compared was 36-84 years (median: 64 years), with 57 males (63%) and 33 females (37%). The most common primary lesion was the rectum with 33 (37%). The most common clinical stage was stage IV with 48 (53%), followed by stage III with 33 (37%) (Table 103). Patient background in each cluster was compared by gender, age, primary focus, presence / absence of undifferentiated tissue, and stage. Cluster A2 had significantly more early cases in the stage compared to other clusters (p = 0.02). There were no significant differences in gender, age, primary lesion, or presence of undifferentiated tissue. In addition, there was no significant difference in treatment content between clusters.

4．クラスター間の分子生物学的背景の比較
分子生物学的背景として、大腸癌の発がんにおいて重要とされるKRAS、BRAF、PI3CAおよびTP53遺伝子の変異を解析した40。また、散発性大腸癌のMSI-HのほとんどはMLH1のプロモーターのメチル化による発現消失が原因とされるため、MLH1の免疫組織染色をMSIの評価のスクリーニングとして代用した41。クラスターA2はKRAS遺伝子野生型症例が有意に多く、クラスターB2はKRAS遺伝子変異型症例が有意に多く認められた (p<0.01) (表１０３)。BRAF、PIK3CA、TP53遺伝子の変異およびMLH1の発現にはクラスター間に有意差を認めなかった。 Four. As a comparative molecular background of molecular biological background between clusters and analyzed KRAS that are important in the carcinogenesis of colorectal cancer, BRAF, mutation of PI3CA and TP53 genes 40. In addition, since most MSI-H in sporadic colorectal cancers is caused by loss of expression due to methylation of the MLH1 promoter, MLH1 immunohistochemical staining was substituted for screening for MSI evaluation 41 . Cluster A2 had significantly more KRAS gene wild-type cases, and cluster B2 had KRAS gene-mutated cases significantly more (p <0.01) (Table 103). There were no significant differences between clusters in BRAF, PIK3CA, TP53 gene mutations and MLH1 expression.

5．クラスター間の臨床像の比較
クラスター間のOSを比較した。まず、クラスターA1、A2、B1およびB2を比較した場合、全症例を対象とした解析では、有意差を認めなかった (図1a)。KRAS変異の有無による、抗EGFR抗体薬の治療効果のOSへの影響を除くため、KRAS変異の有無に分けて全生存期間の解析を行った。しかし、KRAS野生型、KRAS変異型ともにクラスター間ではOSに有意差を認めなかった (図1b,c)。さらに、クラスターAとB、クラスター1と2で比較してもOSに有意差を認めなかった (図2a,b,c)。
l-OHPを含む1次治療のPFSを比較すると、クラスターB1はA2と比較してPFSが長いことが認められた (p=0.048) (図3a)。また、クラスター1は2よりPFSが長いことが認められた (p=0.017) (図3b)。
CPT-11を含む1次治療のPFSを比較すると、有意差はないもののクラスターAはBよりPFSが長い傾向を認めた (p=0.13) (図4a,b)。
l-OHPまたはCPT-11を含む1次治療のPFSを比較すると、クラスターA1はB2と比較し、有意差は認めないもののクラスターA1で延長する傾向を認めた(P=0.15)(図5a)。また、クラスター1は2と比較し、有意差は認めないもののクラスター1で延長する傾向を認めた(P=0.15)。(図5b) Five. Comparison of clinical image between clusters We compared OS between clusters. First, when clusters A1, A2, B1 and B2 were compared, no significant difference was found in the analysis of all cases (FIG. 1a). In order to exclude the influence of the therapeutic effects of anti-EGFR antibody drugs on the OS due to the presence or absence of KRAS mutation, we analyzed the overall survival period according to the presence or absence of KRAS mutation. However, there was no significant difference in OS between clusters for both KRAS wild type and KRAS mutant (Fig. 1b, c). Furthermore, there was no significant difference in OS when compared between clusters A and B and clusters 1 and 2 (FIGS. 2a, b, and c).
When comparing PFS of first-line treatment with l-OHP, cluster B1 was found to have a longer PFS compared to A2 (p = 0.048) (Fig. 3a). Cluster 1 was found to have a longer PFS than 2 (p = 0.017) (Fig. 3b).
When comparing the PFS of the first-line treatment including CPT-11, cluster A tended to have a longer PFS than B (p = 0.13) (Figures 4a and b).
When comparing PFS of first-line treatment with l-OHP or CPT-11, cluster A1 showed a tendency to be prolonged in cluster A1 compared to B2, although there was no significant difference (P = 0.15) (Figure 5a) . In addition, cluster 1 showed a tendency to be prolonged in cluster 1 although there was no significant difference compared to 2 (P = 0.15). (Figure 5b)

抗EGFR抗体薬の治療効果について検討を行った。KRAS変異型症例への抗EGFR抗体薬の投薬は本邦でKRAS変異解析が保険適応になる以前に臨床試験として行われている42。全症例のPFSをクラスター間で比較するとクラスターA2はB2よりも有意にPFSが延長した (p=0.01) (図6a)。KRAS野生型の症例で抗EGFR抗体の治療効果を比較したところ、有意差を認めないが、クラスターA2はB2よりPFSが延長する傾向を認めた (p=0.07) (図6b)。また、クラスターAとB、クラスター1と2で比較するとPFSに差を認めなかった (図7a, b)。 The therapeutic effect of anti-EGFR antibody drugs was examined. 42 dosing of anti-EGFR antibody agent to KRAS mutant cases being performed as a clinical trial before KRAS mutation analysis is insurance adapted in Japan. When comparing PFS of all cases between clusters, cluster A2 showed significantly longer PFS than B2 (p = 0.01) (Fig. 6a). When the therapeutic effects of anti-EGFR antibody were compared in KRAS wild-type cases, there was no significant difference, but cluster A2 tended to have a longer PFS than B2 (p = 0.07) (Fig. 6b). In addition, when comparing clusters A and B and clusters 1 and 2, there was no difference in PFS (FIGS. 7a and b).

尚、本発明のクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及び、クラスター2遺伝子の種類及びそれら各遺伝子の発現平均値を表２０〜表１０２に示す。尚、各遺伝子は、National Center for Biotechnology Information (NCBI), U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA」のデータベースにおける、「EntrezGeneID」及び「GeneSymbol」で特定される。   Tables 20 to 102 show the types of cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene of the present invention and the average expression values of these genes. Each gene is identified by “EntrezGeneID” and “GeneSymbol” in the database of National Center for Biotechnology Information (NCBI), U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA.




本発明は抗癌剤及び抗EGFR抗体薬の治療対象患者を、それらに対する応答性に関してより精度良く選別し有効率の向上をもたらすことから、患者の負担軽減と医療費の無駄の削減に貢献することが期待される有用な技術である。 Since the present invention selects patients to be treated with anticancer drugs and anti-EGFR antibody drugs more accurately with respect to their responsiveness and improves the effective rate, it contributes to reducing the burden on patients and reducing waste of medical expenses Expected useful technology.

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Claims (11)

（１）被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
（２）前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
（３）クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
抗ＥＧＦＲ抗体投薬治療において、クラスターA2 に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスターB2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗EGFR抗体に対する応答性を予測する方法。 (1) measuring the expression levels of cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene in a sample obtained from a subject's colon cancer tissue or colon cancer cells;
(2) a step of obtaining a correlation coefficient between the individual expression profile of each cluster obtained from the expression level and the average expression profile of each cluster obtained in advance, and (3) either cluster A or cluster B Assign the specimen to the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of and the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of either cluster 1 or cluster 2. Consisting of processes,
In the anti-EGFR antibody dosing treatment, the anti-hate survival time of the subject who provided the specimen belonging to cluster A2 was longer than that of the subject who provided the specimen belonging to cluster B2, A method for predicting responsiveness to an EGFR antibody. （１）被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
（２）前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
（３）クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
オキサリプラチン (oxaliplatin: l-OHP)を含む１次治療において、クラスターB1に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスターA2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗癌剤に対する応答性を予測する方法。 (1) measuring the expression levels of cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene in a sample obtained from a subject's colon cancer tissue or colon cancer cells;
(2) a step of obtaining a correlation coefficient between the individual expression profile of each cluster obtained from the expression level and the average expression profile of each cluster obtained in advance, and (3) either cluster A or cluster B Assign the specimen to the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of and the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of either cluster 1 or cluster 2. Consisting of processes,
In first-line treatment with oxaliplatin (l-OHP), subjects who provided specimens belonging to cluster B1 had a longer progression-free survival compared to those who received specimens belonging to cluster A2 A method for predicting responsiveness to an anticancer agent of a colorectal cancer patient based on a standard. （１）被験者の大腸癌組織又は大腸癌細胞から得た検体におけるクラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子の発現量を測定する工程と、
（２）前記発現量から得られた各クラスターの個別発現プロファイルと、予め求めた各クラスターの平均発現プロファイルとの間の相関係数を求める工程、及び
（３）クラスターA又はクラスターBのいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに、及び、クラスター1又はクラスター2のいずれかの平均発現プロファイルとの間の相関係数が大きい方のクラスターに当該検体を帰属させる工程からなり、
オキサリプラチン (oxaliplatin: l-OHP)を含む１次治療において、クラスター1に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間はクラスター2に属する検体を提供した被験者の無憎悪生存期間に比べて長いという基準に基づき、大腸癌患者の抗癌剤に対する応答性を予測する方法。 (1) measuring the expression levels of cluster A gene, cluster B gene, cluster 1 gene, and cluster 2 gene in a sample obtained from a subject's colon cancer tissue or colon cancer cells;
(2) a step of obtaining a correlation coefficient between the individual expression profile of each cluster obtained from the expression level and the average expression profile of each cluster obtained in advance, and (3) either cluster A or cluster B Assign the specimen to the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of and the cluster with the larger correlation coefficient between the average expression profile of either cluster 1 or cluster 2. Consisting of processes,
In first-line treatment with oxaliplatin (l-OHP), subjects who provided specimens belonging to cluster 1 had a longer progression-free survival compared to those who received specimens belonging to cluster 2 A method for predicting responsiveness to an anticancer agent of a colorectal cancer patient based on a standard. クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に代えて、それらの各遺伝子集団から、夫々任意に選択した３個以上の遺伝子からなる遺伝子セットを使用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 In place of the cluster A gene, the cluster B gene, the cluster 1 gene, and the cluster 2 gene, a gene set consisting of three or more genes arbitrarily selected from each of these gene groups is used, The method as described in any one of Claims 1-3. クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に代えて、それらの各遺伝子集団から、夫々任意に選択した５個以上の遺伝子からなる遺伝子セットを使用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 In place of the cluster A gene, the cluster B gene, the cluster 1 gene, and the cluster 2 gene, a gene set composed of 5 or more genes arbitrarily selected from each of these gene groups is used, The method as described in any one of Claims 1-3. クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に代えて、それらの各遺伝子集団から、夫々任意に選択した１０個以上の遺伝子からなる遺伝子セットを使用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 In place of the cluster A gene, the cluster B gene, the cluster 1 gene, and the cluster 2 gene, a gene set consisting of 10 or more genes arbitrarily selected from each of these gene groups is used, The method as described in any one of Claims 1-3. クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に代えて、それらの各遺伝子集団から、夫々任意に選択した２０個以上の遺伝子からなる遺伝子セットを使用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 In place of the cluster A gene, the cluster B gene, the cluster 1 gene, and the cluster 2 gene, a gene set composed of 20 or more genes arbitrarily selected from each of these gene groups is used, The method as described in any one of Claims 1-3. 検体がホルマリン固定パラフィン包埋 (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded : FFPE)組織である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the specimen is a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. 遺伝子の発現量を該遺伝子から転写されたRNAをDNAマイクロアレイにより測定する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 8, wherein RNA transcribed from the gene is measured for expression level of the gene by a DNA microarray. クラスターA遺伝子、クラスターB遺伝子、クラスター1遺伝子、及びクラスター2遺伝子に含まれる各遺伝子の少なくとも一部の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法に用いることが出来るキット。 The polynucleotide or oligonucleotide which consists of a base sequence of at least one part of each gene contained in a cluster A gene, a cluster B gene, a cluster 1 gene, and a cluster 2 gene is described in any one of Claims 1-9. Kit that can be used in the method of ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする、請求項１０記載のキット。 The kit according to claim 10, wherein the polynucleotide or oligonucleotide is labeled.
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