JP2013166730A - 消化管免疫制御組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 米麹または米麹処理物のうちの少なくとも1種を含有する。米麹または米麹処理物のうちの少なくとも1種は、例えば米麹の熱水抽出物を凍結乾燥した乾燥粉末体である。米麹は、例えば清酒製造工程で使用される米麹が用いられる。
【選択図】 図1
Description
酒造メーカーより提供された米麹1kgを熱水で抽出し、その抽出物を濾過後に凍結乾燥に付し、乾燥粉末体を得た。これをサンプルとして以下の実験に用いた。
(2)実験動物
C57BL/6N(雄,5w,日本チャールズリバー)を実験時に適宜購入し、金沢大学自然研動物飼育施設で1週間以飼育、上馴化させてから実験に使用した。
(1)の方法で得られたサンプルについて、最終投与量が30mg/kg/dayになるよう、用時、精製水に懸濁して投与サンプルを調製した。この投与サンプルを(2)の条件で飼育したマウスに0.1mL/10gで1日1回(午前10時)、連続的に5日間、経口投与した。
初回のサンプル投与開始から7日後に、マウスを過剰のエーテルにより致死せしめ、無菌条件下に小腸を摘出して、散布するパイエル板を実体顕微鏡下に摘出した。得られたパイエル板を冷えたリン酸緩衝液に入れて洗浄後、750U/mLのコラゲナーゼ(typeI:シグマ・アルドリッチ社製)完全培地(RPMI−1640)に投入し、1時間インキュベートした。インキュベート終了後、分離したパイエル板構成リンパ球を200μmのナイロンメッシュを通してシングルセル懸濁液として細胞数を計測した。
ConAによる刺激培養終了後に、培養液上清を回収し、ここに含まれるTヘルパー細胞による免疫調節因子であるIL−2とIFN−γ(Th1),IL−4とIL−5(Th2)を市販のELISA kit(eBioscience社製)を用いて測定した。測定方法は、kitの添付文書に従い、形成する発色色素の吸光度を測定し、標準物質による検量線からそれぞれのサイトカイン産生量を算定した。
上記のパイエル板構成細胞の培養とは別に、(4)の操作で得られたパイエル板について、市販のRNA抽出kitを使用して、パイエル板から直接total RNAを採取した。すなわち、kitに付属する組織融解用試薬をパイエル板組織に直接添加し、以降はマニュアルに従って操作してtotal RNAを得た。RNA量は260および280nmの吸光度差を測定することにより計測し、その後、total RNA1μgを1.2%アガロースゲルで電気泳動した後、EB染色し、18Sおよび28Sのバンドの明瞭さからRNAのクオリティーを確認した。抽出したtotal RNAは、以下のDNAマイクロアレイによる発現遺伝子網羅解析を実施するまで−80℃で保存した。
パイエル板構成細胞から抽出したtotal RNAについて発現遺伝子の網羅的解析を実施した。すなわち、(6)の方法で得たRNA(700 ng)を市販の商品名MessageAmp II-Biotin Enhanced kit(Ambion社製)でcRNAを作製し、遺伝子標的ハイブリダイゼーションをマウスGeneChip(商品名)(Affymetrix社製)で測定した。すなわち、cRNAから作製した2重鎖DNAをGeneChipに滴下し、45℃、16時間作用させた。作用終了後にチップをFluidic
Station 450で洗浄して染色し、ハイブリッド染色された遺伝子をGeneChip Operating
software(商品名)を搭載したワークステーションでイメージ化し、そのイメージのヒートマップを計算機上で数値化した。ミスマッチする発現遺伝子と完全にマッチした遺伝子との差を計算機上で演算し、その後、対象となるマウスから得た遺伝子との相対的な変動をチェックし、1.5倍以上の変動する遺伝子群を抽出した。抽出された遺伝子群で変化が認められたものについては、適宜、Ingenuity Pathway Analysis(IPA)解析(データベースアクセスは米国)に付し、そのメカニズム解析を実施した。
米麹熱水抽出物を30mg/kg/dayの用量で5日間、マウスに経口投与した結果、図1に示す通り、パイエル板構成細胞におけるIL−2及びIFN−γ産生を有意に抑制し、その作用は48時間目まで持続した。
図3は、何も処置しないマウスから得たパイエル板構成細胞における発現遺伝子の変動を示すものであり、図中、左下は発現が少ない遺伝子であり、右上は頻繁に発現している遺伝子を表す。中線を軸に上下の閾線を設け、上に発現するドットは遺伝子中で上方調節(up-regulation)される遺伝子群を、閾線の下側は下方調節(down-regulation)される遺伝子群をそれぞれ表す。
米麹抽出物は,パイエル板構成細胞におけるTh1およびTh2サイトカイン産生のうち、Th1のIL−2及びIFN−γの産生を選択的に抑制する作用が認められた。これらの一連のサイトカインは、過剰に産生された場合に、自己免疫疾患を誘発することが知られており、このことから、米麹には穏やかな摂取でクローン病など消化管系の疾患やアレルギーの予防、及び腸内悪玉菌の増殖による炎症抑制に効果があるものと考えられる。
proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alphaの発現を上昇させた。この遺伝子にコードされるPPAR−γは、腸組織の再構築に関連することから,、度な米麹摂取は腸環境保全に役立つものと考えられる。さらに、(2)nitric oxide synthase 2,IgM
variable region,hydrogen voltage-gated channel 1の発現を低下させたことから、米麹抽出物は、腸管の過剰な炎症反応を押さえる抗炎症効果を有するものと考えられる。また、(3)stearoyl-Coenzyme
A desaturase 2の発現を低下させることから、これにコードされる酵素によって脂質合成が抑制され(文献:PNAS, 2005 vol. 102
,12501-12506参照)、肥満抑制にも応用できるものと考えられる。
Claims (3)
- 米麹または米麹処理物のうちの少なくとも1種を含有することを特徴とする消化管免疫制御組成物。
- 前記米麹または米麹処理物のうちの少なくとも1種が、米麹の熱水抽出物を凍結乾燥した乾燥粉末体であることを特徴とする請求項1記載の消化管免疫制御組成物。
- 前記米麹が、清酒製造工程で使用される米麹であることを特徴とする請求項1または2記載の消化管免疫制御組成物。
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