JP2013155201A - Resection immunotherapy - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、一般的に免疫療法に、そしてより具体的には、腫瘍および病原体感染組織を治療するための治療方法および組成物に関連する。
The present invention relates generally to immunotherapy, and more specifically to therapeutic methods and compositions for treating tumors and pathogen-infected tissues.
発明の背景
慢性感染性疾患または癌を治療するために、免疫系の力を利用することが、免疫療法の主な目的である。能動免疫療法の処置は、腫瘍または病原体感染細胞を特異的に認識および破壊するために、免疫系を活性化するようデザインされた方法である。２００年以上の間、能動免疫療法のアプローチは、天然痘、狂犬病、腸チフス、コレラ、ペスト、麻疹、水痘、流行性耳下腺炎、灰白髄炎、Ｂ型肝炎および破傷風およびジフテリア毒素を含む、多くの感染性疾患を予防するために使用されてきた。
BACKGROUND OF THE INVENTION Utilizing the power of the immune system to treat chronic infectious diseases or cancer is the main goal of immunotherapy. Active immunotherapy treatment is a method designed to activate the immune system to specifically recognize and destroy tumor or pathogen-infected cells. For over 200 years, active immunotherapy approaches include smallpox, rabies, typhoid, cholera, plague, measles, chickenpox, mumps, gray leukitis, hepatitis B and tetanus and diphtheria toxins, It has been used to prevent many infectious diseases.
能動免疫療法のコンセプトを今適用して、存在する腫瘍を治療する、または腫瘍の再発を予防する、および慢性ウイルス感染を治療および予防する意図を有する治療的癌ワクチンを開発する。これらの技術の多くは、腫瘍または病原体感染細胞を特異的に殺す能力を有する、循環中の免疫細胞の頻度の増加を引き起こすことに成功したことを証明した。しかし、腫瘍抗原に反応性の免疫細胞を産生する能力にも関わらず、腫瘍の回避メカニズムはこの免疫反応を圧倒し、最終的な腫瘍の進行を引き起こす。 The concept of active immunotherapy is now applied to develop therapeutic cancer vaccines with the intention of treating existing tumors or preventing tumor recurrence and treating and preventing chronic viral infections. Many of these techniques have proven successful in causing an increased frequency of circulating immune cells that have the ability to specifically kill tumor or pathogen-infected cells. However, despite the ability to produce immune cells reactive to tumor antigens, tumor evasion mechanisms overwhelm this immune response and cause ultimate tumor progression.
癌の能動免疫療法は、多くのげっ歯類モデルにおいて非常に有効であることが示された。しかし、ヒトにおける様々な型の免疫療法試験の、何十年もの臨床的に失望させる結果は、ヒトの免疫系はヒト癌細胞の脅威／危険を、同じ疾患のげっ歯類モデルの免疫系ほど認知しないことを示した。 Active immunotherapy of cancer has been shown to be very effective in many rodent models. However, decades of clinically disappointing results of various types of immunotherapy trials in humans have shown that the human immune system poses the threat / danger of human cancer cells as much as the immune system of rodent models of the same disease. Shown not to recognize.
慢性ウイルス感染でも同じである。自然免疫反応は、ウイルスの複製を遅くし、そして抗ウイルスタンパク質の合成を引き起こすサイトカインを活性化し得る。適応免疫系はウイルス粒子を中和し、そして感染細胞を破壊する。しかし、ウイルスは、免疫攻撃を避けるために多くの対策を発達させ、そして免疫系の動く標的のままである。 The same is true for chronic viral infections. Innate immune responses can activate cytokines that slow viral replication and cause synthesis of antiviral proteins. The adaptive immune system neutralizes viral particles and destroys infected cells. However, the virus has developed many measures to avoid immune attacks and remains a moving target of the immune system.
腫瘍およびウイルスの免疫回避メカニズムを克服し得る活性免疫療法を提供し、そしてヒト免疫系を、ヒト癌細胞およびウイルス感染細胞の脅威／危険を認識するよう訓練する必要性が存在し、それはそれらが体のどこにあっても腫瘍または病原体感染細胞を根絶し得る免疫反応を引き起こす。 There is a need to provide active immunotherapy that can overcome tumor and viral immune evasion mechanisms, and to train the human immune system to recognize the threat / danger of human cancer cells and virus-infected cells, which Causes an immune response that can eradicate tumor or pathogen-infected cells anywhere in the body.
要旨
本発明は、同種細胞治療の組み合わせを用いて、腫瘍または病原体に対する全身性の適応免疫反応を誘発するための方法および組成物、および腫瘍特異的抗原または病原体特異的抗原の放出を引き起こす、腫瘍または病原体感染組織を細胞窮迫に付す方法に関連する。
The present invention relates to methods and compositions for eliciting a systemic adaptive immune response against a tumor or pathogen using a combination of allogeneic cell therapies, and tumors that cause the release of tumor-specific or pathogen-specific antigens Or related to methods of subjecting pathogen-infected tissues to cellular distress.
本発明の１つの局面において、本発明は、患者にワクチン接種する方法を含む。その方法は、以下の工程を含む：（１）癌または感染性疾患を有する患者に、抗同種Ｔｈ１免疫を誘発する方式で、患者の免疫系によって拒絶されるようデザインされた、同種細胞のアリコートを含むプライミング組成物を投与する；（２）同じ患者において、抗同種Ｔｈ１免疫記憶が発達する時間（約７から１４日）がたった後、腫瘍抗原または病原体抗原の供給源（例えば弱毒化ウイルス、腫瘍溶解物、熱ショックタンパク質）を含む、好ましくは感染または癌性組織の同じ個人の自己溶解物から含む、抗原性組成物を、好ましくは皮内に注射する、その溶解物は、好ましくはシャペロンタンパク質を含み、そしてそのような溶解物を、同種細胞（患者をプライミングするのに使用した同じ細胞）のアリコートと処方して拒絶反応を産生し、そして全身性抗腫瘍または抗病原体免疫の刺激のアジュバントとなる同種抗原に対する遅延型過敏症反応を刺激する。さらなる局面において、この方法を、プライミング工程無しで実施し得る。 In one aspect of the invention, the invention includes a method of vaccinating a patient. The method comprises the following steps: (1) An aliquot of allogeneic cells designed to be rejected by the patient's immune system in a manner that induces anti-allo-Th1 immunity in patients with cancer or infectious diseases (2) in the same patient, after a period of time (about 7 to 14 days) during which anti-allo-Th1 immune memory develops, a source of tumor antigen or pathogen antigen (eg, attenuated virus, An antigenic composition, preferably from the same individual's autolysate of infected or cancerous tissue, is preferably injected intradermally, preferably a chaperone Contain protein and formulate such a lysate with an aliquot of allogeneic cells (the same cells used to prime the patient) to produce rejection And it stimulates delayed type hypersensitivity reactions to alloantigens as a systemic anti-tumor or anti-pathogen immune stimulation adjuvant. In a further aspect, the method can be performed without a priming step.
別の局面において、本発明は、腫瘍抗原または病原体抗原および同種細胞のアリコートを含む抗原性組成物を含む、患者において腫瘍または病原体を治療するための治療的組成物を含み、ここで患者に抗原性組成物を注射することは、免疫反応を生じ、それによって続く患者の抗原提示細胞の成熟が、抗腫瘍または抗病原体免疫を全身性に刺激する。組成物中の腫瘍抗原は、腫瘍のネクローシス由来である。組成物中の病原体抗原は、病原体感染組織のネクローシス由来である。その治療的組成物はまた、同種細胞のアリコートを含むプライミング組成物も含み得る。プライミング組成物および抗原性組成物中の同種細胞のアリコートは、約１×１０８および約１×１０１０の間の細胞を含み得る。 In another aspect, the present invention includes a therapeutic composition for treating a tumor or pathogen in a patient, comprising an antigenic composition comprising an aliquot of tumor antigen or pathogen antigen and allogeneic cells, wherein Injecting the sex composition results in an immune response whereby subsequent maturation of the patient's antigen presenting cells systemically stimulates anti-tumor or anti-pathogen immunity. The tumor antigen in the composition is derived from tumor necrosis. The pathogen antigen in the composition is derived from necrosis of the pathogen-infected tissue. The therapeutic composition can also include a priming composition comprising an aliquot of allogeneic cells. An aliquot of allogeneic cells in the priming composition and the antigenic composition can comprise between about 1 × 10 8 and about 1 × 10 10 cells.
別の局面において、本発明は、腫瘍または病原体に対する患者のためのワクチンを含む。そのワクチンは、腫瘍または病原体由来の抗原性物質および同種細胞のアリコートを含む抗原性組成物を含み、ここでその抗原性組成物の患者に対する投与は、拒絶反応を生じ、そして抗原に対する遅延型過敏症反応を刺激し、それによって患者における全身性抗腫瘍または抗病原体免疫の刺激に対するアジュバントとして作用する。そのワクチンはまた、プライミング組成物も含み得、ここでそのプライミング組成物は同種細胞のアリコートを含む。 In another aspect, the invention includes a vaccine for a patient against a tumor or pathogen. The vaccine comprises an antigenic composition comprising an antigenic substance from a tumor or pathogen and an aliquot of allogeneic cells, wherein administration of the antigenic composition to a patient results in rejection and delayed hypersensitivity to the antigen It acts as an adjuvant to the stimulation of systemic anti-tumor or anti-pathogen immunity in patients. The vaccine can also include a priming composition, wherein the priming composition includes an aliquot of allogeneic cells.
本発明の別の局面において、本発明は、患者において腫瘍または病原体に対する適応免疫反応を誘発する方法である。その方法は、以下の工程を含む：（１）癌または感染性疾患を有する患者に、抗同種Ｔｈ１免疫を誘発する方式で患者の免疫系によって拒絶されるようデザインされた同種細胞のアリコートを投与する；（２）同じ患者において、抗同種Ｔｈ１免疫記憶が形成される時間（約７から１４日）がたった後、入手できる腫瘍病変または病原体感染組織を、好ましくはネクローシスによって（例えばエレクトロポレーション、冷凍切除（ｃｒｙｏａｂｌａｔｉｏｎ）、化学療法、放射線治療、超音波治療、エタノール化学切除、マイクロ波熱切除、高周波エネルギーまたはその組み合わせによって）、少なくとも一部の腫瘍または感染組織を破壊する方法で、切除する；次いで；（３）同じ同種細胞の２番目のアリコートを、好ましくは切除工程の２−２４時間後に、病変内に注射して（プライミングするために使用したものと同じ細胞）、抗原の取り込みに対するアジュバントとして作用する免疫反応、および続くネクローシスまたはアポトーシス組織に反応する宿主抗原提示細胞（すなわち樹状細胞）の成熟を生じる。病変由来の成熟抗原提示細胞は次いで、リンパ節に遊走し、そして全身性の抗腫瘍または抗病原体免疫を刺激する。本発明の別の局面において、プライミング工程を省く。腫瘍または病原体感染組織由来の組織を切除し、そして同種細胞のアリコートを、切除後に注射して、望ましい免疫反応を生じる。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
患者における腫瘍または病原体を処置するための治療組成物であって、該治療組成物は、腫瘍抗原または病原体抗原および同種細胞のアリコートを含む抗原性組成物を含み、ここで、該抗原性組成物は、該組成物中の抗原の取り込みに対するアジュバントととして働く免疫応答を生成し、それによって、該患者の抗原提示細胞の続く成熟は、抗腫瘍免疫または抗病原体免疫を全身的に刺激する、治療組成物。
（項目２）
上記組成物中の上記腫瘍抗原が、上記腫瘍のネクローシスに由来する、項目１に記載の組成物。
（項目３）
上記組成物中の上記病原体抗原が、上記病原体感染組織のネクローシスに由来する、項目１に記載の組成物。
（項目４）
プライミング組成物をさらに含む、項目１に記載の組成物であって、該プライミング組成物は、上記同種細胞のアリコートを含む、組成物。
（項目５）
上記プライミング組成物の上記同種細胞が、静脈内に投与される、項目４に記載の組成物。
（項目６）
上記プライミング組成物の上記同種細胞が、皮内に投与される、項目４に記載の組成物。
（項目７）
上記同種細胞が活性化Ｔ細胞である、項目１に記載の組成物。
（項目８）
上記同種細胞のアリコートが、約１×１０ ８ 個と約１×１０ １０ 個との間の細胞を含む、項目１に記載の組成物。
（項目９）
上記同種細胞がＴｈ１サイトカインを産生する、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
上記患者の免疫系が、約７日間〜約１４日間の間に抗同種Ｔｈ１免疫記憶を形成することが可能である、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
切除後に注射された上記同種細胞が、病変内に投与される、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
腫瘍または病原体に対する患者のためのワクチンであって、該ワクチンは、該腫瘍または該病原体由来の抗原性物質および同種細胞のアリコートを含む抗原性組成物を含み、該患者への該抗原性組成物の投与は、拒絶反応を生成し、該抗原に対する遅延型過敏症反応を刺激し、それによって、該患者における全身性の抗腫瘍免疫または抗病原体免疫の刺激に対するアジュバントとして作用する、ワクチン。
（項目１３）
プライミング組成物をさらに含む項目１２に記載のワクチンであって、該プライミング組成物は、上記同種細胞のアリコートを含む、ワクチン。
（項目１４）
上記組成物中の上記腫瘍抗原が、上記腫瘍のネクローシスに由来する、項目１２に記載のワクチン。
（項目１５）
上記組成物中の上記抗原が、上記病原体感染組織のネクローシスに由来する、項目１２に記載のワクチン。
（項目１６）
上記プライミング組成物の上記同種細胞が、静脈内に投与される、項目１３に記載のワクチン。
（項目１７）
上記プライミング組成物の上記同種細胞が、皮内に投与される、項目１３に記載のワクチン。
（項目１８）
上記同種細胞が活性化Ｔ細胞である、項目１２に記載のワクチン。
（項目１９）
上記同種細胞のアリコートが、約１×１０ ８ 個と約１×１０ １０ 個との間の細胞を含む、項目１２に記載のワクチン。
（項目２０）
上記同種細胞がＴｈ１サイトカインを産生する、項目１２に記載のワクチン。
In another aspect of the invention, the invention is a method for inducing an adaptive immune response against a tumor or pathogen in a patient. The method comprises the following steps: (1) administering to a patient with cancer or infectious disease an aliquot of allogeneic cells designed to be rejected by the patient's immune system in a manner that induces anti-allo-Th1 immunity. (2) In the same patient, after the time (about 7 to 14 days) that anti-allo-Th1 immune memory is formed, available tumor lesions or pathogen-infected tissues are preferably converted by necrosis (eg, electroporation, Excision in a manner that destroys at least some tumor or infected tissue (by cryoablation, chemotherapy, radiation therapy, ultrasound therapy, ethanol chemoablation, microwave thermal ablation, radio frequency energy or a combination thereof); Then (3) a second aliquot of the same allogeneic cell, preferably of the excision step -24 hours later, injected into the lesion (same cells as used to prime), immune response acting as an adjuvant to antigen uptake, and host antigen presenting cells responding to subsequent necrotic or apoptotic tissues (ie Dendritic cells) mature. Mature antigen-presenting cells from the lesion then migrate to the lymph nodes and stimulate systemic anti-tumor or anti-pathogen immunity. In another aspect of the present invention, the priming step is omitted. Tissue from tumor or pathogen infected tissue is excised and an aliquot of allogeneic cells is injected after excision to produce the desired immune response.
The present invention also provides the following items.
(Item 1)
A therapeutic composition for treating a tumor or pathogen in a patient, said therapeutic composition comprising an antigenic composition comprising an aliquot of tumor antigen or pathogen antigen and allogeneic cells, wherein said antigenic composition Produces an immune response that acts as an adjuvant to the uptake of antigens in the composition, whereby subsequent maturation of the patient's antigen-presenting cells systemically stimulates anti-tumor immunity or anti-pathogen immunity Composition.
(Item 2)
The composition according to item 1, wherein the tumor antigen in the composition is derived from necrosis of the tumor.
(Item 3)
Item 2. The composition according to Item 1, wherein the pathogen antigen in the composition is derived from necrosis of the pathogen-infected tissue.
(Item 4)
The composition of item 1, further comprising a priming composition, wherein the priming composition comprises an aliquot of said allogeneic cells.
(Item 5)
Item 5. The composition according to Item 4, wherein the allogeneic cell of the priming composition is administered intravenously.
(Item 6)
Item 5. The composition according to Item 4, wherein the allogeneic cell of the priming composition is administered intradermally.
(Item 7)
Item 2. The composition according to Item 1, wherein the allogeneic cell is an activated T cell.
(Item 8)
The composition of claim 1, wherein the aliquot of allogeneic cells comprises between about 1 × 10 8 and about 1 × 10 10 cells.
(Item 9)
Item 2. The composition according to Item 1, wherein the allogeneic cell produces Th1 cytokine.
(Item 10)
2. The composition of item 1, wherein the patient's immune system is capable of forming an anti-allo-Th1 immune memory between about 7 days and about 14 days.
(Item 11)
Item 2. The composition according to Item 1, wherein the allogeneic cells injected after resection are administered into a lesion.
(Item 12)
A vaccine for a patient against a tumor or pathogen, the vaccine comprising an antigenic composition comprising an antigenic substance from the tumor or pathogen and an aliquot of allogeneic cells, wherein the antigenic composition to the patient The administration of a vaccine produces a rejection response and stimulates a delayed type hypersensitivity response to the antigen, thereby acting as an adjuvant to the stimulation of systemic anti-tumor immunity or anti-pathogen immunity in the patient.
(Item 13)
13. The vaccine of item 12, further comprising a priming composition, wherein the priming composition comprises an aliquot of said allogeneic cell.
(Item 14)
Item 13. The vaccine according to Item 12, wherein the tumor antigen in the composition is derived from necrosis of the tumor.
(Item 15)
Item 13. The vaccine according to item 12, wherein the antigen in the composition is derived from necrosis of the pathogen-infected tissue.
(Item 16)
14. A vaccine according to item 13, wherein the allogeneic cells of the priming composition are administered intravenously.
(Item 17)
14. A vaccine according to item 13, wherein the allogeneic cells of the priming composition are administered intradermally.
(Item 18)
Item 13. The vaccine according to item 12, wherein the allogeneic cell is an activated T cell.
(Item 19)
13. A vaccine according to item 12, wherein the aliquot of allogeneic cells comprises between about 1 x 10 8 and about 1 x 10 10 cells.
(Item 20)
Item 13. The vaccine according to Item 12, wherein the allogeneic cell produces Th1 cytokine.
例示的な実施形態の詳細な説明
本発明は、患者において抗腫瘍または抗病原体免疫を刺激する方法を含む。その方法は同種細胞のアリコートを注入することによって、最初に患者を「プライミング」してＴｈ１抗同種抗原免疫記憶を発達させることを含む。同種細胞の注入が患者の免疫系を刺激して、同種細胞に反応することが望ましい。患者の免疫系が抗同種記憶を形成することが可能になるまで時間を経過させる。いくつかの実施態様において、患者は、適当なＴｈ１免疫記憶を発達させるために同種細胞の追加免疫を必要とし得る。
Detailed Description of Exemplary Embodiments The present invention includes a method of stimulating anti-tumor or anti-pathogen immunity in a patient. The method involves first “priming” the patient to develop a Th1 anti-alloantigen immune memory by injecting an aliquot of allogeneic cells. Desirably, the infusion of allogeneic cells stimulates the patient's immune system to react to allogeneic cells. Time passes until the patient's immune system is able to form anti-homogeneous memory. In some embodiments, the patient may require allogeneic booster immunization to develop appropriate Th1 immune memory.
本明細書中で使用される患者は、マウスだけでなくヒトも含む。本明細書中で使用されるＴｈ１反応は、Ｔ細胞およびマクロファージを活性化するサイトカインプロファイルの産生を指す。Ｔｈ１反応は、抗体に依存する免疫反応を主に活性化し、そしてＴｈ１反応に拮抗的なＴｈ２反応から区別される。 As used herein, patients include not only mice but also humans. As used herein, a Th1 response refers to the production of a cytokine profile that activates T cells and macrophages. The Th1 response is primarily distinguished from antibody-dependent immune responses and is distinct from Th2 responses that are antagonistic to Th1 responses.
次の工程は、患者が十分な抗同種Ｔｈ１免疫記憶を発達させた後の、腫瘍ベッドまたは病原体感染組織内の細胞の損傷および／または死を含む。組織の損傷または死は、細胞成分を放出し、そしてスカベンジャー細胞を損傷部位へリクルートする。腫瘍ベッドまたは病原体感染組織で組織の損傷または死を引き起こす様々な方法が、当該分野で公知である。好ましくは、死はネクローシスにより、それはスカベンジャー細胞の損傷部位へのリクルートを引き起こす。いくつかの好ましい実施態様において、組織の死または損傷は、冷凍切除による、または不可逆的なエレクトロポレーションによる。あるいは、組織をエキソビボで切除し、そして放出された成分を患者に注射する。 The next step involves cell damage and / or death in the tumor bed or pathogen-infected tissue after the patient has developed sufficient anti-allo-Th1 immune memory. Tissue damage or death releases cellular components and recruits scavenger cells to the site of injury. Various methods are known in the art to cause tissue damage or death in tumor beds or pathogen-infected tissues. Preferably, death is due to necrosis, which causes recruitment of the scavenger cells to the site of injury. In some preferred embodiments, the tissue death or damage is by cryoablation or by irreversible electroporation. Alternatively, the tissue is excised ex vivo and the released components are injected into the patient.
未熟な樹状細胞を含むスカベンジャー細胞は、損傷したまたは死んだ組織から放出された抗原をピックアップし得る。同種細胞の２番目のアリコートを、抗原に対するＴｈ１免疫のプライミングのために樹状細胞（ＤＣ）の成熟を引き起こすために、病変内に注射する。病変内によって（ｂｙ ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌｌｙ）とは、本発明の組成物を、癌領域または腫瘍または病原体感染組織へ、注射によって、または他の方法で直接的に投与することを意味する。好ましい実施態様において、患者に投与した全ての同種細胞は、同じ供給源由来である。好ましくは、同種細胞を、組織の切除後約２および約２４時間の間に投与する。固形または転移性腫瘍の処置において、特に前立腺、乳房、骨、肝臓、肺、または腎臓に存在する腫瘍病変を有する患者において、この方法は特に有用である。 Scavenger cells, including immature dendritic cells, can pick up antigen released from damaged or dead tissue. A second aliquot of allogeneic cells is injected intralesionally to cause dendritic cell (DC) maturation for priming of Th1 immunity against the antigen. By intralesionally means that the composition of the invention is administered directly to the cancer area or tumor or pathogen infected tissue by injection or otherwise. In a preferred embodiment, all allogeneic cells administered to a patient are from the same source. Preferably, the allogeneic cells are administered between about 2 and about 24 hours after tissue excision. This method is particularly useful in the treatment of solid or metastatic tumors, particularly in patients with tumor lesions present in the prostate, breast, bone, liver, lung, or kidney.
最初のアリコートによって導入された同種細胞に対するＴｈ１免疫に対して患者がプライミングされたという事実のために、同種細胞の２番目のアリコートの導入のときに、患者が、同種細胞の拒絶を引き起こす、強い遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を生じることが望ましい。抗同種抗原ＤＴＨ反応の傍観者効果は、損傷組織からの抗原を回収および処理するＤＣの成熟および流入領域リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）への遊走を引き起こすようにはたらく「危険シグナル」を産生し得る。組織損傷の導入およびＤＴＨ拒絶反応の組み合わせは、炎症性の環境を産生し得、それは損傷組織から放出された抗原に対するＴｈ１免疫を引き起こす。 Due to the fact that the patient was primed against Th1 immunity against allogeneic cells introduced by the first aliquot, the patient causes the rejection of allogeneic cells upon introduction of the second aliquot of allogeneic cells It is desirable to produce a delayed type hypersensitivity (DTH) reaction. The bystander effect of the anti-alloantigen DTH response can produce a “danger signal” that acts to cause maturation and migration to the draining lymph node of DCs that recover and process antigen from damaged tissue . The combination of the introduction of tissue damage and DTH rejection can produce an inflammatory environment that causes Th1 immunity against antigens released from the damaged tissue.
治療過程によって引き起こされた炎症の一般的な状態は、ＤＣが損傷組織における抗原に対するＴｈ１免疫に対してＴ細胞をプログラムすることを引き起こすようはたらき得、それは腫瘍または病原体感染細胞に対する全身性の適応免疫反応を引き起こし、そして腫瘍および病原体による免疫回避メカニズムを無能にする。適応免疫によって（ｂｙ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）とは、抗原への曝露後に、患者の防御がＢおよびＴ細胞によって媒介されること、およびそのような防御が特異性、多様性、記憶、および自己／非自己の認識を示すことを意味する。そのような適応免疫は、患者において全身性である。適応免疫は、非特異的でありそして抗原への曝露前に存在する自然免疫から区別される。 The general state of inflammation caused by the course of treatment can serve to cause DCs to program T cells against Th1 immunity against antigens in damaged tissues, which is a systemic adaptive immunity against tumor or pathogen-infected cells. Causes a response and disables immune evasion mechanisms by tumors and pathogens. By adaptive immunity means that after exposure to an antigen, the patient's defense is mediated by B and T cells, and such protection is specific, diverse, memory, and self / non-self. It means to show recognition. Such adaptive immunity is systemic in the patient. Adaptive immunity is distinct from innate immunity that is non-specific and exists prior to exposure to an antigen.
いくつかの実施態様において、切除に続く同種細胞の投与が、望ましい反応を生じるために十分であり得る。言い換えると、同種細胞の最初のアリコートによる患者のプライミングを省略し得る。これらの実施態様において、腫瘍由来または病原体が感染した組織を切除し、続いて同種細胞のアリコートを注射する。 In some embodiments, administration of allogeneic cells following excision may be sufficient to produce the desired response. In other words, patient priming with the first aliquot of allogeneic cells may be omitted. In these embodiments, tumor-derived or pathogen-infected tissue is excised and subsequently injected with an aliquot of allogeneic cells.
本発明はまた、癌性細胞または感染組織を有する患者にワクチン接種する方法を含む。この方法を、好ましくは血液悪性腫瘍（例えば慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、および非ホジキンリンパ腫）またはウイルス感染疾患（例えばＢまたはＣ型肝炎、ヘルペス、ＨＩＶ）、および侵された病変が切除のために容易に評価し難い他の異常を有する患者のために使用する。 The invention also includes a method of vaccinating a patient having cancerous cells or infected tissue. This method is preferably used for hematological malignancies (eg, chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma, and non-Hodgkin lymphoma) or viral infections (eg, hepatitis B or C, herpes, HIV), and affected lesions. Use for patients with other abnormalities that are difficult to evaluate for resection.
その方法は、まず同種細胞の最初のアリコートを注入することによって、患者を「プライミング」してＴｈ１抗同種抗原免疫記憶を発達させることを含む。同種細胞の注入が、同種細胞に対して反応するよう患者の免疫系を刺激することが望ましい。患者の免疫系が抗同種記憶を形成するのを可能にするまで時間を経過させる。いくつかの実施態様において、適当なＴｈ１免疫記憶を発達させるために、患者は同種細胞の追加免疫を必要とし得る。 The method involves “priming” the patient to develop Th1 anti-alloantigen immune memory by first injecting an initial aliquot of allogeneic cells. It is desirable to stimulate the patient's immune system so that the infusion of allogeneic cells reacts against the allogeneic cells. Time is allowed to elapse until the patient's immune system is able to form anti-allogeneic memory. In some embodiments, the patient may require a booster of allogeneic cells in order to develop an appropriate Th1 immune memory.
次の工程は、患者に癌性細胞または感染組織由来の抗原を含む自己溶解物を含む、抗原性組成物を注射することを含む。この組成物はまた、同種細胞のアリコート、すなわちプライミング工程で使用した同種細胞と同じ供給源由来の同種細胞を含む。抗原性組成物の注射は、患者において拒絶反応を生じ得、そして抗原に対する遅延型過敏症反応を刺激し得る。 The next step involves injecting the patient with an antigenic composition comprising an autolysate containing antigen from cancerous cells or infected tissue. The composition also includes an aliquot of allogeneic cells, i.e. allogeneic cells from the same source as the allogeneic cells used in the priming step. Injection of the antigenic composition can cause rejection in the patient and can stimulate a delayed-type hypersensitivity response to the antigen.
未熟な樹状細胞を含むスカベンジャー細胞は、自己溶解物由来の抗原をピックアップし得る。同種細胞は、抗原に対するＴｈ１免疫のプライミングのために樹状細胞の成熟を引き起こし得る。患者が、プライミング工程の間に同種細胞の最初のアリコートによって導入された、同種細胞に対するＴｈ１免疫にプライミングされたという事実のために、自己溶解物による同種細胞の導入のときに、患者が強力なＤＴＨ反応を起こすことが望ましい。 Scavenger cells, including immature dendritic cells, can pick up antigens from autolysates. Allogeneic cells can cause dendritic cell maturation due to priming of Th1 immunity against the antigen. Due to the fact that the patient was primed for Th1 immunity against allogeneic cells, introduced by the first aliquot of allogeneic cells during the priming process, the patient is powerful when introducing allogeneic cells with autolysates. It is desirable to cause a DTH reaction.
処置工程によって引き起こされる一般的な炎症の状態は、ＤＣがＴ細胞を自己溶解物中の抗原に対するＴｈ１免疫にプログラムするようはたらき得、それは腫瘍または病原体感染細胞に対する全身性の適応免疫反応を引き起こし、そして腫瘍および病原体媒介の免疫回避メカニズムを不能にする。 The general inflammatory condition caused by the treatment process can serve to program DCs into Th1 immunity against antigens in autolysates, which causes a systemic adaptive immune response against tumor or pathogen-infected cells, And disables tumor and pathogen-mediated immune evasion mechanisms.
本発明はまた、弱い免疫原性の、または非免疫原性の腫瘍の免疫原性を増強する方法、および免疫反応を、非保護的免疫反応（例えばＴｈ２反応）から、保護免疫反応（例えばＴｈ１）に偏向させる方法を提供する。そのような疾患は、例えば全ての型の癌、および様々な病原体（例えば肝炎ウイルス、アスペルギルスのような真菌感染、ＨＩＶ、マラリア、腸チフス、コレラ、ヘルペスウイルス、クラミジア、およびＨＰＶ）による感染によって引き起こされる疾患を含む。 The present invention also provides a method of enhancing the immunogenicity of weakly immunogenic or non-immunogenic tumors and the immune response from non-protective immune responses (eg Th2 responses) to protective immune responses (eg Th1 ) Is provided. Such diseases are caused, for example, by all types of cancer, and infection by various pathogens (eg, hepatitis virus, fungal infections such as Aspergillus, HIV, malaria, typhoid fever, cholera, herpes virus, chlamydia, and HPV). Including disease.
本発明はまた、患者において腫瘍または病原体を処置するための治療的組成物を含む。その治療的組成物は、好ましくはプライミング組成物および抗原性組成物を含む。プライミング組成物は、一般的に同種細胞を含み、それを患者に注射して、同種Ｔｈ１免疫を誘発する方式で、患者の免疫系による拒絶反応を生じる。 The invention also includes a therapeutic composition for treating a tumor or pathogen in a patient. The therapeutic composition preferably comprises a priming composition and an antigenic composition. The priming composition generally contains allogeneic cells that are injected into the patient to cause rejection by the patient's immune system in a manner that induces allogeneic Th1 immunity.
抗原性組成物は、腫瘍または病原体感染組織由来の抗原性物質、および同種細胞のアリコートを含む。好ましい実施態様において、その抗原性物質は、癌性細胞または感染組織由来の抗原を含む、自己溶解物である。抗原性物質は、腫瘍または病原体感染組織の組織ネクローシス由来であり得る。好ましくは、抗原性物質は、腫瘍または病原体感染組織の切除由来である。切除を、インビボまたはエキソビボで行い得る。いくつかの実施態様に
おいて、抗原性物質は、腫瘍または病原体感染組織から、組織の切除時に放出される熱ショックタンパク質を含む。
The antigenic composition includes an antigenic material from a tumor or pathogen-infected tissue, and an aliquot of allogeneic cells. In a preferred embodiment, the antigenic substance is an autolysate comprising an antigen from cancerous cells or infected tissue. The antigenic material can be derived from tissue necrosis of a tumor or pathogen infected tissue. Preferably, the antigenic material is derived from excision of a tumor or pathogen infected tissue. Excision can be performed in vivo or ex vivo. In some embodiments, the antigenic material comprises a heat shock protein that is released from the tumor or pathogen-infected tissue upon excision of the tissue.
抗原性組成物はまた、同種細胞を含む。抗原性物質および同種細胞を、一緒に組み合わせ得る、または別に包装し得る。抗原性物質および同種細胞を含む抗原性組成物は、患者に注射した場合、拒絶反応を生じ得、そして抗原に対する遅延型過敏症反応を刺激し、それによって患者における全身性の抗腫瘍または抗病原体免疫の刺激に対するアジュバントとして作用する。 Antigenic compositions also include allogeneic cells. The antigenic material and allogeneic cells can be combined together or packaged separately. An antigenic composition comprising an antigenic substance and allogeneic cells can cause rejection when injected into a patient and stimulates a delayed type hypersensitivity reaction to the antigen, thereby systemic anti-tumor or anti-pathogen in the patient Acts as an adjuvant to immune stimulation.
治療的組成物は、プライミング組成物および抗原性組成物によって産生された反応に対するアジュバントとして作用する、他の成分を含み得る。プライミング組成物および抗原性組成物は、一般的に治療的組成物において見出される他の成分、例えば保存剤を含み得る。これらの成分の追加は、本発明の範囲内である。 The therapeutic composition may include other ingredients that act as adjuvants to the responses produced by the priming composition and the antigenic composition. Priming compositions and antigenic compositions can include other ingredients, such as preservatives, commonly found in therapeutic compositions. The addition of these components is within the scope of the present invention.
いくつかの実施態様において、治療的組成物は、抗原性組成物のみを含み得、そしてプライミング組成物を含まない。抗原性組成物が、望ましい免疫反応を得るために十分であり得る。 In some embodiments, the therapeutic composition can include only the antigenic composition and not the priming composition. An antigenic composition may be sufficient to obtain the desired immune response.
本発明はまた、腫瘍または病原体に対する患者のためのワクチンを含む。そのワクチンは、好ましくはプライミング組成物および抗原性組成物を含む。プライミング組成物は、一般的に同種細胞を含み、それを患者に注射して、同種Ｔｈ１免疫を誘発する方式で、患者の免疫系による拒絶反応を生じさせる。 The invention also includes vaccines for patients against tumors or pathogens. The vaccine preferably includes a priming composition and an antigenic composition. The priming composition generally comprises allogeneic cells that are injected into the patient to cause rejection by the patient's immune system in a manner that induces allogeneic Th1 immunity.
抗原性組成物は、腫瘍または病原体感染組織由来の抗原性物質、および同種細胞のアリコートを含む。好ましい実施態様において、その抗原性物質は、癌性細胞または感染組織由来の抗原を含む、自己溶解物である。抗原性物質は、腫瘍または病原体感染組織の組織ネクローシス由来であり得る。好ましくは、抗原性物質は、腫瘍または病原体感染組織の切除由来である。切除を、インビボまたはエキソビボで行い得る。いくつかの実施態様において、抗原性物質は、腫瘍または病原体感染組織から、組織の切除のときに放出される熱ショックタンパク質を含む。 The antigenic composition includes an antigenic material from a tumor or pathogen-infected tissue, and an aliquot of allogeneic cells. In a preferred embodiment, the antigenic substance is an autolysate comprising an antigen from cancerous cells or infected tissue. The antigenic material can be derived from tissue necrosis of a tumor or pathogen infected tissue. Preferably, the antigenic material is derived from excision of a tumor or pathogen infected tissue. Excision can be performed in vivo or ex vivo. In some embodiments, the antigenic material comprises a heat shock protein that is released from the tumor or pathogen infected tissue upon excision of the tissue.
抗原性組成物はまた、同種細胞を含む。抗原性物質および同種細胞を、一緒に組み合わせ得る、または別に包装し得る。抗原性物質および同種細胞を含む抗原性組成物は、患者に注射した場合、拒絶反応を生じ得、そして抗原に対する遅延型過敏症反応を刺激し、それによって患者における全身性の抗腫瘍または抗病原体免疫の刺激に対するアジュバントとして作用する。 Antigenic compositions also include allogeneic cells. The antigenic material and allogeneic cells can be combined together or packaged separately. An antigenic composition comprising an antigenic substance and allogeneic cells can cause rejection when injected into a patient and stimulates a delayed type hypersensitivity reaction to the antigen, thereby systemic anti-tumor or anti-pathogen in the patient Acts as an adjuvant to immune stimulation.
ワクチンは、プライミング組成物および抗原性組成物によって産生された反応に対するアジュバントとして作用する、他の成分を含み得る。プライミング組成物および抗原性組成物は、一般的にワクチンにおいて見出される他の成分、例えば保存剤を含み得る。これらの成分の追加は、本発明の範囲内である。 Vaccines can contain other components that act as adjuvants to the responses produced by the priming and antigenic compositions. The priming composition and the antigenic composition may include other ingredients commonly found in vaccines, such as preservatives. The addition of these components is within the scope of the present invention.
いくつかの実施態様において、ワクチンは、抗原性組成物のみを含み得、そしてプライミング組成物を含まない。抗原性組成物が、望ましい免疫反応を得るために十分であり得る。 In some embodiments, the vaccine may contain only the antigenic composition and no priming composition. An antigenic composition may be sufficient to obtain the desired immune response.
本発明の治療的ワクチンは、免疫反応を抑制または回避することによって発症および／または持続する癌または慢性ウイルス疾患のような疾患の予防および処置のために有用である。 The therapeutic vaccines of the present invention are useful for the prevention and treatment of diseases such as cancer or chronic viral diseases that develop and / or persist by suppressing or avoiding an immune response.
プライミング工程
プライミング工程の目的は、患者において、続く同種抗原への曝露したときに復活し得る、抗同種Ｔｈ１免疫を産生することである。患者を同種細胞のアリコートに曝露すること、および続いて２番目のアリコートを患者に投与した場合に、免疫記憶から生じる患者の免疫系によって、これら同種細胞が拒絶されることによってプライミングが起こる。患者の注入された同種細胞を拒絶する能力が阻害されるので、および抗同種抗原Ｔｈ１免疫の発達も阻害するので、好ましくは、患者はプライミングの前に免疫抑制されない。
Priming Step The purpose of the priming step is to produce anti-allo-Th1 immunity in a patient that can be restored upon subsequent exposure to alloantigens. Priming occurs when the patient is exposed to an aliquot of allogeneic cells, and subsequently, when the second aliquot is administered to the patient, the patient's immune system resulting from immune memory rejects these allogeneic cells. Preferably, the patient is not immunosuppressed prior to priming because the patient's ability to reject infused allogeneic cells is inhibited and also the development of anti-alloantigen Th1 immunity.
本発明の１つの実施態様において、患者の免疫系を歪めてＴｈ１免疫を産生する。同種細胞の拒絶に対して反応して、Ｔｈ２免疫ではなくＴｈ１免疫が発達するように、同種細胞を操作することが好ましい。１つの実施態様において、注入した場合にＴｈ１サイトカイン（例えばＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）を産生する同種細胞を投与することによって、患者の免疫系を歪めてＴｈ１反応を産生し得る。Ｔｈ１サイトカインは、同種抗原に対する免疫反応をＴｈ１型の免疫へ歪めることを助け得る。患者の免疫系を、Ｔｈ１免疫を産生するように歪める他の方法も、本発明の範囲内である。 In one embodiment of the invention, the patient's immune system is distorted to produce Th1 immunity. It is preferred to manipulate allogeneic cells so that Th1 immunity, but not Th2 immunity, develops in response to rejection of allogeneic cells. In one embodiment, the patient's immune system can be distorted to produce a Th1 response by administering allogeneic cells that, when injected, produce Th1 cytokines (eg, IFN-γ and TNF-α). Th1 cytokines can help distort the immune response to alloantigens to Th1-type immunity. Other methods of distorting the patient's immune system to produce Th1 immunity are also within the scope of the invention.
最初に患者をプライミングするために使用した、および次いで後に病変内投与（細胞死の誘導後）のために、または病原体または腫瘍物質の供給源のアジュバントとして使用した同種細胞は、好ましくは同種活性化Ｔ細胞、より好ましくは同種活性化ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞、より好ましくはエフェクターまたはメモリー細胞へ分化し、そして高レベルのＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのような１型サイトカインを産生する、そして好ましくは細胞表面に高密度でＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、およびＦａｓＬのようなエフェクター分子も発現するが、ＩＬ−４または他の２型サイトカインを産生しない同種ＣＤ４＋Ｔ細胞である。自然免疫細胞（例えば樹状細胞、マクロファージおよびＮＫ細胞）のＣＤ４０ライゲーションは、高レベルのサイトカインＩＬ−１２を誘導する能力を有し、それはＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ１型免疫へ分極させ（ｐｏｌａｒｉｚｅｓ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増強し、そしてＮＫ細胞を活性化する。これらの前炎症性の出来事は、患者の免疫系による拒絶のときに、一貫した同種細胞上の同種抗原へのＴｈ１免疫の発達を可能にし得る。 Allogeneic cells that were first used to prime the patient and then later used for intralesional administration (after induction of cell death) or as an adjuvant for the source of pathogen or tumor material are preferably allogeneic activation Differentiate into T cells, more preferably allogeneic activated CD4 + Th1 cells, more preferably effector or memory cells, and produce high levels of type 1 cytokines such as IL-2, IL-15, IFN-γ, TNF-α And preferably allogeneic CD4 + T cells that also express effector molecules such as CD40L, TRAIL, and FasL at high density on the cell surface but do not produce IL-4 or other type 2 cytokines. CD40 ligation of innate immune cells (eg dendritic cells, macrophages and NK cells) has the ability to induce high levels of the cytokine IL-12, which polarizes CD4 + T cells to Th1-type immunity (CD8 + T). It enhances cell proliferation and activates NK cells. These pro-inflammatory events may allow the development of Th1 immunity to allogeneic antigens on allogeneic cells consistently upon rejection by the patient's immune system.
プライミング工程において、活性化された同種Ｔ細胞を患者に、好ましくは静脈内に投与するが、皮内投与もし得る。同種細胞は、好ましくは故意にＨＬＡミスマッチのドナー由来である。静脈内注入のための同種細胞のアリコートにおいて好ましい投与量は、少なくとも約１×１０７細胞、およびより好ましくは約１×１０８から１×１０１０細胞の間である。免疫反応を主に生じ得る、この範囲外の同種細胞の投与量も、本発明の範囲内である。 In the priming step, activated allogeneic T cells are administered to the patient, preferably intravenously, but can also be administered intradermally. Allogeneic cells are preferably deliberately derived from HLA mismatched donors. A preferred dosage in an aliquot of allogeneic cells for intravenous infusion is at least about 1 × 10 7 cells, and more preferably between about 1 × 10 8 and 1 × 10 10 cells. Doses of allogeneic cells outside this range that can primarily produce an immune response are also within the scope of the present invention.
冒された組織の切除または抗原性組成物の投与前に、Ｔｈ１抗同種抗原免疫の発達に関して、患者を試験することが望ましい。Ｔｈ１抗同種抗原免疫の発達は、少なくとも約７日間かかり得る。好ましくは、患者に約７日から約１４日の間、Ｔｈ１抗同種抗原免疫を発達させる。Ｔｈ１抗同種抗原免疫の発達を、例えばＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定し得る。Ｔｈ１抗同種抗原免疫の発達に関して患者を試験する他の方法も、本発明の範囲内である。もしＴｈ１抗同種抗原免疫が弱いなら、同種細胞のさらなる追加免疫注射を投与し得る。追加免疫注射を、好ましくは皮内に行って、皮膚において遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を産生する。 Prior to excision of the affected tissue or administration of the antigenic composition, it is desirable to test the patient for the development of Th1 anti-alloantigen immunity. The development of Th1 anti-alloantigen immunity can take at least about 7 days. Preferably, the patient develops Th1 anti-alloantigen immunity for about 7 to about 14 days. The development of Th1 anti-alloantigen immunity can be measured, for example, by ELISPOT assay. Other methods of testing patients for the development of Th1 anti-alloantigen immunity are also within the scope of the present invention. If Th1 anti-alloantigen immunity is weak, additional booster injections of allogeneic cells can be administered. Booster injections are preferably made intradermally to produce a delayed type hypersensitivity (DTH) response in the skin.
同種Ｔ細胞の産生
活性化および患者への注入のときに、Ｔｈ１免疫が患者によって産生され得るように、同種Ｔ細胞を産生し得ることが望ましい。抗同種Ｔｈ１免疫の刺激に必要な性質を有する同種細胞を産生するために好ましい方法は、以下のものを含む：（１）正常なスクリーニングされたドナーから、白血球搬出によって、単核細胞供給源物質を回収する；（２）供給源物質からＣＤ４Ｔ細胞を単離する；（３）０、３、および６日目に、固定化抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）でＣＤ４＋細胞を活性化する；（４）９日目に再び固定化抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂｓで細胞を活性化し、そして細胞を活性化の２４時間以内に注入する。
Production of allogeneic T cells It is desirable to be able to produce allogeneic T cells so that Th1 immunity can be produced by the patient upon activation and infusion into the patient. Preferred methods for producing allogeneic cells having the properties necessary for stimulation of anti-allo-Th1 immunity include the following: (1) Mononuclear cell source material by leukocyte export from normal screened donors (2) Isolate CD4 T cells from source material; (3) Activate CD4 + cells with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies (mAb) on days 0, 3, and 6 (4) Activate the cells again with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 mAbs on day 9, and inject the cells within 24 hours of activation.
細胞死工程
細胞死または細胞損傷は、ＤＣの病変へのリクルートを引き起こし得、そしてＤＣによる取り込みのための抗原の供給源を提供する。標的組織を、ネクローシスによる死を引き起こす過程によって破壊することが好ましい。ネクローシスによって、かなりの量の細胞内成分が、環境に放出されるような、個々の細胞または細胞のグループの死を意味する。この適用の目的のために、ネクローシスは、冷凍切除、不可逆的エレクトロポレーション、化学療法、放射線治療、超音波治療、エタノール化学切除、マイクロ波熱切除、高周波エネルギーまたはその組み合わせを含む、様々な方法による細胞死を含む。ネクローシスで殺された細胞は、ＤＣのリクルートおよび成熟の原因である障害の内因性シグナルを活性化し、それは健康なまたはアポトーシスで死んだ細胞によっては産生されない刺激である。さらに、これらの刺激に未熟なＤＣを曝露することは、局所および全身性Ｔｈ１免疫を開始するために決定的な、成熟シグナルを提供する。
Cell Death Process Cell death or cell damage can cause recruitment of DCs to the lesion and provides a source of antigen for uptake by DCs. The target tissue is preferably destroyed by a process that causes necrotic death. By necrosis is meant the death of an individual cell or group of cells such that a significant amount of intracellular components are released to the environment. For purposes of this application, necrosis can be performed in a variety of ways, including cryoablation, irreversible electroporation, chemotherapy, radiation therapy, ultrasound therapy, ethanol chemoablation, microwave thermal ablation, radio frequency energy, or a combination thereof. Including cell death. Cells killed in necrosis activate the intrinsic signal of the disorder responsible for DC recruitment and maturation, a stimulus that is not produced by healthy or apoptotic dead cells. Furthermore, exposing immature DCs to these stimuli provides a critical maturation signal to initiate local and systemic Th1 immunity.
１つの好ましい実施態様において、ネクローシスによる死を引き起こすために、標的組織を凍結することが好ましい。冷凍手術は、液体窒素またはアルゴンガスの適用によって、組織のネクローシスを誘導し得る、よく照準を合わせた、そしてコントロールされた手順である。冷凍手術中および後に起こる生物学的な変化が、インビトロおよびインビボで研究された。細胞の凍結および解凍後に発症する血管のうっ滞によって、組織の損傷およびネクローシスが誘発される。凍結手術（インサイツ凍結）は、凍結組織の自己抗原に対して特異的な免疫反応を産生し得る、抗原性刺激（抗原の非経口投与によって得られるものに匹敵する）を誘発することが知られていた。 In one preferred embodiment, it is preferred to freeze the target tissue to cause necrotic death. Cryosurgery is a well-targeted and controlled procedure that can induce tissue necrosis by the application of liquid nitrogen or argon gas. Biological changes that occur during and after cryosurgery have been studied in vitro and in vivo. Vascular stasis that develops after freezing and thawing of cells induces tissue damage and necrosis. Cryosurgery (in situ freezing) is known to induce antigenic stimuli (comparable to those obtained by parenteral administration of antigen) that can produce specific immune responses against frozen tissue self-antigens. It was.
冷凍切除は、ＤＣによる抗原処理のために、ペプチドを溶解した腫瘍または病原体感染細胞から放出させ得、そして前炎症性サイトカイン環境を産生する。ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦのような、冷凍切除後に放出されるサイトカインは、癌または病原体感染細胞を破壊し得る免疫反応に必須である、Ｔ、ＮＫ、およびランゲルハンス細胞を活性化し得る。 Cryoablation can release peptides from lysed tumor or pathogen-infected cells for antigen processing by DC and produce a pro-inflammatory cytokine environment. Cytokines released after cryoablation, such as IL-1, IL-2, TNF-α, IFN-γ, and GM-CSF, are essential for immune responses that can destroy cancer or pathogen-infected cells. , NK, and Langerhans cells can be activated.
別の好ましい実施態様において、ネクローシスによる死を引き起こすために、標的組織に不可逆的エレクトロポレーションを行うことが好ましい。不可逆的エレクトロポレーションは、組織切除技術であり、ここでマイクロからミリ秒の電気パルスが組織に送達されて、不可逆的な細胞膜の透過処理によって細胞のネクローシスを生じる。不可逆的エレクトロポレーションにおいて、電極間の細胞の細胞膜は破壊され、細胞のネクローシスを引き起こす。不可逆的エレクトロポレーションは、ＤＣによる抗原処理のために、抗原の溶解腫瘍または病原体感染細胞からの放出を引き起こし得、そして前炎症性サイトカイン環境を産生する。 In another preferred embodiment, it is preferred to perform irreversible electroporation on the target tissue to cause necrotic death. Irreversible electroporation is a tissue ablation technique in which micro to millisecond electrical pulses are delivered to the tissue, resulting in cell necrosis by irreversible permeabilization of the cell membrane. In irreversible electroporation, the cell membrane of the cell between the electrodes is destroyed, causing cell necrosis. Irreversible electroporation can cause release of antigen from lysed tumors or pathogen-infected cells for antigen processing by DC and produces a pro-inflammatory cytokine environment.
抗原の供給源を産生する別の好ましい方法は、死んだ感染組織または腫瘍から、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）としても知られている、自己シャペロンタンパク質を単離することである。ＨＳＰは、細菌、真菌および寄生虫病原体への免疫反応の主な標的に含まれる。細胞外環境におけるあるシャペロンも、そのポリペプチドを介添えする能力、および宿主の免疫系、特に専門の抗原提示細胞と相互作用する能力のために、自然および適応免疫を調節し得る。腫瘍由来の熱ショックタンパク質によるワクチン接種は、抗腫瘍反応を誘発することが示された。現在の研究は、ＨＳＰの免疫原性は、それらが結合する抗原性ペプチド由来であることを示す。 Another preferred method of producing a source of antigen is to isolate autologous chaperone proteins, also known as heat shock proteins (HSPs), from dead infected tissues or tumors. HSPs are among the main targets of immune responses against bacterial, fungal and parasitic pathogens. Certain chaperones in the extracellular environment can also modulate natural and adaptive immunity due to their ability to mediate polypeptides and to interact with the host immune system, particularly specialized antigen presenting cells. Vaccination with tumor-derived heat shock proteins has been shown to induce an anti-tumor response. Current studies indicate that the immunogenicity of HSPs is derived from the antigenic peptides to which they bind.
抗原供給源として使用するためのシャペロンタンパク質を単離する好ましい方法は、Ｋａｔｓａｎｔｉｓによって、米国特許第６，８７５，８４９号において記載されている。さらなる方法が、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａによって、米国特許第６，７９７，４８０；６，１８７，３１２、６，１６２，４３６；６，１３９，８４１；６，１３６，３１５；および５，８３７，２５１号において記載されている。 A preferred method of isolating chaperone proteins for use as an antigen source is described by Katsantis in US Pat. No. 6,875,849. Further methods are described by Srivastava in US Pat. Nos. 6,797,480; 6,187,312, 6,162,436; 6,139,841; 6,136,315; and 5,837,251. ing.
アジュバント工程
アジュバント工程の目的は、ＤＣの成熟を引き起こして、死んだ標的組織を含む病変において取り込まれた抗原に対するＴｈ１免疫を刺激することである。これを、同じ同種細胞、すなわち患者をプライミングするために使用したものと同じ起源の同種細胞の注射によって達成し得る。この同種細胞のアリコートを、好ましくは病変内に、すなわち冷凍切除によって、または他の細胞死の方法によって引き起こされたネクローシス病変に直接注射する。あるいは、シャペロンタンパク質を抗原の供給源として使用する場合、患者をプライミングするために使用した同じ同種細胞を、シャペロンタンパク質と共に、好ましくは皮内に注射する。望ましい免疫反応を生じるための同種細胞の投与量は、一般的に、少なくとも約１×１０７細胞、およびより好ましくは約１×１０８から１×１０１０細胞の間である。望ましい免疫反応を生じ得る、この範囲外の同種細胞の投与量も、本発明の範囲内である。同種細胞の調製は、上記で述べたものと同じである。
Adjuvant process The purpose of the adjuvant process is to cause DC maturation to stimulate Th1 immunity against antigens taken up in lesions containing dead target tissues. This can be achieved by injection of the same allogeneic cells, i.e., allogeneic cells of the same origin used to prime the patient. This aliquot of allogeneic cells is preferably injected directly into the lesion, ie necrotic lesions caused by cryoablation or by other methods of cell death. Alternatively, if chaperone protein is used as a source of antigen, the same allogeneic cells used to prime the patient are injected, preferably intradermally, with the chaperone protein. The dose of allogeneic cells to produce the desired immune response is generally at least about 1 × 10 7 cells, and more preferably between about 1 × 10 8 and 1 × 10 10 cells. Doses of allogeneic cells outside this range that can produce the desired immune response are also within the scope of the present invention. Allogeneic cell preparation is the same as described above.
免疫反応を開始し、そして免疫系が自己組織に対して有する天然の寛容を克服するために、ネクローシス細胞死の後に放出された、またはシャペロンタンパク質と結合した抗原は、ＤＣによって取り込まれ、そして「危険」のシグナルを出す免疫活性化成分と共に提示されなければならない。同種細胞に対する記憶免疫反応が、この「危険」を産生する。 In order to initiate the immune response and overcome the natural tolerance that the immune system has against self tissue, the antigen released after necrotic cell death or bound to the chaperone protein is taken up by the DC and “ It must be presented with an immunostimulatory component that gives a "danger" signal. A memory immune response against allogeneic cells produces this “danger”.
未熟ＤＣと呼ばれる組織常在性ＤＣは、環境からＡｇを捕捉し得るが、Ｔ細胞を刺激が欠けている。病原体感染および続く炎症性反応に反応して、ＤＣは成熟と呼ばれる分化過程を経験し、これによってそれらは流入領域リンパ節に遊走する能力をアップレギュレートし、そして捕捉した抗原をＴ細胞へ提示する。Ｔｈ１ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＴＬを活性化するために、ＤＣは多くの成熟／分化刺激を統合しなければならない。病原体または腫瘍と遭遇する部位において、病原体または腫瘍由来の決定基、前炎症性サイトカイン、および／または細胞破片への曝露は、成熟過程の第一段階を誘発する。これは、同時刺激分子およびケモカイン受容体のアップレギュレーションを含み、これによってＤＣはそれぞれ抗原をＴ細胞へ提示し、そしてリンパ節へ遊走する能力を得る。リンパ節において、同族ＣＤ４＋Ｔ細胞の遭遇は、ＤＣにさらなる分化刺激を与え、それは活性化Ｔ細胞の生存およびＣＤ４＋Ｔ細胞の分極（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を調節する。 Tissue resident DCs called immature DCs can capture Ag from the environment but lack stimulation of T cells. In response to pathogen infection and subsequent inflammatory responses, DCs undergo a differentiation process called maturation, which up-regulates their ability to migrate to draining lymph nodes and present captured antigens to T cells. To do. In order to activate Th1CD4 + T cells and CTLs, DCs must integrate many maturation / differentiation stimuli. At the site where the pathogen or tumor is encountered, exposure to pathogen or tumor-derived determinants, pro-inflammatory cytokines, and / or cell debris triggers the first stage of the maturation process. This includes up-regulation of costimulatory molecules and chemokine receptors, whereby the DCs each have the ability to present antigen to T cells and migrate to lymph nodes. In lymph nodes, the encounter of cognate CD4 + T cells gives further differentiation stimulation to DCs, which regulates the survival of activated T cells and the polarization of CD4 + T cells.
ＤＣの成熟は、抗原の取り込み部位で起こり、そして拒絶反応の復活は、ＤＣ成熟、リンパ節への遊走、および病変において取り込まれた抗原に対するＴｈ１免疫のプログラミングに必要な、適当な炎症性危険シグナルを提供するためのアジュバントとしてはたらく。 DC maturation occurs at the site of antigen uptake, and resurrection of rejection is an appropriate inflammatory risk signal required for DC maturation, migration to lymph nodes, and Th1 immunity programming against antigens taken up in the lesion. Serves as an adjuvant to provide
動物
Ｂａｌｂ／ｃマウスが宿主であり、そしてＣ５７Ｂｌ／６（Ｂ６）マウスをＴｈ１細胞の供給源として使用した。全てのマウスは６から１０週齢であり、Ｈａｄａｓｓａｈ−Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの特定の病原体を含まない施設で維持し、そして認可された動物プロトコールで処置した。
Animals Balb / c mice were hosts and C57B1 / 6 (B6) mice were used as a source of Th1 cells. All mice were 6 to 10 weeks of age, maintained in a Hadassah-Hebrew University Medical Center specific pathogen free facility and treated with approved animal protocols.
同種Ｔｈ１記憶細胞の調製
オスＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞を採取し、そして赤血球の溶解のために塩化アンモニウム−カリウム（ＡＣＫ）緩衝液で処理した。脾臓あたり約７千万−１億個の細胞を単離した。次いでＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上のＣＤ４免疫磁性粒子を用いて、ポジティブセレクションによってＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し（純度＞９８％）、約８００万−１２００万個のＣＤ４細胞が、５０−６０％の収率で単離された。Ｔｈ１記憶細胞を、最初のビーズ：ＣＤ４細胞比が３：１で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコートした常磁性ビーズ（ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞エキスパンダービーズ、Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による増殖によって産生した。精製ＣＤ４細胞を、２０ＩＵ／ｍＬの組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−７、および１０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）および１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩＬ−４ｍＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）と共に、１０％のＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）および３．３ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ；Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（完全培地）中でインキュベートした。さらなるサイトカインを含む、ｒｍＩＬ−２およびｒｍＩＬ−７を含む完全培地を、ＣＤ４培養に、３日から６日目に毎日加えて、細胞濃度を０．５および１×１０６細胞／ｍＬの間に維持した。さらなるＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを、３日から６日目に毎日加えた。加えたビーズの数を計算して、細胞が増殖するときに１：１のビーズ：細胞比を維持した。培養６日後、ＣＤ４細胞は約８０から１００倍に増殖し、そして同細胞を回収し、および物理的破壊および磁石上を通過させることによってビーズをはずした（ｄｅｂｅａｄｅｄ）。実験で使用した、回収細胞の表現型は、＞９５％ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌｌｏ、ＩＦＮ−α＋およびＩＬ−４−であった。
Preparation of allogeneic Th1 memory cells Spleen cells from male C57BL / 6 mice were harvested and treated with ammonium chloride-potassium (ACK) buffer for lysis of red blood cells. Approximately 70-100 million cells were isolated per spleen. CD4 + T cells were then purified by positive selection using CD4 immunomagnetic particles on an MS column (Miltenyi Biotec, Germany) (purity> 98%), with approximately 8-12 million CD4 cells being 50-60% Isolated in a yield of Th1 memory cells were produced by growth on paramagnetic beads (CD3 / CD28 T cell expander beads, Dynal / Invitrogen) coated with anti-CD3 and anti-CD28 at an initial bead: CD4 cell ratio of 3: 1. Purified CD4 cells were treated with 20 IU / mL recombinant mouse (rm) IL-2, 20 ng / mL rmIL-7, and 10 ng / mL rmIL-12 (Peprotech, New Jersey) and 10 μg / mL anti-mouse IL-. RPMI 1640 medium (complete with 4 mAb (Becton Dickenson), 10% FBS, penicillin-streptomycin-glutamine, non-essential amino acids (NEAA) (Biological Industries, Israel) and 3.3 mM N-acetylcysteine (NAC; Sigma) Medium). Complete media containing rmIL-2 and rmIL-7, including additional cytokines, is added daily to CD4 cultures on days 3-6 to achieve cell concentrations between 0.5 and 1 × 10 6 cells / mL. Maintained. Additional CD3 / CD28 beads were added daily on days 3-6. The number of beads added was calculated to maintain a 1: 1 bead: cell ratio as the cells grew. After 6 days in culture, CD4 cells proliferated approximately 80-100 fold, and the cells were harvested and debeaded by physical disruption and passing over a magnet. Were used in the experiment, the phenotype of the recovered cells,> 95% CD4 +, CD45RO +, CD62L lo, was IFN-alpha + and IL-4-a.
ＣＤ３／ＣＤ２８ナノビーズの調製
ビオチン化マウス抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をそれぞれ、２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで、４００μｌのＰＢＳ中で希釈し、そして次いで１：１の比で混合して最終的な容量を８００μｌにした。２０μｌのストレプトアビジンでコートしたナノビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を洗浄し、そしてＰＢＳ中で２００μｌの最終容量まで希釈した。８００μｌのＣＤ３／ＣＤ２８ｍＡｂ溶液および２００μｌの希釈したナノビーズを、次いで混合して、全容量１ｍｌ中、それぞれのｍＡｂの最終濃度を１０μｇ／ｍｌにした。混合物を、ＲＴで３０分間、回転混合装置に置いた。ｍＡｂが結合したナノビーズを、次いで磁石上でＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に通過させ、そして十分に洗浄した。次いで保持されたナノビーズをカラムから放出し、そして２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。該ナノビーズは、未処理のＴ細胞を活性化することができなかった。従って、このナノビーズを、ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞エキスパンダービーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｎｏｒｗａｙ）で６日前に前活性化しておいた、回収したＴｈ１記憶細胞に対して滴定した（ｔｉｔｔｅｒｅｄ）。バッチによってわずかな変動はあったが、一般的に２０μｌ／１０７細胞が、以前に活性化されたＴｈ１記憶細胞の最適な活性化を提供することが見出された。
Preparation of CD3 / CD28 nanobeads Biotinylated mouse anti-CD3 and anti-CD28 mAb (BD Pharmingen) were each diluted in 400 μl PBS to a final concentration of 25 μg / ml and then mixed in a 1: 1 ratio to final The volume was 800 μl. 20 μl streptavidin coated nanobeads (Miltenyi, Germany) were washed and diluted in PBS to a final volume of 200 μl. 800 μl of CD3 / CD28 mAb solution and 200 μl of diluted nanobeads were then mixed to a final concentration of 10 μg / ml of each mAb in a total volume of 1 ml. The mixture was placed on a rotary mixer for 30 minutes at RT. The mAb-bound nanobeads were then passed over an MS column (Miltenyi, Germany) and washed thoroughly. The retained nanobeads were then released from the column and resuspended in 200 μl PBS. The nanobeads could not activate untreated T cells. Therefore, the nanobeads were titrated against recovered Th1 memory cells that had been pre-activated 6 days ago with CD3 / CD28 T cell expander beads (Dynal, Norway). Although there were slight variations from batch to batch, it was generally found that 20 μl / 10 7 cells provided optimal activation of previously activated Th1 memory cells.
ＣＤ３／ＣＤ２８架橋
活性化Ｔｈ１記憶細胞の注入を必要とする実験において、回収したＴｈ１細胞を、注入の前に、前もって滴定した（ｐｒｅ−ｔｉｔｔｅｒｅｄ）濃度のＣＤ３／ＣＤ２８結合ナノビーズとインキュベートした。最適な活性化のために、細胞をナノビーズと最低４時間、および最大１８時間インキュベートしなければならなかった。最適な活性化は、ＩＦＮ−αの産生および細胞表面上のＣＤ４０ＬおよびＦａｓＬのアップレギュレーションを引き起こした。これらの実験に関して、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞の全ての注入は、プレインキュベーションの４−８時間後に起こった。あらゆる結合していないナノビーズを除去するために、注入の前に細胞を十分に洗浄した。これらの実験で使用した架橋Ｔｈ１記憶細胞は、ＦａｓＬおよびＣＤ４０Ｌを細胞表面に発現し、そして２０００ｎｇ／ｍｌ／１０６細胞／６ｈを超えるＩＦＮ−α、そして１０６細胞／６ｈあたり２０ｐｇ／ｍｌより少ないＩＬ−４を産生した。ＣＤ３／ＣＤ２８架橋を有さないＴｈ１記憶細胞は、サイトカインを産生せず、またはＦａｓＬまたはＣＤ４０Ｌを発現しなかった。
In experiments requiring injection of CD3 / CD28 cross-linked activated Th1 memory cells, recovered Th1 cells were incubated with pre-titrated concentrations of CD3 / CD28-conjugated nanobeads prior to injection. For optimal activation, cells had to be incubated with the nanobeads for a minimum of 4 hours and a maximum of 18 hours. Optimal activation caused production of IFN-α and upregulation of CD40L and FasL on the cell surface. For these experiments, all injections of CD3 / CD28 cross-linked Th1 memory cells occurred 4-8 hours after preincubation. Cells were washed thoroughly prior to injection to remove any unbound nanobeads. The cross-linked Th1 memory cells used in these experiments expressed FasL and CD40L on the cell surface and greater than 2000 ng / ml / 10 6 cells / 6h and less than 20 pg / ml per 10 6 cells / 6h IL-4 was produced. Th1 memory cells without CD3 / CD28 cross-linking did not produce cytokines or expressed FasL or CD40L.
寒冷療法
寒冷療法を、直径３ｍｍの球状の亜酸化窒素クリオプローブで行った。該気体を５０バールの圧力に維持し、そしてジュール−トムソン効果は組織において−３０から−４０℃の範囲の温度を達成することを可能にした。腫瘍の中央に切開をし、クリオプローブを腫瘍と接して置いた（それを１−２ｍｍの深さに挿入した）：その目的はそれを凍結することによって影響を与えるが完全には破壊しないことであった。迅速な凍結（２０秒間続く）に続く遅い解凍の３サイクルを行った。病変の中心でアイスボールが産生され、そして全腫瘍体積の約３分の２に達した。
Cryotherapy Cryogenic therapy was performed with a spherical nitrous oxide cryoprobe 3 mm in diameter. The gas was maintained at a pressure of 50 bar and the Joule-Thompson effect made it possible to achieve temperatures in the range of −30 to −40 ° C. in the tissue. An incision was made in the middle of the tumor and the cryoprobe was placed in contact with the tumor (it was inserted to a depth of 1-2 mm): its purpose is to affect it by freezing it but not to destroy it completely Met. Three cycles of quick thawing (lasting 20 seconds) followed by slow thawing were performed. Ice balls were produced at the center of the lesion and reached approximately two thirds of the total tumor volume.
エレクトロポレーション：
実施例１
同種Ｔｈ１細胞の、広範囲の転移性疾患において全身性抗腫瘍免疫を刺激する能力を試験するために、以下のプロトコールを試験した。ＢＣＬ１白血病、４Ｔ１乳癌および３ＬＬ肺癌を含む腫瘍細胞の致死的投与量を、０日目にマウスに静脈内注入し、そして腫瘍細胞を皮内にも注射して固形腫瘍塊を確立した。７日目に、マウスに１×１０５投与量の同種Ｔｈ１細胞を与えた。１４日目に、（ａ）生理食塩水；（ｂ）生理食塩水＋腫瘍の部分的冷凍切除；（ｃ）１０３細胞の投与量における同種Ｔｈ１細胞；または（ｄ）同種Ｔｈ１細胞＋腫瘍の部分的冷凍切除のいずれかの注射によって、マウスを腫瘍内で処置した。９０日目に生存している動物の結果を下記に示す（ｎ＝１０）：
Electroporation:
Example 1
In order to test the ability of allogeneic Th1 cells to stimulate systemic anti-tumor immunity in a wide range of metastatic disease, the following protocol was tested. A lethal dose of tumor cells including BCL1 leukemia, 4T1 breast cancer and 3LL lung cancer was injected intravenously into mice on day 0, and tumor cells were also injected intradermally to establish a solid tumor mass. On day 7, mice received 1 × 10 5 doses of allogeneic Th1 cells. On day 14, (a) saline; of or (d) allogeneic Th1 cells + tumor; (b) partial cryoablation saline + tumors; (c) 10 3 allogeneic Th1 cells in a dose of cells Mice were treated intratumorally by injection of either partial cryoablation. Results for animals surviving on day 90 are shown below (n = 10):
固形腫瘍を有する患者の治療が、本発明によって利益を得るかどうかを調査するために、上記の実験デザインを、固形腫瘍塊を生じる腫瘍の皮内注射のみを受けた動物において繰り返した。その結果は、転移性疾患を有する動物で得られたものと同様であった。
To investigate whether treatment of patients with solid tumors would benefit from the present invention, the above experimental design was repeated in animals that received only intradermal injections of tumors that produced solid tumor masses. The results were similar to those obtained with animals with metastatic disease.
本発明は、好ましい実施態様に関して記載されたが、当業者は、本発明の意図および範囲から離れることなく、形式および詳細において変更をし得ることを認識する。 Although the present invention has been described with reference to preferred embodiments, workers skilled in the art will recognize that changes may be made in form and detail without departing from the spirit and scope of the invention.
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