JP2013153734A

JP2013153734A - 酵素法による連続式バイオディーゼル燃料の生産方法

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Publication number: JP2013153734A
Application number: JP2012019272A
Authority: JP
Inventors: Hideo Noda; 秀夫野田; 真司 ▲濱▼; Shinji Hama
Original assignee: Kansai Chemical Engineering Co Ltd; Bio Energy Corp
Current assignee: Kansai Chemical Engineering Co Ltd; Bio Energy Corp
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2012-01-31
Publication date: 2013-08-15
Anticipated expiration: 2032-01-31
Also published as: JP5986753B2

Abstract

【課題】原料油脂、遊離脂肪酸および水を含有する原料組成物から酵素法により脂肪酸エステルを連続的に生産する方法を提供すること
【解決手段】本発明の肪酸エステルを連続的に生産する方法は、リパーゼが充填されている触媒反応管および該触媒反応管の下流にグリセリン分離槽を備える反応装置において、（ａ）該触媒反応管に、原料油脂、遊離脂肪酸および水を含有する原料組成物と低級アルコールとの混合物を供給する工程；（ｂ）該触媒反応管からの流出液を該グリセリン分離槽に導入してグリセリン層に接触させる工程；（ｃ）該工程（ｂ）後にオーバーフローする上層を回収し、低級アルコールと混合する工程；および（ｄ）該工程（ｃ）で得られた混合物を該触媒反応管に供給し、該工程（ｂ）〜（ｃ）を繰り返す工程を含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、バイオディーゼル燃料として有用な脂肪酸エステルを、酵素法により連続的に生産する方法に関する。

自動車の燃料として、一般に石油および軽油に代表される化石燃料が用いられている。これらの化石燃料、特にディーゼル自動車に用いられている軽油には、窒素化合物、硫黄化合物が多く含まれているため、ディーゼル自動車などの自動車からは、ＣＯ_２、ＮＯ_ｘ、ＳＯ_ｘなどのガスが多量に排出されている。これらの排出ガスは、地球温暖化および環境汚染の原因となっており、その排出量の削減が緊急の解決課題である。

軽油などの化石燃料に代わる燃料として、天然に存在する植物、動物、魚あるいは微生物が産生する油脂を用いる、いわゆるバイオディーゼル燃料が期待されている。これらの油脂のうち、食品生産のために用いられた油脂は環境中に廃棄される場合が多く、環境問題を引き起こす。そのため、廃油からのバイオディーゼル燃料の生産は、大気汚染の防止と廃油の有効利用の点から、特に期待されている。

バイオディーゼル燃料としては、油脂と低級アルコールとをエステル交換反応させて得られる脂肪酸エステルが好ましく用いられている。脂肪酸エステルを生産する方法の１つとして、リパーゼを用いる酵素触媒法に関する研究が種々行われている（特許文献１および２）。この生産方法は、副生するグリセリンの後処理が容易であること、反応条件が温和であること、原料中の遊離脂肪酸のエステル化が可能であることなど、多くの利点を有する（非特許文献１）。

リパーゼを用いる脂肪酸エステルの生産に関して、酵素、油脂および低級アルコールをネジ口瓶あるいは反応槽内にて撹拌／混合することによる、バッチ式によるエステル交換反応の研究が積極的に行われている（非特許文献２および３）。この方式では、反応液の撹拌による酵素の物理的損傷に留意する必要がある。また、反応後の生産物を回収するためには、撹拌を停止して反応液を静置した後、生産物、酵素および副生物をそれぞれ層分離させる過程が必要となる。

一方、リパーゼを充填した管内に油脂と低級アルコールとを通液させるパックドベッドリアクターを用いた脂肪酸エステル生産も報告されている（非特許文献４および５）。この場合、酵素は管内に固定されているため、酵素に対する物理的損傷の程度が少なく、長時間の運転が可能となる。さらには、多量の酵素を反応器内に充填できるため、反応器単位体積当たりならびに反応時間当たりの目的物質の生産量が大幅に増加するという特徴を有する。非特許文献４および５に代表されるパックドベッドリアクターを用いた研究では、油脂と低級アルコールとを反応管上部より供給し、下部から流出した反応液を一旦静置して層分離させた後、上層の脂肪酸エステル（未反応の油脂も含む）を回収する方式を採用している。

一般に、低級アルコールはリパーゼの活性を阻害するため、反応液中に占める低級アルコールの割合は厳密に制御されなければならない。また、低級アルコールの油脂に対する溶解度は非常に低いため、油脂中にアルコールの液滴が生じないように均一な状態を保つ必要がある（非特許文献６）。反応液をヘキサンなど疎水性有機溶媒に溶解させてアルコールの阻害を緩和させる方法もあるが、生産物の回収が困難となり、生産プロセスが複雑となる。

脂肪酸エステルの生成過程で副生するグリセリンは、一定量蓄積すると酵素の周囲に層を形成する。グリセリンから成るこの層は親水性であるため、未反応油脂と酵素との接触効率に多大な影響を及ぼす。さらには、反応過程で残存する低級アルコールの一部がグリセリン層に拡散し、酵素近傍のアルコール濃度を局所的に増加させる結果、酵素活性の低下が引き起こされる（非特許文献４）。従来、透析やイソプロパノールなどの有機溶媒の使用によってグリセリンを除去する試みが報告されているが（非特許文献７および８）、プロセスの工業化の観点から、より簡便なグリセリンの除去方法が望まれる。

リパーゼを用いる工業的なバイオディーゼル燃料の生産には、原料を供給しながら生産物を長期間連続的に回収する方式が望ましく、パックドベッドリアクターの使用が有利である。しかしながら、上述のように、反応管への油脂および低級アルコールの供給や、副生グリセリンの除去の効率によって、望ましい脂肪酸エステルの収率が得られない点に留意しなければならない。したがって、これらの２点を同時に考慮しつつ、連続的にバイオディーゼル燃料を生産する方法の確立が必要である。

本発明者らは、このような方法として、パックドベッドリアクターを用いて、低級アルコールの濃度を厳密に制御し、副生するグリセリンも自動的に除去可能なプロセスを開発している（特許文献３）。

しかしながら、リパーゼを油脂のエステル交換反応に用いる場合、原料中の水分濃度に留意する必要がある。油脂中の０．２重量％以上の水は、リパーゼによるエステル交換反応速度を著しく減少させる（非特許文献２および９）。トリグリセリドと脂肪酸との混合原料を用いた場合、脂肪酸のエステル化により生じた水がリパーゼによるトリグリセリドのエステル交換反応を強く阻害する（非特許文献１０）。したがって、遊離脂肪酸や水を大量に含む低コストの原料油脂からリパーゼを用いた１ステップの反応により高反応率を得ることは、水（原料中に元々存在するものおよび遊離脂肪酸のエステル化で生成するもの）による酵素に対する反応阻害が生じる限り困難である。

一方、水の存在下、リパーゼを産生する微生物を油脂および低級アルコールに反応させ、脂肪酸エステルを低コストかつ効率的に製造する方法が知られている（特許文献１）。この方法によれば、水分を多く含む低コストの原料油脂から、脂肪酸のエステル化を伴いつつバイオディーゼル燃料を得ることが可能である。しかしながら、水分を含む反応系は、非水反応系と比べて反応率（油層中の脂肪酸エステル濃度）が低く、バイオディーゼル燃料の品質に課題がある（非特許文献１１）。

国際公開第０１／０３８５５３号国際公開第００／１２７４３号国際公開第２００９／０７８２９０号

H. Fukudaら、Journal of Bioscience and Bioengineering、2001年、92巻、405-416頁 Y. Shimadaら、Journal of the American Oil Chemists' Society、1999年、76巻、789-793頁 E.Y. Parkら、Bioresource Technology、2008年、99巻、8号、3130-3135頁 Y. Watanabeら、Journal of the American Oil Chemists' Society、2000年、77巻、355-360頁 K. Nieら、Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic、2006年、43巻、142-147頁 Y. Shimadaら、Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic、2002年、17巻、133-142頁 K.B. Bakoら、Biocatalysis and Biotransformation、2002年、20巻、437-439頁 Y. Xuら、Biocatalysis and Biotransformation、2004年、22巻、45-48頁 T. Samukawaら、Journal of Bioscience and Bioengineering、2000年、90巻、180-183頁 Y. Watanabeら、Journal of the American Oil Chemists’ Society、2005年、82巻、825-831頁 S.V. Ranganathanら、Bioresource Technology、2008年、99巻、3975-3981頁

本発明は、原料油脂、遊離脂肪酸および水を含有する原料組成物から酵素法により脂肪酸エステルを連続的に生産する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、原料油脂、遊離脂肪酸および水を含有する原料組成物と低級アルコールとの混合物にリパーゼを作用させて得られる反応液を副生物のグリセリンと接触させることによって遊離脂肪酸および水の含量が減少した中間産物が得られること、およびこの中間産物と低級アルコールとの混合物にさらにリパーゼを作用させることによって、原料油脂、遊離脂肪酸および水を含有する原料組成物から効率的に高品質のバイオディーゼル燃料を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、脂肪酸エステルを連続的に生産する方法を提供し、該方法は、リパーゼが充填されている触媒反応管および該触媒反応管の下流にグリセリン分離槽を備える反応装置において、（ａ）該触媒反応管に、原料油脂、遊離脂肪酸および水を含有する原料組成物と低級アルコールとの混合物を供給する工程；（ｂ）該触媒反応管からの流出液を該グリセリン分離槽に導入してグリセリン層に接触させる工程；（ｃ）該工程（ｂ）後にオーバーフローする上層を回収し、低級アルコールと混合する工程；および（ｄ）該工程（ｃ）で得られた混合物を該触媒反応管に供給し、該工程（ｂ）〜（ｃ）を繰り返す工程を含む。

１つの実施態様では、上記工程（ａ）における上記低級アルコールの量は、上記原料油脂に対して０．５〜１．０モル当量である。

１つの実施態様では、上記工程（ａ）における上記遊離脂肪酸の量は、上記原料油脂に対して２〜４０質量％である。

１つの実施態様では、上記工程（ａ）における上記水の量は、上記原料油脂に対して０．２〜２０質量％である。

本発明の方法によれば、原料油脂、遊離脂肪酸および水を含有する原料組成物から酵素法により脂肪酸エステルを連続的に生産する方法を提供することができる。

本発明の酵素充填カラム（パックドベッドリアクター）の構成を示す模式図である。酵素充填カラム（パックドベッドリアクター）のグリセリン分離槽（Ａ：下層通過なし；Ｂ：下層通過あり）における脂肪酸エステルとグリセリンとの分離の様子を示す模式図である。油層中の脂肪酸メチルエステル濃度（含有率）およびオレイン酸濃度（含有率）の経時変化を示すグラフである。本発明の酵素充填カラム（パックドベッドリアクター）の段数と分離液中のメチルエステル濃度（含有率）との関係を示すグラフである。本発明の酵素充填カラム（パックドベッドリアクター）の段数と分離液中の水分濃度（含有率）との関係を示すグラフである。本発明の酵素充填カラム（パックドベッドリアクター）の段数とメチルエステル濃度（含有率）および水分濃度（含有率）との関係を示すグラフである。

（リパーゼ）
本発明において、リパーゼとは、グリセリド（アシルグリセロールともいう）に作用して、該グリセリドをグリセリンまたは部分グリセリドと脂肪酸とに分解する能力を有し、かつ直鎖低級アルコールの存在下ではエステル交換により脂肪酸エステルを生成する能力を有する酵素を意味する。

本発明に用いるリパーゼは、１，３−特異的であっても、非特異的であってもよい。脂肪酸の直鎖低級アルコールエステルの生産の面からは、非特異的である方が好ましい。リパーゼとしては、例えば、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）、ムコール属、アスペルギルス属、リゾプス属、ペニシリウム属などに属する糸状菌に由来するリパーゼ；キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ，Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ，Ｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）などに属する酵母に由来するリパーゼ；シュードモナス属、セラチア属などに属する細菌に由来するリパーゼ；および、豚膵臓などの動物に由来するリパーゼが挙げられる。市販のリパーゼも用いられる。例えば、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ由来のリパーゼ（リポザイムＩＭ６０：ノボノルディスク社製）、Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼ（ノボザイム４３５：ノボザイム社製）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓｄｅｌｅｍａｒ由来のリパーゼ（タリパーゼ：田辺製薬株式会社製）、Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ（リパーゼＯＦ：名糖産業株式会社製）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のリパーゼ（リパーゼＰＳ、リパーゼＡＫ：天野製薬株式会社製）が挙げられる。

本発明において、固定化リパーゼとは任意の担体に固定化されたリパーゼをいう。樹脂などの一般的な担体に固定化された固定化酵素であってもよく、あるいはリパーゼを産生かつ保持する細胞であってもよい。また、後述するように、細胞がさらに任意の担体に固定化されていてもよい。また、各触媒反応管で異なる種類の固定化リパーゼを使用することも有効である。

担体に固定化されるリパーゼは、一般的には、天然物または組換え体から単離または抽出された精製酵素または粗精製酵素が用いられる。精製酵素または粗精製酵素が固定化される担体としては、通常、酵素の固定化に用いられる担体が挙げられる。例えば、種々のイオン交換樹脂などの有機高分子化合物、セラミックなどの無機多孔質などが挙げられる。固定化には、例えば、担体結合法、架橋法および包括法などの当業者が通常用いる方法が適用できる。担体結合法には、イオン交換性の樹脂に吸着させる化学的吸着法あるいは物理的吸着法が含まれる。

本発明において、リパーゼを産生かつ保持する細胞は、細菌、真菌、植物細胞などであり、特に限定されない。好適には、酵母および糸状菌が使用される。種々のリパーゼ遺伝子が導入された組換え体も用いられ得る。

本発明で用いられるリパーゼ産生細胞は、担体に固定化されていてもよい。本発明に用い得る担体の材質としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォーム、セルロース多孔質体などの発泡体あるいは樹脂が好ましい。増殖および活性が低下した細胞あるいは死滅した細胞の脱落などを考慮すると、多孔質の担体が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは細胞によっても異なるが、細胞が十分に入り込めて、増殖できる大きさが適当である。５０μｍ〜１０００μｍが好適であるが、これに限定されない。また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率などを考慮すると、球状あるいは立方体状であり、大きさは、球状の場合、直径が１ｍｍ〜５０ｍｍ、立方体状の場合、２ｍｍ〜５０ｍｍ角が好ましい。

（原料組成物）
本発明において、原料組成物とは、原料油脂に由来する組成物であり、少なくとも油脂成分を含有する組成物をいう。原料油脂と他の成分とを混合および／または反応させて得られる組成物であってもよく、原料油脂から特定の成分を分離して得られる組成物であってもよい。遊離脂肪酸および水を含有していてもよい。

（原料油脂）
原料油脂としては、特に限定されず、例えば、植物油脂、動物油脂、魚油、微生物が産生する油脂、これらの混合油脂、あるいはこれらの廃油が挙げられる。植物油脂としては、特に限定されず、例えば、大豆油、菜種油、パーム油、オリーブ油が挙げられる。動物油脂としては、特に限定されず、例えば、牛脂、豚脂、鯨油、羊脂が挙げられる。魚油としては、特に限定されず、例えば、イワシ油、マグロ油、イカ油が挙げられる。微生物が産生する油脂としては、特に限定されず、例えば、モルティエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）やシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）によって産生される油脂が挙げられる。廃油とは、使用済みの植物および動物油脂をいい、例えば、天ぷら廃油などを意味する。廃油は、高温にさらされているので、水素化され、酸化され、あるいは過酸化された油を含んでいるが、これらも原料となり得る。

（遊離脂肪酸）
遊離脂肪酸としては、特に限定されず、例えば、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸が挙げられる。原料組成物中の遊離脂肪酸としては、元々存在するもの、添加されるものが挙げられる。

（水）
原料組成物中の水としては、元々存在するもの、遊離脂肪酸のエステル化で生成するものが挙げられる。水はリパーゼのエステル交換反応を阻害することが知られている。

（低級アルコール）
本発明において、低級アルコールとは、炭素数１〜８のアルコールを意味する。直鎖低級アルコールが好ましく、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびｎ−ブタノールが特に好ましい。

（反応装置）
本発明において、反応装置とは、ステンレスパイプなどの管に固定化リパーゼあるいはリパーゼ産生細胞を充填した触媒反応管が連結された装置を意味する。図１に、本発明の代表的な反応装置の実施態様の構成を、該反応装置がパックドベッドリアクターである場合を例に挙げて模式的に示すが、これに限定されない。この代表的な反応装置は、触媒反応管１０、グリセリン分離槽４０および原料タンク３０を含む。

図１の触媒反応管１０の長さは、反応効率に応じて適宜決定し得る。触媒反応管１０の長さは１〜２ｍ、内径は１〜５ｃｍが好適であるが、これに限定されない。触媒反応管１０は、油脂の粘性、ならびに原料および生産物による劣化を考慮した材質のものが好ましい。このような材質として、ステンレスなどが挙げられる。

この触媒反応管１０には、上記のリパーゼが充填されており、公知の任意の手段によって固定されている。

触媒反応管１０は、例えばチューブによって連結されている。チューブは、原料タンク３０と触媒反応管１０の上部とを連結し、触媒反応管１０の下部から流出液を流出させるように触媒反応管１０を連結する。チューブもまた、油脂の粘性ならびに原料および生産物による劣化を考慮した材質のものが好ましい。例えば、シリコーンチューブ、テフロン（登録商標）チューブがより好ましく用いられる。

原料タンク３０には、原料油脂または原料組成物と低級アルコールとが供給され、混合される。あるいは原料タンク３０では、原料油脂と低級アルコールとの混合物にリパーゼが添加および混合され、バッチ式エステル交換反応が行われる。原料タンク３０には、これらの供給口および混合手段が備えられる。

本実施態様において、圧力計２０が、触媒反応管１０内の圧力を測定する目的で設けられる。１ＭＰａまでの圧力を表示し得るものが好ましい。

本実施態様において、ポンプ５０が、原料油脂または原料組成物と低級アルコールとを触媒反応管１０へ供給するために備えられる。触媒反応管１０内の圧力損失を考慮すると、０．４〜１．０ＭＰａ程度の最高吐出圧力を有する定量ポンプが好適である。

グリセリン分離槽４０は、触媒反応管１０の下部に備えられる。グリセリン分離槽４０の構造としては、特に限定されないが、好ましくは、図２に示すように、触媒反応管１０からの流出液（脂肪酸エステル、未反応油脂、未反応遊離脂肪酸、水およびグリセリンを含む）を一定時間滞留させるための空間（例えば、サイトグラス４１内の一定の空間）を有し、流出液がグリセリン層Ｌ３に接触するように構成される（Ｂ）。グリセリン分離槽４０中に流出液を滞留させることによって、流出液中に含まれる比重の大きいグリセリンが沈降し、脂肪酸エステルおよび未反応油脂を含む上層Ｌ１とグリセリンを含む下層Ｌ３とが層分離する。流出液が下層Ｌ３に接触することによって、流出液中の大部分の水がグリセリンを含む下層Ｌ３に移行する。流出液中にわずかに残存する未反応遊離脂肪酸は、上層Ｌ１に滞留する。上層Ｌ１はオーバーフローして、分離液として得られ、下層Ｌ３は、一定時間が経過すると電磁弁４２の開閉に応じて下方へ放出され、受器にて回収される。遊離脂肪酸のエステル化反応速度は原料油脂のエステル交換反応速度よりも圧倒的に大きいため、ほとんどの遊離脂肪酸は触媒反応管１０内でエステル交換され、この際に副生する多量の水は下層Ｌ３にて除去される。

触媒反応管１０および原料タンク３０の周囲には、さらに、恒温水循環装置が備えられることが好ましい。恒温水循環装置としては、反応装置、特に触媒反応管１０の温度を、酵素反応がより好適に実施される２５℃〜４５℃に維持し得るものが好ましい。あるいは、反応装置全体と触媒反応管１０とを恒温室に設置してもよい。

（脂肪酸エステルの生産方法）
本発明の脂肪酸エステルを連続的に生産する方法は、リパーゼが充填されている触媒反応管および該触媒反応管の下流にグリセリン分離槽を備える反応装置において、（ａ）該触媒反応管に、原料油脂、遊離脂肪酸および水を含有する原料組成物と低級アルコールとの混合物を供給する工程；（ｂ）該触媒反応管からの流出液を該グリセリン分離槽に導入してグリセリン層に接触させる工程；（ｃ）該工程（ｂ）後にオーバーフローする上層を回収し、低級アルコールと混合する工程；および（ｄ）該工程（ｃ）で得られた混合物を該触媒反応管に供給し、該工程（ｂ）〜（ｃ）を繰り返す工程を含む。

本発明では、リパーゼが充填されている触媒反応管を備える反応装置として、例えば、図１に示すような反応装置を用いて、連続的に脂肪酸エステルを生産することができる。

本発明では、原料組成物と低級アルコールとの混合物にリパーゼを反応させて中間産物を得、この中間産物と低級アルコールとを混合して触媒反応管に供給する。このため、触媒反応管に供給する原料組成物に遊離脂肪酸や水が混入していてもリパーゼを阻害することなく、連続的に脂肪酸エステルを生産することができる。

本発明では、原料組成物と低級アルコールとの混合物にリパーゼを反応させて中間産物を得るために、例えば、混合物を触媒反応管の上部に通液し、触媒反応管からの流出液を下流のグリセリン分離槽に導入して、グリセリン層に接触させる。このため、グリセリン分離槽からオーバーフローして得られる分離液は、遊離脂肪酸および水をほとんど含有しない。

この分離液と低級アルコールとを混合して再度触媒反応管１０に供給する。これらの工程は、本発明の工程（ｂ）〜（ｄ）と同様である。これらの工程を繰り返すことによって、分離液中の脂肪酸エステルの濃度を上げることができる。繰り返しサイクルの数としては、特に限定されないが、好ましくは３〜６回程度である。

リパーゼにより触媒される油脂と低級アルコールとのエステル交換反応は、一般的には５℃〜８０℃、好ましくは１５℃〜５０℃、より好ましくは２５℃〜４５℃で行われる。反応温度は、用いる微生物または酵素により決定すればよく、例えば、耐熱性の微生物または酵素であれば、比較的高温で反応できる。

最終的に、脂肪酸エステルは、蒸留などの当業者が通常用いる分離操作により、未反応のグリセリドおよび低級アルコールを含む分離液から分離され、回収される。こうして回収された脂肪酸エステルは、バイオディーゼル燃料として利用され得る。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。

（実施例１：原料組成物を用いた連続式エステル交換反応１）
（反応装置）
連続的エステル交換反応に用いたパックドベッドリアクターの構成を示す模式図を図１に示す。ステンレスパイプ（長さ１．５ｍ、内径１５．７ｍｍ、体積２９０．２ｍＬ）に、ノボザイム４３５を酵素充填率６０％（ｖ／ｖ）になるように充填して、触媒反応管１０を作製した。触媒反応管１０は３０℃で保温し、管の上部に圧力計２０を設置して圧力損失を確認した。

また、触媒反応管１０の下部にグリセリン分離槽４０を設置し、図２に示すように、触媒反応管１０からの流出液をグリセリン分離槽４０のサイトグラス４１内の一定の空間で滞留させると、脂肪酸エステルおよび未反応油脂は、分離槽内の下層（グリセリン層）と接触しながら上層へ移行し、オーバーフローして連続的に回収される。

（原料組成物の検討）
大豆油４．８３ｇに対してメタノール０．１７５ｇ（１モル当量）を添加して溶解した。さらに、オレイン酸を適量添加して酸価が０．１９、９．１１、１８．２または３１．２の原料組成物を調製した。これらの原料組成物に対して４％（ｗ／ｗ）の固定化酵素ノボザイム４３５（ノボザイム社製）を添加および混合し、バッチ式にて３０℃で酵素反応を行った。反応液中の脂肪酸メチルエステル濃度（含有率）を分析した。

脂肪酸メチルエステル濃度（含有率）（質量％）は、トリカプリリンを内部標準とするガスクロマトグラフィー分析によって決定した。分析条件は以下の通りである：
カラム：ＺＢ−５ＨＴ（フェノメネクス社製、内径０．２５ｍｍ、長さ１５ｍ）
カラム温度：
初期：１３０℃、２分
昇温：３５０℃、１０℃／分
３８０℃、７℃／分
最終温度：３８０℃、１０分
インジェクター温度：３２０℃
ディテクター温度：３８０℃
キャリアガス：ヘリウムガス（１．７６ｍＬ／分）
スプリット比：１／５０。

反応液中の脂肪酸メチルエステル濃度（含有率）の経時変化を図３に示す。図３から明らかなように、オレイン酸の添加量が少ないと、脂肪酸メチルエステル濃度が増加した。また、高い酸価（１８．２および３１．２ｍｇ−ＫＯＨ／ｇ−ｏｉｌ）の原料組成物から得られる脂肪酸メチルエステル濃度は、低い酸価（０．１９ｍｇ−ＫＯＨ／ｇ−ｏｉｌ）の原料組成物から得られる脂肪酸メチルエステル濃度よりも低かった。いずれの場合も８時間の反応でオレイン酸の含有量は極めて低い値を示したにもかかわらず、最終的に得られる脂肪酸メチルエステル含有量は原料組成の酸価によって大きく異なった。これは、オレイン酸のエステル化により生じた水が原料油脂の主成分であるトリグリセリドのエステル交換反応を阻害したためと考えられる（非特許文献１０）。

（連続式エステル交換反応）
原料タンク３０内で、原料油脂の廃食用油１ｋｇ（初期酸価：４ｍｇ−ＫＯＨ／ｇ−ｏｉｌ）に、油脂に対して０．５モル当量のメタノールを添加して溶解した。さらに、オレイン酸を適量添加して酸価が４３．１または７６．７の原料組成物を調製した。この原料組成物を定量ポンプ５０により触媒反応管１０の上部に連続的に通液した。なお、触媒反応管１０における体積流量を６００ｍＬ／ｈに設定した。オーバーフローした分離液の２００μＬを採取し、脂肪酸メチルエステル濃度（含有率）および水分濃度を分析した。水分濃度は、カールフィッシャー水分計（平沼産業株式会社製）を用いて測定した。

分離液にさらに０．５モル当量のメタノールを添加した組成物を、触媒反応管１０の上部に通液する操作を脂肪酸メチルエステル濃度が規定値に達するまで繰り返した。

各段の分離液中の脂肪酸メチルエステル濃度を図４に示す。図４から明らかなように、段数を増加するにつれて分離液中のメチルエステル濃度が上昇し、いずれの酸価の原料組成物においても、１０段目で９０質量％以上のメチルエステル濃度を得ることができた。

酸価４３．１の原料組成物を定量ポンプ５０により触媒反応管１０の上部に連続的に通液した。触媒反応管からの流出液をグリセリン分離槽内の下層（グリセリン層）と接触させながら上層へオーバーフローさせた。または、触媒反応管からの流出液をグリセリン分離槽内の下層（グリセリン層）と接触させず、一定時間の滞留後にオーバーフローさせた。

各段の分離液中の水分濃度を図５に示す。図５から明らかなように、触媒反応管からの流出液をグリセリン分離槽内の下層（グリセリン層）と接触させながら上層へオーバーフローさせた場合は、いずれの段数においても分離液中の水分濃度は０．１５質量％を下回った。一方、触媒反応管からの流出液をグリセリン分離槽内の下層（グリセリン層）と接触させず、一定時間の滞留後にオーバーフローさせた場合は、１および４段目の分離液中の水分濃度は０．４４質量％を示した。８段目において若干の水分濃度の低下（０．２２質量％）が観察されたのは、触媒反応管内部で発生したグリセリンにより水が抽出されたためと考えられる。以上の結果より、グリセリン分離槽を設置した本システムを用いて、脂肪酸のエステル化で生じた水を除去しながら最終的に高い脂肪酸メチルエステル濃度が得られることがかわった。

（実施例２：原料組成物を用いた連続式エステル交換反応２）
（反応装置）
Fusarium heterosporum由来のリパーゼ遺伝子を発現するように形質転換された組換えコウジカビ（Aspergillus oryzae）を６ｍｍ立方体のポリウレタンスポンジに固定化し（S. Hamaら、Applied Microbiology and Biotechnology、2008年、81巻、637-645頁）、これをステンレスパイプ（長さ３００ｍｍ、内径１５ｍｍ）に１０００個充填して、触媒反応管１０を作製した。

原料タンク３０内で、原料油脂の白絞油に種々の量の水を添加して撹拌後、超音波処理を施すことによって油／水懸濁液を得た。次いで、この懸濁液に対して１モル当量のメタノールを添加および混合し、この混合物を定量ポンプ５０により触媒反応管１０の上部に連続的に通液した。なお、触媒反応管１０における滞留時間が１４０分となるように設定した。オーバーフローした分離液の脂肪酸メチルエステル濃度（含有率）および水分濃度を分析した。結果を表１に示す。

表１から明らかなように、油脂に対して１モル当量のメタノールを添加した場合、２６〜２８質量％程度の脂肪酸メチルエステル濃度が得られた。いずれの水分濃度でも比較的高い脂肪酸メチルエステル濃度を得ることができた。また、原料に多量の水を添加したにもかかわらず、分離液中の水分濃度は０．３４〜０．４０質量％と極めて低かった。このように、水分を多量に含む原料であっても、水分濃度が著しく減少した分離液が得られることが分かった。

この分離液にメタノールを添加して２〜６段目の触媒反応管に順次、通液したところ、段数に応じて分離液中の脂肪酸メチルエステル濃度が増加した。また、各段の分離液中の水分濃度は０．２質量％以下の低い水準を維持できた。さらに、５段目から生じた分離液にメタノールを添加して触媒反応管に通液したところ、エステル交換反応を阻害することなく反応させることもできた。

１０触媒反応管
２０圧力計
３０原料タンク
４０グリセリン分離槽
４１サイトグラス
４２電磁弁
５０ポンプ
Ｌ１脂肪酸エステル、未反応油脂、未反応遊離脂肪酸および水を含む上層（Ａ）、脂肪酸エステル、未反応油脂および未反応遊離脂肪酸を含む上層（Ｂ）
Ｌ２グリセリンの液滴
Ｌ３グリセリンを含む下層（Ａ）、グリセリンおよび水を含む下層（Ｂ）

Claims

脂肪酸エステルを連続的に生産する方法であって、
リパーゼが充填されている触媒反応管および該触媒反応管の下流にグリセリン分離槽を備える反応装置において、
（ａ）該触媒反応管に、原料油脂、遊離脂肪酸および水を含有する原料組成物と低級アルコールとの混合物を供給する工程；
（ｂ）該触媒反応管からの流出液を該グリセリン分離槽に導入してグリセリン層に接触させる工程；
（ｃ）該工程（ｂ）後にオーバーフローする上層を回収し、低級アルコールと混合する工程；および
（ｄ）該工程（ｃ）で得られた混合物を該触媒反応管に供給し、該工程（ｂ）〜（ｃ）を繰り返す工程
を含む、方法。
前記工程（ａ）における前記低級アルコールの量が、前記原料油脂に対して０．５〜１．０モル当量である、請求項１に記載の方法。
前記工程（ａ）における前記遊離脂肪酸の量が、前記原料油脂に対して２〜４０質量％である、請求項１または２に記載の方法。
前記工程（ａ）における前記水の量が、前記原料油脂に対して０．２〜２０質量％である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。