JP2013146244A - Method for classifying genotype of pseudomonas aeruginosa, and primer set used for the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、緑膿菌の遺伝子型別分類法（菌株特定法）およびこれに用いるプライマーセットに関する。 The present invention relates to a method for classifying Pseudomonas aeruginosa by genotype (strain identification method) and a primer set used therefor.
緑膿菌は病院で数多く分離される病原菌である。院内感染の原因菌であり感染管理が必要である。またカルバペネム、アミカシン、ニューキノロンに耐性を示すいわゆる多剤耐性化が問題となっており、感染管理の重要性が増している。
厚生労働省院内感染対策サーベイランス事業では、全国の主要な約7,600病院からの報告だけで、緑膿菌感染症は年間80,000件以上に及んでいる。
以上のことから緑膿菌は病院で非常に多く分離され、感染防止のための疫学調査が常に必要な病原菌であると考えられる。言い換えると、緑膿菌は院内感染原因菌として重要な菌である。院内感染を減少させるためには感染ルートの特定が重要である。
Pseudomonas aeruginosa is a pathogen that is isolated in many hospitals. It is a causative bacterium of nosocomial infection and needs to be managed. In addition, so-called multidrug resistance that is resistant to carbapenem, amikacin, and new quinolone has become a problem, and the importance of infection control is increasing.
The Ministry of Health, Labor and Welfare's in-hospital infection control surveillance business reports more than 80,000 Pseudomonas aeruginosa infections annually from only about 7,600 major hospitals nationwide.
Based on the above, Pseudomonas aeruginosa has been isolated in hospitals in large numbers, and is considered to be a pathogen that always requires an epidemiological survey to prevent infection. In other words, Pseudomonas aeruginosa is an important fungus that causes nosocomial infections. In order to reduce nosocomial infection, it is important to identify the infection route.
院内感染が疑われる場合には、感染ルートを特定するために、異なる患者から分離された菌株が同一か否かを判定する必要がある。そのために菌株が保有するゲノムの特徴を検出し菌株を特定するが、これを遺伝子型別分類という。
菌の遺伝子型別分類の方法としては、従来、パルスフィールドゲル電気泳動法（以下、PFGEという。）が多用されている。PFGEは菌のゲノムDNAを制限酵素で切断し、その断片の電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、識別能力が高く、再現性があることから遺伝子型別分類の定法とされている。
When nosocomial infection is suspected, it is necessary to determine whether the strains isolated from different patients are identical in order to identify the infection route. Therefore, the characteristics of the genome possessed by the strain are detected to identify the strain, which is called genotyping classification.
Conventionally, pulse field gel electrophoresis (hereinafter referred to as PFGE) has been frequently used as a method for classifying bacteria by genotype. PFGE is a method that cleaves bacterial genomic DNA with restriction enzymes and determines the genotype of the strain as an electrophoretic pattern of its fragments. It is a standard method for classification by genotype because of its high discrimination ability and reproducibility. Yes.
しかし、PFGEは結果が出るまでに早くても菌株分離同定後３日程度と時間がかかり、検査結果が出たときにはすでに感染拡大が終了していることが多い。また複雑なバンドパターンにより判定する必要があることに加え、緑膿菌のPFGEパターンは変化しやすく同一集団感染由来株であってもバンドパターンが変化していることも多く、主観的な要素が入りがちである。そのため同時に泳動した菌株でさえも遺伝子型が同一か否かを判断するには精通した技術者が必要である。したがって、時間的あるいは距離的に隔たりのある（異なる時または別の場所で行った）PFGE解析結果間での遺伝子型の比較は実質上不可能であった。
さらに、PFGEは作業が煩雑で作業者の熟練を要するうえ、パルスフィールドゲル電気泳動装置などの特殊な装置を必要とし、コストが高い。したがって、より簡便かつ迅速に、幅広く緑膿菌を遺伝子型別分類することができる方法の開発が依然として強く望まれている。
However, PFGE takes about 3 days after the identification and identification of the strain at the earliest before results are obtained, and when the test results are obtained, the spread of infection is often already completed. In addition to the need to make a judgment based on a complex band pattern, the PFGE pattern of Pseudomonas aeruginosa is easy to change. Tend to enter. Therefore, a skilled engineer is required to judge whether the genotypes are the same even in strains that migrate simultaneously. Therefore, it was virtually impossible to compare genotypes between PFGE results that were separated in time or distance (performed at different times or elsewhere).
Furthermore, PFGE is cumbersome and requires skilled workers, and requires special equipment such as a pulse field gel electrophoresis apparatus, which is expensive. Therefore, development of a method capable of classifying Pseudomonas aeruginosa by genotype more easily and quickly is still strongly desired.
他方、特許文献１には、黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが記載されている。 On the other hand, Patent Document 1 describes a method for classifying S. aureus by genotype and a primer set used therefor.
本発明は、上記実情に鑑みて、迅速に遺伝子型別分類する手法を開発し、より実際の産業（医療現場）利用に適した緑膿菌の遺伝子型別分類法を提供することを目的としている。また本発明は、さらに上記遺伝子型別分類法に用いるプライマーセットを提供することをもその目的としている。 In view of the above circumstances, the present invention aims to develop a method for quickly classifying by genotype and to provide a method for classifying Pseudomonas aeruginosa suitable for actual industrial (medical field) use. Yes. Another object of the present invention is to provide a primer set for use in the above genotyping method.
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、緑膿菌のゲノム上の、（１）genomic isletを構成するORF、（２）ファージ由来遺伝子のORFを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うことにより、より有効に緑膿菌の遺伝子型別分類を行うことができることを見出した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has arbitrarily determined whether (1) an ORF constituting a genomic islet and (2) an ORF constituting an ORF of a phage-derived gene on the genome of Pseudomonas aeruginosa. In this order, it was found that the classification of Pseudomonas aeruginosa by genotype can be performed more effectively by classification according to the combination of the presence or absence of these ORFs.
即ち、本発明によれば、緑膿菌のゲノム上の、
（１）genomic isletを構成するオープンリーディングフレーム（ORF）、および
（２）ファージ由来遺伝子のORF、
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、緑膿菌の遺伝子型別分類法が提供される。
That is, according to the present invention, on the genome of Pseudomonas aeruginosa,
(1) Open reading frame (ORF) constituting genomic islet, and (2) ORF of phage-derived gene,
There is provided a method for classification of Pseudomonas aeruginosa by genotype, which comprises the steps of detecting the presence or absence of these in any order and classifying them according to the combination of the presence or absence of ORFs.
本発明の緑膿菌の遺伝子型別分類法においては、前記（１）のgenomic isletを構成するORFが、PSPA7_0045、PA2794 、PA14_20600 、PA1509、PA2119 、PA3065、PA4549、PA5264、PA1380 、PA14_10960からなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも５種、特に好ましくは全ての１０種）の遺伝子であり、前記（２）のファージ由来遺伝子におけるＯＲＦがPSPA7_0104、PLES_26051、PSPA7_5342、PSPA7_2363、phage D3 p35からなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも２種、特に好ましくは全ての５種）の遺伝子であることが好ましい。 In the classification method according to the genotype of Pseudomonas aeruginosa of the present invention, the ORF constituting the genomic islet of (1) is a group consisting of PSPA7_0045, PA2794, PA14_20600, PA1509, PA2119, PA3065, PA4549, PA5264, PA1380, PA14_10960. From at least one (more preferably at least 5, particularly preferably all 10) genes selected from the above, the ORF in the phage-derived gene of (2) above is from PSPA7_0104, PLES_26051, PSPA7_5342, PSPA7_2363, and phage D3 p35 It is preferable that the gene is at least one gene selected from the group consisting of (more preferably at least 2, particularly preferably all 5 genes).
また、本発明の遺伝子型別分類法は、配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーを用いて、PCR（polymerase chain reaction）法により前記（１）のORFの検出を行い、配列表の配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０に示された５組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる５組のプライマーを用いて、PCR法により前記（２）のORFの検出を行うことによって実施することができる。 In addition, the classification method according to the genotype of the present invention includes SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 17 and 18 , SEQ ID NOs: 19 and 20, SEQ ID NOs: 21 and 22, SEQ ID NOs: 23 and 24, and combinations of 10 base sequences shown in SEQ ID NOs: 25 and 26 (provided that the base sequence is an addition of 2 or less bases) The ORF of (1) above was detected by PCR (polymerase chain reaction) method using 10 sets of primers consisting of (which may have substitution, deletion and / or insertion) Nos. 11 and 12, SEQ ID Nos. 13 and 14, SEQ ID Nos. 15 and 16, SEQ ID Nos. 27 and 28, and combinations of 5 base sequences shown in SEQ ID Nos. 29 and 30 (provided that the base sequence is 2 bases or less) With base additions, substitutions, deletions and / or insertions And the detection of the ORF of (2) above by PCR method.
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。 As described above, the primer may have addition, substitution, deletion and / or insertion of 2 or less bases. From the viewpoint of classifying by genotype with high accuracy, the primer contains bases. Preferably there are no additions, substitutions, deletions and / or insertions.
前記PCR法としてマルチプレックスPCR法を採用すると、遺伝子型別分類のコストを抑えることができる。 When a multiplex PCR method is employed as the PCR method, the cost of genotyping can be reduced.
前記（１）〜（２）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化すると、検出結果が見やすくなる。
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化することで、結果の桁数が少なくなり、結果がより見やすくなる。
If the detection results of the presence / absence of ORFs in (1) to (2) are replaced with 1 (yes) and 0 (no), respectively, and binary coding is performed, the detection results are easy to see.
By further converting the result of the binary encoding into a decimal encoding, the number of digits of the result is reduced, and the result becomes easier to see.
さらに本発明によれば、配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーと、配列表の配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０に示された５組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる５組のプライマーとを含む、緑膿菌の遺伝子型別分類用プライマーセットが提供される。 Furthermore, according to the present invention, SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 17 and 18, SEQ ID NO: 19 and 20, combinations of 10 base sequences shown in SEQ ID NOs: 21 and 22, SEQ ID NOs: 23 and 24, and SEQ ID NOs: 25 and 26 (provided that the above base sequences are additions, substitutions and deletions of bases of 2 bases or less) And / or may have an insertion) and SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 16, SEQ ID NO: 27 and 28, SEQ ID NO: 29 And 5 sets of base sequences shown in 30 (provided that the base sequence may have addition, substitution, deletion and / or insertion of 2 or less bases) Including a primer for classification of Pseudomonas aeruginosa by genotype Ma set is provided.
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。 As described above, the primer may have addition, substitution, deletion and / or insertion of 2 or less bases. From the viewpoint of classifying by genotype with high accuracy, the primer contains bases. Preferably there are no additions, substitutions, deletions and / or insertions.
本発明によれば、緑膿菌の遺伝子型別分類を、特殊な装置や作業者の熟練を要さずに簡便に、迅速、客観的かつ高感度に行うことができるため、緑膿菌の院内感染の経路を速やかに決定し、院内感染の広がりを防止することができる。 According to the present invention, the classification of Pseudomonas aeruginosa by genotype can be performed simply, quickly, objectively and with high sensitivity without requiring specialized equipment or operator skill. It is possible to quickly determine the route of nosocomial infection and prevent the spread of nosocomial infection.
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明に係る緑膿菌の遺伝子型別分類法は、緑膿菌のゲノム上の、（１）genomic isletを構成するオープンリーディングフレーム（ORF）（２）ファージ由来遺伝子を構成するORFの保有の有無を任意の順で検出し、これら２種類の由来の異なるORFの保有の有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを有することを特徴としている。以下、これらのＯＲＦについて説明する。
Hereinafter, the present invention will be specifically described.
The classification method of Pseudomonas aeruginosa according to the present invention includes (1) an open reading frame (ORF) constituting a genomic islet on the genome of Pseudomonas aeruginosa (2) possessing an ORF constituting a phage-derived gene. It has a step of detecting the presence or absence in an arbitrary order and classifying by genotype according to the combination of the presence or absence of different ORFs derived from these two types. Hereinafter, these ORFs will be described.
［（１）genomic isletを構成するＯＲＦ］
（日本で分離される緑膿菌の遺伝的特徴）
緑膿菌の遺伝的バックグラウンドを系統的に分類する方法として、multilocus sequence typing（MLST）解析が利用されている。
[(1) ORF that composes genomic islet]
(Genetic characteristics of Pseudomonas aeruginosa isolated in Japan)
As a method for systematically classifying the genetic background of Pseudomonas aeruginosa, multilocus sequence typing (MLST) analysis is used.
MLST解析では7カ所のハウスキーピング遺伝子の塩基配列を決定し、sequence type(ST)を決定する。また近縁なSTを集めたclonal complex (CC)とすることで、遺伝的バックグラウンドが同一の株をまとめることが可能であり、疫学調査には欠かせない。なお、CCを推定するにはgenomic isletの保有パターンを検出することが有効であることが黄色ブドウ球菌では示されていたが、緑膿菌でも同様の手法が有効であるかどうかはこれまでの所不明であった。 In MLST analysis, base sequences of seven housekeeping genes are determined, and sequence type (ST) is determined. In addition, it is indispensable for epidemiological studies because it is possible to collect strains with the same genetic background by using a clonal complex (CC) that gathers closely related STs. In addition, S. aureus showed that it is effective to detect the possession pattern of genomic islet to estimate CC, but whether the same method is effective for Pseudomonas aeruginosa It was unknown.
緑膿菌にはさまざまな遺伝的バックグラウンドを持つものが存在する。実際の野生株における遺伝的バックグラウンドの調査結果（種々のＯＲＦの検出結果を含む）は文献として個々の研究施設における断片的な情報として利用できるが、最低限のＯＲＦの検出によって緑膿菌を分類できる遺伝子型別分類法を開発するには十分でない。 Pseudomonas aeruginosa has a variety of genetic backgrounds. The genetic background survey results (including the detection results of various ORFs) in actual wild strains can be used as fragmentary information in individual research facilities as literature. It is not enough to develop a classification method by genotype that can be classified.
そこで本発明者は、日本で分離される緑膿菌を収集しMLST解析を行い、それらの遺伝的バックグラウンドの調査を行った。その結果、日本で分離される緑膿菌には多様なCCに分類される株が存在することが判明し、緑膿菌を遺伝子型別分類するにはCCを識別できる程度の菌株識別能を実現する必要がある。 Therefore, the present inventors collected Pseudomonas aeruginosa isolated in Japan, conducted MLST analysis, and investigated their genetic background. As a result, it was found that Pseudomonas aeruginosa isolated in Japan has strains classified into various CCs. It needs to be realized.
（genomic isletを構成するＯＲＦ）
前記のCC型を区別するためには、緑膿菌においてもgenomic isletを構成するＯＲＦを検出することが有用であることがわかった（下記表１参照）。genomic isletとは、細菌のゲノム同士を比較した場合に、５ｋｂｐ程度、またはそれ以下の大きさで配列が異なる部分を言い、これはゲノム全体に散在しており、個体の生存確率に影響せず、進化の過程で取り残されたものと考えられる。
(ORF that composes genomic islet)
In order to distinguish the CC type, it was found that it is useful to detect ORFs constituting a genomic islet even in Pseudomonas aeruginosa (see Table 1 below). Genomic islet refers to the part where the sequence differs by about 5 kbp or less when comparing bacterial genomes, which are scattered throughout the genome and do not affect the survival probability of the individual. It is thought that it was left behind in the process of evolution.
表１からわかるように、緑膿菌のPAO1株(GenBank Accession Number AE004091)の遺伝子PA2794、PA1509、PA2119、PA3065、PA4549、PA5264、PA1380、UCBPP-PA14株(GenBank Accession Number CP000438)の遺伝子PA14_20600、PA14_10960、PA7株(GenBank Accession Number CP000744)の遺伝子PSPA7_0045を検出することで前記のCC型を区別可能であった。 As can be seen from Table 1, genes PA2794, PA1509, PA2119, PA3065, PA4549, PA5264, PA1380, UCBPP-PA14 (GenBank Accession Number CP000438) of PAO1 strain (GenBank Accession Number AE004091) of Pseudomonas aeruginosa PA14_10960, PA14_10960 By detecting the gene PSPA7_0045 of the PA7 strain (GenBank Accession Number CP000744), the CC type was distinguishable.
なお、たとえば前記PA2794は、GenBankにおいて公開されているPAO1株の2794番目の遺伝子である、ということを意味するが、この遺伝子はPAO1株のみにしか存在しないわけではなく、例えばPA14_27990など、それから派生した菌株や、それとは異なる系統の緑膿菌においても存在する可能性がある。 For example, the above-mentioned PA2794 means that it is the 2794th gene of the PAO1 strain published in GenBank, but this gene does not exist only in the PAO1 strain, for example, PA14_27990 is derived from it. May exist in Pseudomonas aeruginosa and other strains of Pseudomonas aeruginosa.
なお、遺伝子PSPA7_0045は、配列表の配列番号１（フォワード）および２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子PA2794は、配列表の配列番号３（リバース）および４（フォワード）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子PA14_20600は、配列表の配列番号５（フォワード）および６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子PA1509は、配列表の配列番号７（フォワード）および８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子PA2119は、配列表の配列番号９（フォワード）および１０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
The gene PSPA7_0045 can be detected by PCR using primers of SEQ ID NOs: 1 (forward) and 2 (reverse) in the sequence listing,
Gene PA2794 can be detected by PCR using primers of SEQ ID NOs: 3 (reverse) and 4 (forward) in the sequence listing,
The gene PA14_20600 can be detected by PCR using primers of SEQ ID NOs: 5 (forward) and 6 (reverse) in the sequence listing,
The gene PA1509 can be detected by PCR using primers of SEQ ID NOs: 7 (forward) and 8 (reverse) in the sequence listing,
The gene PA2119 can be detected by PCR using the primers of SEQ ID NO: 9 (forward) and 10 (reverse) in the sequence listing.
遺伝子PA3065は、配列表の配列番号１７（フォワード）および１８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子PA4549は、配列表の配列番号１９（フォワード）および２０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子PA5264は、配列表の配列番号２１（フォワード）および２２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子PA1380は、配列表の配列番号２３（フォワード）および２４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子PA14_10960は、配列表の配列番号２５（フォワード）および２６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
上記ORFを検出することで、容易にＣＣ型の区別ができる。
The gene PA3065 can be detected by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 17 (forward) and 18 (reverse) in the sequence listing.
Gene PA4549 can be detected by PCR using primers of SEQ ID NOs: 19 (forward) and 20 (reverse) in the sequence listing.
The gene PA5264 can be detected by PCR using the primers of SEQ ID NO: 21 (forward) and 22 (reverse) in the sequence listing.
The gene PA1380 can be detected by PCR using the primers of SEQ ID NO: 23 (forward) and 24 (reverse) in the sequence listing.
The gene PA14_10960 can be detected by PCR using the primers of SEQ ID NO: 25 (forward) and 26 (reverse) in the sequence listing.
By detecting the ORF, the CC type can be easily distinguished.
［（２）ファージ由来遺伝子のORF］
近年、ゲノム解読が進み、緑膿菌ゲノムはおよそ６０００個のＯＲＦから構成されていることが明らかとなった。
[(2) ORF of phage-derived gene]
In recent years, genome decoding has progressed, and it has become clear that the Pseudomonas aeruginosa genome is composed of approximately 6000 ORFs.
前記ゲノム上に存在するファージ由来遺伝子のORFをいくつか組み合わせて検出することが、緑膿菌の菌株識別にきわめて有効であることが実験から明らかとなった。 From experiments, it has become clear that detection by combining several ORFs of phage-derived genes present on the genome is extremely effective for strain identification of Pseudomonas aeruginosa.
そこで本発明者はGenBankの緑膿菌ならびに緑膿菌関連ファージについての公開遺伝子情報を利用し、多くのファージ由来遺伝子のORFを検出するためのプライマーを設計し、多様な遺伝的バックグラウンドを持つ緑膿菌について、それらの保有するファージ由来遺伝子のORFについて検討した。 Therefore, the present inventor has designed genetic primers for detecting ORFs of many phage-derived genes using GenBank's public information on Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas aeruginosa-related phages, and has various genetic backgrounds. For Pseudomonas aeruginosa, the ORFs of the phage-derived genes they possessed were examined.
その結果、PSPA7_0104（GenBank Accession No. CP000744）、
PLES_26051（GenBank Accession No. FM209186）、
PSPA7_5342（GenBank Accession No. CP000744）、
PSPA7_2363（GenBank Accession No. CP000744）および
Phage D3 D3p35（GenBank Accession No. AF165214）を検出の対象とすると、緑膿菌の菌株を高精度で分類することができることを本発明者は見出した。
As a result, PSPA7_0104 (GenBank Accession No. CP000744),
PLES_26051 (GenBank Accession No. FM209186),
PSPA7_5342 (GenBank Accession No. CP000744),
PSPA7_2363 (GenBank Accession No. CP000744) and
The present inventor has found that when Phage D3 D3p35 (GenBank Accession No. AF165214) is a detection target, strains of Pseudomonas aeruginosa can be classified with high accuracy.
またこれらを、後述するＰＣＲおよび電気泳動を利用して検出した場合には、ＤＮＡが増幅しやすく、またエクストラバンドが現れにくい。
なお、PSPA7とは緑膿菌のPA7株の遺伝子であることを示し、PLESとはLESB58株の遺伝子であることを示し、D3とはファージD3の遺伝子であることを示す。また、PSPA7などの後に示される数字は、全ゲノムにおいて、その示された番号の遺伝子であることを示す。
In addition, when these are detected using PCR and electrophoresis described later, DNA is easily amplified and an extra band hardly appears.
PSPA7 indicates a gene of Pseudomonas aeruginosa PA7 strain, PLES indicates a gene of LESB58 strain, and D3 indicates a gene of phage D3. In addition, the numbers shown after PSPA7 and the like indicate the genes of the indicated numbers in the whole genome.
上記PSPA7_0104は、配列表の配列番号１１（リバース）および１２（フォワード）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
ＳPLES_26051は、配列表の配列番号１３（リバース）および１４（フォワード）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
PSPA7_5342は、配列表の配列番号１５（フォワード）および１６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
PSPA7_2363は、配列表の配列番号２７（フォワード）および２８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
Phage D3 D3p35は、配列表の配列番号２９（フォワード）および３０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
The PSPA7_0104 can be detected by PCR by using the primers of SEQ ID NO: 11 (reverse) and 12 (forward) in the sequence listing,
SPLES — 26051 can be detected by PCR using primers of SEQ ID NOs: 13 (reverse) and 14 (forward) in the sequence listing,
PSPA7_5342 can be detected by PCR using primers of SEQ ID NOs: 15 (forward) and 16 (reverse) in the sequence listing,
PSPA7_2363 can be detected by PCR using primers of SEQ ID NOs: 27 (forward) and 28 (reverse) in the sequence listing,
Phage D3 D3p35 can be detected by PCR using the primers of SEQ ID NO: 29 (forward) and 30 (reverse) in the sequence listing.
以上では、ＰＣＲ法によりファージ由来遺伝子のＯＲＦ（２）を検出することを主に説明してきたが、ファージ由来遺伝子のＯＲＦ（２）はその他の方法によっても検出可能であり、たとえばハイブリダイゼーションによって検出可能である。 In the above, the detection of the ORF (2) of the phage-derived gene has been mainly explained by the PCR method, but the ORF (2) of the phage-derived gene can also be detected by other methods, for example, by hybridization. Is possible.
［ORF検出手段］
上述した、緑膿菌のゲノム上の、genomic isletを構成するORF（１）およびファージ由来遺伝子のORF（２）の保有の有無の検出は、任意の順で行うことができる。具体的には、これらORFを各ORF毎に任意の順に検出してもよく、複数のORF毎に任意の順にまとめて検出してもよく、全てのORFを同時に検出してもよい。ＯＲＦを検出する手段としては、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションが挙げられる。
[ORF detection means]
The detection of the presence or absence of the ORF (1) constituting the genomic islet and the ORF (2) of the phage-derived gene on the genome of Pseudomonas aeruginosa described above can be performed in any order. Specifically, these ORFs may be detected in any order for each ORF, may be detected collectively in any order for a plurality of ORFs, or all ORFs may be detected simultaneously. Means for detecting the ORF include PCR and hybridization.
＜ＰＣＲ＞
各ORF毎に別々に検出する場合には、たとえば、検出対象のORF毎にそれぞれ対応する１組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を用いて、独立した系で、緑膿菌のDNA抽出サンプルとともに、real time PCR反応を行い、PCR増幅産物の生成シグナル蛍光をリアルタイムに検出する。
<PCR>
When detecting each ORF separately, for example, using a set of primers (forward primer and reverse primer) corresponding to each ORF to be detected in an independent system, DNA extraction sample of Pseudomonas aeruginosa At the same time, a real time PCR reaction is performed to detect the signal fluorescence of the PCR amplification product in real time.
また、複数のORF毎にまとめて検出する場合には、たとえば、緑膿菌マーカーとしてpotCを検出するプライマー（配列表の配列番号３１と３２）を加えた、複数のORFにそれぞれ対応する複数組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマーの組）を混合し、同一の反応系に入れてPCR反応を行うマルチプレックスPCRが実施可能である。この場合には、各ORFに対応するPCR増幅産物の有無は、反応系を電気泳動、たとえば、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などで泳動して得られたバンドの有無によって確認する。 Moreover, when detecting collectively for every several ORF, for example, the primer (sequence number 31 and 32 of a sequence table) which detects potC as a Pseudomonas aeruginosa marker was added, and several sets each corresponding to several ORF Multiplex PCR can be performed in which the primers (a set of forward primer and reverse primer) are mixed and placed in the same reaction system to perform a PCR reaction. In this case, the presence or absence of a PCR amplification product corresponding to each ORF is confirmed by the presence or absence of a band obtained by electrophoresis of the reaction system by electrophoresis, for example, agarose gel electrophoresis or capillary electrophoresis.
全てのORFを同時に検出する場合には、たとえばmicro arrayを応用してＯＲＦを検出する。micro arrayでは検出する各ＯＲＦとハイブリダイズするプローブをmicro arrayの各wellに作成しておき、培養菌からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをハイブリダイズさせ、未反応のＤＮＡを洗浄した後、２本鎖ＤＮＡと結合する蛍光色素でラベルし、蛍光を捉える機械で測定することで目的のＯＲＦが検出可能となる。
これらのうちでは、複数のORFを簡易な装置で効率よくまとめて検出できる点から、マルチプレックスPCRが好ましい。
When all ORFs are detected simultaneously, for example, a microarray is applied to detect the ORF. In the microarray, probes that hybridize with each ORF to be detected are prepared in each well of the microarray, DNA purified from the culture by column extraction or phenol-chloroform extraction is hybridized, and unreacted DNA is washed. After that, the target ORF can be detected by labeling with a fluorescent dye that binds to double-stranded DNA and measuring with a machine that captures fluorescence.
Among these, multiplex PCR is preferable because a plurality of ORFs can be efficiently and collectively detected with a simple apparatus.
（プライマーの設計）
上記genomic isletを構成するORF（１）およびファージ由来遺伝子のORF（２）については塩基配列が90％程度相同なORFが臨床分離株やデータベース上に見られることから、これらの相同なORFも検出できるよう変異の少ない部分にプライマーを設計することで、ほとんどの緑膿菌に汎用的に使用できるとともに突然変異の影響を受けにくいプライマーとする。
(Primer design)
For ORF (1) and phage-derived gene ORF (2) that constitute the genomic islet, ORFs with a base sequence of about 90% are found in clinical isolates and databases, so these homologous ORFs are also detected. By designing the primer in the part with few mutations as much as possible, the primer can be used universally for most Pseudomonas aeruginosa and is not easily affected by the mutation.
上記genomic isletを構成するORF（１）およびファージ由来遺伝子のORF（２）に加え、緑膿菌マーカーとしてのpotC、カルバペネム耐性遺伝子であるvimおよびimpのそれぞれに対応するプライマーの設計にあたっては、プライマー自身が折れ曲がって相補的になっている部分が結合して２重鎖を形成したり、異なるプライマー同士が、互いに相補的になっている部分において結合して２量体またはそれ以上の結合体を形成したりしないような配列にする。 In addition to the ORF (1) and the phage-derived gene ORF (2) that constitute the above genomic islet, the primer for designing potC as a Pseudomonas aeruginosa marker and vim and imp as carbapenem resistance genes should A part that is bent and complementary to each other binds to form a double strand, or a different primer binds to a part that is complementary to each other to form a dimer or higher conjugate. Arrange them so that they do not form.
さらに、マルチプレックスPCRで検出することを考慮し、プライマーのGC比をおよそ50％とし、Tm値を合わせるよう工夫することが好ましい。また、増幅効率と、電気泳動の際に短時間で分離可能なよう、PCR増幅産物サイズがおよそ50bp〜700bp、好ましくは70bp〜600bpとなるように調整することが望ましい。なお、同じ反応系で検出するＯＲＦにおいては、ＰＣＲ増幅産物のサイズが同じにならないようにプライマーを設計することはもちろんである。 Furthermore, in consideration of detection by multiplex PCR, it is preferable that the primer GC ratio is about 50% and that the Tm value is matched. Further, it is desirable to adjust the amplification efficiency so that the PCR amplification product size is about 50 bp to 700 bp, preferably 70 bp to 600 bp so that separation can be performed in a short time during electrophoresis. In addition, in ORF detected by the same reaction system, it is needless to say that primers are designed so that the sizes of PCR amplification products are not the same.
上記のような条件を設定することでマルチプレックスPCRにおいて再現性の高い増幅結果が得られるプライマーおよびプライマーセットを得ることができる。このようなプライマーの設計は、市販のソフトウェアにより行うことができる。 By setting the conditions as described above, it is possible to obtain primers and primer sets that can obtain highly reproducible amplification results in multiplex PCR. Such primer design can be performed by commercially available software.
具体的には、上記（１）〜（２）のORFの項目でそれぞれ述べたように、
（１）genomic isletを構成するORFのためのプライマーとして１０組のプライマー（配列表の配列番号１〜１０、１７〜２６）
（２）ファージ由来遺伝子のORFのためのプライマーとして５組のプライマー（配列表の配列番号１１〜１６、２７〜３０）の合計１５組のプライマーを本発明者は設計した。
Specifically, as described in the ORF items (1) to (2) above,
(1) 10 sets of primers as primers for ORF constituting the genomic islet (SEQ ID NOS: 1 to 10, 17 to 26 in the sequence listing)
(2) The present inventors designed a total of 15 sets of 5 primers (SEQ ID NOs: 11 to 16 and 27 to 30 in the sequence listing) as primers for the ORF of the phage-derived gene.
なお、上記プライマーセットを用いてマルチプレックスPCRを行う場合には、下記表３および表４にprimer mixture 1および2として示すように、８組および７組のプライマーセットに緑膿菌マーカーとしてのpotCを検出するプライマー（配列表の配列番号３１と３２）を各々に加え、primer mixture 1にvimを検出するプライマー（配列表の配列番号３３と３４）を加え、primer mixture 2にimpを検出するプライマー（配列表の配列番号３５と３６）を加えた１０組および９組のプライマーを組み合わせて混合し、二つの反応系にてＰＣＲを実施することが望ましい。 In addition, when performing multiplex PCR using the above primer sets, as shown in Tables 3 and 4 below as primer mixtures 1 and 2, potC as a Pseudomonas aeruginosa marker is added to 8 sets and 7 sets of primers. To detect primer (SEQ ID NOs: 31 and 32 in the sequence listing), add primer to primer mixture 1 (SEQ ID NO: 33 and 34 in the sequence listing), and detect imp in primer mixture 2 It is desirable to carry out PCR in two reaction systems by mixing and mixing 10 sets and 9 sets of primers to which (SEQ ID NOs: 35 and 36 in the sequence listing) are added.
なお、配列番号３１および３２で示された増幅ＯＲＦのpotCとは、polyamine transport protein PotCをコードする遺伝子であり、緑膿菌に普遍的に見出されるので、緑膿菌マーカーとして用いられる。 The potC of the amplified ORF shown in SEQ ID NOs: 31 and 32 is a gene encoding polyamine transport protein PotC, and is found universally in Pseudomonas aeruginosa and is therefore used as a Pseudomonas aeruginosa marker.
以上に示した具体的なプライマーは、標的ＯＲＦを増幅するために最適化された配列であり、これらのプライマーに２塩基程度の付加、置換、欠失及び／又は挿入といった変更があっても、プライマーとしての機能は失われず、ＰＣＲによって標的ＯＲＦを増幅することができる。付加とは、表に示されたプライマーの５’側または３’側の末端に塩基が追加されることをいい、挿入とは、前記の末端ではなく、プライマーの内側において、塩基と塩基の間に塩基が追加されることを言う。 The specific primers shown above are sequences optimized for amplifying the target ORF, and even if these primers have changes such as addition, substitution, deletion and / or insertion of about 2 bases, The function as a primer is not lost, and the target ORF can be amplified by PCR. Addition means that a base is added to the 5 'or 3' end of the primer shown in the table, and insertion means not between the above ends but between the base and the base inside the primer. Say that a base is added.
プライマーとして高い性能を発揮する観点からは、前記変更は、２塩基以下の付加、置換、欠失、挿入であることが好ましく、２塩基以下の付加または２塩基以下の５’側または３’側の末端における欠失であることがより好ましく、１塩基以下の標的ＯＲＦと相補的な塩基の付加または５’側または３’側の末端における１塩基以下の欠失であることが特に好ましい。一般的に、５’側の変更はプライマーとしての機能を失わせにくく、３’側の変更はプライマーの機能を失わせやすい傾向がある。 From the viewpoint of exerting high performance as a primer, the change is preferably addition, substitution, deletion, or insertion of 2 bases or less, and addition of 2 bases or less, or 5 ′ side or 3 ′ side of 2 bases or less. Is more preferable, and addition of a base complementary to the target ORF of 1 base or less or deletion of 1 base or less at the 5′-end or 3′-end is particularly preferable. In general, changes on the 5 'side do not easily lose the function as a primer, and changes on the 3' side tend to lose the function of the primer.
＜ハイブリダイゼーション＞
ハイブリダイゼーションによりＯＲＦを検出する場合には、まず培養菌（緑膿菌）からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをアルカリ変性し、ナイロンメンブレン、セルロースメンブレンあるいはマイクロプレートに定着させる。本発明で検出する各々のＯＲＦとハイブリダイズするプローブを作成する。プローブは人工合成ＤＮＡでも、上記で説明したプライマーを利用したＰＣＲで作成しても良い。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素などを用いてラベルしておく。菌抽出ＤＮＡとプローブをハイブリダイズし、プローブのラベルに応じて、酵素付加、発色、発光などさせ、シグナルを捉える。これを各々の検出ＯＲＦについて実施する。
<Hybridization>
When detecting ORF by hybridization, DNA purified from a culture (Pseudomonas aeruginosa) by column extraction or phenol-chloroform extraction is first alkali-denatured and fixed on a nylon membrane, cellulose membrane or microplate. Probes are prepared that hybridize with each ORF detected by the present invention. The probe may be artificially synthesized DNA or may be prepared by PCR using the primers described above. The probe is labeled using biotin, digoxigenin, a fluorescent dye, or the like. The bacteria-extracted DNA is hybridized with the probe, and according to the label of the probe, enzyme addition, color development, light emission, etc. are performed to capture the signal. This is performed for each detected ORF.
［ORF検出遺伝子型別分類法実施方法］
以下、マルチプレックスPCRを行い、上記（１）〜（２）のＯＲＦのうち、上述した検出対象として好ましいＯＲＦを検出する場合を一例とし、本発明の緑膿菌の遺伝子型別分類法の手順を説明する。
[ORF detection genotype classification method implementation method]
Hereinafter, multiplex PCR is performed, and the procedure for detecting the ORF that is preferable as the detection target among the ORFs of the above (1) to (2) is taken as an example, and the procedure of the classification method according to genotype of Pseudomonas aeruginosa of the present invention Will be explained.
（菌種の同定）
血液、痰、膿、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液などの患者由来の検体あるいは患者に使用したカテーテルやガーゼ等の医療器具などの材料から、NAC寒天培地（緑膿菌分離用）、血液寒天培地（一般細菌分離用）などの緑膿菌分離培地を用いて緑膿菌様の菌を分離する。その後、グラム染色による形態の確認、および生化学性状の確認により、緑膿菌と同定する。
(Identification of bacterial species)
From NAC agar medium (for Pseudomonas aeruginosa isolation), blood agar medium from materials such as blood, sputum, pus, throat swab, nasal swab, and patient-derived specimens or medical devices such as catheters and gauze used for patients Isolate Pseudomonas aeruginosa-like bacteria using Pseudomonas aeruginosa isolation medium (for general bacteria isolation). Thereafter, it is identified as Pseudomonas aeruginosa by confirmation of morphology by Gram staining and confirmation of biochemical properties.
緑膿菌であると同定された菌株を、緑膿菌を増殖可能な液体培地（Luria-Bertani broth、Brain Heart Infusion培地、トリプトソイブイヨン等）、あるいは寒天培地（Luria-Bertani寒天培地、Brain Heart Infusion寒天培地、トリプトソイ寒天培地、普通寒天培地等）を用いて37℃で一晩培養する。 A strain identified as Pseudomonas aeruginosa can be used in liquid media that can grow Pseudomonas aeruginosa (Luria-Bertani broth, Brain Heart Infusion, Tryptosoy broth, etc.), or agar media (Luria-Bertani agar, Brain Heart). Infusion agar, trypsoy agar, normal agar, etc.) are cultured overnight at 37 ° C.
（DNA抽出）
培養した菌体から、熱抽出、フェノール抽出、あるいは市販のDNA抽出キットを用いるなどの方法でDNAを抽出し、サンプルとする。
(DNA extraction)
DNA is extracted from the cultured cells by heat extraction, phenol extraction, or using a commercially available DNA extraction kit, and used as a sample.
（PCR反応）
マルチプレックスPCRでORF（上記表３に記載の、genomic isletを構成するORF 10個およびファージ由来遺伝子のORF 5個の合計15個）に加えて緑膿菌マーカーとしてのpotC、カルバペネム耐性遺伝子としてvimおよびimpを検出する。具体的には、検出対象のORF群に対応する数のプライマーの組（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を、１０組および９組の２群に分け、それぞれの組毎に同一の反応チューブに入れ（（１）〜（２）のＯＲＦ用のプライマー１５組、ポジティブコントロール用のプライマー、カルバペネム耐性遺伝子検出用プライマー２組をチューブ１つあたり１組なので、プライマーの合計は１９組である）、PCR反応を行う。
(PCR reaction)
In addition to ORF in multiplex PCR (15 total of 10 ORFs constituting genomic islet and 5 ORFs of phage-derived genes described in Table 3 above), potC as a Pseudomonas aeruginosa marker, vim as a carbapenem resistance gene And detect imp. Specifically, the number of primer pairs (forward primer and reverse primer) corresponding to the ORF group to be detected is divided into two groups of 10 and 9 groups, and each group is put in the same reaction tube ( (1)-(2) ORF primer set of 15, positive control primer, carbapenem resistance gene detection primer set of 1 set per tube, so the total number of primers is 19 sets), PCR reaction I do.
（電気泳動）
およそ50bp〜600bpのDNA断片が充分に分離されるようなアガロースゲルなどのゲルを用い、PCR増幅産物を電気泳動する。泳動距離は約5〜6 cmでよく、ミニゲルの場合100V、50分程度で充分分離可能である。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色して写真撮影を行う。
(Electrophoresis)
The PCR amplification product is electrophoresed using a gel such as an agarose gel in which DNA fragments of approximately 50 bp to 600 bp are sufficiently separated. The migration distance may be about 5 to 6 cm, and in the case of a minigel, it can be sufficiently separated at about 100 V for about 50 minutes. After electrophoresis, photograph by staining with ethidium bromide.
（結果判定）
１反応につき最大１０本のバンドが現れる。PFGEと異なり、本発明の遺伝子型別分類法ではバンドサイズがあらかじめわかっているため、それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定する。場合によっては目的のサイズ以外の非特異的なバンドが現れることがあるが、非特異バンドは無視する。目的のサイズのバンド（各ＯＲＦに対応するバンドおよびポジティブコントロールに対応するバンド）が増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として２進法のコードを作成する。
(Result judgment)
Up to 10 bands appear per reaction. Unlike PFGE, since the band size is known in advance in the genotyping classification method of the present invention, it is determined whether or not there is a band of the desired size in each strain and reaction system. In some cases, non-specific bands other than the target size may appear, but the non-specific bands are ignored. A binary code is created with a band of the desired size (a band corresponding to each ORF and a band corresponding to a positive control) being 1 if no amplification is seen.
このコードは（１）〜（２）の各ＯＲＦごとに作成してもよいし、すべてをまとめて一つのコードとして作成してもよいし、あるいは（１）〜（２）のＯＲＦの一部をまとめて作成するなどしてもよい。本発明の遺伝子型別分類法が実際の医療の現場で使用される場合に、（１）〜（２）のＯＲＦすべてをまとめて一つのコードとして作成すると、桁数が大きくなって見にくいことから、いくつかのＯＲＦの結果はまとめて一つのコードとして作成することが好ましい。 This code may be created for each ORF of (1) to (2), or all may be created as a single code, or a part of the ORFs of (1) to (2) May be created together. When the genotype classification method of the present invention is used in an actual medical field, if all the ORFs (1) to (2) are created as one code, the number of digits becomes large and difficult to see. The results of several ORFs are preferably created as a single code.
ここで上述のとおり、遺伝子型の分類上、緑膿菌は、clonal complex (CC)型にまとめると理解がしやすい。（１）のＯＲＦはCC型との相関が高く、CCを推定するのに役立つ。
また、（２）のＯＲＦは、緑膿菌の薬剤耐性等に関するタンパク質をコードしているわけではなく、また分類学上重視されているわけではないが、菌株識別能力を高めるのに有用である。
Here, as described above, Pseudomonas aeruginosa is easy to understand when grouped into a clonal complex (CC) type in terms of genotype classification. The ORF of (1) has a high correlation with the CC type and is useful for estimating CC.
The ORF of (2) does not encode a protein related to drug resistance of Pseudomonas aeruginosa and is not important for taxonomics, but is useful for enhancing strain identification ability. .
さらにカルバペネム耐性遺伝子の有無はCCとの相関は無いが、菌株の遺伝情報として有用である。
したがって、（１）のＯＲＦ検出結果をまとめて一つのコードとし、（２）のＯＲＦ検出結果およびカルバペネム耐性遺伝子検出結果を一つのコードとして作成することが好ましい。
Furthermore, the presence or absence of a carbapenem resistance gene has no correlation with CC, but is useful as genetic information of the strain.
Therefore, it is preferable that the ORF detection results of (1) are combined into one code, and the ORF detection results and carbapenem resistance gene detection results of (2) are generated as one code.
そして、たとえばこのようにして作成された２進法のコードを、より桁数を少なくして見やすくするため、たとえば１０進法に変換し、遺伝子型コードとする。以上のコード作成の一例を下記表５に示す。 Then, for example, in order to make the binary code created in this way easier to see by reducing the number of digits, it is converted into, for example, a decimal system to obtain a genotype code. An example of the above code creation is shown in Table 5 below.
まず、適切なプライマーを使用したＰＣＲおよび電気泳動により、試験対象の緑膿菌における各ＯＲＦの有無を検出し、それを２進法によりコード化する。そして、このコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードを得る（３８２（コード１）−０（コード２））。 First, the presence or absence of each ORF in the Pseudomonas aeruginosa to be tested is detected by PCR and electrophoresis using appropriate primers, and encoded by the binary method. And this code | cord | chord is converted into a decimal system and a genotype code | cord | chord is obtained (382 (code 1) -0 (code 2)).
表５に示された例において、コード１は（１）のＯＲＦの検出結果をまとめたものであるので、複数の緑膿菌株について遺伝子型コードを作成した場合に、まずコード１からその緑膿菌のCCを判断することができる。さらに複数の緑膿菌のコード１を比較することによって、複数の緑膿菌が同一の流行クローンであるかどうかを判断することができる。 In the example shown in Table 5, since the code 1 is a summary of the ORF detection results of (1), when genotype codes are generated for a plurality of Pseudomonas aeruginosa strains, the code 1 is first converted from the Pseudomonas aeruginosa. The CC of the fungus can be determined. Further, by comparing the codes 1 of a plurality of Pseudomonas aeruginosa, it can be determined whether or not the plurality of Pseudomonas aeruginosa are the same epidemic clone.
コード２は（２）のＯＲＦの検出結果をまとめたものである。したがって、コード１でそのCC型を判断し、複数の緑膿菌について、コード１の比較で同一のクローンであるかどうかを判断したうえで、コード２を比較することで、より詳細に緑膿菌株を識別することができる。たとえば患者ＡとＢから採取した緑膿菌は、ともに同一CCであり、流行クローンは同一であるがコード２が異なるので感染経路が異なり、患者ＢとＣとは緑膿菌のCCが同一であり、しかもコード２がそれぞれ同一であるので、感染経路が同一である、などといった判定を行うことができる。したがって本発明の遺伝子型別分類法は、医療の現場において緑膿菌の感染経路を特定する手段として有用であると考えられる。 Code 2 summarizes the ORF detection results of (2). Therefore, the CC type is determined by code 1, and it is determined whether or not a plurality of Pseudomonas aeruginosa are identical clones by comparing code 1, and then by comparing code 2 in more detail. The strain can be identified. For example, Pseudomonas aeruginosa collected from patients A and B are both the same CC, and the epidemic clone is the same, but the code 2 is different, so the route of infection is different. In addition, since the codes 2 are the same, it is possible to determine that the infection route is the same. Therefore, the genotyping method of the present invention is considered to be useful as a means for specifying the infection route of Pseudomonas aeruginosa in medical practice.
具体的には、たとえば、緑膿菌臨床分離株23株における17個のORF（ORF1〜22）の保有の有無を、上記と同様にして２進法コード化、さらに１０進法コード化すると、下記表６の通りである。 Specifically, for example, the presence or absence of 17 ORFs (ORF1 to 22) in 23 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa is binary coded and further decimal coded in the same manner as above. It is as Table 6 below.
表６において、一番左側の行は、菌株をサンプリングした患者の番号である。
このように判定結果をコード化し、得られた遺伝子型コード同士を比較することで、異なる時期や施設で分離された菌株の特定であっても、容易かつ客観的に行うことができる。したがって、本発明の緑膿菌の遺伝子型別分類法によれば、PFGEとは異なり、時間的あるいは距離的に隔たりのある遺伝子型別分類結果間での遺伝子型の比較も可能である。
In Table 6, the leftmost row is the number of the patient who sampled the strain.
By coding the determination results in this way and comparing the obtained genotype codes, it is possible to easily and objectively identify strains separated at different times and facilities. Therefore, according to the genotype classification method of Pseudomonas aeruginosa of the present invention, genotypes can be compared between genotype classification results that are separated in time or distance, unlike PFGE.
また、上記表６より明らかであるが、カルバペネム耐性緑膿菌は、コード２の数値が通常の緑膿菌のもの（６４以上または奇数）と異なるので、上記のようにコード２から、対象の緑膿菌がカルバペネム耐性であるかまたは感受性であるかを判定することができる。 Further, as is clear from Table 6 above, since the carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa has a numerical value of code 2 different from that of normal Pseudomonas aeruginosa (64 or more or odd), from code 2 as described above, It can be determined whether Pseudomonas aeruginosa is carbapenem resistant or susceptible.
さらに、本発明で検出の対象としているＯＲＦは、緑膿菌の病原性等に関連しないＯＲＦである。病原性に関連するなど、特定の機能を有する遺伝子は、その緑膿菌が宿主内で増殖する確率を上げたり、あるいはその遺伝子産物が宿主の免疫システムのターゲットとなり、反対に生存確率を下げることがある。つまりこのような遺伝子は、緑膿菌の多くが持っている、あるいは反対にほとんど持っていないと考えられる。本発明では、このようなバイアスがかからないように適切なＯＲＦを選択して遺伝子型別分類を行っているのである。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
Furthermore, the ORF to be detected in the present invention is an ORF not related to the pathogenicity of Pseudomonas aeruginosa. Genes with specific functions, such as those related to virulence, increase the probability that the Pseudomonas aeruginosa grows in the host, or the gene product becomes the target of the host immune system, and conversely decreases the probability of survival. There is. In other words, most of these genes are thought to be possessed by many Pseudomonas aeruginosa, or vice versa. In the present invention, appropriate ORFs are selected and genotype classification is performed so that such a bias is not applied.
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further more concretely based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
実施例１
ある病院で臨床分離された緑膿菌23株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
Example 1
The 23 Pseudomonas aeruginosa strains clinically isolated at a hospital were classified by genotype by ORF detection according to the following procedure.
＜ORF検出による遺伝子型別分類＞
（緑膿菌の培養）
緑膿菌であると同定された２３の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
<Classification by genotype by ORF detection>
(Culture of Pseudomonas aeruginosa)
Twenty-three strains identified as Pseudomonas aeruginosa were cultured overnight at 37 ° C. using tryptic soy agar.
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
(DNA extraction)
An amount corresponding to approximately one colony of the cultured bacteria was suspended in 100 μl of Tris-EDTA buffer in a 1.5 ml Eppendorf tube and heated at 100 ° C. for 10 minutes. Next, the tube was centrifuged at 12,000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was used as a DNA heat extraction sample.
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、DMSO 0.6μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl,、蒸留水14.1μlおよびprimer mixture 1もしくは2を0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
(Preparation of PCR reaction solution)
Roche's FastStart DNA polymerase was used according to the instructions. At that time, the reaction volume was 20 μl. The composition of 20 μl of the reaction solution is 10 μm FastStart Taq Buffer 2 μl, 10 mM dNTP Mix 0.4 μl, DMSO 0.6 μl, FastStart Taq DNA polymerase 0.2 μl, distilled water 14.1 μl and primer mixture 1 or 2 is 0.2 μl. 2 μl (1/10 volume of the reaction solution) of the above-mentioned DNA heat extraction sample was added thereto.
プライマーは１０組あるいは９組（ポジティブコントロール用のプライマー１組およびカルバペネム耐性遺伝子検出用プライマー２組を含む）を組み合わせ２本の反応チューブを使用し、１９個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ（primer mixture 1および2）、及びその最終濃度は下記表７および表８のとおりである。 Multiplex PCR was performed on 19 ORFs using 10 or 9 primers (including 1 set of positive control primers and 2 sets of primers for carbapenem resistance gene detection) and 2 reaction tubes. . The primer combinations (primer mixtures 1 and 2) and their final concentrations are shown in Tables 7 and 8 below.
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）にサンプルをセットし、最初に95℃で４分間処理し、その後、95℃ 30秒、65℃ 2分30秒のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を４℃で保存した。
(PCR reaction)
A sample was set in a thermal cycler (Applied Biosytems, GeneAmp PCR System 9700), first treated at 95 ° C. for 4 minutes, and then cycled at 95 ° C. for 30 seconds and 65 ° C. for 2 minutes 30 seconds 30 times. After completion of the cycle reaction, the PCR product was stored at 4 ° C.
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで50分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
(Electrophoresis)
Using an agarose gel (4% NuSieve 3: 1 in TBE buffer), a minigel was prepared, and 5 μl of PCR product was electrophoresed at 100 V for 50 minutes. The migration distance was about 5 cm. After electrophoresis, it was stained with ethidium bromide and photographed.
（結果判定）
１反応につき最大１０本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表６と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図１および表６に示す。
(Result judgment)
A maximum of 10 bands appeared per reaction. It is determined whether or not there is a band of the target size in each strain and reaction system. If the band of the target size is amplified, 1 is set. A binary code was created. Further, the binary code was converted to the decimal system to obtain a genotype code.
The results are shown in FIG.
表６において、前述のようにコード１が流行クローンを示すが、たとえば菌株１８〜２３はすべてコード１が２０７で同じであるが、コード２を比較すると、実際は異なる菌株であることがわかる。 In Table 6, code 1 indicates an epidemic clone as described above. For example, all of strains 18 to 23 have the same code 1 of 207, but when code 2 is compared, it can be seen that they are actually different strains.
実施例２
以下、プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
先の実施例と同じ、ある病院で臨床分離された緑膿菌23株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
Example 2
Hereinafter, an example in which the primer sequence is changed by about 2 bases will be described more specifically.
As with the previous example, 23 strains of Pseudomonas aeruginosa clinically isolated at a hospital were classified by genotype by ORF detection according to the following procedure.
＜ORF検出による遺伝子型別分類＞
（緑膿菌の培養）
緑膿菌であると同定された２３の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
<Classification by genotype by ORF detection>
(Culture of Pseudomonas aeruginosa)
Twenty-three strains identified as Pseudomonas aeruginosa were cultured overnight at 37 ° C. using tryptic soy agar.
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
(DNA extraction)
An amount corresponding to approximately one colony of the cultured bacteria was suspended in 100 μl of Tris-EDTA buffer in a 1.5 ml Eppendorf tube and heated at 100 ° C. for 10 minutes. Next, the tube was centrifuged at 12,000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was used as a DNA heat extraction sample.
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、DMSO 0.6μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl,、蒸留水14.1μlおよびprimer mixture 1もしくは2を0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
(Preparation of PCR reaction solution)
Roche's FastStart DNA polymerase was used according to the instructions. At that time, the reaction volume was 20 μl. The composition of 20 μl of the reaction solution is 10 μm FastStart Taq Buffer 2 μl, 10 mM dNTP Mix 0.4 μl, DMSO 0.6 μl, FastStart Taq DNA polymerase 0.2 μl, distilled water 14.1 μl and primer mixture 1 or 2 is 0.2 μl. 2 μl (1/10 volume of the reaction solution) of the above-mentioned DNA heat extraction sample was added thereto.
プライマーは１０組あるいは９組（ポジティブコントロール用のプライマー１組およびカルバペネム耐性遺伝子検出用プライマー２組を含む）を組み合わせ２本の反応チューブを使用し、１９個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ（primer mixture 1および2）、及びその最終濃度は下記表９および表１０のとおりである。 Multiplex PCR was performed on 19 ORFs using 10 or 9 primers (including 1 set of positive control primers and 2 sets of primers for carbapenem resistance gene detection) and 2 reaction tubes. . The primer combinations (primer mixtures 1 and 2) and their final concentrations are shown in Tables 9 and 10 below.
なお、配列番号３７は配列番号１に対して2塩基を付加したものであり、配列番号３８は配列番号２に対して2塩基を付加したものであり、配列番号３９は配列番号３に対して1塩基を置換したものであり、配列番号４０は配列番号４に対して1塩基を置換したものであり、配列番号４１は配列番号５に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号４２は配列番号６に対して2塩基を置換したものであり、配列番号４３は配列番号７に対して2塩基を付加したものであり、配列番号４４は配列番号８に対して1塩基を付加したものであり、配列番号４５は配列番号９に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号４６は配列番号１０に対して1塩基を置換したものであり、配列番号４７は配列番号１１に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号４８は配列番号１２に対して2塩基を置換したものであり、配列番号４９は配列番号１３に対して1塩基を付加し、1塩基を置換したものであり、配列番号５０は配列番号１４に対して1塩基を付加したものであり、配列番号５１は配列番号１５に対して2塩基を置換したものであり、配列番号５２は配列番号１６に対して2塩基を付加したものであり、配列番号５３は配列番号１７に対して1塩基を欠失させたものであり、配列番号５４は配列番号１８に対して1塩基を欠失させたものであり、配列番号５５は配列番号１９に対して2塩基を付加したものであり、配列番号５６は配列番号２０に対して1塩基を付加し、1塩基を欠失させたものであり、配列番号５７は配列番号２１に対して1塩基を付加し、1塩基を置換したものであり、配列番号５８は配列番号２２に対して1塩基を付加し、1塩基を置換したものであり、配列番号５９は配列番号２３に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号６０は配列番号２４に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号６１は配列番号２５に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号６２は配列番号２６に対して1塩基を付加し、1塩基を置換したものであり、配列番号６３は配列番号２７に対して2塩基を付加したものであり、配列番号６４は配列番号２８に対して1塩基を付加し、1塩基を欠失させたものであり、配列番号６５は配列番号２９に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号６６は配列番号３０に対して2塩基を付加したものである。 SEQ ID NO: 37 is obtained by adding 2 bases to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38 is obtained by adding 2 bases to SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 39 is obtained by adding SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 3. 1 base substitution, SEQ ID NO: 40 is a substitution of 1 base with respect to SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 41 is a deletion of 2 bases with respect to SEQ ID NO: 5, No. 42 is obtained by substituting two bases with respect to SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 43 is obtained by adding two bases with respect to SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 44 is provided with one base with respect to SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 45 is obtained by deleting 2 bases from SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 46 is obtained by replacing 1 base with respect to SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 47 is 2 bases deleted from SEQ ID NO: 11, No. 48 is obtained by substituting two bases with respect to SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 49 is obtained by adding one base to SEQ ID NO: 13 and substituting one base, and SEQ ID NO: 50 comprises SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 51 is obtained by substituting 2 bases with respect to SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 52 is obtained by adding 2 bases with respect to SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 53 is obtained by deleting one base from SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 54 is obtained by deleting one base from SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 55 is obtained by replacing SEQ ID NO: 19. 2 bases are added, SEQ ID NO: 56 is obtained by adding 1 base to SEQ ID NO: 20 and deleting 1 base, SEQ ID NO: 57 is 1 base relative to SEQ ID NO: 21 Is added, and 1 base is substituted, SEQ ID NO: 58 is 1 base is added to column number 22 and 1 base is substituted, SEQ ID NO: 59 is a sequence obtained by deleting 2 bases from SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 60 is SEQ ID NO: 24 2 bases are deleted, SEQ ID NO: 61 is a deletion of 2 bases from SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 62 adds 1 base to SEQ ID NO: 26, 1 base is substituted, SEQ ID NO: 63 is obtained by adding 2 bases to SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 64 is added 1 base to SEQ ID NO: 28, and 1 base is deleted. SEQ ID NO: 65 is obtained by deleting 2 bases from SEQ ID NO: 29, and SEQ ID NO: 66 is obtained by adding 2 bases to SEQ ID NO: 30.
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）にサンプルをセットし、最初に95℃で４分間処理し、その後、95℃ 30秒、65℃ 2分30秒のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を４℃で保存した。
(PCR reaction)
A sample was set in a thermal cycler (Applied Biosytems, GeneAmp PCR System 9700), first treated at 95 ° C. for 4 minutes, and then cycled at 95 ° C. for 30 seconds and 65 ° C. for 2 minutes 30 seconds 30 times. After completion of the cycle reaction, the PCR product was stored at 4 ° C.
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで50分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
(Electrophoresis)
Using an agarose gel (4% NuSieve 3: 1 in TBE buffer), a minigel was prepared, and 5 μl of PCR product was electrophoresed at 100 V for 50 minutes. The migration distance was about 5 cm. After electrophoresis, it was stained with ethidium bromide and photographed.
（結果判定）
１反応につき最大１０本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表６と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図２に示す。図1および表６と同様の結果が得られた。
(Result judgment)
A maximum of 10 bands appeared per reaction. It is determined whether or not there is a band of the target size in each strain and reaction system. If the band of the target size is amplified, 1 is set. A binary code was created. Further, the binary code was converted to the decimal system to obtain a genotype code.
The results are shown in FIG. Results similar to those in FIG. 1 and Table 6 were obtained.
本発明によれば、緑膿菌の遺伝子型別分類を、特殊な装置や作業者の熟練を要さずに簡便、迅速、客観的かつ高感度に行うことができるため、院内感染の経路を速やかに決定し、院内感染の広がりを防止することができる。
より具体的には、下記（１）〜（４）の効果を奏することができる。
（１）複雑なマルチプレックスPCRに使用可能なプライマー設計を行えば、1検体あたりのPCR反応チューブを2本に減らすことが可能となり、実施コストが削減される。
（２）プライマー配列の工夫により広範囲のテンプレート濃度に適用でき、増幅バンドの濃さにむらが生じにくく、判定が容易である。
（３）Genomic isletのORFを検出することで、ゲノムの遺伝的な由来を特定することが可能であり、緑膿菌すべてにおける菌株識別能力が向上している。
（４）ファージ由来遺伝子のORF検出プライマー配列を改良することで、緑膿菌すべてにおいて菌株識別能力向上が可能となった。
According to the present invention, the classification of Pseudomonas aeruginosa by genotype can be performed simply, quickly, objectively and with high sensitivity without requiring specialized equipment or operator skill. Decide quickly and prevent the spread of nosocomial infections.
More specifically, the following effects (1) to (4) can be obtained.
(1) By designing a primer that can be used for complex multiplex PCR, it is possible to reduce the number of PCR reaction tubes per sample to two, thereby reducing implementation costs.
(2) It can be applied to a wide range of template concentrations by devising the primer sequence, and the unevenness of the amplification band is less likely to be uneven and easy to judge.
(3) By detecting the ORF of the genomic islet, it is possible to identify the genetic origin of the genome, and the strain identification ability of all Pseudomonas aeruginosa is improved.
(4) By improving the ORF detection primer sequence of the phage-derived gene, it became possible to improve the strain identification ability in all Pseudomonas aeruginosa.
Claims (11)
（１）genomic isletを構成するオープンリーディングフレーム（ORF）、および
（２）ファージ由来遺伝子のORF、
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、緑膿菌の遺伝子型別分類法。 On the genome of Pseudomonas aeruginosa,
(1) Open reading frame (ORF) constituting genomic islet, and (2) ORF of phage-derived gene,
A method for classifying Pseudomonas aeruginosa by genotype, which includes the step of detecting the presence or absence of serotypes in any order and classifying them according to the combination of the presence or absence of these ORFs.
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