JP2013137223A - Ａｐｐの局在の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、ＡＰＰの機能、役割、代謝調節等の解明にとって有益と思われるＡＰＰの局在情報を得る方法を提供することを目的とする。
【課題解決手段】
本発明は、以下の工程を含むＡＰＰを検出する方法を提供する。
（ａ）細胞中のＡＰＰと、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体と反応させる工程；
（ｂ）該抗体とＡＰＰの複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を検出する工程；および
（ｄ）該複合体の検出部位を特定し、ＡＰＰの局在情報を得る工程
【選択図】なし
【課題解決手段】
本発明は、以下の工程を含むＡＰＰを検出する方法を提供する。
（ａ）細胞中のＡＰＰと、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体と反応させる工程；
（ｂ）該抗体とＡＰＰの複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を検出する工程；および
（ｄ）該複合体の検出部位を特定し、ＡＰＰの局在情報を得る工程
【選択図】なし
Description
本発明は、特定の抗体を用いてＡＰＰの局在を検出する方法に関する。
アルツハイマー症（アルツハイマー病ともいう。以下単にＡＤと省略することがある）は厚生労働省老険局データと患者調査の結果をもとに推計すると、２０１０年時点におけるアルツハイマー型認知症患者数は約１１６万人、２０１５年には１４２万人、２０２５年には２２０万人に達すると予測される。米国では５３０万人が罹病しているといわれ、６５歳以上では死亡原因の５位、３０年以内には世界で患者数が１位になる疾病と予測されている。
ここで、患者数の多い他の疾病である、高血圧、糖尿病、高脂血症は、完全に治癒できないまでもその病状を進行させずにコントロールすることが可能になってきており、ガンも一部についてであるが、治癒またはその病状はコントロール可能になりつつある。しかし、ＡＤは、原因および作用機序が不明であり、その病状の進行ほとんどコントロールできていない。（真の発症は１０〜２０年依然だが）ＡＤであると診断を受けてから死亡までの（通常５〜１２年）家族の精神的・経済的負担は疾病の中でも最も大きく社会問題の１つである。したがって、ＡＤは早期診断、予防、治療の社会的要請が極めて高い疾病である。
ＡＤが進行すると、症状として脳細胞の消失による脳の退縮が起こることが知られており、これに関係している中心分子としてアミロイドβＡ４プレカーサープロテイン（以下ＡＰＰと略する）が知られている。ＡＤの発症機序については、ＡＰＰの機能、役割、代謝調節等すでに３０年以上も研究が続けられているが、いまだに解明されていない部分が多く、少なくともＡβ４２またはＡβ４３の蓄積とＡＤ発症の相関は極めて高いだろうということまでは分かっているが全てではない（非特許文献１）。これまで、ＡＰＰの存在部位は完全には把握されておらず、細胞質に存在するものと考えられていた（非特許文献２〜７）。
ここで、患者数の多い他の疾病である、高血圧、糖尿病、高脂血症は、完全に治癒できないまでもその病状を進行させずにコントロールすることが可能になってきており、ガンも一部についてであるが、治癒またはその病状はコントロール可能になりつつある。しかし、ＡＤは、原因および作用機序が不明であり、その病状の進行ほとんどコントロールできていない。（真の発症は１０〜２０年依然だが）ＡＤであると診断を受けてから死亡までの（通常５〜１２年）家族の精神的・経済的負担は疾病の中でも最も大きく社会問題の１つである。したがって、ＡＤは早期診断、予防、治療の社会的要請が極めて高い疾病である。
ＡＤが進行すると、症状として脳細胞の消失による脳の退縮が起こることが知られており、これに関係している中心分子としてアミロイドβＡ４プレカーサープロテイン（以下ＡＰＰと略する）が知られている。ＡＤの発症機序については、ＡＰＰの機能、役割、代謝調節等すでに３０年以上も研究が続けられているが、いまだに解明されていない部分が多く、少なくともＡβ４２またはＡβ４３の蓄積とＡＤ発症の相関は極めて高いだろうということまでは分かっているが全てではない（非特許文献１）。これまで、ＡＰＰの存在部位は完全には把握されておらず、細胞質に存在するものと考えられていた（非特許文献２〜７）。
実験医学 2008年10月号 Vol.26 No.16 異常タンパク質蓄積とアルツハイマー病の治療戦略 Proteolysis機構の解明と，バイオマーカーによる診断法確立への挑戦 岩坪威／企画
T.E. Golde, S. Estus, M. Usiak, L.H. Younkin, S.G. Younkin SG, Expression of beta amyloid protein precursor mRNAs: Recognition of a novel alternatively spliced form and quantitation in Alzheimer's disease using PCR, Neuron. 4 (1990) 253-67.
G. Thinakaran, E.H. Koo, Amyloid precursor protein trafficking, processing, and function, J. Biol. Chem. 283 (2008) 29615-2969.
W.T. Kimberly, J.B. Zheng, S.Y. Guenette, D.J. Selkoe, The intracellular domain of the beta-amyloid precursor protein is stabilized by Fe65 and translocates to the nucleus in a notch-like manner, J. Biol. Chem. 276 (2001) 40288-40292.
R.C. von Rotz, B.M. Kohli, J. Bosset, M. Meier, T. Suzuki, R.M. Nitsch, U. Konietzko, The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor, J. Cell Sci. 117 (2004) 4435-4448.
H. Yamaguchi, T. Yamazaki, K. Ishiguro, M. Shoji, Y. Nakazato, S. Hirai, Ultrastructural localization of Alzheimer amyloid beta/A4 protein precursor in the cytoplasm of neurons and senile plaque-associated astrocytes, Acta Neuropathol. 85 (1992) 15-22.
G.L. Caporaso, K. Takei, S.E. Gandy, M. Matteoli, O Mundigl, P. Greengard, P. De Camilli, Morphologic and biochemical analysis of the intracellular trafficking of the Alzheimer beta/A4 amyloid precursor protein, J. Neurosci. 14 (1994) 3122-3138.
本発明は、ＡＰＰの機能、役割、代謝調節等の解明にとって有益と思われるＡＰＰの局在情報を得る方法を提供することを目的とする。
ＡＰＰの検出方法について鋭意検討した結果、ＡＰＰのＮ末端側を認識する特定の抗体を特定の条件で用いた場合に、神経癌細胞等の細胞質、核または核小体にＡＰＰが存在していることを発見した。長年の膨大な研究の中でもＡＰＰのＮ末端側が核に局在するという知見は全く知られておらず新規な知見である。また、この知見が意味する内容は、細胞の盛衰を左右する重要な調節への関与である。
具体的には本発明は以下の構成を有する。
〔１〕以下の工程を含むＡＰＰを検出する方法。
（ａ）細胞中のＡＰＰと、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体と反応させる工程；
（ｂ）該抗体とＡＰＰの複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を検出する工程；および
（ｄ）該複合体の検出部位を特定し、ＡＰＰの局在情報を得る工程
〔２〕該複合体の検出部位の特定が、あらかじめ細胞を前処理して部位を選択し、当該選択部位における検出有無により行う、前記〔１〕に記載のＡＰＰを検出する方法。
〔３〕ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、４４−６３番目の一部を認識する抗体である前記〔１〕または〔２〕に記載のＡＰＰを検出する方法。
〔４〕ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、ＧＳ４４６３（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｎｏ．Ａ００６９２、抗ＡＰＰ抗体（４４−６３））または１０Ｄ１（ＩＢＬ社、Ｎｏ．１１０９０、抗ヒトＡＰＰ（Ｎ）抗体（１０Ｄ１））（図６）である前記〔１〕−〔３〕のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
〔５〕ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、ＧＳ４４６３（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｎｏ．Ａ００６９２、抗ＡＰＰ抗体（４４−６３））と競合する抗体または１０Ｄ１（ＩＢＬ社、Ｎｏ．１１０９０、抗ヒトＡＰＰ（Ｎ）抗体（１０Ｄ１））と競合する抗体である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
〔６〕ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、ＨＭＰ−２０を認識する抗体である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
〔７〕検出部位が、細胞質、核または核小体のいずれか１以上である前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
〔８〕検出部位が核小体であって、さらに以下の工程を含む前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
（ｅ）フィブラリン抗体またはｅｌＦ６により核小体を検出する工程
〔９〕細胞におけるＡＰＰ局在性の異常有無の判定方法であって、
（ａ）細胞中のＡＰＰと、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体と接触させる工程；
（ｂ）該抗体とＡＰＰの複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を検出する工程；および
（ｄ）該複合体の検出部位を特定することによりＡＰＰの局在情報を得て、あらかじめ求めた正常状態との比較から、細胞のＡＰＰ局在性の異常有無を判定する工程、
を含む方法。
〔１０〕ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体、および当該抗体とＡＰＰとの複合体の局在情報と異常有無との関連付けについて説明された取扱説明書、を含むＡＰＰの局在性の異常有無を判定する検査キット。
具体的には本発明は以下の構成を有する。
〔１〕以下の工程を含むＡＰＰを検出する方法。
（ａ）細胞中のＡＰＰと、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体と反応させる工程；
（ｂ）該抗体とＡＰＰの複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を検出する工程；および
（ｄ）該複合体の検出部位を特定し、ＡＰＰの局在情報を得る工程
〔２〕該複合体の検出部位の特定が、あらかじめ細胞を前処理して部位を選択し、当該選択部位における検出有無により行う、前記〔１〕に記載のＡＰＰを検出する方法。
〔３〕ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、４４−６３番目の一部を認識する抗体である前記〔１〕または〔２〕に記載のＡＰＰを検出する方法。
〔４〕ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、ＧＳ４４６３（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｎｏ．Ａ００６９２、抗ＡＰＰ抗体（４４−６３））または１０Ｄ１（ＩＢＬ社、Ｎｏ．１１０９０、抗ヒトＡＰＰ（Ｎ）抗体（１０Ｄ１））（図６）である前記〔１〕−〔３〕のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
〔５〕ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、ＧＳ４４６３（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｎｏ．Ａ００６９２、抗ＡＰＰ抗体（４４−６３））と競合する抗体または１０Ｄ１（ＩＢＬ社、Ｎｏ．１１０９０、抗ヒトＡＰＰ（Ｎ）抗体（１０Ｄ１））と競合する抗体である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
〔６〕ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、ＨＭＰ−２０を認識する抗体である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
〔７〕検出部位が、細胞質、核または核小体のいずれか１以上である前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
〔８〕検出部位が核小体であって、さらに以下の工程を含む前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
（ｅ）フィブラリン抗体またはｅｌＦ６により核小体を検出する工程
〔９〕細胞におけるＡＰＰ局在性の異常有無の判定方法であって、
（ａ）細胞中のＡＰＰと、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体と接触させる工程；
（ｂ）該抗体とＡＰＰの複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を検出する工程；および
（ｄ）該複合体の検出部位を特定することによりＡＰＰの局在情報を得て、あらかじめ求めた正常状態との比較から、細胞のＡＰＰ局在性の異常有無を判定する工程、
を含む方法。
〔１０〕ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体、および当該抗体とＡＰＰとの複合体の局在情報と異常有無との関連付けについて説明された取扱説明書、を含むＡＰＰの局在性の異常有無を判定する検査キット。
本発明によりＡＰＰの新しい局在情報を知ることができる。そして当該情報により、ＡＰＰの新しい代謝調節経路、機能の情報を得ることにつながり、ＡＰＰの本来の生理作用とＡＤ発症機構を探る研究にとって極めて有用性が高い。たとえば、ＡＰＰが核に局在するという情報だけでも、ＡＰＰの関係する機能が複製、ＤＮＡ修飾、転写などに絞られる。また、同様に、核小体はｒＲＮＡ合成工場であり、細胞の休止・生育・消失の制御に関わるため、ＡＰＰが核小体に局在するという情報だけでも、ＡＰＰの関連する機能をこれらに絞ることができる。 さらにまた、ＡＰＰの異常な局在性と疾病との相関性を調べることにより、ＡＰＰの異常な局在性と相関する疾病の診断をすることも可能になる。
本発明は、特定の抗体を用いてＡＰＰの局在性を調べる方法である。ＡＰＰの局在性とは、細胞のどの部位にどのようにＡＰＰが存在するかを検出することをいう。どの部位にとは、細胞内のうち、細胞質、小胞体、ミトコントドリア、ゴルジ体、中心体、核、核膜、核小体、核スペックルズ、ＰＭＬ体などのどの細胞内小器官や核内構造体をも含む意である。また、どのように存在するかとは、前記部位のみではなく、存在量、存在の範囲、存在の偏移、分子量分布状態、修飾状態、特定のタンパク質との共在性など、あらゆる存在状態をも含める意である。なお、後述する実施例では、ある特定の細胞における、細胞質、核、核小体におけるＡＰＰの存在有無をＡＰＰの局在情報、共在情報として例示した。
（検出）
検出は、細胞中のＡＰＰと抗体とを反応させることにより行われる。細胞中のＡＰＰと抗体との反応は、例えば、細胞と抗体とを特定条件下で接触させることにより、細胞中のＡＰＰと抗体により形成された複合体を可視化して検出することにより行われる。可視化は例えば、１次抗体を蛍光標識、または蛍光標識２次抗体を用いて増感することにより可能である。細胞は、固定化し、抗体とＡＰＰとの複合体を蛍光染色等可視化することにより、蛍光顕微鏡観察することで細胞全体における局在性を直ちに検出することが可能である。また上記以外には例えば、細胞を前処理することにより、細胞質、核、核小体成分に抽出・分離し各器官の試料とし、各器官の試料と抗体を接触することでＡＰＰと抗体の複合体を形成して、該複合体を検出することにより、複合体の検出部位を特定することもできる。さらにまた、各器官を抽出・分離しないまでも各器官を選択的に検出仕分けることで検出部位を特定してもよい。ここで、複合体の定量的な検出だけでなく、定量的に検出（測定）できれば、さらにどの器官にどのくらいの量が存在するのかがわかり、各器官でのＡＰＰの存在比をも明らかにすることができ、より詳細な情報となりうる。また、他の特定の細胞内小器官マーカー抗体を同時に用いて、共在性情報を得ることもできる。
検出は、細胞中のＡＰＰと抗体とを反応させることにより行われる。細胞中のＡＰＰと抗体との反応は、例えば、細胞と抗体とを特定条件下で接触させることにより、細胞中のＡＰＰと抗体により形成された複合体を可視化して検出することにより行われる。可視化は例えば、１次抗体を蛍光標識、または蛍光標識２次抗体を用いて増感することにより可能である。細胞は、固定化し、抗体とＡＰＰとの複合体を蛍光染色等可視化することにより、蛍光顕微鏡観察することで細胞全体における局在性を直ちに検出することが可能である。また上記以外には例えば、細胞を前処理することにより、細胞質、核、核小体成分に抽出・分離し各器官の試料とし、各器官の試料と抗体を接触することでＡＰＰと抗体の複合体を形成して、該複合体を検出することにより、複合体の検出部位を特定することもできる。さらにまた、各器官を抽出・分離しないまでも各器官を選択的に検出仕分けることで検出部位を特定してもよい。ここで、複合体の定量的な検出だけでなく、定量的に検出（測定）できれば、さらにどの器官にどのくらいの量が存在するのかがわかり、各器官でのＡＰＰの存在比をも明らかにすることができ、より詳細な情報となりうる。また、他の特定の細胞内小器官マーカー抗体を同時に用いて、共在性情報を得ることもできる。
（検出条件）
細胞における検出は、洗浄、固定化、抗体との接触、ブロッキング等の処理により行うことができる。洗浄は、ＰＢＳによる洗浄が望ましく、また固定化はパラホルムアルデヒドが望ましい。ブロッキングは、ヤギ血清が望ましく、さらにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００による処理と併用することが望ましい。
具体的には、後述する実施例に示されるように、ＰＢＳよる洗浄、固定：４％パラホルムアルデヒド、０℃２０分、（または−２０℃〜−３０℃メタノール、５分）ＰＢＳ洗浄、０．２５〜０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ ０℃ １５分、ＰＢＳ洗浄 ５％ヤギ血清ＰＢＳでブロッキング、０℃ １時間以上、の処理が挙げられる。このような処理により、従来は検出できなかった核や核小体におけるＡＰＰの検出が可能となり、ＡＰＰの細胞内での局在性を調べることが可能となった。
また、核小体におけるＡＰＰの検出には、核小体の検出に用いられるフィブラリン抗体またはｅｌＦ６とともに本発明の抗体を使用すれば、より正確な核小体におけるＡＰＰ検出情報を得ることができるため望ましい。
細胞における検出は、洗浄、固定化、抗体との接触、ブロッキング等の処理により行うことができる。洗浄は、ＰＢＳによる洗浄が望ましく、また固定化はパラホルムアルデヒドが望ましい。ブロッキングは、ヤギ血清が望ましく、さらにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００による処理と併用することが望ましい。
具体的には、後述する実施例に示されるように、ＰＢＳよる洗浄、固定：４％パラホルムアルデヒド、０℃２０分、（または−２０℃〜−３０℃メタノール、５分）ＰＢＳ洗浄、０．２５〜０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ ０℃ １５分、ＰＢＳ洗浄 ５％ヤギ血清ＰＢＳでブロッキング、０℃ １時間以上、の処理が挙げられる。このような処理により、従来は検出できなかった核や核小体におけるＡＰＰの検出が可能となり、ＡＰＰの細胞内での局在性を調べることが可能となった。
また、核小体におけるＡＰＰの検出には、核小体の検出に用いられるフィブラリン抗体またはｅｌＦ６とともに本発明の抗体を使用すれば、より正確な核小体におけるＡＰＰ検出情報を得ることができるため望ましい。
（抗体）
本発明に用いる抗体は、ＡＰＰに対する抗体のなかでも、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体である必要がある。さらにこのうちでも、４４−６３番目を認識する抗体が望ましく、具体的にはＧＳ４４６３（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｎｏ．Ａ００６９２、抗ＡＰＰ抗体（４４−６３））、１０Ｄ１（ＩＢＬ社、Ｎｏ．＃１１０９０、抗ヒトＡＰＰ（Ｎ）（１０Ｄ１））ＧＳ４４６３と競合する抗体、１０Ｄ１と競合する抗体、またはペプチドＨＭＰ−２０を認識する抗体であることが望ましい（図６）。
本発明に用いる抗体は、ＡＰＰに対する抗体のなかでも、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体である必要がある。さらにこのうちでも、４４−６３番目を認識する抗体が望ましく、具体的にはＧＳ４４６３（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｎｏ．Ａ００６９２、抗ＡＰＰ抗体（４４−６３））、１０Ｄ１（ＩＢＬ社、Ｎｏ．＃１１０９０、抗ヒトＡＰＰ（Ｎ）（１０Ｄ１））ＧＳ４４６３と競合する抗体、１０Ｄ１と競合する抗体、またはペプチドＨＭＰ−２０を認識する抗体であることが望ましい（図６）。
（判定方法）
本発明の細胞におけるＡＰＰ局在性の異常有無の判定方法は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法である。
（ａ）細胞を、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体と接触させる工程；
（ｂ）該抗体とＡＰＰの複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を検出する工程；および
（ｄ）該複合体の検出部位を特定することによりＡＰＰの局在情報を得て、あらかじめ求めた正常状態との比較から、細胞のＡＰＰ局在性の異常有無を判定する工程、
本発明の細胞におけるＡＰＰ局在性の異常有無の判定方法は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法である。
（ａ）細胞を、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体と接触させる工程；
（ｂ）該抗体とＡＰＰの複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を検出する工程；および
（ｄ）該複合体の検出部位を特定することによりＡＰＰの局在情報を得て、あらかじめ求めた正常状態との比較から、細胞のＡＰＰ局在性の異常有無を判定する工程、
（ｄ）の工程は、例えば、細胞質、核、核小体におけるＡＰＰの存在を定量的あるいは定性的に検出し、その情報をもとにＡＰＰの局在性の異常の有無を判定する工程である。あらかじめ求めた正常状態との比較とは、たとえば、正常状態におけるＡＰＰ検出部位や各検出部位でのＡＰＰ検出量などとの比較をいう。たとえば、ある種の細胞について、ＡＰＰが核、核小体、細胞質ともに所定量存在するのが通常であるとし、核および核小体に大量に存在し、細胞質にはほとんど存在しない場合またはその逆の場合を異常と判断するなどである。また、細胞の種類、細胞の由来する患者の疾病について調べて統計的なデータを取得してその関連付けをしておくことで、細胞の異常有無の判定、疾病の判定をすることが可能となる。判定は人が行ってもよいし、画像をコンピュータにより、パターン認識ソフトで容易に解析することもできる。パターン認識ソフトはヒトの顔も識別できるまでに進んでいる。例えば、ＤＡＰＩで染色される核内に別の蛍光がどの程度存在するかは容易に識別できるであろう。正常パターンの形状も記憶させることができるであろう。
ＡＰＰは、アルツハイマー症の病理に密接に関わるアミロイドβ（Ａβ）の前駆体であり、この病気の責任遺伝子産物の一つである（非特許文献１）
ＡＰＰは、一回膜貫通型タンパク質であり、少なくとも、６９５アミノ酸、７５１アミノ酸、７７０アミノ酸からなる３種類のスプライシング分子種が報告されている（非特許文献２）。ＡＰＰは内部に、αセクレターゼ、βセクレターゼ、γセクレターゼによるプロセッシング部位を持つ（非特許文献３）。ＡＰＰはγセクレターゼによる膜内での切断により、溶解型ＡＰＰ（ｓＡＰＰ）が放出される。更に、ｓＡＰＰは、αセクレターゼにより切断されるアミロイド非発生型経路とβセクレターゼにより切断されて、アミロイドＡβができるアミロイド発生型経路で代謝される。細胞内のＡＰＰは、主にゴルジ装置や小胞体の存在するとされている（非特許文献６−１２）。細胞内において、ＡＰＰが小胞体やゴルジに存在することは、ｓＡＰＰが細胞外に分泌されることと一致している。
ＡＩＣＤと呼ばれるＡＰＰのＣ末端の５０アミノ酸程度の短い断片が核内にあることを示唆する報告がいくつかなされている（非特許文献１３）。ＡＰＰ６９５のＣ末端５９アミノ酸を組換え遺伝子から発現させた場合には、核内に局在し、転写調節因子であるＦｅ６５と共在した。ＡＩＣＤと蛍光タンパク質の融合タンパク質を用いた発現実験にでは、Ｆｅ６５および ヒストンアセチラーゼのサブユニットで転写調節因子であるＴｉｐ６０と複合体形成が示唆された（非特許文献１４）。これらの結果は、ＡＩＣＤ配列内に核内移行シグナルまたは修飾が含まれていることを示唆している。しかしながら、Ｇａｌ４−Ｔｉｐ６０転写活性化実験では、全長ＡＰＰプラスミドから発現させたは転写活性化が見られたが、ＡＩＣＤを発現させた場合は見られなかった。ＮｏｔｃｈおよびＮＩＣＤの系とは異なることが示唆された。これらの一連のＡＩＣＤ局在に関する実験は、元々細胞内あるＡＰＰの挙動ではなく、外部からの多量な遺伝子によるＡＩＣＤ断片の強制発現による観察結果であり、全長のＡＰＰの核内局在を否定するものではない。ＡＩＣＤ配列内に核内移行シグナルが含まれているとしたら、ＡＩＣＤを含む全長ＡＰＰが核内に移行することも十分あり得る。
ＡＰＰおよびそのファミリーＡＰＬＰ１とＡＰＬＰ２の同時ノックアウトマウスは致死的であった（非特許文献１５）。ＡＰＰノックアウトマウスは運動および記憶障害を示すことから、ＡＰＰは重要な機能を帯びていると容易に類推できる。このため、Ａβ４２周辺のみならず、ＡＰＰのアミノ酸配列の他の重要な部位における変異は疾病となる可能性が考えられる。ＡＰＰはアルツハイマー発症に関係する重要なタンパク質でありながら、その代謝詳細や機能について、今なお不明な部分が多く残されている。本発明では、ＡＰＰのアミノ末端付近の抗体を３種類用い、ＡＰＰの細胞内局在を鋭意検討した結果、ＡＰＰの一部は核内、更には核小体に局在することを、初めて示した。また核小体に局在する意義と、ＡＰＰ前半部のアミノ酸配列相同性から、機能の一部としてＲＮＡ結合活性を有する可能性を示唆した。
今回明らかになったＡＰＰの挙動として、細胞内ＡＰＰの一部が、核小体内でフィブリラリンおよびｅＩＦ６と共局在していることが分かった。フィブリラリンはｒＲＮＡ ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅであり、プレリボソームｒＲＮＡのプロセッシングの最初のステップに加わる核小体スモールリボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＡ）の構成要素である（非特許文献１６）。ｅＩＦ６はプレ６０Ｓリボソーマル粒子と結合してｍ）核小体から細胞質へリボソームを運ぶ役割を担っている（非特許文献１７）。
本発明において、ＧＳ４４６３の免疫染色シグナルは、抗フィブリラリン抗体や抗ｅＩＦ６抗体のシグナルと共局在しており、このことは、ＡＰＰがリボソーム生産や細胞増殖に関与している可能性を示唆している。細胞増殖におけるＡＰＰの役割は、以前、複数の報告により示唆されている。１つの報告では、アンチセンスＲＮＡ発現プラスミドによりＡＰＰ発現が減った繊維芽細胞は、増殖速度が遅くなった（非特許文献１８）。この細胞に外部から、培地にＡＰＰ６９５を添加すると増殖速度が回復した（非特許文献１８）。この増殖回復に必須な領域は、Ｎ末端側の４０３−４０７位のアミノ酸であった（非特許文献１９）。これらの結果からは、ＡＰＰの細胞増殖に関わる機能は、成長因子のオートクラインまたはパラクライン様式に似ている。可溶性ＡＰＰαは、リーリンやインテグリンα３β１を介して、インビトロおよびインビボにおいても、神経軸索の伸長に極めて重要であることが示された（非特許文献２０−２２）。
核小体と細胞表面を見られるタンパク質としてヌクレオリンがよく知られている。ヌクレオリンは至る所に存在する、核内非ヒストンタンパク質であり、細胞の対数増殖や、リボソームＲＮＡの合成とプロセッシングや細胞死に関与している報告がある（非特許文献２３）。ヌクレオリンは、リボソームタンパク質の核から細胞質への移送に関わっていることが知られている（非特許文献２４）。また、ヌクレオリンはＡＰＰのｍＲＮＡとも相互作用する報告がある（非特許文献２５，２６）。このような重要な生理的役割を担っているため、ヌクレオリンのノックアウト細胞も致死的であったヌクレオリンは、そのアミノ末端側に、余り保存されていない、多様な配列のネガティブチャージアミノ酸のストレッチを多く含み、この点で、ヒストンの酸性アミノ酸部分で静電相互作用して、クロマチンを緩めるＨＭＧタンパク質と類似している。ＡＰＰも、１９０−２６０アミノ酸領域に、グルタミン酸とアスパラギン酸から成る、保存性の低いネガティブチャージアミノ酸ストレッチが密集しており、細胞内挙動に加えて、この点でもヌクレオリンと類似している。
本発明でＯＬＩＧＯＢＬＡＳＴと名付けた方法で、ＡＰＰアミノ酸配列相同性を解析した結果、ＡＰＰの前半部１−５００番目には、種々の生物のｔＲＮＡ合成酵素、リボソームタンパク質、ＲＮＡ分解酵素、転写因子などＲＮＡと相互作用し得るタンパク質と部分的な相同性が見つかったことから、ＡＰＰのｒＲＮＡとの相互作用機能が示唆された（表１）。また、ヌクレオリンとのネガティブチャージアミノ酸ストレッチで部分相同性もあることがわかった（表１）。マウスで同定されたＤＮＡ結合タンパク質であるＣＤＥＢＰは、全長において、ＡＰＰとの配列相同性およびドメイン構成の相同性が見られ、細胞分裂のインタフェースでは核内に検出された（非特許文献２７）。
ＡＰＰは、一回膜貫通型タンパク質であり、少なくとも、６９５アミノ酸、７５１アミノ酸、７７０アミノ酸からなる３種類のスプライシング分子種が報告されている（非特許文献２）。ＡＰＰは内部に、αセクレターゼ、βセクレターゼ、γセクレターゼによるプロセッシング部位を持つ（非特許文献３）。ＡＰＰはγセクレターゼによる膜内での切断により、溶解型ＡＰＰ（ｓＡＰＰ）が放出される。更に、ｓＡＰＰは、αセクレターゼにより切断されるアミロイド非発生型経路とβセクレターゼにより切断されて、アミロイドＡβができるアミロイド発生型経路で代謝される。細胞内のＡＰＰは、主にゴルジ装置や小胞体の存在するとされている（非特許文献６−１２）。細胞内において、ＡＰＰが小胞体やゴルジに存在することは、ｓＡＰＰが細胞外に分泌されることと一致している。
ＡＩＣＤと呼ばれるＡＰＰのＣ末端の５０アミノ酸程度の短い断片が核内にあることを示唆する報告がいくつかなされている（非特許文献１３）。ＡＰＰ６９５のＣ末端５９アミノ酸を組換え遺伝子から発現させた場合には、核内に局在し、転写調節因子であるＦｅ６５と共在した。ＡＩＣＤと蛍光タンパク質の融合タンパク質を用いた発現実験にでは、Ｆｅ６５および ヒストンアセチラーゼのサブユニットで転写調節因子であるＴｉｐ６０と複合体形成が示唆された（非特許文献１４）。これらの結果は、ＡＩＣＤ配列内に核内移行シグナルまたは修飾が含まれていることを示唆している。しかしながら、Ｇａｌ４−Ｔｉｐ６０転写活性化実験では、全長ＡＰＰプラスミドから発現させたは転写活性化が見られたが、ＡＩＣＤを発現させた場合は見られなかった。ＮｏｔｃｈおよびＮＩＣＤの系とは異なることが示唆された。これらの一連のＡＩＣＤ局在に関する実験は、元々細胞内あるＡＰＰの挙動ではなく、外部からの多量な遺伝子によるＡＩＣＤ断片の強制発現による観察結果であり、全長のＡＰＰの核内局在を否定するものではない。ＡＩＣＤ配列内に核内移行シグナルが含まれているとしたら、ＡＩＣＤを含む全長ＡＰＰが核内に移行することも十分あり得る。
ＡＰＰおよびそのファミリーＡＰＬＰ１とＡＰＬＰ２の同時ノックアウトマウスは致死的であった（非特許文献１５）。ＡＰＰノックアウトマウスは運動および記憶障害を示すことから、ＡＰＰは重要な機能を帯びていると容易に類推できる。このため、Ａβ４２周辺のみならず、ＡＰＰのアミノ酸配列の他の重要な部位における変異は疾病となる可能性が考えられる。ＡＰＰはアルツハイマー発症に関係する重要なタンパク質でありながら、その代謝詳細や機能について、今なお不明な部分が多く残されている。本発明では、ＡＰＰのアミノ末端付近の抗体を３種類用い、ＡＰＰの細胞内局在を鋭意検討した結果、ＡＰＰの一部は核内、更には核小体に局在することを、初めて示した。また核小体に局在する意義と、ＡＰＰ前半部のアミノ酸配列相同性から、機能の一部としてＲＮＡ結合活性を有する可能性を示唆した。
今回明らかになったＡＰＰの挙動として、細胞内ＡＰＰの一部が、核小体内でフィブリラリンおよびｅＩＦ６と共局在していることが分かった。フィブリラリンはｒＲＮＡ ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅであり、プレリボソームｒＲＮＡのプロセッシングの最初のステップに加わる核小体スモールリボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＡ）の構成要素である（非特許文献１６）。ｅＩＦ６はプレ６０Ｓリボソーマル粒子と結合してｍ）核小体から細胞質へリボソームを運ぶ役割を担っている（非特許文献１７）。
本発明において、ＧＳ４４６３の免疫染色シグナルは、抗フィブリラリン抗体や抗ｅＩＦ６抗体のシグナルと共局在しており、このことは、ＡＰＰがリボソーム生産や細胞増殖に関与している可能性を示唆している。細胞増殖におけるＡＰＰの役割は、以前、複数の報告により示唆されている。１つの報告では、アンチセンスＲＮＡ発現プラスミドによりＡＰＰ発現が減った繊維芽細胞は、増殖速度が遅くなった（非特許文献１８）。この細胞に外部から、培地にＡＰＰ６９５を添加すると増殖速度が回復した（非特許文献１８）。この増殖回復に必須な領域は、Ｎ末端側の４０３−４０７位のアミノ酸であった（非特許文献１９）。これらの結果からは、ＡＰＰの細胞増殖に関わる機能は、成長因子のオートクラインまたはパラクライン様式に似ている。可溶性ＡＰＰαは、リーリンやインテグリンα３β１を介して、インビトロおよびインビボにおいても、神経軸索の伸長に極めて重要であることが示された（非特許文献２０−２２）。
核小体と細胞表面を見られるタンパク質としてヌクレオリンがよく知られている。ヌクレオリンは至る所に存在する、核内非ヒストンタンパク質であり、細胞の対数増殖や、リボソームＲＮＡの合成とプロセッシングや細胞死に関与している報告がある（非特許文献２３）。ヌクレオリンは、リボソームタンパク質の核から細胞質への移送に関わっていることが知られている（非特許文献２４）。また、ヌクレオリンはＡＰＰのｍＲＮＡとも相互作用する報告がある（非特許文献２５，２６）。このような重要な生理的役割を担っているため、ヌクレオリンのノックアウト細胞も致死的であったヌクレオリンは、そのアミノ末端側に、余り保存されていない、多様な配列のネガティブチャージアミノ酸のストレッチを多く含み、この点で、ヒストンの酸性アミノ酸部分で静電相互作用して、クロマチンを緩めるＨＭＧタンパク質と類似している。ＡＰＰも、１９０−２６０アミノ酸領域に、グルタミン酸とアスパラギン酸から成る、保存性の低いネガティブチャージアミノ酸ストレッチが密集しており、細胞内挙動に加えて、この点でもヌクレオリンと類似している。
本発明でＯＬＩＧＯＢＬＡＳＴと名付けた方法で、ＡＰＰアミノ酸配列相同性を解析した結果、ＡＰＰの前半部１−５００番目には、種々の生物のｔＲＮＡ合成酵素、リボソームタンパク質、ＲＮＡ分解酵素、転写因子などＲＮＡと相互作用し得るタンパク質と部分的な相同性が見つかったことから、ＡＰＰのｒＲＮＡとの相互作用機能が示唆された（表１）。また、ヌクレオリンとのネガティブチャージアミノ酸ストレッチで部分相同性もあることがわかった（表１）。マウスで同定されたＤＮＡ結合タンパク質であるＣＤＥＢＰは、全長において、ＡＰＰとの配列相同性およびドメイン構成の相同性が見られ、細胞分裂のインタフェースでは核内に検出された（非特許文献２７）。
ＡＰＰの核小体における局在情報の知見が得られる場合を考えてみる。
核小体は、細胞のタンパク質製造工場であるｒＲＮＡとリボソーム構築を活発に行う構造体であり、細胞の生命活動、生育、休止の制御に直接的に関わっている細胞内小器官である。ＡＤは脳神経の神経細胞数減少、消失が最終的な表現型であるため、核小体の関与の可能性も考えられる。
ＡＰＰがある状態の細胞で、一部が核小体に細胞内輸送され、例えばリボソームｒＲＮＡ合成の制御に関わっているとしたら、ＡＰＰの移動制御や核小体での働きに影響を与えるような変異は、ＡＤ発症となる可能性がある。従って、このようなＡＰＰの核小体における存否や濃度等の局在情報と細胞の状態（生育、分化、休止、アポトーシス）や認知症発症との相関性を調べていくことはＡＤ発症のメカニズムを調べることにつながる可能性がある。したがって、本発明の検出方法はＡＤの原因または作用機序を明らかにする上で極めて重要な技術である。
核小体は、細胞のタンパク質製造工場であるｒＲＮＡとリボソーム構築を活発に行う構造体であり、細胞の生命活動、生育、休止の制御に直接的に関わっている細胞内小器官である。ＡＤは脳神経の神経細胞数減少、消失が最終的な表現型であるため、核小体の関与の可能性も考えられる。
ＡＰＰがある状態の細胞で、一部が核小体に細胞内輸送され、例えばリボソームｒＲＮＡ合成の制御に関わっているとしたら、ＡＰＰの移動制御や核小体での働きに影響を与えるような変異は、ＡＤ発症となる可能性がある。従って、このようなＡＰＰの核小体における存否や濃度等の局在情報と細胞の状態（生育、分化、休止、アポトーシス）や認知症発症との相関性を調べていくことはＡＤ発症のメカニズムを調べることにつながる可能性がある。したがって、本発明の検出方法はＡＤの原因または作用機序を明らかにする上で極めて重要な技術である。
（キット）
本発明の検査キットは、少なくとも以下の（Ａ）および（Ｂ）を含むキットである。
（Ａ）ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体
（Ｂ）当該抗体とＡＰＰとの複合体の局在情報と異常有無との関連付けについて説明された取扱説明書
ここで、
（Ｂ）の取り扱い説明書は、例えば、細胞質、核、核小体において調べられたＡＰＰの存在、すなわちＡＰＰの局在性と異常有無の関係について記載された説明書をいう。さらに具体的には、ある種の細胞について、ＡＰＰが核、核小体、細胞質ともに所定量存在するのが通常であるとし、核および核小体にはほとんど存在しない場合を異常である、またはその逆の場合に異常と説明された説明書が挙げられる。また、細胞の種類、細胞の由来する患者の疾病について調べて統計的なデータを取得してその関連付けをしておくことで、細胞の異常有無の判定、疾病の判定をすることが可能となる。
本発明の検査キットは、少なくとも以下の（Ａ）および（Ｂ）を含むキットである。
（Ａ）ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体
（Ｂ）当該抗体とＡＰＰとの複合体の局在情報と異常有無との関連付けについて説明された取扱説明書
ここで、
（Ｂ）の取り扱い説明書は、例えば、細胞質、核、核小体において調べられたＡＰＰの存在、すなわちＡＰＰの局在性と異常有無の関係について記載された説明書をいう。さらに具体的には、ある種の細胞について、ＡＰＰが核、核小体、細胞質ともに所定量存在するのが通常であるとし、核および核小体にはほとんど存在しない場合を異常である、またはその逆の場合に異常と説明された説明書が挙げられる。また、細胞の種類、細胞の由来する患者の疾病について調べて統計的なデータを取得してその関連付けをしておくことで、細胞の異常有無の判定、疾病の判定をすることが可能となる。
（対象細胞）
本発明の検出方法が適用できる細胞は、特に種類は問わず、いかなる細胞も検出対象とすることができる。
本発明の検出方法が適用できる細胞は、特に種類は問わず、いかなる細胞も検出対象とすることができる。
Ｉ 材料
（１）１次抗体
（ｉ）ＧＳ４４６３（本明細書でＧＳ４４６３と命名）（図６）
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｎｏ．Ａ００６９２、抗ＡＰＰ抗体（４４−６３）
免疫原がヒトＡＰＰの４４−６３アミノ酸残基であるアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗ペプチド抗体である。２μｇ／ｍｌで使用。
（ｉｉ）１０Ｄ１（図６）
ＩＢＬ社、Ｎｏ．１１０９０、抗ヒトＡＰＰ（Ｎ）抗体（１０Ｄ１）
ヒトＡＰＰのＮ末端の１−２１０アミノ酸残基のＧＳＴ融合を免疫することによって得られたものであるため、エピトープは、ＡＰＰのＮ末端の１−２１０アミノ酸に位置する。マウスモノクローナル抗体。５μｇ／ｍｌで使用。
（ｉｉｉ）２２Ｃ１１（図６）
ミリポア社 Ｎｏ．ＭＡＢ３４８、抗ＡＰＰ抗体
免疫原はＡＰＰの６６−８１アミノ酸残基のペプチドである。マウスモノクローナル抗体。１μｇ／ｍｌで使用。上記（ｉ）から（ｉｉｉ）の抗体のＡＰＰアミノ酸配列における認識部位を示す模式図を図６に示す。
（ｉｖ）フィブリラリン抗体
Ａｂｃａｍ Ｎｏ．ａｂ４５６６、フィブリラリン抗体［３８Ｆ３］マウスＩｇＧモノクローナル抗体。１０００倍希釈で使用。
（ｖ）抗ｅＩＦ６抗体
Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 抗ｅＩＦ６抗体（Ｄ１６Ｅ９） Ｎｏ．３８３３、ウサギモノクローナル抗体。１０００倍希釈で使用。
（ｖｉ）抗ＧＡＰＤＨ抗体
Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏ．２１１８、抗ＧＡＰＤＨ抗体（１４Ｃ１０）、ウサギモノクローナル抗体。１０００倍希釈で使用。
（２）２次抗体
（２−１）蛍光染色用
いずれも、１０００倍希釈で使用した。
（ｉ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｎｏ．Ａ１１００１）ヤギ抗マウスＩｇＧ
（ｉｉ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｎｏ．Ａ１１００８）ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（ｉｉｉ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｎｏ．Ａ２１４２２）ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（２−２）ウエスタンブロット分析用
いずれも５０００倍希釈で使用した。
（ｉ）ウサギポリクローナル抗マウス免疫グロブリンアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＤＡＫＯ Ｎｏ．Ｄ０３１４）
（ｉｉ）ヤギポリクローナル抗ウサギ免疫グロブリンアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＤＡＫＯ Ｎｏ．Ｄ０４８７）
（３）ヒトＡＰＰ合成ペプチド（ＨＭＰ２０）
ヒトＡＰＰのＮ末端の４４−６３番目のアミノ酸配列（Ａｃ−ＨＭＮＶＱＮＧＫＷＤＳＤＰＳＧＴＫＴＣＩ−ＣＯＮＨ２（純度：９２％））からなるペプチド（ＨＭＰ２０）
ＢＬＡＳＴ検索によれば、ヒトにおいてこの配列と７０％以上の相同性のあるタンパク質は、ＡＰＰ以外にはない。オペロン・バイオテクノロジー株式会社（Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（東京）から入手した。
（４）細胞株及び細胞培養条件
（ｉ）ヒト神経芽ＳＫ−Ｎ−ＳＨ
ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製
Ｎｏ．ＥＣ８６０１２８０２
ＭＥＭ−α内で培養
（ｉｉ）正常ヒト星状細胞
Ｎｏ．ＣＣ−２５６５
Ｌｏｎｚａから入手
ＡＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ及びＲＥＧＭ（商標）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）内で培養
（ｉｉｉ）ヒト腎臓上皮細胞
Ｎｏ．ＣＣ−２５５４
同上
（５）細胞抽出物
（ｉ）ウエスタンブロット用タンパク質
９０ｍｍディッシュで培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞剥離溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｎｏ．Ｃ５９１４）で剥離させた。４℃において１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って沈殿させた細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｎｏ．６９７ ４９８ ００１ １１）を含む４００μＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁させた。５μＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ核酸分解酵素（Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．７０６４４−３）及び１００μＬの５×ＳＤＳ試料バッファーを素早く混合しながら添加し、ウェスタンブロット用のタンパク質として使用した。
（ｉｉ）細胞質画分
９０ｍｍディッシュから洗浄剥離し、遠心回収した細胞を、３００μＬのバッファーＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＡＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｎｏ．１１ ６９７ ４９８ ００１））内に再懸濁させ、氷上で１５分間放置した。次に、１８．８μＬの１０％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０をボルテックスしながら添加し、２５００ｒｐｍ（５００×ｇ）で３分間遠心分離した。上澄液を細胞質画分として使用した。
（ｉｉｉ）核画分
上記（ｉｉ）の沈殿物をピペットによって３００μＬのバッファーＡに再懸濁させ、２５００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ペレットを３００μＬのバッファーＢ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））内に再懸濁させ、氷上で１５分間培養し、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液を核画分として使用した。
（１）１次抗体
（ｉ）ＧＳ４４６３（本明細書でＧＳ４４６３と命名）（図６）
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｎｏ．Ａ００６９２、抗ＡＰＰ抗体（４４−６３）
免疫原がヒトＡＰＰの４４−６３アミノ酸残基であるアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗ペプチド抗体である。２μｇ／ｍｌで使用。
（ｉｉ）１０Ｄ１（図６）
ＩＢＬ社、Ｎｏ．１１０９０、抗ヒトＡＰＰ（Ｎ）抗体（１０Ｄ１）
ヒトＡＰＰのＮ末端の１−２１０アミノ酸残基のＧＳＴ融合を免疫することによって得られたものであるため、エピトープは、ＡＰＰのＮ末端の１−２１０アミノ酸に位置する。マウスモノクローナル抗体。５μｇ／ｍｌで使用。
（ｉｉｉ）２２Ｃ１１（図６）
ミリポア社 Ｎｏ．ＭＡＢ３４８、抗ＡＰＰ抗体
免疫原はＡＰＰの６６−８１アミノ酸残基のペプチドである。マウスモノクローナル抗体。１μｇ／ｍｌで使用。上記（ｉ）から（ｉｉｉ）の抗体のＡＰＰアミノ酸配列における認識部位を示す模式図を図６に示す。
（ｉｖ）フィブリラリン抗体
Ａｂｃａｍ Ｎｏ．ａｂ４５６６、フィブリラリン抗体［３８Ｆ３］マウスＩｇＧモノクローナル抗体。１０００倍希釈で使用。
（ｖ）抗ｅＩＦ６抗体
Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 抗ｅＩＦ６抗体（Ｄ１６Ｅ９） Ｎｏ．３８３３、ウサギモノクローナル抗体。１０００倍希釈で使用。
（ｖｉ）抗ＧＡＰＤＨ抗体
Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏ．２１１８、抗ＧＡＰＤＨ抗体（１４Ｃ１０）、ウサギモノクローナル抗体。１０００倍希釈で使用。
（２）２次抗体
（２−１）蛍光染色用
いずれも、１０００倍希釈で使用した。
（ｉ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｎｏ．Ａ１１００１）ヤギ抗マウスＩｇＧ
（ｉｉ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｎｏ．Ａ１１００８）ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（ｉｉｉ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｎｏ．Ａ２１４２２）ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（２−２）ウエスタンブロット分析用
いずれも５０００倍希釈で使用した。
（ｉ）ウサギポリクローナル抗マウス免疫グロブリンアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＤＡＫＯ Ｎｏ．Ｄ０３１４）
（ｉｉ）ヤギポリクローナル抗ウサギ免疫グロブリンアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＤＡＫＯ Ｎｏ．Ｄ０４８７）
（３）ヒトＡＰＰ合成ペプチド（ＨＭＰ２０）
ヒトＡＰＰのＮ末端の４４−６３番目のアミノ酸配列（Ａｃ−ＨＭＮＶＱＮＧＫＷＤＳＤＰＳＧＴＫＴＣＩ−ＣＯＮＨ２（純度：９２％））からなるペプチド（ＨＭＰ２０）
ＢＬＡＳＴ検索によれば、ヒトにおいてこの配列と７０％以上の相同性のあるタンパク質は、ＡＰＰ以外にはない。オペロン・バイオテクノロジー株式会社（Ｏｐｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（東京）から入手した。
（４）細胞株及び細胞培養条件
（ｉ）ヒト神経芽ＳＫ−Ｎ−ＳＨ
ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製
Ｎｏ．ＥＣ８６０１２８０２
ＭＥＭ−α内で培養
（ｉｉ）正常ヒト星状細胞
Ｎｏ．ＣＣ−２５６５
Ｌｏｎｚａから入手
ＡＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ及びＲＥＧＭ（商標）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）内で培養
（ｉｉｉ）ヒト腎臓上皮細胞
Ｎｏ．ＣＣ−２５５４
同上
（５）細胞抽出物
（ｉ）ウエスタンブロット用タンパク質
９０ｍｍディッシュで培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞剥離溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｎｏ．Ｃ５９１４）で剥離させた。４℃において１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って沈殿させた細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｎｏ．６９７ ４９８ ００１ １１）を含む４００μＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁させた。５μＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ核酸分解酵素（Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．７０６４４−３）及び１００μＬの５×ＳＤＳ試料バッファーを素早く混合しながら添加し、ウェスタンブロット用のタンパク質として使用した。
（ｉｉ）細胞質画分
９０ｍｍディッシュから洗浄剥離し、遠心回収した細胞を、３００μＬのバッファーＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＡＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｎｏ．１１ ６９７ ４９８ ００１））内に再懸濁させ、氷上で１５分間放置した。次に、１８．８μＬの１０％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０をボルテックスしながら添加し、２５００ｒｐｍ（５００×ｇ）で３分間遠心分離した。上澄液を細胞質画分として使用した。
（ｉｉｉ）核画分
上記（ｉｉ）の沈殿物をピペットによって３００μＬのバッファーＡに再懸濁させ、２５００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ペレットを３００μＬのバッファーＢ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））内に再懸濁させ、氷上で１５分間培養し、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液を核画分として使用した。
ＩＩ 免疫染色および免疫蛍光顕微鏡法
全ての実験では、８３５４６８８ ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ ＰＤＬ／Ｌａｍｉｎｉｎ８ウェル培養スライド内において、図に示す０．３ｍＬの培地内で細胞（３×１０5）を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養した。免疫染色処理は氷上において０℃で行った。細胞をＰＢＳで２回洗浄（各５分間）し、ＰＢＳで希釈した４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、２回洗浄（各５分間）し、ＰＢＳで希釈した５％ヤギ血清で１時間にわたってブロックした。固定した細胞を、第１の抗体を含む２５０μＬのブロッキングバッファー内で４℃で一晩培養した。第１の抗体の濃度は、２μｇ／ｍＬ（ＧＳ４４６３）、５μｇ／ｍＬ（１０Ｄ１）、１μｇ／ｍＬ（２２Ｃ１１）とした。第１の抗体と共に培養した後、細胞をＰＢＳで３回洗浄（各５分間）し、ＰＢＳで希釈した５％ヤギ血清で３０分間にわたってブロックした。ブロッキングバッファーを第２の抗体を含む同一のバッファーと交換し、Ａｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のコンジュゲートを１０００倍の希釈率で添加し、１時間にわたって培養を行った。３回洗浄（各５分間）した後、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄを細胞に添加した。免疫染色スライドはＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ Ｃｏｎｆｏｃａｌによって分析した。ＧＳ４４６３、ＨＭＰ２０、ヒトＡＰＰ合成ペプチド（４４−６３）（Ａｃ−ＨＭＮＶＱＮＧＫＷＤＳＤＰＳＧＴＫＴＣＩ−ＣＯＮＨ２）を使用した競合実験では、染色反応を行う前に、ＧＳ４４６３を５％ヤギ血清及び１００μｇ／ｍＬの当該ペプチドを含むＰＢＳ内で室温で１時間にプレインキュベーションを行った。
全ての実験では、８３５４６８８ ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ ＰＤＬ／Ｌａｍｉｎｉｎ８ウェル培養スライド内において、図に示す０．３ｍＬの培地内で細胞（３×１０5）を３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養した。免疫染色処理は氷上において０℃で行った。細胞をＰＢＳで２回洗浄（各５分間）し、ＰＢＳで希釈した４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、２回洗浄（各５分間）し、ＰＢＳで希釈した５％ヤギ血清で１時間にわたってブロックした。固定した細胞を、第１の抗体を含む２５０μＬのブロッキングバッファー内で４℃で一晩培養した。第１の抗体の濃度は、２μｇ／ｍＬ（ＧＳ４４６３）、５μｇ／ｍＬ（１０Ｄ１）、１μｇ／ｍＬ（２２Ｃ１１）とした。第１の抗体と共に培養した後、細胞をＰＢＳで３回洗浄（各５分間）し、ＰＢＳで希釈した５％ヤギ血清で３０分間にわたってブロックした。ブロッキングバッファーを第２の抗体を含む同一のバッファーと交換し、Ａｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のコンジュゲートを１０００倍の希釈率で添加し、１時間にわたって培養を行った。３回洗浄（各５分間）した後、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄを細胞に添加した。免疫染色スライドはＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ Ｃｏｎｆｏｃａｌによって分析した。ＧＳ４４６３、ＨＭＰ２０、ヒトＡＰＰ合成ペプチド（４４−６３）（Ａｃ−ＨＭＮＶＱＮＧＫＷＤＳＤＰＳＧＴＫＴＣＩ−ＣＯＮＨ２）を使用した競合実験では、染色反応を行う前に、ＧＳ４４６３を５％ヤギ血清及び１００μｇ／ｍＬの当該ペプチドを含むＰＢＳ内で室温で１時間にプレインキュベーションを行った。
ＩＩＩ ウエスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料のタンパク質濃度を、純水（ＤＷ）で１０倍に希釈した後にＢＩＯＲＡＤタンパク質検定法で測定した。１０μｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用細胞抽出物タンパク質試料又は６μＬの分子量マーカー（ＢＩＯＲＡＤ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ）を４〜２０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｃｏｓｍｏｂｉｏ Ｃｏ． Ｌｔｄ．、Ｎｏ．４１４８７９）（２０ｍＡ）に添加し、ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．ＩＢ１００１）によってニトロセルロース膜（Ｎｏ．ＩＢ３０１０−０２）にブロットした。膜をＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）で希釈した３％スキムミルクによって室温で１時間又は４℃で一晩ブロックし、０．３％スキムミルク／ＰＢＳＴ中で上記で示した濃度で１次抗体と共にインキュベートした。次に、膜を０．３％スキムミルク／ＰＢＳＴで３回洗浄（各５分間）し、２次抗体（アルカリホスファターゼコンジュゲート）（希釈率：５０００倍）と共に１時間インキュベートした。３回洗浄した後、免疫反応バンドをアルカリホスファターゼ基質溶液（１−ｓｔｅｐ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎｏ．ＰＩ３４０４２）と３０分間反応させて検出した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料のタンパク質濃度を、純水（ＤＷ）で１０倍に希釈した後にＢＩＯＲＡＤタンパク質検定法で測定した。１０μｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用細胞抽出物タンパク質試料又は６μＬの分子量マーカー（ＢＩＯＲＡＤ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ）を４〜２０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｃｏｓｍｏｂｉｏ Ｃｏ． Ｌｔｄ．、Ｎｏ．４１４８７９）（２０ｍＡ）に添加し、ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．ＩＢ１００１）によってニトロセルロース膜（Ｎｏ．ＩＢ３０１０−０２）にブロットした。膜をＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）で希釈した３％スキムミルクによって室温で１時間又は４℃で一晩ブロックし、０．３％スキムミルク／ＰＢＳＴ中で上記で示した濃度で１次抗体と共にインキュベートした。次に、膜を０．３％スキムミルク／ＰＢＳＴで３回洗浄（各５分間）し、２次抗体（アルカリホスファターゼコンジュゲート）（希釈率：５０００倍）と共に１時間インキュベートした。３回洗浄した後、免疫反応バンドをアルカリホスファターゼ基質溶液（１−ｓｔｅｐ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎｏ．ＰＩ３４０４２）と３０分間反応させて検出した。
〔実施例１〕 ヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨにおけるＡＰＰの検出（１）
１．試験方法
ヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨについて、抗体、１０Ｄ１、ＧＳ４４６３、２２Ｃ１１を使用して細胞を免疫染色して免疫蛍光顕微鏡により観察した。
２．試験結果
染色の結果を図１に示す。
１０Ｄ１は細胞の細胞質及び核全体を染色した。ＧＳ４４６３も細胞質及び核を染色した。ＧＳ４４６３による核内からの点状染色シグナルは、明らかに核小体又は小斑点様構造を示した。一方、２２Ｃ１１による染色パターンは上記２つの抗体とは異なり、ほとんどが細胞質及びチューブリン様網目構造に存在していた。ＧＳ４４６３及び１００μｇ／ｍＬのヒトＡＰＰ合成ペプチド（４４−６３）とのプレインキュベーションにより、細胞質及び核染色シグナルはなくなった。これらの結果は、ＧＳ４４６３からの免疫染色シグナルは、ＡＰＰの４４−６３アミノ酸残基の配列を認識する抗体から現れることを示している。
１．試験方法
ヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨについて、抗体、１０Ｄ１、ＧＳ４４６３、２２Ｃ１１を使用して細胞を免疫染色して免疫蛍光顕微鏡により観察した。
２．試験結果
染色の結果を図１に示す。
１０Ｄ１は細胞の細胞質及び核全体を染色した。ＧＳ４４６３も細胞質及び核を染色した。ＧＳ４４６３による核内からの点状染色シグナルは、明らかに核小体又は小斑点様構造を示した。一方、２２Ｃ１１による染色パターンは上記２つの抗体とは異なり、ほとんどが細胞質及びチューブリン様網目構造に存在していた。ＧＳ４４６３及び１００μｇ／ｍＬのヒトＡＰＰ合成ペプチド（４４−６３）とのプレインキュベーションにより、細胞質及び核染色シグナルはなくなった。これらの結果は、ＧＳ４４６３からの免疫染色シグナルは、ＡＰＰの４４−６３アミノ酸残基の配列を認識する抗体から現れることを示している。
〔実施例２〕 ヒト神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨにおけるＡＰＰの検出（２）
１．試験方法
上記実施例１によりＧＳ４４６３により細胞質および核にＡＰＰが存在することがわかったが、さらに核のうちでもＡＰＰの存在部位が核小体かどうかについて調べた。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を核小体マーカーであるフィブリラリン及びｅＩＦ６に対する抗体およびＧＳ４４６３によって染色した。
２．試験結果
結果を図２に示す。
核におけるＧＳ４４６３からのシグナルは、フィブリラリン及びｅＩＦ６抗体からのシグナルと完全に一致しており、ＡＰＰと核小体マーカーの共局在化が確認された。一方、ＧＳ４４６３からのシグナルは、小斑点マーカーＳＣ３５抗体（ａｂ１１８２６）（データは示さず）の抗体と共局在化しなかった。これらの結果は、ＡＰＰの一部の画分が核小体（少なくとも培養神経芽細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）に位置することを示している。
１．試験方法
上記実施例１によりＧＳ４４６３により細胞質および核にＡＰＰが存在することがわかったが、さらに核のうちでもＡＰＰの存在部位が核小体かどうかについて調べた。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を核小体マーカーであるフィブリラリン及びｅＩＦ６に対する抗体およびＧＳ４４６３によって染色した。
２．試験結果
結果を図２に示す。
核におけるＧＳ４４６３からのシグナルは、フィブリラリン及びｅＩＦ６抗体からのシグナルと完全に一致しており、ＡＰＰと核小体マーカーの共局在化が確認された。一方、ＧＳ４４６３からのシグナルは、小斑点マーカーＳＣ３５抗体（ａｂ１１８２６）（データは示さず）の抗体と共局在化しなかった。これらの結果は、ＡＰＰの一部の画分が核小体（少なくとも培養神経芽細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）に位置することを示している。
〔実施例３〕 ヒト正常組織、脳及び腎臓から採取した初代培養細胞におけるＡＰＰの検出
１．ヒト正常組織、脳及び腎臓から採取した初代培養細胞について、抗体、１０Ｄ１、ＧＳ４４６３を使用して細胞を免疫染色して免疫蛍光顕微鏡により観察した。
２．試験結果
結果を図３及び図４に示す。
１０Ｄ１は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞と同様にヒト腎臓上皮細胞（ＨＲＥＣ）の核を染色したが、正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）においては、細胞質を染色した。ＧＳ４４６３は、ＮＨＡ及びＨＲＥＣの両方において、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞と同様に核小体様染色を示した。これらの１０Ｄ１、ＧＳ４４６３からのシグナルは、ヒトＡＰＰ合成ペプチド（４４−６３）との予備培養によって観察されなくなった。したがって、ＡＰＰの画分の一部は脳及び腎臓から採取した正常細胞においても核小体に局在することを示している。
１．ヒト正常組織、脳及び腎臓から採取した初代培養細胞について、抗体、１０Ｄ１、ＧＳ４４６３を使用して細胞を免疫染色して免疫蛍光顕微鏡により観察した。
２．試験結果
結果を図３及び図４に示す。
１０Ｄ１は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞と同様にヒト腎臓上皮細胞（ＨＲＥＣ）の核を染色したが、正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）においては、細胞質を染色した。ＧＳ４４６３は、ＮＨＡ及びＨＲＥＣの両方において、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞と同様に核小体様染色を示した。これらの１０Ｄ１、ＧＳ４４６３からのシグナルは、ヒトＡＰＰ合成ペプチド（４４−６３）との予備培養によって観察されなくなった。したがって、ＡＰＰの画分の一部は脳及び腎臓から採取した正常細胞においても核小体に局在することを示している。
〔実施例４〕 細胞質抽出物および核抽出物におけるＡＰＰの検出
１．試験方法
細胞質画分（細胞質抽出物）および核画分（核抽出物）におけるＡＰＰプロセッシング産物の分布及び分子量を調べるために、ＭＥＭ−α内で培養したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の細胞質画分及び核画分について抗体ＧＳ４４６３を使用してウエスタンブロットによって分析した。各画分からの抽出物の濃縮はＧＡＰＤＨ及びフィブリラリンに対する抗体によって確認した（図５−１）。
２．試験結果
結果を図５−２に示す。
完全長のＡＰＰと思われる１１０〜１２０Ｋｄのバンドが全ての抗体によって細胞質画分において観察された（図５−２（１）−（３））。グリコシド化反応のようなより高分子量スメアバンドが１０Ｄ１又は２２Ｃ１１を使用することによって観察された。核画分に特異的な３０Ｋｄのバンドが１０Ｄ１によって観察された。核画分における主要な免疫学的染色バンドは２２Ｃ１１によって観察されなかった。１２０Ｋｄの産物に加えて、ＧＳ４４６３によって５０ｋｄの産物が細胞質画分（主要バンド）及び核画分において観察されたが、細胞質画分で観察された１１０ｋｄのバンドは核画分において検出されなかった。上述したプロトコルによって調製したタンパク質の量が同じ場合、５０Ｋｄの産物に対する１２０ｋｄの産物のモル比は核画分においてより高いように思われる。１２０ｋｄ及び５０Ｋｄの産物はヒトＡＰＰ合成ペプチド（４４−６３）とのプレインキュベーションによって消失し、これらのシグナルはＡＰＰの４４−６３アミノ酸配列を認識する抗体に由来することを示している。また、７０Ｋｄの産物が両方の画分で検出され、６０Ｋｄの産物は強い染色条件においては核画分のみにおいて観察された（図５−２（５））。
１．試験方法
細胞質画分（細胞質抽出物）および核画分（核抽出物）におけるＡＰＰプロセッシング産物の分布及び分子量を調べるために、ＭＥＭ−α内で培養したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の細胞質画分及び核画分について抗体ＧＳ４４６３を使用してウエスタンブロットによって分析した。各画分からの抽出物の濃縮はＧＡＰＤＨ及びフィブリラリンに対する抗体によって確認した（図５−１）。
２．試験結果
結果を図５−２に示す。
完全長のＡＰＰと思われる１１０〜１２０Ｋｄのバンドが全ての抗体によって細胞質画分において観察された（図５−２（１）−（３））。グリコシド化反応のようなより高分子量スメアバンドが１０Ｄ１又は２２Ｃ１１を使用することによって観察された。核画分に特異的な３０Ｋｄのバンドが１０Ｄ１によって観察された。核画分における主要な免疫学的染色バンドは２２Ｃ１１によって観察されなかった。１２０Ｋｄの産物に加えて、ＧＳ４４６３によって５０ｋｄの産物が細胞質画分（主要バンド）及び核画分において観察されたが、細胞質画分で観察された１１０ｋｄのバンドは核画分において検出されなかった。上述したプロトコルによって調製したタンパク質の量が同じ場合、５０Ｋｄの産物に対する１２０ｋｄの産物のモル比は核画分においてより高いように思われる。１２０ｋｄ及び５０Ｋｄの産物はヒトＡＰＰ合成ペプチド（４４−６３）とのプレインキュベーションによって消失し、これらのシグナルはＡＰＰの４４−６３アミノ酸配列を認識する抗体に由来することを示している。また、７０Ｋｄの産物が両方の画分で検出され、６０Ｋｄの産物は強い染色条件においては核画分のみにおいて観察された（図５−２（５））。
〔実施例５〕 ＡＰＰアミノ酸配列とＤＮＡまたＲＮＡ結合タンパク質アミノ酸配列相同性
機能タンパク質は、そもそもポリペプチドの最少機能単位であるモチーフと呼ばれる１５アミノ酸程度の配列の組み合わせであるとされている。これに基づいて、ヒトＡＰＰのアミノ酸配列１−７７０を、３０〜５０アミノ酸ごとに区切り、相同性検索アルゴリズムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で検索した。通常、ＢＬＡＳＴでは、相同性領域が長いほど良いスコアとなり、相同性の高いスコアから、ヒット対象がリストアップされる。このため、そのまま長い配列をＢＬＡＳＴ検索にかけても、相同性は高くとも短い配列のヒット対象は、非常に低いスコアとなり、リスト上位２５０位では見えない。しかしながら、短い配列をＢＬＡＳＴにかけることで、短いが相同性の高いヒット対象が見えるようになる。このようなヒットはＥ値が高くなり、一つ一つの信頼性は低くなるが、同様の機能の種々のタンパク質がヒットしたり、ヒットする位置が集中したりすることで、その領域の機能の類推が可能となる。このような方法を本明細書でＯＬＩＧＯＢＬＡＳＴとした。その結果、表１に示すように、ＡＰＰの１〜５００に、種々の微生物のｔＲＮＡ 合成酵素、リボソームタンパク質、ＲＮＡ分解酵素、転写因子、ＤＮＡ結合タンパク質などと短いが６０−１００％の相同性のあることが分かり、特に４００〜５００番目に集中していた。また、ｒＲＮＡに結合してリボソーム構築に関わり、細胞表面と核小体を行き来するヌクレオリンとの相同性も見つかった。通常のモチーフ検索アルゴリズムでは、これらのヒットは見られないことから、本検索方法は有用である。
機能タンパク質は、そもそもポリペプチドの最少機能単位であるモチーフと呼ばれる１５アミノ酸程度の配列の組み合わせであるとされている。これに基づいて、ヒトＡＰＰのアミノ酸配列１−７７０を、３０〜５０アミノ酸ごとに区切り、相同性検索アルゴリズムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で検索した。通常、ＢＬＡＳＴでは、相同性領域が長いほど良いスコアとなり、相同性の高いスコアから、ヒット対象がリストアップされる。このため、そのまま長い配列をＢＬＡＳＴ検索にかけても、相同性は高くとも短い配列のヒット対象は、非常に低いスコアとなり、リスト上位２５０位では見えない。しかしながら、短い配列をＢＬＡＳＴにかけることで、短いが相同性の高いヒット対象が見えるようになる。このようなヒットはＥ値が高くなり、一つ一つの信頼性は低くなるが、同様の機能の種々のタンパク質がヒットしたり、ヒットする位置が集中したりすることで、その領域の機能の類推が可能となる。このような方法を本明細書でＯＬＩＧＯＢＬＡＳＴとした。その結果、表１に示すように、ＡＰＰの１〜５００に、種々の微生物のｔＲＮＡ 合成酵素、リボソームタンパク質、ＲＮＡ分解酵素、転写因子、ＤＮＡ結合タンパク質などと短いが６０−１００％の相同性のあることが分かり、特に４００〜５００番目に集中していた。また、ｒＲＮＡに結合してリボソーム構築に関わり、細胞表面と核小体を行き来するヌクレオリンとの相同性も見つかった。通常のモチーフ検索アルゴリズムでは、これらのヒットは見られないことから、本検索方法は有用である。
本発明によりAPPの新しい局在情報を知ることができる。そして当該情報により、APPの新しい代謝調節経路、機能の情報を得ることにつながり、APPの本来の生理作用とAD発症機構を探る研究にとって極めて有用性が高い。たとえば、APPが核に局在するという情報だけでも、APPの関係する機能が複製、DNA修飾、転写などに絞られる。また、同様に、核小体はrRNA合成工場であり、細胞の休止・生育・消失の制御に関わるため、APPが核小体に局在するという情報だけでも、APPの関連する機能をこれらに絞ることができる。
さらにまた、APPの異常な局在性と疾病との相関性を調べることにより、APPの異常な局在性と相関する疾病の診断をすることも可能になる。
さらにまた、APPの異常な局在性と疾病との相関性を調べることにより、APPの異常な局在性と相関する疾病の診断をすることも可能になる。
〔非特許文献〕
H.K. Anandatheerthavarada, G. Biswas, M.A. Robin, N.G. Avadhani, Mitochondrial targeting and a novel transmembrane arrest of Alzheimer's amyloid precursor proteinimpairs mitochondrial function in neuronal cells, J. Cell Bio. 161 (2003) 41-54. M. Arbel, I. Yacoby, B. Solomon, Inhibition of amyloid precursor protein processing by beta-secretase through site-directed antibodies, Proc. Natl. Acad. Sci. 102 (2005) 7718-7723. R. Palmisano, P. Golfi, P. Heimann, C. Shaw, C. Troakes, T. Schmitt-John, J.W. Bartsch, Endosomal accumulation of APP in wobbler motor neurons reflects impaired vesicle trafficking: Implications for human motor neuron disease, BMC Neurosci. 12 (2011) 24. R. Cappa, F. Cheng, G.D Ciccotosto, B. E. Needham, C.L. Masters, G.M., L.K. Fransson, K. Mani, The amyloid precursor protein (APP) of Alzheimer disease and its paralog, APLP2, modulate the Cu/Zn-Nitric oxide-catalyzed degradation of glypican-1 heparan sulfate in vivo, J. Biol. Chem. 280 (2005) 13913-13920. P. Seubert, T. Oltersdorf, M.G. Lee, R. Barbour, C. Blomquist, D.L. Davis, K. Bryant, L.C. Fritz, D. Galasko, L.J. Thal, I. Lieberburg, D.B. Schenk, Secretion of beta-amyloid precursor protein cleaved at the amino terminus of the beta-amyloid peptide, Nature. 361 (1993) 260-263. M. Citron, D.B. Teplow, D.J. Selkoe, Generation of amyloid β protein from its precursor is sequence specific, Neuron. 14 (1995) 661-670. X. Cao, T.C. Sudhof, Dissection of amyloid-beta precursor protein-dependent transcriptional transactivation, J. Biol. Chem. 279 (2004) 24601-24611. Heber S, Herms J, Gajic V, Hainfellner J, Aguzzi A, Rulicke T, Kretzschmar H, von Koch C, Sisodia S, Tremml P, Lipp H-P, Wolfer DP, Muller U (2000) Mice with combined gene knock-outs reveal essential and partially redundant functions of amyloid precursor protein family members. J Neurosci 20: 7951-7963. M. Aittaleb, T. Visone, M.O. Fenley, H. Li, Structural and Thermodynamic Evidence for a Stabilizing Role of Nop5p in S-Adenosyl-L-methionine Binding to Fibrillarin, J. Biol. Chem. 279 (2004) 41822-41829. F. Sanvito, S. Piatti, A. Villa, M. Bossi, G. Lucchini, P.C. Marchisio, S. Biffo, The beta4 integrin interactor p27(BBP/eIF6) is an essential nuclear matrix protein involved in 60S ribosomal subunit assembly, J. Cell Biol. 144 (1999) 823-837. T. Saitoh, M. Sundsmo, J.M. Roch, N. Kimura, G. Cole, D. Schubert, T. Oltersdorf, D.B. Schenk, Secreted form of amyloid beta protein precursor is involved in the growth regulation of fibroblasts, Cell. 58(1989) 615-622. H, Ninomiya, J.M. Roch, M.P. Sundsmo, D.A. Otero, T. Saitoh, Amino acid sequence RERMS represents the active domain of amyloid beta/A4 protein precursor that promotes fibroblast growth, J. Cell Biol. 121 (1993) 879-886. R.G. Perez, H. Zheng, L.H. Van der Ploeg, E.H. Koo, The β-Amyloid Precursor Protein of Alzheimer's Disease Enhances Neuron Viability and Modulates Neuronal Polarity, J. Neurosci. 17 (1997) 9407-9414. T.L Young-Pearse, A.C Chen, R. Chang, C. Marquez, D.J. Selkoe, Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1, Neural Develop. 3 (2008) 15. H.-S. Hoe, K.J. Lee, R. S. E. Carney, J. Lee, A. Markova, J.-Y. Lee, B.W. Howell, B.T. Hyman, D.T.S. Pak, G. Bu, G.W. Rebeck, Interaction of reelin with amyloid precursor protein promotes neurite outgrowth, J. Neurosci. 29 (2009) 7459-7473. M. Srivastava, H.B. Pollard, Molecular dissection of nucleolin's role in growth and cell proliferation: New insights, FASEB J. 13 (1999) 1911-1922. E.A. Nigg, Nucleocytoplasmic transport: signals, mechanisms and regulation. Nature 386 (1997) 779-787. S.H. Zaidi, J.S. Malter, Nucleolin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins specifically interact with the 3'-untranslated region of amyloid protein precursor mRNA, J. Biol. Chem. 270 (1995) 17292-17298. M. Erard, F. Lakhadar, F. Amalric, Repeat peptide motifs which contain β-turns and modulate DNA condensation in chromatin, Eur. J. Biochem. 191 (1990) 19-26. A. Blangy, F. Vidal, F. Cuzin, Y.H. Yang, K. Boulukos and M. Rassoulzadegan,CDEBP, a site-specific DNA-binding protein of the 'APP-like' family, is required during the early development of the mouse, 1995 J Cell Sci 108, 675-683.
H.K. Anandatheerthavarada, G. Biswas, M.A. Robin, N.G. Avadhani, Mitochondrial targeting and a novel transmembrane arrest of Alzheimer's amyloid precursor proteinimpairs mitochondrial function in neuronal cells, J. Cell Bio. 161 (2003) 41-54. M. Arbel, I. Yacoby, B. Solomon, Inhibition of amyloid precursor protein processing by beta-secretase through site-directed antibodies, Proc. Natl. Acad. Sci. 102 (2005) 7718-7723. R. Palmisano, P. Golfi, P. Heimann, C. Shaw, C. Troakes, T. Schmitt-John, J.W. Bartsch, Endosomal accumulation of APP in wobbler motor neurons reflects impaired vesicle trafficking: Implications for human motor neuron disease, BMC Neurosci. 12 (2011) 24. R. Cappa, F. Cheng, G.D Ciccotosto, B. E. Needham, C.L. Masters, G.M., L.K. Fransson, K. Mani, The amyloid precursor protein (APP) of Alzheimer disease and its paralog, APLP2, modulate the Cu/Zn-Nitric oxide-catalyzed degradation of glypican-1 heparan sulfate in vivo, J. Biol. Chem. 280 (2005) 13913-13920. P. Seubert, T. Oltersdorf, M.G. Lee, R. Barbour, C. Blomquist, D.L. Davis, K. Bryant, L.C. Fritz, D. Galasko, L.J. Thal, I. Lieberburg, D.B. Schenk, Secretion of beta-amyloid precursor protein cleaved at the amino terminus of the beta-amyloid peptide, Nature. 361 (1993) 260-263. M. Citron, D.B. Teplow, D.J. Selkoe, Generation of amyloid β protein from its precursor is sequence specific, Neuron. 14 (1995) 661-670. X. Cao, T.C. Sudhof, Dissection of amyloid-beta precursor protein-dependent transcriptional transactivation, J. Biol. Chem. 279 (2004) 24601-24611. Heber S, Herms J, Gajic V, Hainfellner J, Aguzzi A, Rulicke T, Kretzschmar H, von Koch C, Sisodia S, Tremml P, Lipp H-P, Wolfer DP, Muller U (2000) Mice with combined gene knock-outs reveal essential and partially redundant functions of amyloid precursor protein family members. J Neurosci 20: 7951-7963. M. Aittaleb, T. Visone, M.O. Fenley, H. Li, Structural and Thermodynamic Evidence for a Stabilizing Role of Nop5p in S-Adenosyl-L-methionine Binding to Fibrillarin, J. Biol. Chem. 279 (2004) 41822-41829. F. Sanvito, S. Piatti, A. Villa, M. Bossi, G. Lucchini, P.C. Marchisio, S. Biffo, The beta4 integrin interactor p27(BBP/eIF6) is an essential nuclear matrix protein involved in 60S ribosomal subunit assembly, J. Cell Biol. 144 (1999) 823-837. T. Saitoh, M. Sundsmo, J.M. Roch, N. Kimura, G. Cole, D. Schubert, T. Oltersdorf, D.B. Schenk, Secreted form of amyloid beta protein precursor is involved in the growth regulation of fibroblasts, Cell. 58(1989) 615-622. H, Ninomiya, J.M. Roch, M.P. Sundsmo, D.A. Otero, T. Saitoh, Amino acid sequence RERMS represents the active domain of amyloid beta/A4 protein precursor that promotes fibroblast growth, J. Cell Biol. 121 (1993) 879-886. R.G. Perez, H. Zheng, L.H. Van der Ploeg, E.H. Koo, The β-Amyloid Precursor Protein of Alzheimer's Disease Enhances Neuron Viability and Modulates Neuronal Polarity, J. Neurosci. 17 (1997) 9407-9414. T.L Young-Pearse, A.C Chen, R. Chang, C. Marquez, D.J. Selkoe, Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1, Neural Develop. 3 (2008) 15. H.-S. Hoe, K.J. Lee, R. S. E. Carney, J. Lee, A. Markova, J.-Y. Lee, B.W. Howell, B.T. Hyman, D.T.S. Pak, G. Bu, G.W. Rebeck, Interaction of reelin with amyloid precursor protein promotes neurite outgrowth, J. Neurosci. 29 (2009) 7459-7473. M. Srivastava, H.B. Pollard, Molecular dissection of nucleolin's role in growth and cell proliferation: New insights, FASEB J. 13 (1999) 1911-1922. E.A. Nigg, Nucleocytoplasmic transport: signals, mechanisms and regulation. Nature 386 (1997) 779-787. S.H. Zaidi, J.S. Malter, Nucleolin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins specifically interact with the 3'-untranslated region of amyloid protein precursor mRNA, J. Biol. Chem. 270 (1995) 17292-17298. M. Erard, F. Lakhadar, F. Amalric, Repeat peptide motifs which contain β-turns and modulate DNA condensation in chromatin, Eur. J. Biochem. 191 (1990) 19-26. A. Blangy, F. Vidal, F. Cuzin, Y.H. Yang, K. Boulukos and M. Rassoulzadegan,CDEBP, a site-specific DNA-binding protein of the 'APP-like' family, is required during the early development of the mouse, 1995 J Cell Sci 108, 675-683.
Claims (10)
- 以下の工程を含むＡＰＰを検出する方法。
（ａ）細胞中のＡＰＰと、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体と反応させる工程；
（ｂ）該抗体とＡＰＰの複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を検出する工程；および
（ｄ）該複合体の検出部位を特定し、ＡＰＰの局在情報を得る工程 - 該複合体の検出部位の特定が、あらかじめ細胞を前処理して部位を選択し、当該選択部位における検出有無により行う、請求項１に記載のＡＰＰを検出する方法。
- ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、４４−６３番目の一部を認識する抗体である請求項１または２に記載のＡＰＰを検出する方法。
- ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、ＧＳ４４６３（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｎｏ．Ａ００６９２、抗ＡＰＰ抗体（４４−６３））または１０Ｄ１（ＩＢＬ社、Ｎｏ．１１０９０、抗ヒトＡＰＰ（Ｎ）抗体（１０Ｄ１））である請求項１〜３のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
- ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、ＧＳ４４６３（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｎｏ．Ａ００６９２、抗ＡＰＰ抗体（４４−６３））とＡＰＰ結合において競合する抗体または１０Ｄ１（ＩＢＬ社、Ｎｏ．１１０９０、抗ヒトＡＰＰ（Ｎ）抗体（１０Ｄ１））とＡＰＰ結合において競合する抗体である請求項１〜４のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
- ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体が、ＨＭＰ−２０を認識する抗体である請求項１〜５のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
- 検出部位が、細胞質、核または核小体のいずれか１以上である請求項１〜６のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
- 検出部位が核小体であって、さらに以下の工程を含む請求項１〜７のいずれかに記載のＡＰＰを検出する方法。
（ｅ）フィブラリン抗体またはｅｌＦ６により核小体を検出する工程 - 細胞におけるＡＰＰ局在性の異常有無の判定方法であって、
（ａ）細胞中のＡＰＰと、ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体と接触させる工程；
（ｂ）該抗体とＡＰＰの複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を検出する工程；および
（ｄ）該複合体の検出部位を特定することによりＡＰＰの局在情報を得て、あらかじめ求めた正常状態との比較から、細胞のＡＰＰ局在性の異常有無を判定する工程、
を含む方法。 - ＡＰＰのアミノ酸配列の１−２１０番目（ただし、６６−８１番目を除く）のいずれか一部を認識する抗体、および当該抗体とＡＰＰとの複合体の局在情報と異常有無との関連付けについて説明された取扱説明書、
を含むＡＰＰの局在性の異常有無を判定する検査キット。
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| JP2011524523A (ja) * | 2008-06-12 | 2011-09-01 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 神経変性を抑制する化合物のスクリーニング方法 |
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| JPN6014040912; ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ ＮＥＵＲＯＬＯＧＹ ｖｏｌ．３４８, 1994, ｐ．２４４-２６０ * |
| JPN7014002804; Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｖｏｌ． １３, 2004, ｐ．４７５-４８８ * |
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