JP2013113759A - METHOD FOR SCREENING ANIMAL ASCITES CONTAINING IgG ANTIBODY - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、免疫学的検出試薬に適用するＩｇＧ抗体を含有する腹水のスクリーニング方法に関する。さらに詳しくは、動物の腹水からIgG抗体を精製するに際して、原料となる腹水の段階で適切なロットをスクリーニングする方法に関する。 The present invention relates to a method for screening ascites containing an IgG antibody applied to an immunological detection reagent. More specifically, the present invention relates to a method of screening an appropriate lot at the stage of ascites as a raw material when purifying IgG antibodies from animal ascites.
近年、迅速性、簡便性に優れているという観点から、簡易検査キットが迅速診断試薬として急速に広まってきている。
簡易検査法としては、ニトロセルロース等のメンブレンを用いたイムノクロマトグラフィーが知られている。イムノクロマトグラフィーは、被検出物に特異的に結合するメンブレン固相物質、被検出物、被検出物に特異的に結合する標識物の複合体をメンブレン上に形成させて被検出物を測定する方法である。標識物は、被検出物と特異的に結合する抗体に、アルカリフォスファターゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド、着色ラテックス粒子等で標識したものが一般的であり、特に金コロイド粒子や着色ラテックス粒子を用いる場合が多い。着色ラテックス粒子の場合、色、粒子径、官能基等様々な種類のものが製造可能であり、選択性に優れている。また複数の色調のラテックス粒子を用いて、複数の被検出物を検出する方法も提案されている。
これらの簡易検査法では、被検出物との特異的な結合以外で生じる偽陽性反応が検出されることがある。偽陽性反応の原因の一つとして、被検体に含まれるなんらかの成分がメンブレン固相物質に非特異的にトラップされることが考えられる。この様な問題を解決するために、イムノクロマトグラフィーによるインフルエンザウイルスの検査用検体の前処理液であって、少なくとも非イオン性界面活性剤及びアルカリ金属イオンを含む検体前処理液を用いる方法（特許文献１）、等が提案されている。
また、偽陽性反応の原因が、被検体ではなく、検出するための抗体側に存在する場合も考えられる。抗体は動物の腹水から複数段階の精製を経て得られることが多い。腹水中には、目的とする抗体以外の抗体も含まれている可能性が高いが、この目的外の抗体が偽陽性反応の原因であるとすれば、なるべく精製工程の初期の段階で原因を除去することが望ましい。
ところで、ＩｇＧ抗体は、一般に次のような工程を経て得られる。
（１）マウスなどの動物を免疫し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択す る工程
ハイブリドーマの作製はKohlerとMilsteinの方法（Nature、第256巻495頁（1975
年）参照）に準じ、免疫した動物の脾臓細胞と同種のミエローマ細胞（骨髄腫細
胞）とを細胞融合して作製する。
（２）ハイブリドーマを限界希釈法にてクローニングする工程
（３）ＩｇＧ抗体含有腹水を採取する工程
マウスなどの動物の腹腔内に、ハイブリドーマの一定の細胞数を投与し、投与後1 週間目から1日おきに腹水を採取し、遠心処理して上清を得る。
（４）培養上清を精製する工程
上清をプロテインAカラムに通し、抗体をカラムに吸着させ、緩衝液（pH3.0）で 溶出し、中和後、透析を行い、目的とする精製抗体（ＩｇＧ抗体）を取得する。
In recent years, simple test kits are rapidly spreading as rapid diagnostic reagents from the viewpoint of being quick and simple.
As a simple test method, immunochromatography using a membrane such as nitrocellulose is known. Immunochromatography is a method of measuring a detected substance by forming a complex of a membrane solid phase substance that specifically binds to the detected substance, a detected substance, and a labeled substance that specifically binds to the detected substance on the membrane. It is. The label is generally labeled with an antibody that specifically binds to an analyte with an enzyme such as alkaline phosphatase, a metal colloid such as a gold colloid, or a colored latex particle. Often colored latex particles are used. In the case of colored latex particles, various types such as color, particle diameter, and functional group can be produced, and the selectivity is excellent. There has also been proposed a method for detecting a plurality of objects to be detected using latex particles of a plurality of colors.
In these simple test methods, a false positive reaction that occurs other than specific binding to the detection target may be detected. As one of the causes of the false positive reaction, it is conceivable that some component contained in the specimen is trapped nonspecifically by the membrane solid phase substance. In order to solve such a problem, a method of using a sample pretreatment liquid containing at least a nonionic surfactant and an alkali metal ion, which is a pretreatment liquid for a test for influenza virus by immunochromatography (Patent Literature) 1), etc. have been proposed.
Moreover, the case where the cause of the false positive reaction exists not on the subject but on the antibody side for detection may be considered. Antibodies are often obtained from animal ascites through multiple stages of purification. Ascites fluid is likely to contain antibodies other than the target antibody, but if this non-target antibody is the cause of the false positive reaction, the cause should be as early as possible in the purification process. It is desirable to remove.
By the way, an IgG antibody is generally obtained through the following steps.
(1) A step of immunizing an animal such as a mouse and selecting a hybridoma that produces the target antibody. Hybridomas were prepared by the method of Kohler and Milstein (Nature, Vol. 256, p. 495 (1975
According to year)), spleen cells of the immunized animal and myeloma cells (myeloma cells) of the same type are cell-fused.
(2) Step of cloning hybridoma by limiting dilution method (3) Step of collecting IgG antibody-containing ascites A certain number of cells of the hybridoma is administered into the abdominal cavity of an animal such as a mouse. Ascites is collected every other day and centrifuged to obtain a supernatant.
(4) Step of purifying the culture supernatant Pass the supernatant through a protein A column, adsorb the antibody to the column, elute with buffer solution (pH 3.0), neutralize, dialyze, and purify the desired purified antibody (IgG antibody) is obtained.
本発明は、動物の腹水からＩｇＧ抗体を取得するに際して、腹水の段階で、抗体を製造するのに適した腹水かどうかを判定する方法、すなわち、腹水中に偽陽性反応原因成分が存在するか否かを判定する方法を提供することを課題とする。また、当該判定方法を利用して、偽陽性反応原因成分を有さないＩｇＧ抗体を製造する方法の提供を課題とする。さらにまた、特定の精製条件による偽陽性反応原因成分を含まないＩｇＧ抗体の精製方法の提供も課題とする。 The present invention is a method for determining whether or not ascites is suitable for producing antibodies at the stage of ascites when obtaining an IgG antibody from the ascites of an animal, that is, whether there is a false positive reaction cause component in the ascites It is an object to provide a method for determining whether or not. It is another object of the present invention to provide a method for producing an IgG antibody that does not have a false positive reaction cause component using the determination method. It is another object of the present invention to provide a method for purifying an IgG antibody that does not contain a false positive reaction cause component under specific purification conditions.
偽陽性反応の原因としては様々なものが考えられるが、本発明者らは、ＩｇＧ抗体の由来であるマウスなどの動物の腹水を調べたところ、腹水のロットの違いによって、その後に精製したＩｇＧ抗体を使用したイムノクロマトグラフィーでの偽陽性反応の発生に違いがあることを発見した。すなわち、イムノクロマトグラフィーによるアッセイの結果において偽陽性反応を生じた抗体の由来を調べたところ、特定の腹水ロットを由来とするものにのみ偽陽性反応が現れていることがわかった。したがって、抗体の取得工程において、腹水の段階で偽陽性反応の原因となる成分（以下、単に偽陽性反応原因成分ということがある）を有する腹水か否かを判定することができれば、その後の精製工程を無駄にすることなく、腹水から効率的にＩｇＧ抗体を精製、取得することできることを見出した。また、偽陽性反応原因成分を特定し、この影響を排除できるような精製方法が見つかれば腹水から効率的にＩｇＧ抗体を精製、取得することできることを見出した。
上記課題を解決するために、本発明者らは、鋭意研究した結果、ＩｇＧ抗体の由来となる動物の腹水中の偽陽性反応原因成分が何であるかを突き止めることに成功した。本発明は、当該偽陽性反応原因成分の量が所定値以下であるか否かを基準としたＩｇＧ抗体含有腹水のスクリーニング方法を提供する。また、当該スクリーニング方法により選ばれた腹水を精製することにより偽陽性反応を生じないＩｇＧ抗体を製造する方法を提供する。さらにまた、腹水中に偽陽性反応原因成分が存在したとしても当該偽陽性反応原因成分の影響を排除し、当該成分を含まないＩｇＧ抗体の製造方法を提供する。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
〔１〕ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法。
（ａ）ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水中における、ＩｇＧ２ｂに活性を有するＩｇＭ抗体量、を測定する工程
（ｂ）（ａ）の測定値が所定値以下の場合に、ＩｇＧ抗体を精製する腹水として適切と判断する工程
〔２〕動物がマウスである前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕工程（ｂ）の判断を、腹水のロット単位で行う前記〔１〕にまたは〔２〕に記載の方法。
〔４〕ＩｇＧ抗体の製造方法であって、以下の工程を含む製造方法。
（ａ）ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水中における、IgG2bに活性を有するIgM抗体量、を測定する工程
（ｂ）（ａ）の測定値が所定値以下の場合に、ＩｇＧ抗体を精製する腹水として適切と判断する工程
（ｃ）（ｂ）の工程で適切であると判断された腹水をプロテインＡカラムにより精製し、ＩｇＧ抗体を取得する工程
〔５〕ＩｇＧ抗体の製造方法であって、以下の工程を含む製造方法。
（ａ）ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水をプロテインＡカラムに通過させる工程
（ｂ）プロテインＡカラムにｐＨ４以上の溶出液を通過させてＩｇＧ抗体を溶出させてIｇＧを取得する工程
There are various possible causes of the false positive reaction, but the present inventors examined the ascites of animals such as mice from which the IgG antibody was derived. It was discovered that there is a difference in the occurrence of false positive reactions in immunochromatography using antibodies. That is, when the origin of the antibody that produced a false positive reaction in the result of the immunochromatographic assay was examined, it was found that a false positive reaction appeared only in those derived from a specific ascites lot. Therefore, in the antibody acquisition process, if it can be determined whether or not the ascites has a component that causes a false positive reaction in the ascites stage (hereinafter sometimes simply referred to as a false positive reaction causing component), the subsequent purification It has been found that IgG antibodies can be efficiently purified and obtained from ascites without wasting the process. In addition, it was found that if a purification method that can identify a false positive reaction-causing component and eliminate this influence is found, an IgG antibody can be efficiently purified and obtained from ascites.
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have intensively studied, and as a result, have succeeded in finding out what is the cause of false positive reaction in the ascites of an animal from which IgG antibodies are derived. The present invention provides a screening method for IgG antibody-containing ascites based on whether the amount of the false positive reaction-causing component is a predetermined value or less. Also provided is a method for producing an IgG antibody that does not produce a false positive reaction by purifying ascites selected by the screening method. Furthermore, even if a false positive reaction cause component is present in the ascites, the influence of the false positive reaction cause component is eliminated, and a method for producing an IgG antibody containing no such component is provided.
That is, the present invention has the following configuration.
[1] A method for screening the ascites of non-human animals containing an IgG antibody, the method comprising the following steps.
(A) a step of measuring the amount of IgM antibody having an activity to IgG2b in the ascites of animals other than humans containing IgG antibody (b) When the measured value of (a) is not more than a predetermined value, the IgG antibody is purified [2] The method according to [1] above, wherein the animal is a mouse.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the determination in the step (b) is performed for each lot of ascites.
[4] A method for producing an IgG antibody, comprising the following steps.
(A) a step of measuring the amount of IgM antibody having activity in IgG2b in the ascites of animals other than humans containing IgG antibody; (b) purifying IgG antibody when the measured value in (a) is below a predetermined value; (C) a step of determining as appropriate ascites (c) a step of purifying ascites determined to be appropriate in the steps of (b) using a protein A column and obtaining an IgG antibody [5] A method for producing an IgG antibody The manufacturing method including the following processes.
(A) a step of passing non-human animal ascites containing an IgG antibody through a protein A column (b) a step of passing an eluate of pH 4 or higher through the protein A column to elute the IgG antibody to obtain IgG
本発明によれば、動物の腹水を精製する前に、腹水中の偽陽性反応原因成分の有無をあらかじめ判定することができるため、効率的に抗体を精製することができる。また、このようにして得られるＩｇＧ抗体は偽陽性反応原因成分を含まないため、イムノクロマトグラフィーに利用した場合に、偽陽性反応を生じることがなく、抗原の検出、定量の正確性が向上し、ひいては正確な診断、判定をすることができる。 According to the present invention, since the presence or absence of a false positive reaction-causing component in ascites can be determined in advance before purifying the ascites of the animal, the antibody can be purified efficiently. In addition, since the IgG antibody obtained in this way does not contain false positive reaction-causing components, when used for immunochromatography, false positive reaction does not occur, and the accuracy of antigen detection and quantification is improved. As a result, accurate diagnosis and determination can be made.
本発明の１つの実施態様は、ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水のスクリーニング方法である。本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む。
（ａ）ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水中における、ＩｇＧ２ｂに活性を有するＩｇＭ抗体量、を測定する工程
（ｂ）（ａ）の測定値が所定値以下の場合に、ＩｇＧ抗体を精製する腹水として適切と判断する工程
One embodiment of the present invention is a method for screening non-human animal ascites containing IgG antibodies. The screening method of the present invention includes the following steps (a) and (b).
(A) a step of measuring the amount of IgM antibody having an activity to IgG2b in the ascites of animals other than humans containing IgG antibody (b) When the measured value of (a) is not more than a predetermined value, the IgG antibody is purified To determine that it is appropriate as ascites
本発明のスクリーニングの対象となる動物腹水は、目的とするＩｇＧ抗体が産生されている腹水であって、ヒト以外の動物の腹水であればいずれでもよい。ヒト以外の動物としては、抗体産生用の動物として一般に使用される動物があげられ、魚類、爬虫類、鳥類、両生類、ヒト以外の哺乳動物等が挙げられ、具体的にはマウス、ラット、ウサギ等があげられる。 The animal ascites to be screened according to the present invention is ascites in which the target IgG antibody is produced, and any ascitic fluid from animals other than humans may be used. Examples of animals other than humans include animals generally used as animals for antibody production, including fish, reptiles, birds, amphibians, mammals other than humans, and specifically, mice, rats, rabbits, etc. Can be given.
本発明の目的とするＩｇＧ抗体が産生されている腹水は、以下の工程（１）−（３）により得ることができる。本発明は、（３）の腹水、またはそれを遠心処理した上清、その他プロテインＡカラムによる精製を行う前までの状態の腹水のいずれにも適用することができる。
（１）マウスなどの動物を免疫し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
ハイブリドーマの作製はKohlerとMilsteinの方法（Nature、第256巻495頁（1975年）参照）に準じ、免疫した動物の脾臓細胞と同種のミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを細胞融合して作製する。
（２）ハイブリドーマを限界希釈法にてクローニングする工程
（３）ＩｇＧ抗体含有腹水を採取する工程
マウスなどの動物の腹腔内に、ハイブリドーマの一定の細胞数を投与し、投与後1週間目から1日おきに腹水を採取し、遠心処理して上清を得る。
Ascites in which the IgG antibody of interest of the present invention is produced can be obtained by the following steps (1)-(3). The present invention can be applied to any of the ascites of (3), the supernatant obtained by centrifuging the ascites, and the ascites in a state before purification with a protein A column.
(1) Immunization of animals such as mice and selection of hybridomas producing the desired antibody Hybridomas are prepared according to the method of Kohler and Milstein (see Nature, Vol. 256, p. 495 (1975)). It is prepared by cell fusion of the spleen cells of the prepared animal and the same type of myeloma cells (myeloma cells).
(2) Step of cloning hybridoma by limiting dilution method (3) Step of collecting ascites containing IgG antibody A certain number of cells of the hybridoma is administered into the abdominal cavity of an animal such as a mouse. Ascites is collected every other day and centrifuged to obtain a supernatant.
本発明においてスクリーニングされる腹水の単位としては、ハイブリドーマを腹腔内に投与された動物毎に得られる腹水であってもよいし、同一の動物から腹水が複数回にわたって採取される場合は、１回分の腹水であってもよいし、１回に複数本のロットに分注される場合には、１ロット分の腹水であってもよい。本発明のスクリーニング方法は、前記いずれの単位の腹水であっても適用することができ、採取した動物腹水中のＩｇＧ２ｂに活性を有するＩｇＭ抗体量を測定し、当該ＩｇＭ抗体の量が所定値以下であった場合に、不要な偽陽性反応原因成分を含まず、ＩｇＧ抗体を精製するのに適切な腹水であると判断する方法である。所定の値は、得られるＩｇＧ抗体の使用目的の妨げとならないような数値をあらかじめ求めておき、この値に設定することができる。たとえば、得られるＩｇＧ抗体を診断薬としてのイムノクロマトグラフィー用テストデバイスに供する場合、当該診断薬の判定において偽陽性反応が生じず、かつ、目的とする検出感度が得られるような抗体である必要がある。したがって、あらかじめ当該テストデバイスに抗原を含まない検体をアプライして、偽陽性を生じる場合と生じない場合の抗体の由来である腹水のＩｇＭ抗体量を求めておき、偽陽性を生じない場合の最大の数値を基準（所定値）とすることなどにより目的のＩｇＧ抗体を得ることができる。ＩｇＭの抗体量は、腹水における所定値の範囲内かどうかを調べるためのものであるから、絶対量として求めても、濃度として求めてもよく、また測定は周知の測定方法を採用すればよく、後述する実施例に示すようにＩｇＧ２ｂ抗体を固相化した抗体固定化ＥＬＩＳＡ法により測定することもできる。 The unit of ascites to be screened in the present invention may be ascites obtained for each animal to which the hybridoma has been administered intraperitoneally, or when ascites is collected multiple times from the same animal, Ascites fluid may be used, and when it is dispensed into a plurality of lots at a time, it may be ascites fluid for one lot. The screening method of the present invention can be applied to any unit of ascites, and the amount of IgM antibody active in IgG2b in the collected animal ascites is measured, and the amount of the IgM antibody is below a predetermined value. Is an ascites that is suitable for purifying IgG antibody without containing unnecessary false positive reaction-causing components. As the predetermined value, a numerical value that does not interfere with the intended purpose of the obtained IgG antibody can be obtained in advance and set to this value. For example, when the obtained IgG antibody is used in a test device for immunochromatography as a diagnostic agent, it is necessary that the antibody does not cause a false positive reaction in the determination of the diagnostic agent and can obtain a target detection sensitivity. is there. Therefore, the specimen containing no antigen is applied to the test device in advance to determine the amount of IgM antibody in the ascites that is the origin of the antibody when false positive occurs and when it does not occur. As a reference (predetermined value), the target IgG antibody can be obtained. Since the antibody amount of IgM is for examining whether it is within the range of the predetermined value in ascites, it may be obtained as an absolute amount or as a concentration, and the measurement may be carried out using a known measurement method. As shown in Examples described later, it can also be measured by an antibody-immobilized ELISA method in which an IgG2b antibody is immobilized.
また、本発明の別の実施態様は、ＩｇＧ抗体の製造方法である。本発明のＩｇＧ抗体の製造方法は以下の工程を含む。
（ａ）ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水中における、ＩｇＧ２ｂに活性を有するＩｇＭ抗体量、を測定する工程
（ｂ）（ａ）の測定値が所定値以下の場合に、ＩｇＧ抗体を精製する腹水として適切と判断する工程
（ｃ）（ｂ）の工程で適切であると判断された腹水をプロテインＡカラムにより精製し、ＩｇＧ抗体を取得する工程
Another embodiment of the present invention is a method for producing an IgG antibody. The method for producing an IgG antibody of the present invention includes the following steps.
(A) a step of measuring the amount of IgM antibody having an activity to IgG2b in the ascites of animals other than humans containing IgG antibody (b) When the measured value of (a) is not more than a predetermined value, the IgG antibody is purified (C) The step of determining as appropriate ascites (c) The step of purifying the ascites determined to be appropriate in the step (b) with a protein A column to obtain an IgG antibody
本製造方法によれば、（ｂ）の工程で適切であると判断された腹水のみをプロテインＡカラムにより精製するため、偽陽性反応を生じないＩｇＧ抗体を得るのに不適切な腹水を精製するという無駄な工程を排除することができる。ここで、工程（ｂ）で不適切と判断される腹水には、目的とするＩｇＧ抗体とは違うＩｇＭ抗体であって、ＩｇＧ２ｂに活性を有するものが多く含まれていることになる。通常、ＩｇＭ抗体はプロテインＡカラムによる吸着工程および溶出工程を通じて、カラムに吸着されずに排出される。しかし、ＩｇＧ２ｂに活性を有するＩｇＭ抗体の場合、ＩｇＧ２ｂがカラムに吸着されるため、当該ＩｇＭ抗体がＩｇＧ２ｂを介して複合体を形成してカラムに吸着されることになり、その後の溶出工程で遊離されて目的とするＩｇＧ抗体とともに溶出され、偽陽性反応の原因となる。したがって、ＩｇＧ２ｂに活性を有するＩｇＭ抗体を所定量より多く含む腹水を排除して、所定量以下の腹水のみをプロテインＡカラムによる精製工程に供すれば、無駄な精製工程を経ることなく、所望の水準のＩｇＧ抗体を得ることができる。 According to this production method, only ascites determined to be appropriate in the step (b) is purified by the protein A column, so that ascites inappropriate for obtaining an IgG antibody that does not cause a false positive reaction is purified. The useless process can be eliminated. Here, the ascites determined to be inappropriate in the step (b) contains many IgM antibodies different from the target IgG antibody and having activity in IgG2b. Usually, the IgM antibody is discharged without being adsorbed to the column through the adsorption step and elution step by the protein A column. However, in the case of an IgM antibody having activity on IgG2b, since IgG2b is adsorbed to the column, the IgM antibody forms a complex via IgG2b and is adsorbed to the column, and is released in the subsequent elution step. And eluted together with the target IgG antibody, causing a false positive reaction. Therefore, if ascites containing more than a predetermined amount of IgM antibody having an activity to IgG2b is excluded and only ascites below a predetermined amount is subjected to a purification step using a protein A column, the desired purification step can be performed without a wasteful purification step. Levels of IgG antibodies can be obtained.
さらにまた、ＩｇＧ２ｂに活性を有するＩｇＭ抗体を所定量より多く含む腹水であっても、精製工程において当該ＩｇＭ抗体を排除することができれば、当該ＩｇＭ抗体の含有量が所定値以下の腹水を用いて精製するのと同様に、所望の水準のＩｇＧ抗体を得ることができる。
すなわち、本発明のまた別の実施態様は、ＩｇＧ抗体の製造方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水をプロテインＡカラムに通過させる工程
（ｂ）プロテインＡカラムにｐＨ４以上の溶出液を通過させてＩｇＧ抗体を溶出させ、ＩｇＧ抗体を取得する工程
Furthermore, even ascites containing more than a predetermined amount of IgG2b-active IgM antibody, if the IgM antibody can be eliminated in the purification step, the ascites with the IgM antibody content below a predetermined value can be used. Similar to purification, the desired level of IgG antibody can be obtained.
That is, another embodiment of the present invention is a method for producing an IgG antibody, which comprises the following steps.
(A) a step of passing non-human animal ascites containing an IgG antibody through a protein A column (b) a step of passing an eluate of pH 4 or higher through the protein A column to elute the IgG antibody to obtain the IgG antibody
プロテインＡカラムによるＩｇＧ抗体の精製は、通常、腹水を遠心分離した上清を吸着用緩衝液と混和後、ろ過したろ液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに通し、目的とする抗体であるＩｇＧ抗体をカラムに吸着させ、次に、溶出用緩衝液でカラムからＩｇＧ抗体溶出することにより行われる。ここで、本発明のＩｇＧ抗体の製造方法では、プロテインＡカラムによる精製において溶出用緩衝液（溶出液）のｐＨを４以上とすることが望ましい。ｐＨを４以上とすれば、ＩｇＧ抗体はプロテインＡカラムから溶出されるが、ＩｇＧ２ｂに結合して複合体を形成したＩｇＭ抗体は、プロテインＡカラム内に吸着されたまま留まるからである。ｐＨが４未満の場合、ＩｇＭ抗体は目的とするＩｇＧ抗体とともに溶出され、偽陽性反応の原因成分となる。 Purification of IgG antibody using a protein A column is usually performed by mixing the supernatant obtained by centrifuging ascites with an adsorption buffer, and passing the filtrate through a protein A column equilibrated with the adsorption buffer. IgG antibody, which is an antibody, is adsorbed to the column, and then IgG antibody is eluted from the column with an elution buffer. Here, in the method for producing an IgG antibody of the present invention, it is desirable that the pH of the elution buffer (eluate) is 4 or more in the purification using a protein A column. If the pH is 4 or more, the IgG antibody is eluted from the protein A column, but the IgM antibody bound to IgG2b to form a complex remains adsorbed in the protein A column. When the pH is less than 4, the IgM antibody is eluted together with the target IgG antibody and becomes a causative component of the false positive reaction.
本発明により提供されるＩｇＧ抗体はいずれの用途にも使用することができる。当該抗体をイムノアッセイに用いた場合、各種の試料、たとえば生体試料中の抗原の濃度を高感度で、かつ、正確に検出することができる。イムノアッセイのうちでも、特にイムノクロマトグラフィーを利用したアッセイは、近年、検体の抽出液に増感剤を添加して高感度測定を行う傾向があり、この場合、抗原が含まれないブランク測定であってもあたかも抗原が含まれているかのような偽陽性反応を生じる場合があった。しかし、本発明の腹水のスクリーニング方法を利用した抗体の製造方法によれば、偽陽性反応原因成分であるＩｇＧ２ｂに活性のあるＩｇＭ抗体を含有する腹水をあらかじめ選別、排除することができるため、そのような偽陽性反応原因成分を含まない腹水のみを精製し、偽陽性反応を生じない検出を可能とするＩｇＧ抗体を取得することができる。また、本発明の別の製造方法によっても、あらかじめ偽陽性反応原因成分を含有する腹水のプロテインＡカラムによる精製工程において、当該成分を溶出しないように精製するため、当該偽陽性反応を生じない検出を可能とするＩｇＧ抗体を取得することができる。 The IgG antibody provided by the present invention can be used for any application. When the antibody is used in an immunoassay, the concentration of an antigen in various samples, for example, biological samples, can be detected with high sensitivity and accuracy. Among immunoassays, in particular, those using immunochromatography have recently tended to perform high-sensitivity measurement by adding a sensitizer to the sample extract, and in this case, it is a blank measurement that does not contain an antigen. In some cases, a false positive reaction occurred as if the antigen was contained. However, according to the antibody production method using the ascites screening method of the present invention, ascites containing IgM antibody active against IgG2b, which is a false positive reaction-causing component, can be selected and eliminated in advance. Only ascites that does not contain such false positive reaction-causing components can be purified, and an IgG antibody that enables detection without producing a false positive reaction can be obtained. Further, even in another production method of the present invention, in the purification step using the protein A column of ascites containing a false-positive reaction-causing component in advance, the purification is performed so as not to elute the component, so that the detection does not cause the false-positive reaction. Can be obtained.
〔試験例１〕モノクローナル抗体含有腹水の作製方法
１．免疫及びハイブリドーマの作製方法
免疫用抗原(rFluA抗原, Panama/2007/99)25μgを雌（６週齢）のBALB/cマウスに皮内免疫した。この操作（免疫）を2週間毎に2回繰り返した。免疫開始5週間後、試験採血にて高い抗体価が確認されたマウスから脾臓を抽出し、50%-PEG1450（Sigma社製）を用いて常法により細胞融合を行った。ミエローマ細胞はSP2/0を用いた。得られた融合細胞は、脾臓細胞として2.5×106個/mLになるようにHAT、15%ウシ胎児血清及び10%のBM-Condimed H1 Hybridoma Cloning Supplement (Roche社製)を含むRPMI1640倍地に懸濁し、96穴培養プレートに0.2mLずつ分注した。これを5%CO2インキュベーター中で37℃にて培養した。
[Test Example 1] Method for producing monoclonal antibody-containing ascites Immunization and Hybridoma Production Method 25 μg of antigen for immunization (rFluA antigen, Panama / 2007/99) was immunized intradermally in female (6 weeks old) BALB / c mice. This operation (immunization) was repeated twice every two weeks. Five weeks after the start of immunization, the spleen was extracted from a mouse whose antibody titer was confirmed to be high by test blood sampling, and cell fusion was performed by a conventional method using 50% -PEG1450 (manufactured by Sigma). SP2 / 0 was used for myeloma cells. The resulting fused cells are placed in RPMI1640 medium containing HAT, 15% fetal bovine serum, and 10% BM-Condimed H1 Hybridoma Cloning Supplement (Roche) to 2.5 × 10 6 cells / mL as spleen cells. The suspension was suspended and dispensed in a volume of 0.2 mL into a 96-well culture plate. This was cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
２．抗A型インフルエンザ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合７日後に１次スクリーニングとして、培養上清を用いて後記抗原固相化ELISA法を行い、A型インフルエンザに対し高い反応性を示したwellを１次陽性wellとして選別した。該１次陽性well中の細胞は、24穴プレートにおいて継代した。継代2日後、2次スクリーニングとして、培養上清を用いて後記競合ELISA法を行い、A型インフルエンザに対し高い反応性を示すwellを2次陽性wellとして選択した。
2. Screening of anti-influenza A antibody-producing hybridomas As the primary screening 7 days after cell fusion, the wells that showed high reactivity against influenza A were performed by performing the antigen-immobilized ELISA method described later using the culture supernatant. Sorted as positive wells. Cells in the primary positive well were passaged in 24-well plates. Two days after passage, as a secondary screening, the competitive ELISA described below was performed using the culture supernatant, and wells showing high reactivity against influenza A were selected as secondary positive wells.
３−１．抗原固相化ELISA用プレートの作製
150mM塩化ナトリウムを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.2；以下、PBSという）で1μg/mLの濃度に調製したrFluA抗原（Panama/2007/99)を、50μL/wellずつ96穴プレートに固相化し、4℃で一晩静置した。0.05%Tween(登録商標) 20を含むPBS溶液(以下、PBSTという) 300μL/wellで3回洗浄後、1%BSAを含むPBST（以下、BSA-PBSTという）を100μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置してブロッキングを行い、ELISA用プレートを作成した。該ELISA用プレートは、PBSTで３回洗浄後、各試薬を添加して試験例記載の各ELISA法に用いた。
3-1. Preparation of antigen-immobilized ELISA plate
RFluA antigen (Panama / 2007/99) prepared at a concentration of 1 μg / mL with 10 mM phosphate buffer (pH 7.2; hereinafter referred to as PBS) containing 150 mM sodium chloride is applied to a 96-well plate in a solid phase of 50 μL / well. And left at 4 ° C. overnight. PBS solution containing 0.05% Tween (registered trademark) 20 (hereinafter referred to as PBST) was washed 3 times with 300 μL / well, and PBST containing 1% BSA (hereinafter referred to as BSA-PBST) was dispensed at 100 μL / well, The plate was allowed to stand at room temperature for 1 hour for blocking to prepare an ELISA plate. The ELISA plate was washed 3 times with PBST, and then each reagent was added and used for each ELISA method described in the test examples.
３−２．抗原固相化ELISA法（一次スクリーニング）
(ｉ)上記３−１．で作製した ELISA用プレートに、BSA-PBSTにより段階希釈した融合細胞の培養上清を50μL/wellずつ分注し、室温で１時間静置した。
(ii) PBSTで３回洗浄後、HRP−Goat-Anti-Mouse IgG(BIOSOURCE社製）をBSA-PBSTで5000倍希釈した溶液を50μL/wellずつ分注し、室温で１時間静置した。
(iii) PBSTで３回洗浄後、0.02％過酸化水素水を含む0.2Mクエン酸緩衝液（以下基質溶解液という）にOPD（東京化成工業社製）を2mg/mLにて溶解し、50μl/wellずつ添加して室温で10分間反応させた。
(iv) 1mM EDTAを含む1.5N硫酸（以下反応停止液という）を50μL/wellずつ添加し、マルチスキャンプレートリーダー（タイターテック社製）を用いて波長492nmにて吸光度を測定した。
3-2. Antigen-immobilized ELISA (primary screening)
(i) The above 3-1. 50 μL / well of the culture supernatant of the fused cells serially diluted with BSA-PBST was dispensed into the ELISA plate prepared in (1) above and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
(ii) After washing with PBST three times, a solution obtained by diluting HRP-Goat-Anti-Mouse IgG (manufactured by BIOSOURCE) 5000 times with BSA-PBST was dispensed at 50 μL / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
(iii) After washing 3 times with PBST, dissolve OPD (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) at 0.2 mg / mL in 0.2 M citrate buffer (hereinafter referred to as “substrate solution”) containing 0.02% hydrogen peroxide, and add 50 μl. Each well was added and allowed to react at room temperature for 10 minutes.
(iv) 1.5 N sulfuric acid containing 1 mM EDTA (hereinafter referred to as “reaction stop solution”) was added at 50 μL / well, and the absorbance was measured at a wavelength of 492 nm using a multi-scan plate reader (manufactured by Titertech).
３−３． 競合ELISA用プレートの作製
ELISA用プレートに、PBSで5μg/mLに希釈したヤギ抗マウスIgG、Fcγ(Jackson Immuno Research社製)を50μl/wellずつ分注し、室温で2時間静置した。PBST 300μL/wellで3回洗浄後、1%BSAを含むPBST（以下、BSA-PBSTという）を300μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置してブロッキングを行い、ELISA用プレートを作成した。該ELISA用プレートは、PBSTで３回洗浄後、各試薬を添加して実施例記載の各ELISA法試験に用いた。
3-3. Production of competitive ELISA plate
50 μl / well of goat anti-mouse IgG and Fcγ (Jackson Immuno Research) diluted to 5 μg / mL with PBS were dispensed on an ELISA plate and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with PBST 300μL / well, dispense PBST containing 1% BSA (hereinafter referred to as BSA-PBST) at 300μL / well, and let stand for 1 hour at room temperature to perform blocking to create an ELISA plate did. The ELISA plate was washed 3 times with PBST, and then each reagent was added and used for each ELISA method test described in the Examples.
３−４． 競合ELISA法 (二次スクリーニング)
(ｉ) ELISA用プレートに、BSA-PBSTにより段階希釈した融合細胞の培養上清を50μl/wellずつ分注し、室温で１時間静置した。
(ii) PBSTで３回洗浄後、100ng/mLのFluA抗原21種(NIBC, National Institute forBiological Standards and Control製)を50μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置した。
(iii) PBSTで3回洗浄後、2mODのビオチン化ポリクローナルFluA抗体（Caprocorn社製）を50μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置した。
(iv) PBSTで3回洗浄後、1μg/mLのHRP-Streptavidin(PIERCE社製)を50μL/wellずつ分注し、室温で10分間静置した。
(ｖ) PBSTで3回洗浄後、OPD発色液を50μL/wellずつ分注し、室温で10分間静置した。
(vi）反応停止液を50μL/wellずつ添加し、マルチスキャンプレートリーダー（タイターテック社製）を用いて波長492nmにて吸光度を測定した。
3-4. Competitive ELISA (secondary screening)
(i) The culture supernatant of the fused cells serially diluted with BSA-PBST was dispensed into an ELISA plate at 50 μl / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
(ii) After washing three times with PBST, 21 types of 100 ng / mL FluA antigens (NIBC, manufactured by National Institute for Biological Standards and Control) were dispensed at 50 μL / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
(iii) After washing 3 times with PBST, 50 μL / well of 2 mOD biotinylated polyclonal FluA antibody (Caprocorn) was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
(iv) After washing 3 times with PBST, 50 μL / well of 1 μg / mL HRP-Streptavidin (manufactured by PIERCE) was dispensed and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
(v) After washing 3 times with PBST, 50 μL / well of OPD coloring solution was dispensed and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
(vi) 50 μL / well of reaction stop solution was added, and the absorbance was measured at a wavelength of 492 nm using a multi-scan plate reader (manufactured by Titertech).
４．クローニング及びモノクローナル抗体含有腹水・モノクローナル抗体の採取
上記のスクリーニングで選択したハイブリドーマを限界希釈法にてクローニングした。次いで各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を採取するため、２週間前にプリスタン0.5mLを腹腔内に注射しておいた8週齢の雄BALB/cマウスに、ハイブリドーマを細胞数0.4〜1.3×106個の量で腹腔内に投与した。投与後1週間目から1日おきに腹水を採取し、遠心処理して上清を得た（ここで得られるモノクローナル抗体含有マウス腹水の上清を以下、単に腹水ロットということがある）。各腹水ロットの溶液を50%硫酸アンモニウムで塩析し、TBSで溶解後、同液で透析した。これを等量の吸着用緩衝液（3M NaCl、1.5M Glycine-NaOH 緩衝液、pH8.5）と混和後、ろ過した。該ろ液を、吸着用緩衝液で平衡化したプロテインAセファロースカラムに通し、ろ液中の抗体をカラムに吸着させた後、0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.0）で溶出させた。各溶出液を、1M Tris-HCl緩衝液(pH9.0)で中和後、20mM TBSで透析を行ったもの（ここで得られる腹水ロットの溶出液を以下、単に精製ロットということがある）を精製抗A型インフルエンザ抗体とした。
4). Cloning and collection of monoclonal antibody-containing ascites / monoclonal antibody The hybridoma selected in the above screening was cloned by limiting dilution. Then for each hybridoma to collect the monoclonal antibody produced, pristane 0.5mL two weeks ago to 8-week-old male BALB / c mice that had been injected intraperitoneally, several hybridoma cells 0.4 to 1.3 × 10 6 A single dose was administered intraperitoneally. Ascites was collected every other day from the 1st week after administration, and centrifuged to obtain a supernatant (the supernatant of the monoclonal antibody-containing mouse ascites obtained here may be simply referred to as an ascites lot hereinafter). The solution of each ascites lot was salted out with 50% ammonium sulfate, dissolved in TBS, and dialyzed with the same solution. This was mixed with an equal amount of an adsorption buffer (3M NaCl, 1.5M Glycine-NaOH buffer, pH 8.5) and then filtered. The filtrate was passed through a protein A sepharose column equilibrated with an adsorption buffer, and the antibody in the filtrate was adsorbed on the column and then eluted with 0.1 M citrate buffer (pH 3.0). Each eluate was neutralized with 1M Tris-HCl buffer (pH 9.0) and dialyzed with 20 mM TBS (the ascites lot obtained here may be simply referred to as a purification lot). Was used as a purified anti-influenza A antibody.
〔試験例２〕イムノクロマトグラフィー用テストデバイスの作製
１．金コロイド標識抗A型インフルエンザ抗体（コンジュゲート）の作製
2mM ホウ酸 pH8.0で71.4μg/mLに希釈調整したF(ab')2化抗A型インフルエンザ抗体（#622212A）1mLを1OD/mLの金コロイド（粒径50nm）溶液20mLに添加し、室温で10分間攪拌した。該金コロイド-F(ab')2化抗A型インフルエンザ抗体混合液に対し、10%ウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を1.5mL添加し、さらに5分間攪拌後、10℃にて、10,000rpmで45分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。得られたコンジュゲートに対し、Conjugate Dilution Buffer (Scripps社製)を0.3mL添加しコンジュゲートを懸濁させ50℃で24時間静置した。懸濁液をろ過後、各コンジュゲートの極大吸収波長における吸光度を測定した。
[Test Example 2] Production of test device for immunochromatography Preparation of colloidal gold labeled anti-influenza A antibody (conjugate)
Add 1 mL of F (ab ') 2 anti-influenza A antibody (# 622212A) diluted with 2 mM boric acid pH 8.0 to 71.4 μg / mL to 20 mL of 1 OD / mL colloidal gold (particle size 50 nm), Stir at room temperature for 10 minutes. 1.5 mL of 10% bovine serum albumin (BSA) aqueous solution is added to the gold colloid-F (ab ′) 2 anti-influenza A antibody mixture, stirred for 5 minutes, and then at 10 ° C. and 10,000 rpm. Centrifugation was performed for 45 minutes to obtain a sediment (conjugate). To the obtained conjugate, 0.3 mL of Conjugate Dilution Buffer (manufactured by Scripps) was added to suspend the conjugate, and the mixture was allowed to stand at 50 ° C. for 24 hours. After the suspension was filtered, the absorbance at the maximum absorption wavelength of each conjugate was measured.
２．コンジュゲートパッドの作製
上記１．で調製したコンジュゲートを吸光度が12.6ODになるようConjugate dilution bufferで調整してコンジュゲート溶液とし、コンジュゲート溶液：casein buffer (1.33%カゼイン、4%スクロース溶液(pH7.5))：10%マリアリム溶液（日油社）=600：992：8 (容量比) になるようコンジュゲート塗布液を調整した。調整したコンジュゲート塗布液（ｆ）をイムノクロマト用ディスペンサー Bio Dot Inc. XYZ 3000を用いて、13.0mm×254mm (幅×長さ)のグラスファイバー製パッド（日本ポール社、No.8964）の端から15mm の位置に塗布した。ドライオーブン内で70℃、30min乾燥し、コンジュゲートパッドとした。
2. Preparation of conjugate pad The conjugate prepared in step 1 was adjusted with a conjugate dilution buffer so that the absorbance was 12.6 OD to obtain a conjugate solution. Conjugate solution: casein buffer (1.33% casein, 4% sucrose solution (pH 7.5)): 10% Marialim The conjugate coating solution was adjusted so that the solution (NOF Corporation) = 600: 992: 8 (volume ratio). Using the immunochromatographic dispenser Bio Dot Inc. XYZ 3000, adjust the conjugate coating solution (f) from the end of a 13.0mm x 254mm (width x length) glass fiber pad (Nippon Pole, No. 8964). It was applied at a position of 15 mm. The conjugate pad was dried in a dry oven at 70 ° C. for 30 minutes.
３．抗A型インフルエンザ抗体固相化メンブレンの作製
25.0mm×254mm (幅×長さ)のニトロセルロースメンブレン（Sartorius社、No.CN 140）の短辺の一端の内側11mmの位置に、Sucroseを2.5%含むように20mMTBSで1mg/mLに調整した上記抗A型インフルエンザ抗体を1.0μL/cm幅でライン状に塗布した。ドライオーブン内で70℃、45min乾燥し、抗A型インフルエンザ抗体固相化メンブレンとした。
3. Preparation of anti-influenza A antibody-immobilized membrane
25.0mm x 254mm (width x length) nitrocellulose membrane (Sartorius, No.CN 140) was adjusted to 1mg / mL with 20mMTBS so that 2.5% of sucrose was contained at 11mm inside one end of the short side. The anti-influenza A antibody was applied in a line form at a width of 1.0 μL / cm. The membrane was dried in a dry oven at 70 ° C. for 45 min to obtain an anti-influenza A influenza antibody-immobilized membrane.
４．テストストリップの作製
プラスチック製粘着シート(a)に上記抗A型インフルエンザ抗体固相化メンブレン(b)を貼り、該メンブレンの抗A型インフルエンザ抗体(c)を塗布部の展開上流部側に上記2)で作製したコンジュゲートパッド(d)を配置装着し、反対側の端には吸収パッド(e)(Whatman社、CF6)を配置装着した。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を7.11mm幅に切断してテストストリップを作製した。該ストリップの外寸は7.11mm×42.0mm（幅×長さ）である。該テストストリップは、アッセイの際、プラスチック性の専用のハウジングに格納・搭載され、イムノクロマトグラフィー用テストデバイスを構成する。図１にイムノクロマトグラフィー用テストストリップの構造模式図を示した。このようにして作製されたイムノクロマトテストデバイスは各試験例のイムノアッセイに用いられた。
4). Preparation of test stripAttach the anti-influenza A antibody-immobilized membrane (b) to the plastic adhesive sheet (a), and apply the anti-influenza A antibody (c) of the membrane to the development upstream side of the application part 2 The conjugate pad (d) prepared in (1) was placed and mounted, and the absorbent pad (e) (Whatman, CF6) was placed and mounted on the opposite end. A test strip was produced by cutting the structure in which the respective constituent elements were superposed in this manner to a width of 7.11 mm. The outer dimension of the strip is 7.11 mm × 42.0 mm (width × length). During the assay, the test strip is housed and mounted in a dedicated plastic housing and constitutes an immunochromatographic test device. FIG. 1 shows a structural schematic diagram of a test strip for immunochromatography. The thus prepared immunochromatographic test device was used for the immunoassay of each test example.
〔試験例３〕イムノクロマトグラフィーにおけるモノクローナル抗体含有腹水のロット間差の検討
１．試験方法
上記試験例1の４．において製造した腹水ロット３種を由来とする精製ロット５種を用いてイムノクロマトテストデバイスを作製した。サンプルは抗原を含まない下記2種類の検体希釈液115μLを当該デバイスのサンプル滴下窓部に添加し、15分後のテストデバイスの検出窓部におけるラインの発色強度を検出した（いわゆるBlank測定に相当する）。
（ｉ）精製抗体
以下の5種類を用いた。（ ）内は由来とする腹水ロットの番号である。また抗体の番号は同番号の精製ロットから得られた抗体であることを意味する。
#100218（MM44131）、#100731（MM46123）、#101113（MM44131）、#101115（MM46123）、#101119（MM46081)
（ii）検体希釈液
現行処方：積水メディカル株式会社製ラピッドテスタFLUII付属品
改良処方：積水メディカル株式会社製ラピッドテスタFLUII付属品に増感効果の認められ
るポリビニルピロリドンを添加したもの
[Test Example 3] Examination of lot-to-lot difference of monoclonal antibody-containing ascites in immunochromatography Test Method 4 in Test Example 1 above. An immunochromatographic test device was prepared using 5 types of purified lots derived from 3 types of ascites lots manufactured in 1). For the sample, add 115 μL of the following two specimen dilutions that do not contain the antigen to the sample dropping window of the device, and detect the color intensity of the line in the detection window of the test device 15 minutes later (corresponding to the so-called Blank measurement) To do).
(I) Purified antibodies The following 5 types were used. The number in parentheses is the number of the ascites lot to be derived. The antibody number means an antibody obtained from a purification lot having the same number.
# 100218 (MM44131), # 100731 (MM46123), # 101113 (MM44131), # 101115 (MM46123), # 101119 (MM46081)
(Ii) Specimen Diluent Current Formula: Sekisui Medical Co., Ltd. Rapid Tester FLUII Accessory Improvement Formula: Sekisui Medical Co., Ltd. Rapid Tester FLUII Accessory with added polyvinylpyrrolidone with sensitizing effect
２．試験結果
結果を表１に示す。本結果によれば、現行処方の抗体希釈液を用いた場合は全てのマウス腹水ロットでラインは検出されなかったのに対し、改良処方の抗体希釈液を用いた場合には、抗原を含まないにもかかわらず、腹水ロットMM46123由来の精製ロットである100731および101115を用いたアッセイで偽陽性反応が検出された。このことから偽陽性反応原因成分は、同一の腹水ロット（MM46123）に含まれている可能性が示唆された。
2. Test results The results are shown in Table 1. According to this result, no line was detected in all mouse ascites lots when using the antibody dilution of the current formulation, whereas no antigen was included when using the antibody dilution of the improved formulation. Nevertheless, false positive reactions were detected in assays using 100711 and 101115, purified lots from ascites lot MM46123. This suggested that the false-positive reaction-causing component may be contained in the same ascites lot (MM46123).
〔試験例４〕モノクローナル抗体含有腹水のプロテインＡカラムによる精製条件の検討
１．試験方法
上記の偽陽性反応が認められなかったマウス腹水ロットMM46081の上清を50%硫酸アンモニウムで塩析し、TBSで溶解後、同液で透析した。これを等量の吸着用緩衝液（3M NaCl、1.5M Glycine-NaOH 緩衝液、pH8.5）と混和後、ろ過した。該ろ液を、吸着用緩衝液で平衡化したプロテインAセファロースカラムに通し、0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.0、pH4.0、pH4.5、pH5.0）の4条件で溶出させ（初回溶出）、該溶出液を、1M Tris-HCl緩衝液(pH9.0)で中和後、20mM TBSで透析を行った。尚、pH4.0以上の0.1Mクエン酸緩衝液を用いた条件では、各pHの0.1Mクエン酸緩衝液で溶出後のカラム残存物をpH3.0の0.1Mクエン酸緩衝液で溶出を試みた（再溶出）。各溶出物についてフラクションごとに吸光度を測定し、また、各溶出物についてSDS-PAGE(還元、非還元条件)及び等電点電気泳動で精製度を確認した。
[Test Example 4] Examination of purification conditions using protein A column of ascites containing monoclonal antibody Test Method The supernatant of the mouse ascites lot MM46081 in which the false positive reaction was not observed was salted out with 50% ammonium sulfate, dissolved in TBS, and dialyzed with the same solution. This was mixed with an equal amount of an adsorption buffer (3M NaCl, 1.5M Glycine-NaOH buffer, pH 8.5) and then filtered. The filtrate is passed through a protein A sepharose column equilibrated with an adsorption buffer, and eluted under 4 conditions of 0.1 M citrate buffer (pH 3.0, pH 4.0, pH 4.5, pH 5.0) ( First elution), the eluate was neutralized with 1M Tris-HCl buffer (pH 9.0), and dialyzed against 20 mM TBS. Under conditions using 0.1M citrate buffer of pH 4.0 or higher, try to elute the column residue after elution with 0.1M citrate buffer of each pH with 0.1M citrate buffer of pH 3.0. (Re-elution). The absorbance of each eluate was measured for each fraction, and the purity of each eluate was confirmed by SDS-PAGE (reducing and non-reducing conditions) and isoelectric focusing.
２．試験結果
初回溶出物のフラクションの吸光度は、図２の （i）、（ii）、（iii）、（iv）に示され、再溶出フラクションの吸光度は図２の （v）、（vi）、（vii）に示されるとおりである。
また、SDS-PAGEおよび等電点電気泳動の結果を図３に示す。非還元条件下でのSDS-PAGEにおいて、初回溶出物のレーン（（i）−(iv)）では分子量 約170kDaの位置に目的抗体となるIgGのバンドが検出されたのに対し、再溶出物のレーン（（v）−（vii））では目的抗体のバンド以外にそれよりも高分子量の位置でバンドが検出された（図３Ａの横長丸で囲んだ部分）。
また、還元状態のSDS-PAGEにおいても、再溶出物のレーン（（v）−（vii））では80kDa付近に目的物以外のバンドが確認された（図３Ｂの横長丸で囲んだ部分）。また、（i）−（iv）と（v）−（vii）では、低分子量のバンドの位置も少しずれている（矢印位置）。このことから、プロテインAカラムによる精製において、必要としているＩｇＧ抗体は初回溶出でほぼ回収出来ており、カラム内に残存しているIgGはマウス由来の別抗体（IgG2b）であると考えられる。
さらに、等電点電気泳動の結果においては、目的抗体のバンドと同位置にはバンドは検出されず、pＩ9.5付近でスメア状にバンドが検出された（図３Ｃ）。
2. The absorbance of the fraction of the first elution product is shown in (i), (ii), (iii) and (iv) of FIG. 2, and the absorbance of the re-eluted fraction is shown in (v), (vi) and As shown in (vii).
The results of SDS-PAGE and isoelectric focusing are shown in FIG. In SDS-PAGE under non-reducing conditions, in the first eluate lane ((i)-(iv)), an IgG band as the target antibody was detected at a molecular weight of about 170 kDa, whereas the re-eluate In the lane ((v)-(vii)), in addition to the target antibody band, a band was detected at a position of higher molecular weight than that of the target antibody (the part surrounded by the horizontal long circle in FIG. 3A).
Also in the reduced SDS-PAGE, in the re-eluted lane ((v)-(vii)), a band other than the target product was confirmed in the vicinity of 80 kDa (the portion surrounded by the horizontal long circle in FIG. 3B). In (i)-(iv) and (v)-(vii), the position of the low molecular weight band is also slightly shifted (arrow position). From this, in the purification by the protein A column, the necessary IgG antibody can be almost recovered by the first elution, and the IgG remaining in the column is considered to be another mouse-derived antibody (IgG2b).
Furthermore, in the result of isoelectric focusing, no band was detected at the same position as the band of the target antibody, and a band was detected in a smear shape near pI9.5 (FIG. 3C).
〔試験例５〕
１．試験方法
上記試験例４の溶出物(i)−（vii）の7種の精製抗体液を用いてイムノクロマトテストデバイスを作製した。検体希釈液には試験例３の改良処方を用いた。Blank測定に加え、A型インフルエンザウイルス株（A/Kitakyushyu/159/93、H3N2）を検体希釈液で6.7×104TCID50/mL、3.3×104TCID50/mLに希釈した後、115μLをサンプル滴下窓に添加し、15分後のテストデバイスの検出窓部におけるラインの発色強度を確認した。
[Test Example 5]
1. Test Method An immunochromatographic test device was prepared using seven kinds of purified antibody solutions of the eluate (i)-(vii) of Test Example 4 above. The improved formulation of Test Example 3 was used as the sample diluent. In addition to the Blank measurement was diluted to 6.7 × 10 4 TCID 50 /mL,3.3×10 4 TCID 50 / mL A influenza virus strains (A / Kitakyushyu / 159/93 , H3N2) in sample diluent, a 115μL The sample was added to the sample dropping window, and the color intensity of the line in the detection window portion of the test device after 15 minutes was confirmed.
２．試験結果
初回溶出物(i)−(iv)を精製抗体としたアッセイでは、Blank測定における偽陽性反応は検出されず、感度も全条件で同等の結果が得られた。一方、再溶出物(v)−(vii)を精製抗体としたアッセイでは強い偽陽性反応が確認され、抗原に対する活性も認められなかった(表２)。また偽陽性反応は還元状態のSDS-PAGEで確認された80kDa付近のバンドの濃淡に比例して高いことを確認した。
2. Test Results In the assay using the first eluate (i)-(iv) as a purified antibody, no false positive reaction was detected in the blank measurement, and the sensitivity was the same under all conditions. On the other hand, in the assay using the re-eluted product (v)-(vii) as a purified antibody, a strong false positive reaction was confirmed and no activity against the antigen was observed (Table 2). Moreover, it was confirmed that the false positive reaction was higher in proportion to the density of the band around 80 kDa confirmed by SDS-PAGE in the reduced state.
〔試験例６〕ウェスタンブロットによる偽陽性誘発物質の同定
１．試験方法
試験例４で得られた再溶出物(v)（pH4.0の0.1Mクエン酸緩衝液を用いて溶出後、pH3.0の0.1Mクエン酸緩衝液で溶出）について、ウェスタンブロットによって、SDS-PAGE (還元状態)で80kDa付近に存在したバンド（図３Ｂの(v)のレーン）の同定を行った。該精製物をSDS電気泳動後、PVDF膜に転写した。この転写膜に1% BSA-PBST(1%BSA, 0.05% Tween-20 in PBS, pH8.0)を添加してブロッキングした後、1μg/mLのビオチン標識抗マウスIgM抗体(Biolegend社製)を反応させ、1% BSA-PBSTで洗浄後、1μg/mLのImmuno pure strept avidin HRP(PIERCE社製)を反応させた。1% BSA-PBSTで洗浄後、DAB溶液で発光させた。対照染色として抗マウスIgG抗体を用いて染色した。
[Test Example 6] Identification of false positive inducer by Western blot Test method The re-eluted product (v) obtained in Test Example 4 (eluted with 0.1 M citrate buffer at pH 4.0 and then eluted with 0.1 M citrate buffer at pH 3.0) was analyzed by Western blot. The band (lane (v) in FIG. 3B) present in the vicinity of 80 kDa was identified by SDS-PAGE (reduced state). The purified product was transferred to a PVDF membrane after SDS electrophoresis. After adding 1% BSA-PBST (1% BSA, 0.05% Tween-20 in PBS, pH 8.0) to this transfer membrane for blocking, 1 μg / mL biotin-labeled anti-mouse IgM antibody (manufactured by Biolegend) was added. After the reaction and washing with 1% BSA-PBST, 1 μg / mL of Immuno pure strept avidin HRP (PIERCE) was reacted. After washing with 1% BSA-PBST, light was emitted with a DAB solution. As a control staining, anti-mouse IgG antibody was used for staining.
２．試験結果
結果を図４に示す。還元状態で80kDa付近に検出されたバンドは抗マウスIgM抗体のみに反応していることからマウスIgMであることがわかった。また、非還元状態の場合、泳動開始点付近のバンドが抗IgG抗体および抗IgM抗体のいずれとも反応していることから、当該バンド（偽陽性誘発物質）は、IgGとIgMとの複合体である可能性が示唆された。
2. The test result is shown in FIG. The band detected at around 80 kDa in the reduced state reacted with only the anti-mouse IgM antibody, indicating that it was mouse IgM. In the non-reducing state, since the band near the migration start point reacts with both the anti-IgG antibody and the anti-IgM antibody, the band (false positive inducer) is a complex of IgG and IgM. One possibility was suggested.
〔実施例１〕腹水ロットのスクリーニング方法
IgGに活性を有するIgM型抗体量を測定することにより、腹水ロットのスクリーニングを行った。
１．試験方法
ELISAプレートに固相化したIgG2b抗体(#A239(抗A型インフルエンザ抗体, DEAE精製品))に、0、10、100μg/ｍLに希釈した腹水ロット3種（MM44131, MM46031, MM46123）を反応させ、20%Blocking One(nacalai tesque社製)にてブロッキングした後、ビオチン標識した抗マウスIgM抗体(Biolegend社製)を反応させた。発光にはImmuno pure strept avidin HRP(PIERCE社製)を用い、TMB（3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine）により発光させ450nmの吸光度を測定することで、反応性を確認した。
[Example 1] Screening method for ascites lot
Ascites lots were screened by measuring the amount of IgM-type antibody active in IgG.
1. Test method
3 kinds of ascites lots (MM44131, MM46031, MM46123) diluted to 0, 10, 100 μg / mL were reacted with IgG2b antibody (# A239 (anti-influenza A antibody, DEAE purified product)) immobilized on ELISA plate. After blocking with 20% Blocking One (manufactured by nacalai tesque), biotin-labeled anti-mouse IgM antibody (manufactured by Biolegend) was reacted. For the light emission, immunopure strept avidin HRP (manufactured by PIERCE) was used, and light was emitted by TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine), and the absorbance was measured at 450 nm to confirm the reactivity.
２．試験結果
結果を図５に示す。本結果より、試験例３の改良処方の検体希釈液を用いた場合にＡ型偽陽性反応が検出された腹水ロットMM46123に強い活性がみられ、当該ロットに高濃度のIgMが含まれていることがわかった。また、試験例３の改良処方の検体希釈液を用いた場合にＡ型偽陽性反応が検出されなかった腹水ロットMM46131、MM46081については腹水ロットMM46123より弱い活性しかみられず、これらのロット間にはIgM量に差があることが明らかとなった。
以上の結果から、腹水ロットによって、IgG2bに活性のあるIgM量に違いがあり、当該IgM量が多いと当該腹水を精製した得られた抗体にもIgＭが含まれ、この精製抗体をイムノアッセイに用いた場合に、Ａ型偽陽性反応が発生することがわかった。
したがって、IgG2bに活性のあるIgM量の腹水ロット中での基準値を設定し、当該基準値以下の腹水を選択することにより、偽陽性反応を発生しない精製抗体の由来となる腹水を選択することができる。また、当該基準値以下となるような精製条件を採用することにより、偽陽性反応を生じない精製抗体を取得することができる。
スクリーニング基準の設定としては、例えば偽陽性反応が検出されていない精製ロットの由来である腹水ロットのうち、IgM含量が最も高かったロット（本実施例ではMM46081)を基準ロットとする方法等が挙げられる。当該方法によれば、スクリーニング対象の腹水ロットのIgM量を測定し、基準ロットよりもIgM量が低いロットをスクリーニングできる。その後、該IgM量が低いロットを精製することで偽陽性反応成分の少ない精製抗体を提供することができる。
2. Test results The results are shown in FIG. From this result, when the sample diluent of the improved formulation of Test Example 3 was used, strong activity was observed in the ascites lot MM46123 in which a type A false positive reaction was detected, and the lot contained high concentrations of IgM. I understood it. In addition, ascites lots MM46131 and MM46081 in which no type A false positive reaction was detected when using the sample diluent of the improved formulation of Test Example 3, only weaker activity was observed than the ascites lot MM46123. It became clear that there was a difference in IgM amount.
From the above results, there is a difference in the amount of IgM active in IgG2b depending on the ascites lot. When the amount of IgM is large, the antibody obtained by purifying the ascites also contains IgM, and this purified antibody is used for immunoassay. It was found that type A false positive reaction occurred.
Therefore, by setting a reference value in an ascites lot with an IgM amount active in IgG2b and selecting ascites below the reference value, select ascites from which purified antibodies that do not generate false positive reactions are derived. Can do. In addition, a purified antibody that does not cause a false positive reaction can be obtained by employing a purification condition that is equal to or lower than the reference value.
Examples of the setting of the screening standard include a method in which a lot having the highest IgM content (MM46081 in this example) is used as a standard lot among ascites lots derived from purified lots in which no false positive reaction is detected. It is done. According to this method, the amount of IgM in the ascites lot to be screened can be measured, and a lot having an IgM amount lower than that of the reference lot can be screened. Thereafter, a purified antibody with few false positive reaction components can be provided by purifying a lot having a low IgM amount.
〔実施例２〕モノクローナル抗体含有腹水のプロテインＡカラムによる精製条件の検討
１．試験方法
上記の偽陽性反応が認められたマウス腹水ロットMM46123の上清を50%硫酸アンモニウムで塩析し、TBSで溶解後、同液で透析した。これを等量の吸着用緩衝液（3M NaCl、1.5M Glycine-NaOH 緩衝液、pH8.5）と混和後、ろ過した。該ろ液を、吸着用緩衝液で平衡化したプロテインAセファロースカラムに通し、ろ液中の抗体をカラムに吸着させた後、0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0）の4条件で溶出させた。該溶出液を、1M Tris-HCl緩衝液(pH9.0)で中和後、20mM TBSで透析を行い精製抗体液を得た。この4種の精製抗体液を用いてイムノクロマトテストデバイスを作製した。検体希釈液には試験例３の改良処方を用いた。Blank測定に加え、A型インフルエンザウイルス株（A/Kitakyushyu/159/93、H3N2）を検体希釈液で6.7×104TCID50/mL、3.3×104TCID50/mLに希釈した後、115μLをサンプル滴下窓に添加し、15分後のテストデバイスの検出窓部におけるラインの発色強度を確認した。
２．試験結果
結果を表３に示す。pH3.0の0.1Mクエン酸緩衝液で溶出した精製抗体液を用いたアッセイでは偽陽性反応が検出されたのに対し、pH4以上の0.1Mクエン酸緩衝液で溶出した精製抗体を用いたアッセイでは偽陽性反応が検出されなかった(表３)。本試験により、モノクローナル抗体含有腹水をプロテインAセファロースカラムで精製する場合、溶出液のpHを4以上にコントロールすることで偽陽性反応原因成分であるIgGに活性のあるIgMのカラムからの溶出を抑え、偽陽性反応原因成分の少ない精製ロットを得ることが可能であることがわかった。
[Example 2] Examination of purification conditions using protein A column of ascites containing monoclonal antibody Test Method The supernatant of mouse ascites lot MM46123 in which the above false positive reaction was observed was salted out with 50% ammonium sulfate, dissolved in TBS, and dialyzed with the same solution. This was mixed with an equal amount of an adsorption buffer (3M NaCl, 1.5M Glycine-NaOH buffer, pH 8.5) and then filtered. The filtrate was passed through a protein A sepharose column equilibrated with an adsorption buffer, and the antibody in the filtrate was adsorbed onto the column, and then 0.1 M citrate buffer (pH 3.0, pH 4.0, pH 5. (0, pH 6.0). The eluate was neutralized with 1M Tris-HCl buffer (pH 9.0) and dialyzed with 20 mM TBS to obtain a purified antibody solution. An immunochromatographic test device was prepared using these four types of purified antibody solutions. The improved formulation of Test Example 3 was used as the sample diluent. In addition to the Blank measurement was diluted to 6.7 × 10 4 TCID 50 /mL,3.3×10 4 TCID 50 / mL A influenza virus strains (A / Kitakyushyu / 159/93 , H3N2) in sample diluent, a 115μL The sample was added to the sample dropping window, and the color intensity of the line in the detection window portion of the test device after 15 minutes was confirmed.
2. Test results The results are shown in Table 3. In the assay using purified antibody solution eluted with 0.1M citrate buffer solution at pH 3.0, false positive reaction was detected, whereas assay using purified antibody eluted with 0.1M citrate buffer solution at pH 4 or higher. No false positive reaction was detected (Table 3). When purifying ascites containing monoclonal antibodies using a protein A sepharose column, the pH of the eluate is controlled to 4 or higher to suppress elution of IgG, which is a false-positive reaction-causing component, from the IgM column. It was found that it is possible to obtain a purified lot with few false positive reaction-causing components.
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）抗A型インフルエンザ抗体固相化メンブレン
（ｃ）抗A型インフルエンザ抗体
（ｄ）コンジュゲートパッド
（ｅ）吸収パッド
（ｆ）コンジュゲート塗布液
(A) Plastic adhesive sheet (b) Anti-influenza A influenza antibody solid-phase membrane (c) Anti-influenza A influenza antibody (d) Conjugate pad (e) Absorption pad (f) Conjugate coating solution
本発明によれば、偽陽性反応を生じる原因となる腹水をあらかじめ判定することができるため、精製度の高いＩｇＧ抗体を効率的に製造することができる。また、このようにして得られるＩｇＧ抗体は偽陽性反応原因成分を含まないため、イムノクロマトグラフィーに利用したアッセイにおいて、偽陽性反応を生じることなく、正確な検出、測定につながり、ひいては正確な診断、判定をすることができる。 According to the present invention, since ascites causing a false positive reaction can be determined in advance, an IgG antibody with a high degree of purification can be efficiently produced. In addition, since the IgG antibody obtained in this way does not contain a false positive reaction-causing component, the assay used in immunochromatography leads to accurate detection and measurement without causing false positive reaction, and thus accurate diagnosis, Judgment can be made.
Claims (5)
（ａ）ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水中における、ＩｇＧ２ｂに活性を有するＩｇＭ抗体量、を測定する工程
（ｂ）（ａ）の測定値が所定値以下の場合に、ＩｇＧ抗体を精製する腹水として適切と判断する工程 A non-human animal ascites screening method containing an IgG antibody, comprising the following steps.
(A) a step of measuring the amount of IgM antibody having an activity to IgG2b in the ascites of animals other than humans containing IgG antibody (b) When the measured value of (a) is not more than a predetermined value, the IgG antibody is purified To determine that it is appropriate as ascites
（ａ）ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水中における、ＩｇＧ２ｂに活性を有するＩｇＭ抗体量、を測定する工程
（ｂ）（ａ）の測定値が所定値以下の場合に、ＩｇＧ抗体を精製する腹水として適切と判断する工程
（ｃ）（ｂ）の工程で適切であると判断された腹水をプロテインＡカラムにより精製し、ＩｇＧ抗体を取得する工程 A method for producing an IgG antibody, comprising the following steps.
(A) a step of measuring the amount of IgM antibody having an activity to IgG2b in the ascites of animals other than humans containing IgG antibody (b) When the measured value of (a) is not more than a predetermined value, the IgG antibody is purified (C) The step of determining as appropriate ascites (c) The step of purifying the ascites determined to be appropriate in the step (b) with a protein A column to obtain an IgG antibody
（ａ）ＩｇＧ抗体を含有するヒト以外の動物腹水をプロテインＡカラムに通過させる工程
（ｂ）プロテインＡカラムにｐＨ４以上の溶出液を通過させてＩｇＧ抗体を溶出させてIｇＧを取得する工程 A method for producing an IgG antibody, comprising the following steps.
(A) a step of passing non-human animal ascites containing an IgG antibody through a protein A column (b) a step of passing an eluate of pH 4 or higher through the protein A column to elute the IgG antibody to obtain IgG
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