JP2013094158A

JP2013094158A - Tendon cell sheet and method for manufacturing the same

Info

Publication number: JP2013094158A
Application number: JP2011250133A
Authority: JP
Inventors: Takao Sakai; 尚雄酒井; Keisuke Ashiba; 恵介芦葉; Yusuke Hirota; 祐輔廣田
Original assignee: Cellseed Inc
Current assignee: Cellseed Inc
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2013-05-20

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a tendon cell sheet, rich in orientation and having high strength.SOLUTION: Culture is conducted on a substrate surface for cell culture that can be expanded and contracted, and during the culture period, the substrate is drawn and contracted or repeatedly subjected to drawing and contraction.

Description

本発明は生物学、医学分野における有用な腱細胞シートに関するものである。 The present invention relates to a tendon cell sheet useful in the fields of biology and medicine.

今日、動物細胞培養技術が著しく進歩し、動物細胞を対象とした研究開発もさまざまな分野に広がって実施されるようになってきた。対象となる動物細胞の使われ方も、開発当初の細胞そのものを製品化したり、その産生物を製品化するだけでなく、今や細胞やその表層蛋白質を分析することで有用な医薬品を設計したり、患者本人の細胞を生体外で増殖させたり、或いはその細胞の機能を高めて生体内へ戻し治療することも実施されつつある。現在、動物細胞を培養する技術は、多くの研究者が注目している一分野であり、特に生体の組織や臓器構造に類似した細胞の配向構造や機能が反映された細胞培養方法は、医薬品設計の評価のみならず生体組織構築技術としても非常に注目されている。 Today, animal cell culture technology has made significant progress, and research and development on animal cells has been extended to various fields. The target animal cells can be used not only to commercialize the original cells, but also to produce useful products by analyzing the cells and their surface proteins. In addition, the patient's own cells are being grown in vitro, or the function of the cells is increased and returned to the living body for treatment. Currently, the technology for culturing animal cells is one field that many researchers are paying attention to. Cell culture methods that reflect cell orientation structures and functions that are similar to biological tissues and organ structures are In addition to design evaluation, it is attracting a great deal of attention as a living tissue construction technique.

ヒト細胞を含め動物細胞の多くは付着依存性のものである。すなわち、動物細胞を生体外で培養しようとするときは、それらを一度、どこかに付着させる必要性がある。そのような背景のもと、以前より多くの研究者らによって細胞にとってより好ましい基材表面の設計、考案がなされてきたが、これらの技術は何れも細胞培養時に関係するものばかりであった。付着依存性の培養細胞は何かに付着する際、自ら接着性蛋白質を産生する。従ってその細胞を剥離させるときには、従来技術ではその接着性蛋白質を破壊しなければならず、通常酵素処理が行われる。その際、細胞が培養中に産生した各種細胞固有の細胞表層蛋白も同時に破壊されてしまうという重大な課題であった。さらに、腱組織とは、生体内で常に伸縮しているものである。生体外で腱細胞を培養するために、生体内の腱細胞と同様な培養条件下で検討を進めることが急務であった。 Many animal cells, including human cells, are adhesion-dependent. That is, when cultivating animal cells in vitro, it is necessary to attach them once somewhere. Against this background, more and more researchers have designed and devised a substrate surface that is more favorable for cells than before. However, all of these techniques are related to cell culture. When an adhesion-dependent cultured cell attaches to something, it produces an adhesive protein by itself. Therefore, when the cells are detached, the adhesive protein must be destroyed in the prior art, and usually an enzyme treatment is performed. At that time, it was a serious problem that the cell surface proteins inherent to various cells produced during culturing of the cells were destroyed at the same time. Furthermore, the tendon tissue is one that is constantly expanding and contracting in the living body. In order to cultivate tendon cells in vitro, it was urgent to investigate the same culture conditions as in vivo tendon cells.

このような背景のもと、特許文献１には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃であるポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。また、特許文献２には、この温度応答性細胞培養基材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。さらに、特許文献３には、この温度応答性細胞培養基材を用いて培養細胞の表層蛋白質の修復方法が記載されている。温度応答性細胞培養基材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになってきた。 Against this background, Patent Document 1 discloses that cells are upper critically lysed on a cell culture support having a substrate surface coated with a polymer having an upper or lower critical lysis temperature of 0 to 80 ° C. in water. A novel cell culturing method is described in which culture is performed at a temperature lower than or below the lower critical lysis temperature and then exfoliated without an enzyme treatment by setting the temperature to the upper critical lysis temperature or higher or the lower critical lysis temperature or lower. Patent Document 2 discloses that the temperature-responsive cell culture substrate is used to cultivate skin cells at an upper critical dissolution temperature or lower or a lower critical dissolution temperature or higher, and thereafter, an upper critical dissolution temperature or higher or a lower critical dissolution temperature or lower. It is described that the cultured skin cells are detached with low damage. Further, Patent Document 3 describes a method for repairing surface protein of cultured cells using this temperature-responsive cell culture substrate. By utilizing a temperature-responsive cell culture substrate, various new developments have been made with respect to conventional culture techniques.

細胞が細胞培養基材表面に接着、伸展、増殖する場合、細胞外マトリックスなどのような接着タンパク質の吸着を介して、細胞が接着することが知られている。非特許文献１では、膵島由来の細胞が温度応答性細胞培養表面に接着、増殖するためには特定の細胞外マトリックスの吸着が必要であることが示されている。また、非特許文献２では、ある細胞が材料表面に接着するには、材料表面の接触角を適度にすることが需要であり、良好な接着を実現するには、細胞種によって、その適度な接触角が異なることが示されている。これらの文献は温度応答性細胞培養表面に目的とする臓器、組織由来の細胞を接着、増殖させるには血清中に含まれる、特定の細胞外マトリクスの吸着が必要であり、目的の細胞種を接着、増殖させるには適当な温度応答性細胞培養表面の設計が重要であることが示されている。 It is known that when a cell adheres, spreads and grows on the surface of a cell culture substrate, the cell adheres via adsorption of an adhesion protein such as an extracellular matrix. Non-Patent Document 1 shows that a specific extracellular matrix needs to be adsorbed in order for cells derived from islets to adhere to and grow on the temperature-responsive cell culture surface. Further, in Non-Patent Document 2, in order for a certain cell to adhere to the material surface, it is necessary to make the contact angle of the material surface moderate, and in order to realize good adhesion, depending on the cell type It is shown that the contact angles are different. In these documents, in order to adhere and proliferate cells derived from the target organ or tissue on the surface of the temperature-responsive cell culture, it is necessary to adsorb a specific extracellular matrix contained in the serum. Appropriate temperature-responsive cell culture surface design has been shown to be important for adhesion and growth.

特開平０２−２１１８６５号公報Japanese Patent Laid-Open No. 02-21865 特開平０５−１９２１３８号公報JP 05-192138 A 再表２００７−１０５３１１号公報No. 2007-105311

Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３０，５９４３−５９４９（２００９）Biomaterials, 30, 5943-5949 (2009) 再生医学「ティシュエンジニアリングの基礎から最先端まで」、図１９−２、株式会社エヌ・ティー・エス発行（２００２）Regenerative medicine "From the basics to the latest in tissue engineering", Fig. 19-2, issued by NTS Corporation (2002)

本発明は、伸縮可能な基材表面上で腱細胞を培養し、培養期間中、当該基材を延伸、収縮、或いはそれらを繰り返すことで、細胞が配向し、強固な細胞外マトリックスを有した腱細胞シート及びその製造方法の提供を目的とする。 In the present invention, tendon cells are cultured on a stretchable substrate surface, and the substrate is stretched, contracted, or repeated during the culture period, so that the cells are oriented and have a strong extracellular matrix. An object is to provide a tendon cell sheet and a method for producing the same.

本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、驚くべくことに、伸縮可能な基材表面上で腱細胞を培養し、培養期間中、当該基材を延伸、収縮、或いはそれらを繰り返すことで、腱細胞が配向し、強固な細胞外マトリックスを形成することを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。 In order to solve the above problems, the present inventors have studied and developed from various angles. As a result, surprisingly, the tendon cells are cultured on the surface of the stretchable base material, and the base material is stretched, contracted, or repeated during the culture period, so that the tendon cells are oriented and strong cells. It was found to form an outer matrix. The present invention has been completed based on such findings.

すなわち、本発明は、細胞培養用基材を延伸、収縮、或いはそれらを繰り返すことでその基材表面上で培養された腱細胞シート、及びその製造方法を提供するものである。 That is, the present invention provides a tendon cell sheet cultured on the surface of the base material by stretching, contracting, or repeating the base material for cell culture, and a method for producing the same.

腱細胞に対し本発明のような負荷を与えると、腱細胞は配向し、また細胞外マトリックス成分を活発に産生し、強固な細胞外マトリックスを形成する。その結果として、強度の高い腱細胞シートが得られることとなる。そのような細胞シートは医学、薬学領域のさまざまな用途への展開をはかれる世界に類のない新規な発想による極めて重要な発明と考えている。 When a load as in the present invention is applied to a tendon cell, the tendon cell is oriented and actively produces an extracellular matrix component to form a strong extracellular matrix. As a result, a high-strength tendon cell sheet is obtained. Such a cell sheet is considered to be an extremely important invention based on a novel idea that is unparalleled in the world, which is being developed for various uses in the medical and pharmaceutical fields.

実施例２において、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を固定化したシリコンシート上に付着した腱細胞のようすを示す図である。In Example 2, it is a figure which shows the appearance of the tendon cell adhering on the silicon sheet which fix | immobilized poly (N-isopropylacrylamide). 実施例２おいて、培養中、延伸を繰り返し、培養後、冷却することで得られた腱細胞シートのようすを示す図である。In Example 2, it is a figure which shows the appearance of the tendon cell sheet | seat obtained by repeating extending | stretching during culture | cultivation and cooling after culture | cultivation.

本発明で用いられる腱細胞とは特に限定されないが、例えば成熟腱細胞、腱前駆細胞、腱組織細胞のいずれか、若しくはそれらの混合物が挙げられる。その由来も特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット、アフリカミドリザル等が挙げられるが特に限定されるものではない。また、本発明で用いる培地は、動物細胞を培養する培地であれば特に限定されないが、例えば、無血清培地、血清含有培地等が挙げられる。そのような培地は、さらにレチノイン酸、アスコルビン酸等の分化誘導物質を添加しても良い。基材表面への播種密度は常法に従えば良く特に限定されるものではない。 The tendon cells used in the present invention are not particularly limited, and examples thereof include mature tendon cells, tendon progenitor cells, tendon tissue cells, or a mixture thereof. The origin thereof is not particularly limited, and examples thereof include humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, rats, nude mice, mice, guinea pigs, pigs, sheep, Chinese hamsters, cows, marmoset, African green monkeys, and the like. It is not something. The medium used in the present invention is not particularly limited as long as it is a medium for culturing animal cells, and examples thereof include a serum-free medium and a serum-containing medium. Such a medium may further contain a differentiation inducer such as retinoic acid or ascorbic acid. The seeding density on the substrate surface is not particularly limited as long as it follows a conventional method.

本発明で用いられる伸縮性基材とは、物理的に変形なく可逆的に伸縮できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ゴム及びこれらの各種誘導体が挙げられる。本発明では、これらを単独で用いても良く、２種以上を組み合わせて良く、何ら限定されるものではない。その中で、ポリジメチルシロキサンについて具体的に示すと、本発明ではポリジメチルシロキサンとして市販のシリコン膜、シリコンシート、シリコン製板等が挙げられる。その際、末端がアミノプロピル基、カロボキシプロピル基、水酸基で修飾されたポリジメチルシロキサン、或いはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などの官能基を含むシロキサン、ポリシロキサン化合物を利用し、予め目的とする官能基を含んだポリジメチルシロキサン構造体を作製し利用することでもできる。本発明で用いられる伸縮性基材の伸縮能については特に限定されるものでないが、延伸前を０とした場合に、５〜１００％延伸できるものが好ましく、より好ましくは１０〜９０％延伸できるものが良く、さらに好ましくは１５〜８０％延伸できるものが良く、最も好ましくは２０〜６０％延伸できるものが良い。５％より長く延伸できない基材の場合、本発明で示すところの基材表面を伸縮することでさまざまな状態の温度応答性表面を作製することができず好ましくない。 The stretchable substrate used in the present invention is not particularly limited as long as it can be reversibly stretched without being physically deformed. For example, polydimethylsiloxane, polyurethane, rubber, and various derivatives thereof can be used. Can be mentioned. In this invention, these may be used independently and 2 or more types may be combined and it is not limited at all. Among them, specific examples of polydimethylsiloxane include a commercially available silicon film, silicon sheet, silicon plate and the like as polydimethylsiloxane in the present invention. At that time, using a polydimethylsiloxane whose terminal is modified with an aminopropyl group, a carboxoxypropyl group or a hydroxyl group, or a siloxane or polysiloxane compound containing a functional group such as an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group or a thiol group, It is also possible to prepare and use a polydimethylsiloxane structure containing a target functional group in advance. The stretchability of the stretchable substrate used in the present invention is not particularly limited. However, when the stretchable substrate is 0, it is preferably stretchable by 5 to 100%, more preferably stretchable by 10 to 90%. Those that can be stretched by 15 to 80% are more preferable, and those that can be stretched by 20 to 60% are most preferable. In the case of a base material that cannot be stretched for more than 5%, it is not preferable because a temperature-responsive surface in various states cannot be produced by stretching the base material surface shown in the present invention.

本発明に用いる温度応答性ポリマーはホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ（Ｎ−（Ｎ’−プロピルカルバミド）プロピル（メタ）アクリルアミド（同１８〜２８℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。 The temperature-responsive polymer used in the present invention may be either a homopolymer or a copolymer. Examples of such a polymer include polymers described in JP-A-2-21865. Specifically, for example, it can be obtained by homopolymerization or copolymerization of the following monomers. Examples of the monomer that can be used include a (meth) acrylamide compound, an N- (or N, N-di) alkyl-substituted (meth) acrylamide derivative, or a vinyl ether derivative. Two or more of these can be used. Furthermore, copolymerization with monomers other than the above monomers, grafting or copolymerization of polymers, or a mixture of polymers and copolymers may be used. Moreover, it is also possible to crosslink within a range that does not impair the original properties of the polymer. In this case, since the cells to be cultured and peeled are cells, separation is performed in the range of 5 ° C. to 50 ° C., and as the temperature-responsive polymer, poly-Nn-propylacrylamide (of a homopolymer) Lower critical solution temperature 21 ° C), poly-Nn-propylmethacrylamide (27 ° C), poly-N-isopropylacrylamide (32 ° C), poly-N-isopropylmethacrylamide (43 ° C), poly- N-cyclopropylacrylamide (at 45 ° C), poly-N-ethoxyethylacrylamide (at about 35 ° C), poly-N-ethoxyethylmethacrylamide (at about 45 ° C), poly-N-tetrahydrofurfurylacrylamide (at the same) About 28 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (about 35 ° C.), poly-N, N-ethylmethyl acetate Luamide (56 ° C.), poly-N, N-diethylacrylamide (32 ° C.), poly (N- (N′-propylcarbamido) propyl (meth) acrylamide (18-28 ° C.), and the like. Monomers for copolymerization used in the invention include polyacrylamide, poly-N, N-diethylacrylamide, poly-N, N-dimethylacrylamide, polyethylene oxide, polyacrylic acid and salts thereof, polyhydroxyethyl methacrylate, poly Hydrous polymers such as hydroxyethyl acrylate, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, cellulose, carboxymethyl cellulose, and the like can be mentioned, but are not particularly limited.

上述の場合、上述の各ポリマーの基材表面への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。その中で、伸縮性基材としてポリジメチルシロキサンを選んだ場合、そのものへの温度応答性ポリマーの固定化方法として、ポリジメチルシロキサンを含む構造体表面にプラズマ処理、塩酸処理、ＵＶ処理を行い、親水性化処理を行なった後、アミノ基、カルボキシル基、チオール基などの親水性官能基を含む有機系化合物あるいは無機系化合物を水系溶媒中でポリジメチルシロキサン構造体表面と反応させ、これらの親水性官能基を表面あるいは界面近傍に導入する方法が挙げられるが特に限定されるものではない。その際、モノマー溶液を０．５ｗｔ％〜７０ｗｔ％で溶媒に溶解させた溶液を親水性官能基で修飾したポリジメチルシラン表面に塗布し、電子線照射重合により温度応答性ポリマーを固定化させても良い。親水性官能基を含む有機系化合物としては、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポルアクリル酸、３−アミノプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。親水性官能基を含む無機系化合物として、アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、（３−メルカプトプロピル）トリエトキシシラン、カルボキシエチルシラントリオールを挙げられる。これらの化合物をポリジメチルシロキサンを含む構造体表面の導入する際、溶媒として水あるいは水と有機溶媒の混合溶液が望ましく、混合溶液の場合、有機溶媒の水に対する比率が１ｗｔ％〜５０ｗｔ％が望ましい。混合する有機溶媒はアセトン、酢酸、メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒が好適である。 In the case described above, the method for coating the surface of each polymer described above is not particularly limited. For example, the substrate and the monomer or polymer are irradiated with electron beam (EB), γ-ray irradiation, ultraviolet irradiation, plasma treatment. , Corona treatment, organic polymerization reaction, or physical adsorption such as coating and kneading. Among them, when polydimethylsiloxane is selected as the stretchable substrate, the surface of the structure containing polydimethylsiloxane is subjected to plasma treatment, hydrochloric acid treatment, and UV treatment as a method for fixing the temperature-responsive polymer to itself. After the hydrophilization treatment, an organic compound or inorganic compound containing a hydrophilic functional group such as an amino group, a carboxyl group, or a thiol group is reacted with the surface of the polydimethylsiloxane structure in an aqueous solvent. Although the method of introduce | transducing a functional functional group into the surface or interface vicinity is mentioned, it does not specifically limit. At that time, a solution obtained by dissolving a monomer solution in a solvent at 0.5 wt% to 70 wt% is applied to the surface of polydimethylsilane modified with a hydrophilic functional group, and the temperature-responsive polymer is immobilized by electron beam irradiation polymerization. Also good. Examples of the organic compound containing a hydrophilic functional group include polyallylamine, polyethyleneimine, poracrylic acid, and 3-aminopropylmethacrylamide. As an inorganic compound containing a hydrophilic functional group, aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane, (3-mercaptopropyl) triethoxysilane, and carboxyethylsilanetriol are used. Can be mentioned. When introducing these compounds into the surface of the structure containing polydimethylsiloxane, water or a mixed solution of water and an organic solvent is desirable as a solvent, and in the case of a mixed solution, the ratio of the organic solvent to water is desirably 1 wt% to 50 wt%. . The organic solvent to be mixed is preferably an alcohol solvent such as acetone, acetic acid, methanol, and ethanol.

本発明とは、上記伸縮性基材表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化する上記温度応答性ポリマーが被覆されたものであり、その基材表面を延伸及び／又は収縮させることで生体材料との親和性を変え、さまざまな用途に展開しようとするものである。このことを実現するためには、上述した生体材料が、まず、本発明の温度応答性基材表面に付着することが必須となる。その生体材料が付着する際の基材表面の条件は、その基材表面に負荷が掛かって延伸、もしくは収縮されていても良く、何ら負荷が掛かっていなくても良く、いずれにせよそのいずれかの負荷状態で、基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量が、０．６〜２．５μｇ／ｃｍ^２の範囲であることが良く、好ましくは１．１〜２．３μｇ／ｃｍ^２の範囲であることが良く、さらに好ましくは１．３〜２．０μｇ／ｃｍ^２の範囲であることが良く、最も好ましくは１．５〜１．８μｇ／ｃｍ^２の範囲であることが良い。０．６μｇ／ｃｍ^２より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の生体材料は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．５μｇ／ｃｍ^２以上であると、その領域に生体材料が付着し難く、生体材料を十分に付着させることが困難となる。このような場合、温度応答性ポリマー被覆層の上にさらにタンパク質を被覆すれば、基材表面の温度応答性ポリマー被覆量は２．３μｇ／ｃｍ^２以上であっても良く、その際の温度応答性ポリマーの被覆量は９．０μｇ／ｃｍ^２以下が良く、好ましくは８．０μｇ／ｃｍ^２以下が良く、７．０μｇ／ｃｍ^２以下が好都合である。温度応答性ポリマーの被覆量が９．０μｇ／ｃｍ^２以上であると温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆しても生体材料が付着し難くなり好ましくない。そのような細胞接着性タンパク質の種類は何ら限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。また、これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、生体材料接着性タンパク質の水溶液を基材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法がとられている。本発明は、温度応答性培養皿を利用したなるべく細胞シートそのものを利用しようとする技術である。従って、温度応答性ポリマー層上の細胞接着性タンパク質の被覆量が極度に多くなっては好ましくない。温度応答性ポリマーの被覆量、並びに細胞接着性タンパク質の被覆量の測定は常法に従えば良く、例えばＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲを用いて細胞付着部を直接測る方法、あらかじめラベル化したポリマーを同様な方法で固定化し細胞付着部に固定化されたラベル化ポリマー量より推測する方法などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。In the present invention, the surface of the stretchable base material is coated with the temperature-responsive polymer whose hydration power changes within a temperature range of 0 to 80 ° C., and the base material surface is stretched and / or shrunk. By changing the affinity, it is intended to change the affinity with biomaterials and to develop various applications. In order to realize this, it is essential that the above-described biomaterial is first attached to the surface of the temperature-responsive substrate of the present invention. The condition of the surface of the base material when the biomaterial adheres may be stretched or shrunk under load on the base material surface, and may not be loaded at all. under load, coverage of the temperature responsive polymer to the substrate surface may be in the range of 0.6~2.5μg / cm ^2, preferably of 1.1~2.3μg / cm ² The range is preferably, more preferably in the range of 1.3 to 2.0 μg / cm ² , and most preferably in the range of 1.5 to 1.8 μg / cm ² . When the coating amount is less than 0.6 μg / cm ² , the biomaterial on the polymer is difficult to peel off even if a stimulus is given, and the working efficiency is remarkably deteriorated. On the other hand, when it is 2.5 μg / cm ² or more, it is difficult for the biomaterial to adhere to the region, and it is difficult to sufficiently attach the biomaterial. In such a case, if the protein is further coated on the temperature-responsive polymer coating layer, the temperature-responsive polymer coating amount on the substrate surface may be 2.3 μg / cm ² or more, and the temperature response at that time coverage of sexual polymer may have 9.0μg / cm ² or less, preferably well 8.0μg / cm ² or less, expediently 7.0μg / cm ² or less. When the coating amount of the temperature-responsive polymer is 9.0 μg / cm ² or more, even if the cell-responsive protein is further coated on the temperature-responsive polymer coating layer, it is difficult to attach the biomaterial. Although the kind of such cell adhesion protein is not limited at all, For example, collagen, laminin, laminin 5, Matrigel etc. are individual, or 2 or more types of mixtures are mentioned. In addition, these cell adhesive protein coating methods may be in accordance with conventional methods. Usually, an aqueous solution of biomaterial adhesive protein is applied to the substrate surface, and then the aqueous solution is removed and rinsed. . The present invention is a technique for using a cell sheet itself as much as possible using a temperature-responsive culture dish. Therefore, it is not preferable that the coating amount of the cell adhesive protein on the temperature-responsive polymer layer becomes extremely large. Measurement of the coating amount of the temperature-responsive polymer and the coating amount of the cell adhesive protein may be in accordance with a conventional method. For example, the method of directly measuring the cell attachment part using FT-IR-ATR, the same as the polymer labeled in advance. For example, a method of inferring from the amount of labeled polymer immobilized by a method and immobilized on the cell attachment portion may be used, and any method may be used.

本発明の基材表面は、温度応答性領域，細胞非付着性領域があっても良く、その２層の形態は、上部から観察して、例えば、▲１▼ラインとスペースからなるパターン、▲２▼水玉模様のパターン、▲３▼格子状のパターン、その他特殊な形のパターン、或いはこれらが混ざっている状態のパターンが挙げられ何ら限定されるものではないが、腱細胞が配向した各組織の状態を考え、▲１▼ラインとスペースからなるものが好ましい。温度応答性領域，細胞非付着性領域の２層のそれぞれの大きさは何ら限定されるものではないが、得られた細胞シートを剥離した際、収縮することを考え、ライン状のパターンの基材を使用する場合、細胞が付着する温度応答性領域は５００ｎｍ以下、好ましくは３００ｎｍ以下、さらに２００ｎｍ以下、最も好ましくは１００ｎｍ以下が良い。細胞が付着する温度応答性領域の幅が５００ｎｍより大きいとそのライン上で培養した細胞が配向せず好ましくない。その際、本発明における細胞と親和性の低い細胞非付着性高分子とは、細胞が付着しないものならば何ら制約されるものではないが、例えば、ポリ−Ｎ−アクリロイルモルホリン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース等の親水性高分子、或いはシリコーン高分子、フッ素高分子等の強疎水性高分子等が挙げられる。 The substrate surface of the present invention may have a temperature-responsive region and a cell non-adhesive region, and the two-layer form is, for example, (1) a pattern consisting of lines and spaces, (2) Polka dot pattern, (3) Lattice pattern, other specially shaped patterns, or patterns in which these are mixed. In view of the above condition, (1) a line and a space are preferable. The size of each of the two layers of the temperature responsive region and the non-cell-adherent region is not limited at all, but it is considered that the obtained cell sheet contracts when the cell sheet is peeled off, and the basis of the line pattern When using a material, the temperature-responsive region to which the cells adhere is 500 nm or less, preferably 300 nm or less, more preferably 200 nm or less, and most preferably 100 nm or less. If the width of the temperature-responsive region to which the cells adhere is larger than 500 nm, the cells cultured on the line are not oriented, which is not preferable. In this case, the cell non-adhesive polymer having a low affinity for cells in the present invention is not limited at all as long as cells do not adhere to it. For example, poly-N-acryloylmorpholine, polyacrylamide, polyacrylamide, Examples thereof include hydrophilic polymers such as dimethylacrylamide, polyethylene glycol, and cellulose, and strongly hydrophobic polymers such as silicone polymers and fluorine polymers.

本発明はこうして準備された生体材料が付着した表面に対し、物理的に伸縮させること、或いは基材周囲の温度を変えること、もしくはこれらを併用することで基材表面に固定化されている温度応答性ポリマー層の状態を変えることで、腱細胞を剥離させることができるようになる。その際は、生体物質が付着した状態が、負荷が掛かって延伸、もしくは収縮された状態であっても、何ら負荷が掛かっていなくても、その状態から伸縮、あるいは延伸され、上述した腱細胞が付着しない温度応答性ポリマーの被覆量の範囲、温度応答性ポリマーの厚さの範囲、温度応答性ポリマーの密度の範囲となれば良く、その収縮、あるいは延伸する方法等のその他の条件は何ら限定されるものでない。本発明では、伸縮性基材表面に被覆されているポリマーは温度応答性を有しており、基材表面を伸縮させなくとも基材の環境温度を変えることでも腱細胞シートを剥離させることができる。その際、生体材料を温度応答性基材から剥離回収するには、生体材料が付着した培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。生体材料をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。 The present invention is the temperature fixed on the surface of the base material by physically expanding or contracting the surface to which the biomaterial prepared in this way is attached, or changing the temperature around the base material, or using them together. By changing the state of the responsive polymer layer, the tendon cells can be detached. In this case, the tendon cell described above is stretched or stretched from the state even when the biological material is attached to the stretched or shrunk state under load or no load. The range of the temperature-responsive polymer coating amount, the thickness range of the temperature-responsive polymer, and the density range of the temperature-responsive polymer should be within the range. It is not limited. In the present invention, the polymer coated on the surface of the stretchable substrate has temperature responsiveness, and the tendon cell sheet can be peeled by changing the environmental temperature of the substrate without stretching the substrate surface. it can. At that time, in order to peel and collect the biomaterial from the temperature-responsive substrate, the temperature of the culture substrate to which the biomaterial is attached is set to the upper limit critical solution temperature or lower limit solution temperature of the coating polymer on the culture substrate. Can be peeled off. In that case, it can be performed in a culture solution or in another isotonic solution, and can be selected according to the purpose. For the purpose of exfoliating and recovering biomaterials faster and more efficiently, the method of tapping or shaking the base material, and the method of stirring the culture medium using a pipette alone or in combination It may be used.

Effect of the invention

基材表面に付着した腱細胞に対し、収縮という負荷を与えると、腱細胞は配向し、また細胞外マトリックス成分を活発に産生し、強固な細胞外マトリックスを形成する。その結果として、強度の高い腱細胞シートが得られるようになる。そのような細胞シートは医学、薬学領域のさまざまな用途への展開をはかれるものである。 When a load of contraction is applied to the tendon cells attached to the substrate surface, the tendon cells are oriented and actively produce extracellular matrix components to form a strong extracellular matrix. As a result, a high-strength tendon cell sheet can be obtained. Such cell sheets can be used for various applications in the medical and pharmaceutical fields.

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but these do not limit the present invention in any way.

市販のシリコンシートを２ｃｍ角に切断し、酸素条件下でプラズマ処理を行い、７０℃の純水４００ｍＬが入ったセパラブルフラスコ内にシリコンシート角を攪拌しながら加え、その後に（３−アミノプロピル）トリエトキシシランを４ｍＬ添加し、３０分間反応させた。得られたアミノ化シリコン膜上に、３０ｗｔ％Ｎ−イロプロピルアクリルアミドの２−プロパノール溶液を１６μＬ塗布し、その後、電子線照射重合を行った。得られた試料を４℃で一晩浸漬した後、十分に洗浄、乾燥を行うことでポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）を固定化したシリコンシートを得た。 A commercially available silicon sheet is cut into 2 cm squares, subjected to plasma treatment under oxygen conditions, added to a separable flask containing 400 mL of pure water at 70 ° C. with stirring, and then (3-aminopropyl ) 4 mL of triethoxysilane was added and allowed to react for 30 minutes. On the obtained aminated silicon film, 16 μL of a 30 wt% N-ilopropylacrylamide 2-propanol solution was applied, and then electron beam irradiation polymerization was performed. The obtained sample was immersed at 4 ° C. overnight, and then thoroughly washed and dried to obtain a silicon sheet on which poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) was immobilized.

当該シリコンシートを伸縮させられる自動装置に装着し、腱細胞を２．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２播種し、２週間培養した（使用した培地：ＤＭＥＭ＋１０％仔ウシ血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）。２日おきに培地交換し、培養５日目より１方向へ１０分間かけて１０％延伸し、その状態を１時間保持し、その後、再び１０分間かけて元の未延伸の状態に戻した。その状態を１時間保持し、その後、その操作を繰り返し行った。延伸前の培養細胞のようすを図１に示す。培養後、当該シリコンシートを２０℃にし、基材表面の細胞シートを剥離させた。得られた腱細胞シートを図２に示す。得られた細胞シートは細胞が配向し、また培養細胞が細胞外マトリックスを産生し、強度のあるものであった。The silicon sheet was mounted on an automatic device that can be expanded and contracted, and tendon cells were seeded at 2.0 × 10 ⁴ cells / cm ² and cultured for 2 weeks (used medium: DMEM + 10% calf serum + 1% penicillin / streptomycin). The medium was changed every two days, and 10% was stretched in one direction over 10 minutes from the fifth day of culture. The state was maintained for 1 hour, and then returned to the original unstretched state over 10 minutes. This state was maintained for 1 hour, and then the operation was repeated. The appearance of cultured cells before stretching is shown in FIG. After culturing, the silicon sheet was brought to 20 ° C., and the cell sheet on the substrate surface was peeled off. The obtained tendon cell sheet is shown in FIG. In the obtained cell sheet, the cells were oriented, and the cultured cells produced an extracellular matrix, which was strong.

本発明であれば、細胞が配向された強度の高い腱細胞シートが得られる。そのような細胞シートは医学、薬学領域のさまざまな用途への展開をはかれる世界に類のない新規な発想による極めて重要な発明と考えている。 According to the present invention, a high-strength tendon cell sheet in which cells are oriented is obtained. Such a cell sheet is considered to be an extremely important invention based on a novel idea that is unparalleled in the world, which is being developed for various uses in the medical and pharmaceutical fields.

Claims

A tendon cell sheet cultured on the substrate surface by stretching, shrinking, or repeating the substrate for cell culture.

The tendon cell sheet according to claim 1, wherein the tendon cells are any of mature tendon cells, tendon progenitor cells, tendon tissue cells, or a mixture of two or more.

The tendon cell sheet according to any one of claims 1 and 2, wherein the base material is a stretchable material.

The tendon cell sheet according to claim 3, wherein the base material is polydimethylsiloxane.

The tendon cell sheet according to any one of claims 1 to 4, wherein the cell culture substrate surface is coated with a temperature-responsive polymer whose hydration power changes within a temperature range of 0 to 80 ° C.

The temperature-responsive polymer coated on the surface of the substrate is a poly-N-substituted acrylamide derivative, a poly-N-substituted methacrylamide derivative, a polyacrylate derivative, a polymethacrylate derivative alone, or a copolymer of two or more thereof. The tendon cell sheet according to any one of claims 1 to 5, comprising:

The tendon cell sheet according to claim 6, wherein the temperature-responsive polymer is poly-N-isopropylacrylamide.

A method for producing a tendon cell sheet, comprising culturing on a stretchable cell culture substrate surface, and stretching, shrinking, or repeating the substrate during the culture period.

The method for producing a tendon cell sheet according to claim 8, wherein the stretching, shrinking, or repeating of the base material is performed immediately after the cells adhere to the surface of the base material.

The pulmonary cell according to any one of claims 8 and 9, wherein the pulmonary cell is peeled off by utilizing a change in the property of the temperature-responsive polymer layer coated on the surface of the cell culture substrate according to any one of claims 5 to 7. Sheet manufacturing method.