JP2013085531A - Method for producing protein with recombinant e.coli - Google Patents
Method for producing protein with recombinant e.coli Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013085531A JP2013085531A JP2011230579A JP2011230579A JP2013085531A JP 2013085531 A JP2013085531 A JP 2013085531A JP 2011230579 A JP2011230579 A JP 2011230579A JP 2011230579 A JP2011230579 A JP 2011230579A JP 2013085531 A JP2013085531 A JP 2013085531A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- replaced
- culture
- protein
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、遺伝子工学的手法により得られた、遺伝子組換えタンパク質を発現可能な大腸菌を用いて、組換えタンパク質、特にＦｃ結合性タンパク質を効率的に製造する方法に関する。特に本発明は、前記大腸菌を効率よく培養することで、組換えタンパク質を効率的に製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for efficiently producing a recombinant protein, particularly an Fc-binding protein, using Escherichia coli capable of expressing a recombinant protein obtained by a genetic engineering technique. In particular, the present invention relates to a method for efficiently producing a recombinant protein by efficiently culturing the E. coli.
大腸菌を利用した組換えタンパク質の生産は、特許文献１をはじめとし、これまでにも多くの例が報告されている。組換えタンパク質を効率的に生産するためには、大腸菌細胞を高密度の状態で培養することが必要である。大腸菌の菌体には炭素、窒素の他に、多種の金属元素を含むことが知られている。そのため大腸菌を効率よく培養するには、培地成分に、炭素源や窒素源のみならず、金属塩も含む必要があり、かつ、培地組成を大腸菌に適合するようにすることが重要である。 Many examples of production of recombinant protein using E. coli have been reported so far, including Patent Document 1. In order to efficiently produce a recombinant protein, it is necessary to culture E. coli cells at a high density. E. coli cells are known to contain various metal elements in addition to carbon and nitrogen. Therefore, in order to efficiently culture E. coli, it is necessary to include not only a carbon source and a nitrogen source but also a metal salt in the medium components, and it is important to make the medium composition compatible with E. coli.
タンパク質のうちＦｃ受容体はＦｃ結合性タンパク質の一つであり、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃ受容体はその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγ受容体、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃε受容体、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃα受容体などがある（非特許文献１）。また、各受容体は、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγ受容体の場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。 Of the proteins, the Fc receptor is one of the Fc binding proteins and is a group of molecules that bind to the Fc region of immunoglobulin molecules. Fc receptors are classified according to the type of immunoglobulin that binds to them. Fcγ receptors that bind to the Fc region of IgG, Fcε receptors that bind to the Fc region of IgE, Fcα receptors that bind to the Fc region of IgA, etc. (Non-Patent Document 1). Each receptor is further classified according to the difference in structure. In the case of an Fcγ receptor, the presence of FcγRI, FcγRII, and FcγRIII has been reported (Non-patent Document 1).
Ｆｃγ受容体の一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。ＦｃγＲＩはＩｇＧ１から４まであるサブクラスのうち、ＩｇＧ１とＩｇＧ３と特に強く結合し、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４との結合は弱いことが知られている。 FcγRI, which is one of the Fcγ receptors, is expressed in monocytes and macrophages, and is inducibly expressed in neutrophils by γ interferon (Non-patent Document 1). FcγRI has high binding affinity for IgG, and its equilibrium dissociation constant (Kd) is 10 −8 M or less (Non-patent Document 2). FcγRI is divided into an extracellular region, a transmembrane region, and an intracytoplasmic region, and binding to IgG occurs in the Fc region of IgG and the extracellular region of FcγRI, and then a signal is transmitted to the cytoplasm. FcγRI is composed of two types of subunits, an α chain with a molecular weight of about 42000 that is directly involved in binding to IgG, and a γ chain. The γ chain covalently binds at the boundary between the cell membrane and the extracellular region, thereby forming a homodimer. (Non-Patent Document 3). It is known that FcγRI particularly strongly binds to IgG1 and IgG3 among the subclasses from IgG1 to IgG4 and weakly binds to IgG2 or IgG4.
ヒトＦｃ受容体のうち、ヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列（配列番号１）は、Ａｌｌｅｎ等により明らかにされており（非特許文献４）、ＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースにも公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。配列番号１のうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシグナルペプチドであり、１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２９２番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）までが細胞外領域の機能ドメイン、２９３番目のバリン（Ｖａｌ）から３７４番目のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。 Among human Fc receptors, the amino acid sequence and nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the human FcγRIα chain have been clarified by Allen et al. (Non-patent Document 4), and are publicly available such as ExPASy (Primary accession number: P12314). It is also published in the database. Similarly, the functional domain in the structure of human FcγRI, the signal peptide sequence for penetrating the cell membrane, and the position of the transmembrane region are also published. In SEQ ID NO: 1, the first methionine (Met) to the 15th glycine (Gly) are signal peptides, and the 16th glutamine (Gln) to the 292nd histidine (His) function in the extracellular region. The domain from the 293th valine (Val) to the 374th threonine (Thr) is defined as a transmembrane region and an intracellular region.
近年になり、Ｆｃ受容体の予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。 In recent years, the unexpected immunosuppressive biological properties of Fc receptors are gaining attention as pharmaceuticals, particularly in the areas of autoimmune disease or autoimmune syndrome, transplant rejection and malignant lymphoproliferation (non- Patent Document 2). Further, the antibody adsorption ability, which is a function of FcγRI, can also be used as a protein responsible for the capture function of various antibody purification chromatography gels.
Ｆｃ受容体を安価に製造することを目的に、Ｆｃ受容体を発現可能な遺伝子組換え体を利用した製造方法についてこれまで検討されており、例えば、組換え大腸菌を用いたＦｃγＲＩの製造方法が報告されている（特許文献２）。しかしながら、大腸菌を用いた発現系では、ＦｃγＲＩの発現量が極めて低いという問題点があった。 For the purpose of producing Fc receptors at low cost, production methods using genetic recombinants capable of expressing Fc receptors have been studied so far. For example, a method for producing FcγRI using recombinant Escherichia coli is disclosed. It has been reported (Patent Document 2). However, the expression system using Escherichia coli has a problem that the expression level of FcγRI is extremely low.
そこで本発明の目的は、タンパク質を発現可能な大腸菌を培養することでタンパク質を製造する方法において、タンパク質、特にＦｃ結合性タンパク質を効率的に製造するのに最適な金属塩の濃度、特にマグネシウム塩の濃度およびその供給方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a metal salt concentration optimum for efficiently producing a protein, particularly an Fc-binding protein, particularly a magnesium salt, in a method for producing a protein by culturing Escherichia coli capable of expressing the protein. It is in providing the density | concentration of this and its supply method.
本発明者らは前記課題に対し、大腸菌培養における、金属塩の供給について鋭意検討した結果、本発明の完成に至った。 As a result of intensive studies on the supply of metal salts in Escherichia coli culture, the present inventors have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する：
（ｉ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７２３５）を形質転換して得られた組換え大腸菌を、マグネシウム塩を添加した培地で培養することでタンパク質を製造する方法であって、マグネシウム塩の添加量が、培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして２．８×１０−２ｍｏｌ以上である、前記方法。
That is, the present invention includes the following inventions:
(I) A method for producing a protein by culturing a recombinant Escherichia coli obtained by transforming Escherichia coli W3110 (ATCC 27235) with an expression vector containing a polynucleotide encoding a protein in a medium to which a magnesium salt is added. And the said amount of addition of magnesium salt is 2.8 * 10 <-2 > mol or more as magnesium ion per liter of culture media.
（ｉｉ）培養開始時の培地にマグネシウム塩の一部を添加し、残部を培養中の培地に添加する、（ｉ）に記載の方法。 (Ii) The method according to (i), wherein a part of the magnesium salt is added to the culture medium at the start of the culture, and the remainder is added to the culture medium being cultured.
（ｉｉｉ）マグネシウム塩とともに炭素源および窒素源を培養中の培地に添加する、（ｉｉ）に記載の方法。 (Iii) The method according to (ii), wherein a carbon source and a nitrogen source are added together with a magnesium salt to the culture medium.
（ｉｖ）培養開始時の培地に添加するマグネシウム塩が、培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして４．０×１０−３ｍｏｌ以上であり、培養中の培地に添加するマグネシウム塩が、培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして２．４×１０−２ｍｏｌ以上である、請求項（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載の方法。 (Iv) The magnesium salt added to the medium at the start of the culture is 4.0 × 10 −3 mol or more as magnesium ions per liter of the medium, and the magnesium salt added to the medium during culturing is as magnesium ions per liter of the medium. The method according to claim (ii) or (iii), which is 2.4 × 10 −2 mol or more.
（ｖ）タンパク質がＦｃ結合性タンパク質である、（ｉ）から（ｉｖ）のいずれかに記載の方法。 (V) The method according to any one of (i) to (iv), wherein the protein is an Fc-binding protein.
（ｖｉ） Ｆｃ結合性タンパク質が、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、（ｖ）に記載の方法。 (Vi) the Fc-binding protein is (1) a protein comprising at least the 16th glutamine to 289th valine amino acid in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, or (2) the amino acid described in SEQ ID NO: 1 The protein according to (v), wherein the protein comprises at least the amino acid from glutamine at position 16 to valine at position 289 in the sequence, and at least one of the amino acids is substituted, inserted or deleted with another amino acid. Method.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明の製造方法では、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７２３５）を形質転換して得られた組換え大腸菌を適切な培地で培養することで、タンパク質を発現させ、製造する。組換え大腸菌を培養するのに用いる培地には、マグネシウム塩を添加する必要があるが、その添加量について検討した結果、培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして２．８×１０−２ｍｏｌ以上とすると効率的にタンパク質を製造できることが判明した。なお、培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして２．８×１０−２ｍｏｌ以上という条件は、培地に添加するマグネシウム塩としてよく用いられる硫酸マグネシウム七水和物の添加量に換算すると培地１Ｌあたり約７ｇ以上、となる。本発明の製造方法で使用するマグネシウム塩としては、前述した硫酸マグネシウムでなくてもよく、塩化マグネシウムといった水溶性のマグネシウム塩であれば特に限定されない。 In the production method of the present invention, recombinant E. coli obtained by transforming E. coli strain W3110 (ATCC 27235) with an expression vector containing a protein-encoding polynucleotide is cultured in an appropriate medium to express the protein. Manufacturing. Although it is necessary to add a magnesium salt to the medium used for culturing recombinant Escherichia coli, as a result of examining the amount added, it is efficient to use 2.8 × 10 −2 mol or more as magnesium ions per liter of the medium. It was found that protein can be produced. In addition, the condition of 2.8 × 10 −2 mol or more as magnesium ions per liter of medium is about 7 g or more per liter of medium when converted to the amount of magnesium sulfate heptahydrate often used as a magnesium salt added to the medium. It becomes. The magnesium salt used in the production method of the present invention is not limited to the above-described magnesium sulfate, and is not particularly limited as long as it is a water-soluble magnesium salt such as magnesium chloride.
その他の培地成分については、組換え大腸菌を増殖可能で、かつ発現ベクターに挿入したポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現可能なものであれば特に限定はない。培地に含まれる炭素源の一例としては、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、粗糖、糖蜜があげられる。培地に含まれる窒素源の一例としては、酵母エキス、ポリペプトン、カゼインおよびその代謝物、コーンスティープリカー、大豆タンパク質、肉エキス、魚肉エキスがあげられるが、特に酵母エキスが好ましい。なお、ナトリウム塩、鉄塩やマンガン塩など、マグネシウム塩以外の金属塩をさらに培地に添加してもよい。金属塩の具体例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンがあげられる。さらに必要に応じ、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンといったビタミン類を培地に添加してもよい。 Other medium components are not particularly limited as long as they can grow recombinant E. coli and can express a protein encoded by a polynucleotide inserted into an expression vector. Examples of the carbon source contained in the medium include glucose, fructose, maltose, sucrose, crude sugar, and molasses. Examples of nitrogen sources contained in the medium include yeast extract, polypeptone, casein and its metabolites, corn steep liquor, soy protein, meat extract, and fish extract, with yeast extract being particularly preferred. In addition, you may add metal salts other than magnesium salt, such as sodium salt, iron salt, and manganese salt, to a culture medium further. Specific examples of the metal salt include sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium chloride, iron (II) sulfate, iron (III) sulfate, iron chloride ( II), iron chloride (III), iron citrate, iron ammonium sulfate, calcium chloride dihydrate, calcium sulfate, zinc sulfate, zinc chloride, copper sulfate, copper chloride, manganese sulfate, manganese chloride. If necessary, vitamins such as biotin, nicotinic acid, thiamine, riboflavin, inositol, and pyridoxine may be added to the medium.
本発明の製造方法で組換え大腸菌を培養する際、培養開始時に炭素源や窒素源といった栄養源を一度に培地に投入すると、組換え大腸菌の増殖およびタンパク質製造が阻害されたり、酢酸などの副生成物が生産されるため、タンパク質の発現効率および得られたタンパク質の品質に悪影響を与える可能性がある。そのため、培養開始時に投入する栄養源は最小限とし、培養中に栄養源を追加供給（流加）しながら培養を行なう流加培養により、タンパク質を製造すると好ましい。なお、流加培養により組換え大腸菌を培養し、タンパク質を製造する際は、培地に添加するマグネシウム塩も、培養開始時の培地に一度に添加するのではなく、培養開始時の培地にその一部を添加し、残部は前記栄養源とともに培養中に添加するのが好ましい。 When culturing recombinant Escherichia coli by the production method of the present invention, if a nutrient source such as a carbon source or nitrogen source is added to the medium at the beginning of the culture, the growth of the recombinant Escherichia coli and protein production may be inhibited, and acetic acid and other sources may be added. Since the product is produced, it can adversely affect the efficiency of protein expression and the quality of the resulting protein. For this reason, it is preferable to produce the protein by fed-batch culture in which the nutrient source to be input at the start of the culture is minimized and the culture is performed while the nutrient source is additionally supplied (fed). When cultivating recombinant Escherichia coli by fed-batch culture to produce a protein, the magnesium salt added to the medium is not added to the medium at the start of the culture at the same time. It is preferable to add a portion during the cultivation together with the nutrient source.
本発明の好ましい製造方法である、流加培養によるタンパク質製造の一例を詳細に示す。必要最小限の炭素源および窒素源を投入した培地に、マグネシウム塩を培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして２．８×１０−２ｍｏｌ以上添加し、さらに必要に応じてマグネシウム塩以外の金属塩やビタミン類等を添加した後、組換え大腸菌の培養を開始する。組換え大腸菌の増殖により炭素源が消費され所定の濃度まで低下した時点で、培養液中の炭素源を所定の濃度に維持しつつ、炭素源と窒素源を供給（流加）して培養することで、組換え大腸菌からタンパク質を発現させ、製造する。 An example of protein production by fed-batch culture, which is a preferred production method of the present invention, is shown in detail. Add 2.8 × 10 −2 mol or more of magnesium salt as magnesium ions per liter of medium to a medium containing the minimum necessary carbon source and nitrogen source, and if necessary, metal salts and vitamins other than magnesium salt Etc. are added and culture | cultivation of recombinant E. coli is started. When the carbon source is consumed and reduced to a predetermined concentration due to the growth of recombinant Escherichia coli, the carbon source and the nitrogen source are supplied (fed) and cultured while maintaining the carbon source in the culture solution at the predetermined concentration. Thus, the protein is expressed from recombinant E. coli and produced.
本発明の好ましい製造方法である、流加培養によるタンパク質製造の別の例として、必要最小限の炭素源および窒素源を投入した培地に、マグネシウム塩を培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして４．０×１０−３ｍｏｌ以上添加し、さらに必要に応じてマグネシウム塩以外の金属塩やビタミン類等を添加した後、組換え大腸菌の培養を開始する。組換え大腸菌の増殖により炭素源が消費され所定の濃度まで低下した時点で、培養液中の炭素源を所定の濃度に維持しつつ、炭素源および窒素源を供給（流加）し、さらにマグネシウム塩を培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして２．４×１０−３ｍｏｌ以上添加して培養することで、組換え大腸菌からタンパク質を発現させ、製造する。 As another example of protein production by fed-batch culture, which is a preferred production method of the present invention, 4.0 × 10 4 magnesium ions as magnesium ions per liter of medium are added to a medium in which the minimum necessary carbon source and nitrogen source are added. After adding −3 mol or more, and further adding a metal salt other than magnesium salt, vitamins, etc. as necessary, the cultivation of recombinant Escherichia coli is started. When the carbon source is consumed by growth of the recombinant Escherichia coli and reduced to a predetermined concentration, the carbon source and nitrogen source are supplied (fed) while maintaining the carbon source in the culture solution at the predetermined concentration, and then magnesium Protein is expressed from recombinant Escherichia coli by producing a salt by adding at least 2.4 × 10 −3 mol of magnesium ion per liter of the medium and culturing.
前述した流加培養によるタンパク質製造において、培養開始時に投入する炭素源の濃度は、炭素源がグルコースの場合、０から２０ｇ／Ｌとすると好ましい。また供給（流加）する炭素源と窒素源は、高濃度の溶液とすると培養液の液量増加を抑えられるため好ましく、炭素源をグルコース、窒素源を酵母エキスとした場合、供給（流加）するグルコース溶液の濃度は３００から９００ｇ／Ｌに、酵母エキス溶液の濃度は１５０から５００ｇ／Ｌに、それぞれすると好ましい。炭素源と窒素源を供給（流加）する際維持する、所定の濃度とは、炭素源が枯渇せず有機酸などの副生成物が生産しない濃度をいう。炭素源をグルコースとした場合、炭素源濃度が５ｇ／Ｌを超えた状態で培養を行なうと副生成物として有機酸が生産され、それが多量に蓄積することにより組換え大腸菌の増殖やＦｃ結合性タンパク質の生産を抑制する可能性があるため、好ましくない。よって、炭素源をグルコースとした場合の所定の濃度とは、少なくとも５ｇ／Ｌ以下、好ましくは１ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．５ｇ／Ｌ以下、最も好ましくは０．１ｇ／Ｌ以下である。炭素源供給量のモニターは、例えば、炭素源を供給するポンプの稼働時間より行なうことができる。炭素源の枯渇をモニターする方法は特に限定はなく、一例として呼吸活性の低下によりモニターすることができる。呼吸活性の低下は、例えば培養液の溶存酸素濃度（ＤＯ）の上昇、排ガス中の酸素濃度の上昇、炭酸ガス濃度の低下、ｐＨの上昇として現れる。特に、ＤＯは応答が速いことから、炭素源の枯渇をモニターするのに好ましい指標である。その理由として、炭素源の濃度が十分に維持されている場合には、微生物の呼吸により酸素が消費されるためＤＯは酸素飽和濃度より低い値に維持されるが、炭素源が枯渇すると微生物の呼吸活性が低下しＤＯが急激に上昇するためである。なお、ＤＯの急激な上昇に連動させて炭素源を追加する方法をＤＯスタット法という。ＤＯ以外の指標（排ガス組成、炭酸ガス濃度、ｐＨ上昇）でモニターした場合は、ＤＯを指標とした場合と比較し応答が遅いという欠点がある。窒素源の供給（流加）量は、炭素源供給（流加）量に比例した量を供給（流加）すればよい。窒素源の供給（流加）方法は特に限定はなく、例えば、炭素源水溶液と窒素源水溶液を任意の濃度で混合し、当該混合液を培地に供給（流加）する方法が例示できる。 In the above-described protein production by fed-batch culture, the concentration of the carbon source introduced at the start of the culture is preferably 0 to 20 g / L when the carbon source is glucose. The carbon source and nitrogen source to be supplied (fed) are preferably a high-concentration solution because the increase in the amount of the culture solution can be suppressed. When the carbon source is glucose and the nitrogen source is yeast extract, the supply (fed-batch) is preferred. The concentration of the glucose solution is preferably 300 to 900 g / L, and the concentration of the yeast extract solution is preferably 150 to 500 g / L. The predetermined concentration maintained when supplying (feeding) a carbon source and a nitrogen source refers to a concentration at which a carbon source is not depleted and a by-product such as an organic acid is not produced. When glucose is used as the carbon source, organic acid is produced as a by-product when culturing in a state where the carbon source concentration exceeds 5 g / L. Accumulation of such a large amount results in growth of recombinant Escherichia coli and Fc binding. This is not preferable because it may suppress the production of sex protein. Therefore, the predetermined concentration when glucose is used as the carbon source is at least 5 g / L or less, preferably 1 g / L or less, more preferably 0.5 g / L or less, and most preferably 0.1 g / L or less. . The monitoring of the carbon source supply amount can be performed, for example, from the operating time of the pump that supplies the carbon source. The method for monitoring the depletion of the carbon source is not particularly limited. For example, it can be monitored by a decrease in respiratory activity. The decrease in respiratory activity appears, for example, as an increase in dissolved oxygen concentration (DO) in the culture solution, an increase in oxygen concentration in the exhaust gas, a decrease in carbon dioxide concentration, or an increase in pH. In particular, DO is a favorable indicator for monitoring carbon source depletion because of its fast response. The reason for this is that when the carbon source concentration is sufficiently maintained, oxygen is consumed by the respiration of microorganisms, so DO is maintained at a value lower than the oxygen saturation concentration. This is because respiratory activity decreases and DO increases rapidly. A method of adding a carbon source in conjunction with a rapid rise in DO is called a DO stat method. When monitoring with an index other than DO (exhaust gas composition, carbon dioxide concentration, pH increase), there is a drawback that the response is slower than when DO is used as an index. The supply (feeding) amount of the nitrogen source may be supplied (feeding) in an amount proportional to the carbon source supply (feeding) amount. The method for supplying (feeding) the nitrogen source is not particularly limited, and examples thereof include a method of mixing the carbon source aqueous solution and the nitrogen source aqueous solution at an arbitrary concentration and supplying (feeding) the mixed solution to the medium.
本発明の製造方法における組換え大腸菌の培養条件は、製造に用いる組換え大腸菌が増殖しタンパク質を発現し得る条件であれば特に限定はないが、培養温度は１５から５０℃が好ましく、特に好ましい温度は２０から３３℃である。ｐＨは６から８が好ましい。培養時間は任意に設定できるが、通常は数時間から１００時間の間に設定される。 The culture conditions for the recombinant Escherichia coli in the production method of the present invention are not particularly limited as long as the recombinant Escherichia coli used for production can grow and express the protein, but the culture temperature is preferably 15 to 50 ° C., particularly preferably. The temperature is 20 to 33 ° C. The pH is preferably 6-8. The culture time can be arbitrarily set, but is usually set between several hours and 100 hours.
本発明の好ましい製造方法では、組換え大腸菌からのタンパク質発現を誘導するために、培養開始から一定時間経過後、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に添加して、さらに培養する。ＩＰＴＧの濃度は最終濃度として０．０１から２．０ｍＭが好ましく、特に好ましい濃度は最終濃度０．１から２．０ｍＭである。 In a preferred production method of the present invention, in order to induce protein expression from recombinant Escherichia coli, isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) is added to the culture solution after a certain time from the start of the culture, Incubate. The concentration of IPTG is preferably 0.01 to 2.0 mM as a final concentration, and a particularly preferable concentration is 0.1 to 2.0 mM.
本発明の製造方法で製造可能なタンパク質の一例として、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモン、およびそれらの受容体のタンパク質等があげられる。以降、本発明の製造方法で製造するタンパク質の好ましい例である、Ｆｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。 Examples of the protein that can be produced by the production method of the present invention include insulin, interferon, interleukin, antibody, erythropoietin, growth hormone, and their receptor proteins. Hereinafter, an Fc-binding protein, which is a preferred example of a protein produced by the production method of the present invention, will be described in detail.
本発明の製造方法で製造する、Ｆｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域と結合する細胞表面に存在する受容体タンパク質である。Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃ受容体の場合、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩなどがあげられる。本発明の製造方法で製造するＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（Ｂ）の具体例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目から２８９番目までのアミノ酸を含み、かつ以下の（１）から（１６８）のいずれかに記載のアミノ酸置換を１つ以上含むＦｃ結合性タンパク質があげられる（特願２０１１−０３８５００号）。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（３）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（５）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンに置換
（６）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（７）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（８）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（１０）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（１１）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１２）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（１３）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（１５）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（１７）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（１８）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（１９）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（２０）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（２１）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（２２）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（２３）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（２４）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（２５）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（２６）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２７）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（２８）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（２９）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
（３０）配列番号１の１７番目のバリンがグリシンまたはグルタミン酸に置換
（３１）配列番号１の１９番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３２）配列番号１の２０番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３３）配列番号１の２５番目のスレオニンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（３４）配列番号１の２７番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
（３５）配列番号１の３５番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（３６）配列番号１の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（３７）配列番号１の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（３８）配列番号１の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（３９）配列番号１の４４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（４０）配列番号１の４５番目のバリンがアラニンに置換
（４１）配列番号１の４６番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（４２）配列番号１の４７番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
（４３）配列番号１の４９番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
（４４）配列番号１の５０番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（４５）配列番号１の５１番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
（４６）配列番号１の５２番目のセリンがグリシンに置換
（４７）配列番号１の５３番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
（４８）配列番号１の５５番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号１の５７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（５０）配列番号１の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（５１）配列番号１の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（５２）配列番号１の６１番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５３）配列番号１の６２番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（５４）配列番号１の６３番目のスレオニンがロイシン、フェニルアラニンに置換
（５５）配列番号１の６４番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
（５６）配列番号１の６５番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
（５７）配列番号１の６６番目のセリンがスレオニンに置換
（５８）配列番号１の６７番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５９）配列番号１の６９番目のセリンがアラニンに置換
（６０）配列番号１の７０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（６１）配列番号１の７１番目のアルギニンがチロシンに置換
（６２）配列番号１の７３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（６３）配列番号１の７４番目のセリンがフェニルアラニンに置換
（６４）配列番号１の７６番目のセリンがアスパラギンに置換
（６５）配列番号１の７７番目のバリンがアスパラギン酸またはリジンに置換
（６６）配列番号１の７８番目のアスパラギンがセリンまたはグリシンに置換
（６７）配列番号１の８０番目のセリンがアラニンに置換
（６８）配列番号１の８４番目のアルギニンがセリンに置換
（６９）配列番号１の８８番目のグリシンがセリンに置換
（７０）配列番号１の８９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７１）配列番号１の９０番目のセリンがグリシンに置換
（７２）配列番号１の９２番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
（７３）配列番号１の９６番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
（７４）配列番号１の９７番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
（７５）配列番号１の１０１番目のヒスチジンがロイシンに置換
（７６）配列番号１の１０２番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
（７７）配列番号１の１０３番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
（７８）配列番号１の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（７９）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
（８０）配列番号１の１１５番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（８１）配列番号１の１１８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８２）配列番号１の１２１番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
（８３）配列番号１の１２８番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
（８４）配列番号１の１２９番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（８５）配列番号１の１３１番目のロイシンがグルタミンに置換
（８６）配列番号１の１３３番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（８７）配列番号１の１３４番目のアスパラギンがセリンに置換
（８８）配列番号１の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（８９）配列番号１の１３８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（９０）配列番号１の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９１）配列番号１の１４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（９２）配列番号１の１４１番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（９３）配列番号１の１４２番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（９４）配列番号１の１４４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（９５）配列番号１の１４７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（９６）配列番号１の１４８番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（９７）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがアルギニンに置換
（９８）配列番号１の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（９９）配列番号１の１５２番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
（１００）配列番号１の１５４番目のスレオニンがセリンに置換
（１０１）配列番号１の１５６番目のロイシンがヒスチジンに置換
（１０２）配列番号１の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（１０３）配列番号１の１５９番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
（１０４）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがスレオニン、バリンまたはロイシンに置換
（１０５）配列番号１の１６１番目のセリンがスレオニンに置換
（１０６）配列番号１の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（１０７）配列番号１の１７１番目のメチオニンがスレオニンに置換
（１０８）配列番号１の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（１０９）配列番号１の１７４番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１１０）配列番号１の１７７番目のスレオニンがセリンに置換
（１１１）配列番号１の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（１１２）配列番号１の１８２番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
（１１３）配列番号１の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（１１４）配列番号１の１９０番目のプロリンがセリンに置換
（１１５）配列番号１の１９３番目のバリンがロイシンに置換
（１１６）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがアラニンに置換
（１１７）配列番号１の１９６番目のアラニンがセリンに置換
（１１８）配列番号１の１９８番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
（１１９）配列番号１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２０）配列番号１の２００番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
（１２１）配列番号１の２０２番目のロイシンがメチオニンに置換
（１２２）配列番号１の２０３番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
（１２３）配列番号１の２０４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１２４）配列番号１の２０７番目のロイシンがグルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１２５）配列番号１の２０９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２６）配列番号１の２１１番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
（１２７）配列番号１の２１３番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
（１２８）配列番号１の２１５番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１２９）配列番号１の２１７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１３０）配列番号１の２１８番目のロイシンがイソロイシン、メチオニンまたはリジンに置換
（１３１）配列番号１の２１９番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
（１３２）配列番号１の２２３番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
（１３３）配列番号１の２２４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３４）配列番号１の２２５番目のロイシンがグルタミンに置換
（１３５）配列番号１の２２７番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（１３６）配列番号１の２３０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（１３７）配列番号１の２３１番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
（１３８）配列番号１の２３３番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
（１３９）配列番号１の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１４０）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがグリシンに置換
（１４１）配列番号１の２４４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１４２）配列番号１の２４５番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
（１４３）配列番号１の２４６番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
（１４４）配列番号１の２４８番目のロイシンがイソロイシンに置換
（１４５）配列番号１の２４９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（１４６）配列番号１の２５０番目のアラニンがバリンに置換
（１４７）配列番号１の２５１番目のアルギニンがセリンに置換
（１４８）配列番号１の２５２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１４９）配列番号１の２５３番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（１５０）配列番号１の２５７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１５１）配列番号１の２６１番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
（１５２）配列番号１の２６２番目のアラニンがバリンに置換
（１５３）配列番号１の２６３番目のアラニンがセリンに置換
（１５４）配列番号１の２６４番目のスレオニンがセリンに置換
（１５５）配列番号１の２６５番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
（１５６）配列番号１の２６８番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
（１５７）配列番号１の２７０番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
（１５８）配列番号１の２７１番目のリジンがアルギニンに置換
（１５９）配列番号１の２７２番目のアルギニンがグルタミンに置換
（１６０）配列番号１の２７７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１６１）配列番号１の２７９番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６２）配列番号１の２８２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１６３）配列番号１の２８３番目のロイシンがプロリンに置換
（１６４）配列番号１の２８５番目のロイシンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６５）配列番号１の２８６番目のプロリンがグルタミン、アルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１６６）配列番号１の２８７番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニンまたはバリンに置換
（１６７）配列番号１の２８８番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
（１６８）配列番号１の２８９番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
なお、本発明の製造方法で製造するＦｃ結合性タンパク質では、分析・精製の迅速化やタンパク質の安定化などの目的でＮ末端側、Ｃ末端側またはＦｃ結合性タンパク質内部に、ポリヒスチジンタグやＣ−ｍｙｃタグといった任意のペプチドを追加してもよい。
The Fc-binding protein produced by the production method of the present invention is a receptor protein present on the cell surface that binds to the Fc region of an antibody. When the Fc binding protein is a human Fc receptor, human FcγRI, human FcγRIIa, human FcγRIIb, human FcγRIII and the like can be mentioned. As an example of the Fc-binding protein produced by the production method of the present invention,
(A) a protein comprising amino acids from at least the 16th glutamine to the 289th valine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
(B) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 contains at least the 16th amino acid from glutamine to 289th valine, and at least one of the amino acids is substituted, inserted or deleted with another amino acid. protein,
Can be given. As a specific example of the (B), the amino acid substitution described in any one of the following (1) to (168) including at least the 16th to 289th amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 Examples thereof include one or more Fc-binding proteins (Japanese Patent Application No. 2011-038500).
(1) 20th threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with proline (2) 25th threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with lysine (3) 38th threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine or serine (4) The 46th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine or proline (5) The 62nd alanine of SEQ ID NO: 1 is replaced with valine (6) The 63rd threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine (7) SEQ ID NO: 1 69 of serine is replaced with phenylalanine or threonine (8) 71st arginine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (9) 77th valine of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine or glutamic acid (10) 78th asparagine is replaced by aspartic acid (11) 94th aspartic acid of SEQ ID NO: 1 is glutamine (12) The 100th isoleucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with valine (13) The 110th serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine (14) The 114th phenylalanine of SEQ ID NO: 1 is replaced with leucine (15) The 125th histidine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine (16) The 131st leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine or proline (17) The 149th tryptophan of SEQ ID NO: 1 is replaced with leucine (18) SEQ ID NO: 1 The 156th leucine is replaced with proline (19) The 160th isoleucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with methionine (20) The 163rd asparagine of SEQ ID NO: 1 is replaced with serine (21) The 195th asparagine of SEQ ID NO: 1 Is replaced with threonine (22) The 199th threonine of SEQ ID NO: 1 is (23) The 206th asparagine of SEQ ID NO: 1 is replaced with lysine, serine or threonine (24) The 207th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with proline (25) The 218th leucine of SEQ ID NO: 1 is valine (26) The 240th asparagine of SEQ ID NO: 1 was replaced with aspartic acid (27) The 248th leucine of SEQ ID NO: 1 was replaced with serine (28) The 283rd leucine of SEQ ID NO: 1 was replaced with histidine (29 ) The 285th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamine (30) The 17th valine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glycine or glutamic acid (31) The 19th threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine (32) 20th threonine of 1 is replaced with isoleucine (33) 25th threonine of SEQ ID NO: 1 Is replaced with methionine or arginine (34) 27th glutamine of SEQ ID NO: 1 is replaced with proline or lysine (35) 35th glutamine of SEQ ID NO: 1 is replaced with leucine, methionine or arginine (36) 36 of SEQ ID NO: 1 The 41st glutamic acid is replaced by glycine (37) The 41st leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced by methionine (38) The 42nd histidine of SEQ ID NO: 1 is replaced by leucine (39) The 44th glutamic acid of SEQ ID NO: 1 is asparagine Substitution with acid (40) 45th valine of SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine (41) 46th leucine of SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glycine, histidine, lysine, serine or tryptophan (42) 47th histidine of SEQ ID NO: 1 Replacement with glutamine, leucine or asparagine (43) Replacement of 49th proline of SEQ ID NO: 1 with serine or alanine (44) Replacement of 50th glycine of SEQ ID NO: 1 with arginine or glutamic acid (45) Position 51 of SEQ ID NO: 1 The serine of A is replaced with alanine, threonine, leucine, proline or valine (46) The 52nd serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glycine (47) The 53rd serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with leucine, threonine or proline (48 ) The 55th glutamine of SEQ ID NO: 1 was replaced with arginine (49) The 57th phenylalanine of SEQ ID NO: 1 was replaced with tyrosine (50) The 58th leucine of SEQ ID NO: 1 was replaced with arginine (51) The 60th glycine is replaced with aspartic acid (52) SEQ ID NO: 1 61st threonine is substituted with alanine or serine (53) 62nd alanine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamic acid (54) 63rd threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with leucine and phenylalanine (55) 64 of SEQ ID NO: 1 The glutamine of the 1st is replaced with proline, histidine, leucine and lysine (56) The 65th threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine or valine (57) The 66th serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine (58) 1 of 67th threonine is replaced with alanine or serine (59) 69th serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine (60) 70th tyrosine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine or phenylalanine (61) SEQ ID NO: 1 71 of arginine was replaced with tyrosine (62) 73 of SEQ ID NO: 1 The threonine is replaced with alanine or serine (63) The 74th serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with phenylalanine (64) The 76th serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine (65) The 77th valine of SEQ ID NO: 1 Is replaced with aspartic acid or lysine (66) 78th asparagine of SEQ ID NO: 1 is replaced with serine or glycine (67) 80th serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine (68) 84th arginine of SEQ ID NO: 1 Is replaced with serine (69) 88th glycine of SEQ ID NO: 1 is replaced with serine (70) 89th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamine or proline (71) 90th serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glycine Substitution (72) 92nd Arginine of SEQ ID NO: 1 is replaced with cysteine or leucine (73) SEQ ID NO: 1 of 96th isoleucine is replaced with valine or lysine (74) 97th glutamine of SEQ ID NO: 1 is replaced with leucine or lysine (75) 101st histidine of SEQ ID NO: 1 is replaced with leucine (76) SEQ ID NO: 1 The arginine at position 102 is replaced with serine or leucine (77) The glycine at position 103 in SEQ ID NO: 1 is replaced with aspartic acid or serine (78) The serine at position 111 in SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine (79) SEQ ID NO: 1 114th phenylalanine is replaced with alanine, isoleucine, methionine, proline, threonine or valine (80) 115th threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine or phenylalanine (81) 118th glutamic acid of SEQ ID NO: 1 is aspartic acid Replace with (82) SEQ ID NO 1 of 121st alanine is replaced with threonine or valine (83) 128th lysine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine or glycine (84) 129th aspartic acid of SEQ ID NO: 1 is replaced with glycine (85) SEQ ID NO: 1 of 131 leucine is replaced with glutamine (86) 133rd tyrosine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine or arginine (87) 134th asparagine of SEQ ID NO: 1 is replaced with serine (88) 137 of SEQ ID NO: 1 The 138th tyrosine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (90) The 139th arginine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (91) The 140th asparagine of SEQ ID NO: 1 is asparagine Substitute for acid (92) 141st glycine of SEQ ID NO: 1 is Substitution with aspartic acid or valine (93) Substitution of lysine 142 of SEQ ID NO: 1 with glutamic acid or arginine (94) Substitution of phenylalanine 144 of SEQ ID NO: 1 with isoleucine (95) Phenylalanine 147 of SEQ ID NO: 1 Substitution with serine (96) 148th histidine of SEQ ID NO: 1 replaced with arginine or glutamine (97) 149th tryptophan of SEQ ID NO: 1 replaced with arginine (98) 151st serine of SEQ ID NO: 1 replaced with threonine (99) The asparagine at position 152 in SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine, isoleucine or proline (100) The threonine at position 154 in SEQ ID NO: 1 is replaced with serine (101) The 156th leucine in SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine ( 102) 15 of SEQ ID NO: 1 The lysine is replaced with arginine (103) The 159th asparagine of SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine or aspartic acid (104) The 160th isoleucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine, valine or leucine (105) SEQ ID NO: 1 The 165th serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with methionine (107) The 171st methionine of SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine (108) The 173rd lysine of SEQ ID NO: 1 Is replaced with arginine (109) 174th histidine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamine (110) 177th threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with serine (111) 181st isoleucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine ( 112) The 182th serine of SEQ ID NO: 1 Substitution with threonine, leucine, valine or glutamic acid (113) Substitution of 184th threonine of SEQ ID NO: 1 with serine (114) Substitution of 190th proline of SEQ ID NO: 1 with serine (115) 193rd valine of SEQ ID NO: 1 Is replaced with leucine (116) 195th asparagine of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine (117) 196th alanine of SEQ ID NO: 1 is replaced with serine (118) 198th valine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glycine or methionine Substitution (119) The 199th threonine of SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine (120) The 200th serine of SEQ ID NO: 1 is substituted with glycine or arginine (121) The 202nd leucine of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine (122 ) The 203rd leucine of SEQ ID NO: 1 is histidine, gluta Substitution of min, tyrosine, arginine, and proline (123) Substitution of glutamic acid at 204 in SEQ ID NO: 1 with valine (124) Substitution of leucine at 207 of SEQ ID NO: 1 with glutamine, histidine, or arginine (125) 209th threonine is replaced with alanine (126) 211th serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine or glycine (127) 213rd glutamic acid of SEQ ID NO: 1 is replaced with valine or isoleucine (128) 215 of SEQ ID NO: 1 The lysine is replaced with arginine or glutamic acid (129) The 217th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine or glutamine (130) The 218th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine, methionine or lysine (131) 1 of 219 Glutamine of the eye is replaced with proline or arginine (132) 223th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine, glutamine or methionine (133) 224th glutamine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine (134) 225th leucine replaced with glutamine (135) 227th phenylalanine of SEQ ID NO: 1 replaced with isoleucine (136) 230th tyrosine of SEQ ID NO: 1 replaced with histidine or phenylalanine (137) 231st of SEQ ID NO: 1 Methionine is replaced with lysine or arginine (138) 233rd serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glycine or asparagine (139) 234th lysine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamic acid (140) 240th asparagine of SEQ ID NO: 1 But Replaced with lysine (141) Substituted 244th glutamic acid of SEQ ID NO: 1 with valine (142) Replaced 245th tyrosine of SEQ ID NO: 1 with histidine or glutamic acid (143) Replaced 246th glutamine of SEQ ID NO: 1 with arginine or lysine (144) The 248th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine (145) The 249th threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine or serine (146) The 250th alanine of SEQ ID NO: 1 is replaced with valine (146) 147) 251st arginine of SEQ ID NO: 1 is replaced with serine (148) 252nd arginine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (149) 253rd glutamic acid of SEQ ID NO: 1 is replaced with glycine (150) SEQ ID NO: 1 257th leucine is arginine or glutamine (151) Glutamic acid at position 261 in SEQ ID NO: 1 is replaced with valine or alanine (152) Alanine at position 262 in SEQ ID NO: 1 is replaced with valine (153) Alanine at position 263 in SEQ ID NO: 1 is replaced with serine ( 154) The 264th threonine of SEQ ID NO: 1 is replaced with serine (155) The 265th glutamic acid of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine or glycine (156) The 268th asparagine of SEQ ID NO: 1 is replaced with serine, isoleucine or threonine (157) 270 th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine, arginine or valine (158) 271 th lysine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine (159) 272 th arginine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamine ( 160) 277th glutamic acid of SEQ ID NO: 1 Substituting valine (161) Substituting 279th glutamine of SEQ ID NO: 1 for arginine or histidine (162) Substituting 282nd glycine of SEQ ID NO: 1 for aspartic acid (163) 283rd leucine of SEQ ID NO: 1 for proline Substitution (164) 285th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine or histidine (165) 286th proline of SEQ ID NO: 1 is substituted with glutamine, arginine or glutamic acid (166) 287th threonine of SEQ ID NO: 1 is isoleucine Substitution of proline, alanine or valine (167) Substitution of 288th proline of SEQ ID NO: 1 to alanine, serine or threonine (168) Substitution of 289th valine of SEQ ID NO: 1 to alanine, aspartic acid, glycine, leucine or isoleucine Place In the Fc-binding protein produced by the production method of the present invention, a polyhistidine tag or N-terminal side, C-terminal side or inside the Fc-binding protein is used for the purpose of speeding up analysis / purification or protein stabilization. Any peptide such as a C-myc tag may be added.
本発明の製造方法で製造する、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製するには、Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する必要があるが、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおけるコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）は必ずしもヒトに合わせる必要はなく、例えば、大腸菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ、当該宿主におけるコドンの使用頻度が少ないもの）の全部または一部を、コードするアミノ酸を同一のまま、大腸菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドであってもよい。なお、コドンの使用頻度の情報は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）から得ることができる。 In order to produce a polynucleotide encoding an Fc binding protein produced by the production method of the present invention, it is necessary to convert the amino acid sequence of the Fc binding protein into a nucleotide sequence. The codon usage in nucleotides does not necessarily match that of humans. For example, all or a part of rare codons in E. coli (rare codon, those with low codon usage in the host) have the same amino acid encoding. The polynucleotide may be converted into a codon that is frequently used in the translation mechanism of E. coli. Information on codon usage frequency can be obtained from public databases (for example, Codon Usage Database on the Kazusa DNA Research Institute website).
本発明の製造方法で用いる、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するベクターに特に限定はなく、大腸菌で異種タンパク質を発現可能なベクターの中から、適宜選択し使用すればよい。具体例としては、ｐＴｒｃ９９ａ（ライフテクノロジーズ社製）があげられる。 The vector for inserting the polynucleotide encoding the Fc binding protein used in the production method of the present invention is not particularly limited, and may be appropriately selected from vectors capable of expressing heterologous proteins in E. coli. A specific example is pTrc99a (manufactured by Life Technologies).
本発明の製造方法で組換え大腸菌より発現したＦｃ結合性タンパク質を定量する方法としては、一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離した後に色素や免疫学的方法で染色して比色定量する方法やＥＬＩＳＡ法などの方法を用いることができるが、ＥＬＩＳＡ法による活性定量が簡便で好ましい。ＥＬＩＳＡ法におけるＦｃ結合性タンパク質の組み合わせは前記タンパク質が定量できる方法であれば特に限定されないが、
（ａ）Ｆｃ結合性タンパク質に対する抗体
（ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質
（ｃ）酵素標識抗Ｆｃ結合性タンパク質抗体
の順番で重ねたサンドイッチ法による方法を好ましく用いることができる。
ここで酵素標識抗Ｆｃ結合性タンパク質抗体として、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素で標識された抗Ｆｃ結合性タンパク質抗体が好ましく使用することができる。また、ＥＬＩＳＡによる検出法についても特に限定されないが、標識に用いた酵素の特異的発色試薬、蛍光試薬または化学発光試薬が市販されており、それらを標識に用いた酵素に応じて任意に使用することができる。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合は発色基質をペルオキシダーゼと過酸化水素で酸化反応させて比色定量する方法があり、例えばＴＭＢ ２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（フナコシ社製）などの市販の試薬で発色させた後、市販の測定装置（例えばマイクロタイタープレートリーダＭＰＲ４ｉ、東ソー社製）で比色定量することができる。
As a method for quantifying Fc-binding protein expressed from recombinant Escherichia coli by the production method of the present invention, a method for colorimetric quantification by separating the protein with general SDS-PAGE and then staining with a dye or an immunological method Or the ELISA method can be used, but the activity quantification by the ELISA method is simple and preferable. The combination of Fc binding proteins in the ELISA method is not particularly limited as long as the protein can be quantified,
(A) Antibody against Fc binding protein (b) Fc binding protein (c) Enzyme-labeled anti-Fc binding protein Antibodies can be preferably used in a sandwich method.
Here, as the enzyme-labeled anti-Fc binding protein antibody, an anti-Fc binding protein antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase can be preferably used. Further, the detection method by ELISA is not particularly limited, but a specific coloring reagent, fluorescent reagent or chemiluminescent reagent for the enzyme used for labeling is commercially available, and these are arbitrarily used depending on the enzyme used for labeling. be able to. For example, when horseradish peroxidase is used, there is a method for colorimetric determination by oxidizing a chromogenic substrate with peroxidase and hydrogen peroxide. For example, a commercially available reagent such as TMB 2-Component Microwell Peroxidase Substrate (Funakoshi) Then, colorimetric quantification can be performed with a commercially available measuring device (for example, microtiter plate reader MPR4i, manufactured by Tosoh Corporation).
本発明は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７２３５）株を形質転換して得られた組換え大腸菌を培養してタンパク質を製造する方法において、組換え大腸菌を培養する際に用いる培地に添加するマグネシウム塩の量を培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして２．８×１０−２ｍｏｌ以上とすることを特徴としており、前記製造方法により組換え大腸菌の効率的な培養および組換え大腸菌からの効率的なタンパク質の発現を実現することができる。なお、ここで添加するマグネシウム塩を、培養開始時にその一部を添加し、残部を培養中に添加すると、より高効率に組換え大腸菌からタンパク質を発現させることができる。 The present invention relates to a method for producing a protein by culturing recombinant Escherichia coli obtained by transforming Escherichia coli W3110 (ATCC 27235) with an expression vector containing a polynucleotide encoding the protein. The amount of magnesium salt added to the medium used for the treatment is 2.8 × 10 −2 mol or more as magnesium ions per liter of the medium. Efficient protein expression from recombinant E. coli can be achieved. If a part of the magnesium salt added here is added at the start of the culture and the rest is added during the culture, the protein can be expressed from recombinant E. coli more efficiently.
以下、本発明の製造方法によるＦｃ結合性タンパク質の製造を例として、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by taking as an example the production of an Fc binding protein by the production method of the present invention, but the present invention is not limited thereto.
実施例１
Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（組換え大腸菌）を、硫酸マグネシウム七水和物を６．９ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして２．８×１０−２ｍｏｌ／Ｌ（培地））添加した培地で培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産を行なった。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩをコードする、配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを、公知の方法（例えば特許文献２の方法）により、プラスミドｐＴｒｃ９９ａのＮｃｏＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に挿入することで、発現ベクター（ｐＴｒｃｐｅｒＢＦｃＲｍ３２）を作製した。なお、配列番号２のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３２のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。なお、ＦｃＲｍ３２は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒト天然型ＦｃγＲＩのうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、かつ、下記に示すアミノ酸置換を行なったＦｃ結合性タンパク質である。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンをプロリンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンをリジンに置換
（３）配列番号１の３６番目のグルタミン酸をグリシンに置換
（４）配列番号１の３８番目のスレオニンをセリンに置換
（５）配列番号１の４５番目のバリンをアラニンに置換
（６）配列番号１の４６番目のロイシンをプロリンに置換
（７）配列番号１の４９番目のプロリンをセリンに置換
（８）配列番号１の６０番目のグリシンをアスパラギン酸に置換
（９）配列番号１の６３番目のスレオニンをイソロイシンに置換
（１０）配列番号１の６５番目のスレオニンをアラニンに置換
（１１）配列番号１の６９番目のセリンをスレオニンに置換
（１２）配列番号１の７１番目のアルギニンをヒスチジンに置換
（１３）配列番号１の７７番目のバリンをグルタミン酸に置換
（１４）配列番号１の７８番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（１６）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（１７）配列番号１の１３３番目のチロシンをヒスチジンに置換
（１８）配列番号１の１３９番目のアルギニンをヒスチジンに置換
（１９）配列番号１の１４９番目のトリプトファンをアルギニンに置換
（２０）配列番号１の１５６番目のロイシンをプロリンに置換
（２１）配列番号１の１６０番目のイソロイシンをスレオニンに置換
（２２）配列番号１の１６３番目のアスパラギンをセリンに置換
（２３）配列番号１の１７３番目のリジンをアルギニンに置換
（２４）配列番号１の１８１番目のイソロイシンをスレオニンに置換
（２５）配列番号１の１９５番目のアスパラギンをスレオニンに置換
（２６）配列番号１の２０３番目のロイシンをヒスチジンに置換
（２７）配列番号１の２０６番目のアスパラギンをスレオニンに置換
（２８）配列番号１の２０７番目のロイシンをグルタミンに置換
（２９）配列番号１の２３１番目のメチオニンをリジンに置換
（３０）配列番号１の２４０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（３１）配列番号１の２８３番目のロイシンをヒスチジンに置換
（３２）配列番号１の２８５番目のロイシンをグルタミンに置換
（Ｂ）（Ａ）で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｒＢＦｃＲｍ３２を用いて、公知の方法（例えば特許文献２の方法）により、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７２３５）を形質転換した。
（Ｃ）形質転換体を、１００ｍＬの２×ＹＴ培地（バクトトリプトン：１６ｇ／Ｌ、酵母エキス：１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム：５ｇ／Ｌ、アンピシリン：０．１ｍｇ／Ｌ）を入れた、５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに植菌し、３０℃で１６時間、毎分１３０回の回転速度、回転半径１インチで前培養を行なった。
（Ｄ）表１に示す培地組成のうち、酵母エキス、リン酸三ナトリウム十二水和物およびリン酸水素二ナトリウム十二水和物を投入した培地約１．４Ｌを３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃で２０分間滅菌後、グルコース、硫酸鉄（ＩＩ）四水和物および塩化マンガン（ＩＩ）四水和物は表１に示す濃度に、硫酸マグネシウム七水和物は６．９ｇ／Ｌ（培地）に、それぞれなるよう添加し、さらに（Ａ）の前培養液９０ｍＬを添加して、本培養を行なった。
Example 1
A transformant capable of expressing an Fc-binding protein (recombinant E. coli) was converted to magnesium sulfate heptahydrate 6.9 g / L (medium) (magnesium ion 2.8 × 10 −2 mol / L (medium). ) Fc-binding protein was produced by culturing in the added medium.
(A) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 that encodes human FcγRI consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is converted into NcoI of plasmid pTrc99a by a known method (eg, the method of Patent Document 2) An expression vector (pTrcperBFcRm32) was prepared by inserting between the site and the HindIII site. In SEQ ID NO: 2, the first methionine to the 26th alanine are MalE signal peptides, the 27th lysine to the 33rd glycine are linker peptides, and the 34th glutamine to the 307th valine are Fc-bound. The amino acid sequence of the sex protein FcRm32, the 308th to 313th histidines, is a polyhistidine tag. Note that FcRm32 corresponds to the region from the 16th glutamine to the 289th valine in the human natural FcγRI consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the Fc binding with the amino acid substitution shown below It is a sex protein.
(1) Replacing the 20th threonine of SEQ ID NO: 1 with proline (2) Replacing the 25th threonine of SEQ ID NO: 1 with lysine (3) Replacing the 36th glutamic acid of SEQ ID NO: 1 with glycine (4) SEQ ID NO: 1) 38th threonine of 1 is replaced with serine (5) 45th valine of SEQ ID NO: 1 is replaced with alanine (6) 46th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with proline (7) 49th of SEQ ID NO: 1 Replace proline with serine (8) Replace 60th glycine of SEQ ID NO: 1 with aspartic acid (9) Replace 63rd threonine of SEQ ID NO: 1 with isoleucine (10) Replace 65th threonine of SEQ ID NO: 1 with alanine Substitution (11) The 69th serine of SEQ ID NO: 1 is replaced with threonine (12) The 71st arginine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (13) SEQ ID NO: (77) Asparagine in the 78th position of SEQ ID NO: 1 is replaced with aspartic acid (15) The 100th isoleucine in the SEQ ID NO: 1 is replaced with valine (16) The 114th position in the SEQ ID NO: 1 Phenylalanine is replaced with leucine (17) The 133rd tyrosine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (18) The 139th arginine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (19) The 149th tryptophan of SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine (20) Substitution of 156th leucine of SEQ ID NO: 1 with proline (21) Substitution of 160th isoleucine of SEQ ID NO: 1 with threonine (22) Substitution of 163rd asparagine of SEQ ID NO: 1 with serine (23) SEQ ID NO: 1 173rd lysine was substituted with arginine (24) 181 of SEQ ID NO: 1 Substitution of isoleucine of the eye with threonine (25) Substitution of 195th asparagine of SEQ ID NO: 1 with threonine (26) Substitution of leucine 203 of SEQ ID NO: 1 with histidine (27) Replacing 206th asparagine of SEQ ID NO: 1 with threonine (28) The 207th leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamine (29) The 231st methionine of SEQ ID NO: 1 is replaced with lysine (30) The 240th asparagine of SEQ ID NO: 1 is replaced with aspartic acid (31 ) Replacing the 283rd leucine of SEQ ID NO: 1 with histidine (32) Substituting the 285th leucine of SEQ ID NO: 1 with glutamine (B) Using the expression vector pTrcperBFcRm32 prepared in (A), a known method (for example, patent E. coli strain W3110 (ATCC 2723) ) Was transformed.
(C) 500 mL of the transformant containing 100 mL of 2 × YT medium (bactotryptone: 16 g / L, yeast extract: 10 g / L, sodium chloride: 5 g / L, ampicillin: 0.1 mg / L) Inoculated into an Erlenmeyer flask with a baffle, and precultured at 30 ° C. for 16 hours at a rotation speed of 130 times per minute at a rotation radius of 1 inch.
(D) Of the medium composition shown in Table 1, about 1.4 L of a medium charged with yeast extract, trisodium phosphate dodecahydrate and disodium hydrogen phosphate dodecahydrate was placed in a 3 L fermentor. After sterilization at 121 ° C. for 20 minutes, glucose, iron (II) sulfate tetrahydrate and manganese (II) chloride tetrahydrate have the concentrations shown in Table 1, and magnesium sulfate heptahydrate has a concentration of 6.9 g / L. (Culture medium) was added to each, and 90 mL of the preculture solution of (A) was further added to perform main culture.
培養装置はエイブル社製ＢＭＳ−０３ＰＩを使用し、通気した空気速度は１．８Ｌ／分に、培養温度は３０℃に、ｐＨは６．９から７．１にそれぞれ設定し、培養中におけるｐＨの変動は、１４％アンモニア水または５０％リン酸の添加により前記範囲に制御した。培養中はグルコース分析計（ＹＳＩ社製２７００）を用いて定期的にグルコース濃度を測定した。炭素源の供給には７００ｇ／Ｌのグルコースを、窒素源の供給には４００ｇ／Ｌの酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）を、それぞれ使用した。供給は、炭素源の溶液と窒素源の溶液を容量比１：１で混合して行なった。エイブル社製ＤＯ（溶存酸素）電極による信号を、エイブル社製培養制御プログラムをインストールしたパーソナルコンピューターにより検出することで、本培養初期に投入したグルコース（２０ｇ／Ｌ）が消費されたことを検知し、溶存酸素濃度が４０％飽和を超えた時点で流加ポンプを起動してグルコース３５０ｇ／Ｌ、酵母エキス２００ｇ／Ｌの混合液を供給した。供給にはワトソン・マーロウ社製定量ポンプ１０１Ｕの高速型を使用した。微生物の増殖は培養液の６００ｎｍの濁度（ＯＤ６００）により測定した。
（Ｅ）ＯＤ６００が９０に達したとき、すなわち培養開始１３時間後に培養温度を２５℃に下げ、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるよう培養液に添加することで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産誘導をかけた。
The culture apparatus is BMS-03PI manufactured by Able, the aerated air velocity is set to 1.8 L / min, the culture temperature is set to 30 ° C., and the pH is set to 6.9 to 7.1. The fluctuation of was controlled within the above range by adding 14% ammonia water or 50% phosphoric acid. During the culture, the glucose concentration was periodically measured using a glucose analyzer (YSI 2700). 700 g / L glucose was used for supplying the carbon source, and 400 g / L yeast extract (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) was used for supplying the nitrogen source. Supply was performed by mixing a carbon source solution and a nitrogen source solution in a volume ratio of 1: 1. By detecting the signal from the Able DO (dissolved oxygen) electrode with a personal computer installed with the Able culture control program, it is detected that the glucose (20 g / L) input at the beginning of the main culture has been consumed. When the dissolved oxygen concentration exceeded 40% saturation, the fed-feed pump was started to supply a mixed solution of glucose 350 g / L and yeast extract 200 g / L. A high-speed type of meter pump 101U manufactured by Watson Marlow was used for the supply. The growth of microorganisms was measured by the turbidity at 600 nm (OD 600 ) of the culture solution.
(E) When the OD 600 reaches 90, that is, 13 hours after the start of culture, the culture temperature is lowered to 25 ° C., and IPTG is added to the culture solution to a final concentration of 0.5 mM. An induction was applied.
４８時間培養を行なったところ、培養液の濁度は１６０に達した。予め求めた濁度と菌体密度の相関式より、乾燥菌体収量は培養液１Ｌあたり４６ｇと求められた。なお、グルコース濃度は、グルコースと酵母エキスの供給を開始した、培養開始８時間後から培養終了（４８時間後）までの期間中、０から０．１ｇ／Ｌに維持された。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩ）の生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり１１００ｍｇであった（図１）。 When cultured for 48 hours, the turbidity of the culture reached 160. From the correlation equation of turbidity and cell density obtained in advance, the dry cell yield was determined to be 46 g per liter of culture solution. The glucose concentration was maintained at 0 to 0.1 g / L during the period from 8 hours after the start of culture until the end of the culture (48 hours) after the supply of glucose and yeast extract was started. Moreover, as a result of quantifying the production amount of the Fc binding protein (human FcγRI) contained in the culture solution after completion of the culture by ELISA, it was 1100 mg per 1 L of the culture solution (FIG. 1).
実施例２
培養開始時の培地として添加する硫酸マグネシウム七水和物を１３．５ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして５．５×１０−２ｍｏｌ／Ｌ（培地））とした他は、実施例１と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を培養した。
Example 2
Example 1 except that magnesium sulfate heptahydrate added as a medium at the start of culture was 13.5 g / L (medium) (magnesium ion 5.5 × 10 −2 mol / L (medium)). Transformants expressing Fc binding protein were cultured in the same manner.
４８時間培養を行なったところ、培養液の濁度は１４０に達した（乾燥菌体収量４０ｇ／Ｌ）。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩ）の生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり１１００ｍｇであった。 When cultured for 48 hours, the turbidity of the culture reached 140 (dry cell yield 40 g / L). Further, the amount of Fc binding protein (human FcγRI) contained in the culture broth after completion of the culture was quantified by ELISA, and as a result, it was 1100 mg per liter of the broth.
比較例１
培養開始時の培地として添加する硫酸マグネシウム七水和物を３．８ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして１．５×１０−２ｍｏｌ／Ｌ（培地））とし、ヒトＦｃγＲＩの生産誘導をかけるときの濁度をＯＤ６００＝７０とした他は、実施例１と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を培養した。
Comparative Example 1
Magnesium sulfate heptahydrate added as a culture medium at the start of culture is 3.8 g / L (medium) (1.5 × 10 −2 mol / L (medium) as magnesium ions) to induce human FcγRI production. Transformants expressing Fc binding protein were cultured in the same manner as in Example 1 except that the turbidity at that time was OD 600 = 70.
４８時間培養を行なったところ、培養液の濁度は８５に達した（乾燥菌体収量２４ｇ／Ｌ（培養液））。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩ）の生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり３００ｍｇであった。 When cultured for 48 hours, the turbidity of the culture reached 85 (dry cell yield 24 g / L (culture)). Moreover, as a result of quantifying the production amount of the Fc binding protein (human FcγRI) contained in the culture solution after completion of the culture by ELISA, it was 300 mg per 1 L of the culture solution.
実施例１および２ならびに比較例１の結果をまとめたものを表２に示す。表２から分かるように、培養開始時の培地に添加する硫酸マグネシウム七水和物の量を６．９ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして２．８×１０−２ｍｏｌ／Ｌ（培地））以上とすると、ヒトＦｃγＲＩの生産量が増大することがわかる。 Table 2 shows a summary of the results of Examples 1 and 2 and Comparative Example 1. As can be seen from Table 2, the amount of magnesium sulfate heptahydrate added to the culture medium at the start of the culture was 6.9 g / L (medium) (magnesium ion 2.8 × 10 −2 mol / L (medium)). From the above, it can be seen that the production amount of human FcγRI increases.
実施例３
実施例１で作製した、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を、硫酸マグネシウム七水和物を１．０ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして４．１×１０−３ｍｏｌ／Ｌ（培地））添加した培地で培養を開始し、その後硫酸マグネシウム七水和物を６．０ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして２．４×１０−３ｍｏｌ／Ｌ（培地））添加して培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産を行なった。
（Ａ）表１に示す培地に硫酸マグネシウム七水和物を１．０ｇ／Ｌ添加して培養を開始した後、グルコース３５０ｇ／Ｌ、酵母エキス２００ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１２．７５ｇ／Ｌの混合液を流加する他は、実施例１と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を培養した。培養終了までに、培養槽に投入される硫酸マグネシウム七水和物は最終的に７ｇ／Ｌ（培地）となる。
Example 3
The transformant produced in Example 1 and capable of expressing Fc binding protein was converted to magnesium sulfate heptahydrate 1.0 g / L (medium) (magnesium ion 4.1 × 10 −3 mol / L ( Culture)) Start culture with the added medium, and then add magnesium sulfate heptahydrate to 6.0 g / L (medium) (2.4 × 10 −3 mol / L (medium) as magnesium ion) and culture As a result, Fc-binding protein was produced.
(A) After adding 1.0 g / L of magnesium sulfate heptahydrate to the medium shown in Table 1 and starting culture, 350 g / L of glucose, 200 g / L of yeast extract, 12.75 g of magnesium sulfate heptahydrate A transformant expressing an Fc binding protein was cultured in the same manner as in Example 1 except that the / L mixture was fed. By the end of the culture, the magnesium sulfate heptahydrate added to the culture tank is finally 7 g / L (medium).
４８時間培養を行なったところ、培養液の濁度は１３０に達した（乾燥菌体収量３７ｇ／Ｌ）。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩ）の生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり１１００ｍｇであった（図２）。 When cultured for 48 hours, the turbidity of the culture reached 130 (dry cell yield: 37 g / L). Moreover, as a result of quantifying the production amount of the Fc binding protein (human FcγRI) contained in the culture solution after completion of the culture by the ELISA method, it was 1100 mg per 1 L of the culture solution (FIG. 2).
実施例４
培養開始時の培地として添加する硫酸マグネシウム七水和物を１．０ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして４．１×１０−３ｍｏｌ／Ｌ（培地））とし、培養中に添加する硫酸マグネシウム七水和物を１２ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして４．９×１０−２ｍｏｌ／Ｌ（培地））とした他は、実施例３と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を培養した。
Example 4
Magnesium sulfate heptahydrate added as a medium at the start of culture is 1.0 g / L (medium) (magnesium ion 4.1 × 10 −3 mol / L (medium)), and magnesium sulfate is added during the culture. Characteristic expression of Fc-binding protein in the same manner as in Example 3, except that heptahydrate was 12 g / L (medium) (magnesium ion: 4.9 × 10 −2 mol / L (medium)) The transformant was cultured.
具体的には、表１に示す培地に硫酸マグネシウム七水和物を１．０ｇ／Ｌ添加して培養を開始した後、グルコース３５０ｇ／Ｌ、酵母エキス２００ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２７ｇ／Ｌの混合液を流加する他は、実施例１と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を培養した。培養終了までに、培養槽に投入される硫酸マグネシウム七水和物は最終的に１３ｇ／Ｌ（培地）となる。 Specifically, after starting the culture by adding 1.0 g / L of magnesium sulfate heptahydrate to the medium shown in Table 1, glucose 350 g / L, yeast extract 200 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 27 g A transformant expressing an Fc binding protein was cultured in the same manner as in Example 1 except that the / L mixture was fed. By the end of the culture, the magnesium sulfate heptahydrate added to the culture tank is finally 13 g / L (medium).
４８時間培養を行なったところ、培養液の濁度は１８０に達した（乾燥菌体収量５２ｇ／Ｌ）。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩ）の生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり１１５０ｍｇであった。 When cultured for 48 hours, the turbidity of the culture reached 180 (dry cell yield: 52 g / L). Further, the amount of Fc-binding protein (human FcγRI) contained in the culture broth after completion of the culture was quantified by the ELISA method. As a result, it was 1150 mg per liter of the culture broth.
比較例２
培養開始時の培地として添加する硫酸マグネシウム七水和物を１．０ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして４．１×１０−３ｍｏｌ／Ｌ（培地））とし、培養中に添加する硫酸マグネシウム七水和物を３ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして１．２×１０−２ｍｏｌ／Ｌ（培地））とした他は、実施例３と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を培養した。
Comparative Example 2
Magnesium sulfate heptahydrate added as a medium at the start of culture is 1.0 g / L (medium) (magnesium ion 4.1 × 10 −3 mol / L (medium)), and magnesium sulfate is added during the culture. Characteristic expression of Fc-binding protein in the same manner as in Example 3 except that heptahydrate was 3 g / L (medium) (magnesium ion 1.2 × 10 −2 mol / L (medium)) The transformant was cultured.
具体的には、表１に示す培地に硫酸マグネシウム七水和物を１．０ｇ／Ｌ添加して培養を開始した後、グルコース３５０ｇ／Ｌ、酵母エキス２００ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物６．７５ｇ／Ｌの混合液を流加する他は、実施例１と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を培養した。培養終了までに、培養槽に投入される硫酸マグネシウム七水和物は最終的に４ｇ／Ｌ（培地）となる。 Specifically, after adding 1.0 g / L of magnesium sulfate heptahydrate to the medium shown in Table 1 and culturing, glucose 350 g / L, yeast extract 200 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 6 A transformant expressing an Fc-binding protein was cultured in the same manner as in Example 1 except that a mixed solution of .75 g / L was fed. By the end of the culture, the magnesium sulfate heptahydrate added to the culture tank is finally 4 g / L (medium).
４８時間培養を行なったところ、培養液の濁度は１３０に達した（乾燥菌体収量３７ｇ／Ｌ）。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩ）の生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり４００ｍｇであった。 When cultured for 48 hours, the turbidity of the culture reached 130 (dry cell yield: 37 g / L). Moreover, as a result of quantifying the production amount of the Fc binding protein (human FcγRI) contained in the culture solution after completion of the culture by ELISA, it was 400 mg per liter of the culture solution.
実施例３および４ならびに比較例２の結果をまとめたものを表３に示す。なお表３における、硫酸マグネシウム濃度は、培養開始時に添加した硫酸マグネシウム七水和物と培養中に添加した硫酸マグネシウム七水和物との合算値（総量）である。表３から分かるように、培養開始時および培養中に添加する硫酸マグネシウム七水和物の量を合計７ｇ／Ｌ（培地）（マグネシウムイオンとして２．８×１０−２ｍｏｌ／Ｌ（培地））以上とすると、ヒトＦｃγＲＩの生産量が増大することがわかる。 Table 3 summarizes the results of Examples 3 and 4 and Comparative Example 2. The magnesium sulfate concentration in Table 3 is the total value (total amount) of magnesium sulfate heptahydrate added at the start of culture and magnesium sulfate heptahydrate added during culture. As can be seen from Table 3, the total amount of magnesium sulfate heptahydrate added at the start of culture and during culture is 7 g / L (medium) (2.8 × 10 −2 mol / L (medium) as magnesium ions). From the above, it can be seen that the production amount of human FcγRI increases.
なお、実施例１の結果と実施例３の結果とを比較すると、実施例３のほうが実施例１よりも菌体あたりのヒトＦｃγＲＩの生産量が向上している。このことから、培地にマグネシウム塩を添加する際は、培養開始時に一度に添加する（実施例１）よりも、培養開始時に一部を添加し、培養中に残部を供給（流加）する（実施例３）ほうが好ましいことが分かる。 In addition, when the result of Example 1 and the result of Example 3 are compared, the production amount of human FcγRI per bacterial cell in Example 3 is higher than that in Example 1. From this, when adding a magnesium salt to a culture medium, a part is added at the time of a culture | cultivation rather than adding at once at the time of culture | cultivation (Example 1), and the remainder is supplied (feeding) during culture | cultivation ( It can be seen that Example 3) is preferred.
Claims (6)
マグネシウム塩の添加量が、培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして２．８×１０−２ｍｏｌ以上である、前記方法。 A method for producing a protein by culturing a recombinant Escherichia coli obtained by transforming Escherichia coli W3110 strain (ATCC 27235) with an expression vector containing a polynucleotide encoding a protein in a medium to which a magnesium salt is added. ,
The said method that the addition amount of magnesium salt is 2.8 * 10 <-2 > mol or more as magnesium ion per liter of culture media.
培養中の培地に添加するマグネシウム塩が、培地１Ｌあたりマグネシウムイオンとして２．４×１０−２ｍｏｌ以上である、
請求項２または３に記載の方法。 The magnesium salt added to the medium at the start of the culture is 4.0 × 10 −3 mol or more as magnesium ions per liter of the medium,
The magnesium salt added to the medium during the culture is 2.4 × 10 −2 mol or more as magnesium ions per liter of the medium.
The method according to claim 2 or 3.
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
請求項５に記載の方法。 Fc binding protein is
(1) a protein comprising an amino acid from at least the 16th glutamine to the 289th valine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, or (2) from at least the 16th glutamine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 A protein comprising amino acids up to 289th valine, wherein one or more of the amino acids are substituted, inserted or deleted with other amino acids,
The method of claim 5.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011230579A JP2013085531A (en) | 2011-10-20 | 2011-10-20 | Method for producing protein with recombinant e.coli |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011230579A JP2013085531A (en) | 2011-10-20 | 2011-10-20 | Method for producing protein with recombinant e.coli |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013085531A true JP2013085531A (en) | 2013-05-13 |
Family
ID=48530122
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011230579A Pending JP2013085531A (en) | 2011-10-20 | 2011-10-20 | Method for producing protein with recombinant e.coli |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2013085531A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015178465A1 (en) * | 2014-05-21 | 2015-11-26 | 味の素株式会社 | Method for producing fibroin-like protein |
| WO2017090665A1 (en) * | 2015-11-25 | 2017-06-01 | 味の素株式会社 | Method for producing fibroin-like protein |
| CN115786214A (en) * | 2022-12-26 | 2023-03-14 | 湖北擎科生物科技有限公司 | High-density fermentation culture medium and high-density fermentation culture method of competent escherichia coli |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002262888A (en) * | 2000-10-04 | 2002-09-17 | Mitsui Chemicals Inc | Method for producing protein |
| WO2011111393A1 (en) * | 2010-03-10 | 2011-09-15 | 公益財団法人相模中央化学研究所 | Fc binding protein and method for producing same |
-
2011
- 2011-10-20 JP JP2011230579A patent/JP2013085531A/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002262888A (en) * | 2000-10-04 | 2002-09-17 | Mitsui Chemicals Inc | Method for producing protein |
| WO2011111393A1 (en) * | 2010-03-10 | 2011-09-15 | 公益財団法人相模中央化学研究所 | Fc binding protein and method for producing same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6015037920; Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ｖｏｌ．３３， ｎｏ．２, 2004, ｐｐ．３２６-３３１ * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015178465A1 (en) * | 2014-05-21 | 2015-11-26 | 味の素株式会社 | Method for producing fibroin-like protein |
| JPWO2015178465A1 (en) * | 2014-05-21 | 2017-04-20 | 味の素株式会社 | Production method of fibroin-like protein |
| US9926348B2 (en) | 2014-05-21 | 2018-03-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing fibroin-like protein |
| WO2017090665A1 (en) * | 2015-11-25 | 2017-06-01 | 味の素株式会社 | Method for producing fibroin-like protein |
| JPWO2017090665A1 (en) * | 2015-11-25 | 2018-09-13 | 味の素株式会社 | Production method of fibroin-like protein |
| US11117937B2 (en) | 2015-11-25 | 2021-09-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing fibroin-like protein |
| JP7057558B2 (en) | 2015-11-25 | 2022-04-20 | 味の素株式会社 | How to make fibroin-like protein |
| CN115786214A (en) * | 2022-12-26 | 2023-03-14 | 湖北擎科生物科技有限公司 | High-density fermentation culture medium and high-density fermentation culture method of competent escherichia coli |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5812627B2 (en) | Improved Fc receptor and method for producing the same | |
| KR101939553B1 (en) | Novel coelenterazine substrates and methods of use | |
| RU2736086C1 (en) | Mutant nitrile hydratase, nucleic acid which encodes said mutant nitrile hydratase, expression vector and transformant containing said nucleic acid, method of producing said mutant nitrile hydratase and method of producing amide compound | |
| EP2489741B1 (en) | Method for production of glutathione or gamma-glutamylcysteine | |
| CN112195143B (en) | Strain for producing D-pantothenic acid by fermentation method and method for producing D-pantothenic acid by fermentation method | |
| RU2746860C1 (en) | VARIANT OF THE cAMP RECEPTOR PROTEIN AND A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING IT | |
| JP2013085531A (en) | Method for producing protein with recombinant e.coli | |
| KR101835164B1 (en) | Modified Ornithine Decarboxylase protein with an improved producing capability for Putrescine and a Use thereof | |
| JP2013188141A (en) | Method for producing protein with gene recombination escherichia coli | |
| EP3147369A1 (en) | Fibroin-like protein production method | |
| KR101584414B1 (en) | Alkaline feed | |
| AU2015270032A1 (en) | Improved nitrile hydratase | |
| JP5768341B2 (en) | Method for producing Fc binding protein | |
| CN112111468B (en) | Gamma-glutamine transpeptidase mutant and application thereof | |
| TWI751154B (en) | A preparation method of recombinant human granulocyte colony stimulating factor | |
| KR101725454B1 (en) | Gene encoding lysine decarboxylase derived from H. alvei, recombinant vector, host cell and method for producing cadaverine using the same | |
| CN111549027A (en) | Corynebacterium glutamicum high-strength promoter Psod-sxAnd applications | |
| Kou et al. | Increasing the productivity of TNFR-Fc in GS-CHO cells at reduced culture temperatures | |
| JP5817550B2 (en) | Fc-binding protein with improved productivity | |
| KR101028039B1 (en) | Microorganism Enhanced Resistance of Succinic Acid and Method for Preparing Succinic Acid Using the Same | |
| Egorova-Zachernyuk et al. | Production of yeastolates for uniform stable isotope labelling in eukaryotic cell culture | |
| JP2018011515A (en) | Method for producing recombinant protein using Escherichia coli | |
| JP2014124135A (en) | Method of producing protein by recombinant escherichia coli | |
| JP2020058343A (en) | Method for producing fucose-binding protein | |
| CN118086261B (en) | Kex2 protease mutant with high stability and high enzyme activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141002 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150929 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160216 |