JP2013070686A - ヒト由来メチルステロール酸化酵素を生産する組換体及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒト由来メチルステロール酸化酵素(SC4MOL)遺伝子を宿主微生物細胞に発現可能な状態で、かつSC4MOL活性を発現し得る状態で導入した組換体。この組換体と共に分析用検体をインキュベーションして、分析用検体のSC4MOLによる反応生成物を得、得られた反応生成物を分析する方法。SC4MOLの基質となり得る化合物を、上記組換体と共にインキュベーションして、前記化合物のSC4MOLによる反応生成物を得、得られた反応生成物を収集することを含む、SC4MOLによる反応生成物の製造方法。
【選択図】なし
Description
[1]
ヒト由来メチルステロール酸化酵素(SC4MOL)遺伝子を宿主微生物細胞に発現可能な状態で、かつSC4MOL活性を発現し得る状態で導入した組換体。
[2]
宿主微生物が出芽酵母である[1]に記載の組換体。
[3]
SC4MOL遺伝子を載せたプラスミドベクターpGYRを導入して形質転換した出芽酵母である[2]に記載の組換体。
[4]
宿主微生物が大腸菌である[1]に記載の組換体。
[5]
SC4MOL遺伝子を載せたプラスミドベクターpET17bを導入して形質転換した大腸菌である[4]に記載の組換体。
[6]
分析用検体を[1]〜[5]のいずれかに記載の組換体と共にインキュベーションして、分析用検体のSC4MOLによる反応生成物を得、得られた反応生成物を分析することを含む分析用検体のSC4MOLによる反応生成物の分析方法。
[7]
分析用検体が、医薬品若しくは医薬品の候補品、または食品成分若しくは食品成分の候補品である[6]に記載の方法。
[8]
SC4MOLの基質となり得る化合物を、[1〜5いずれかに記載の組換体と共にインキュベーションして、前記化合物のSC4MOLによる反応生成物を得、得られた反応生成物を収集することを含む、SC4MOLの基質となり得る化合物のSC4MOLによる反応生成物の製造方法。
[9]
SC4MOLの基質となり得る化合物、医薬品若しくは医薬品の候補品、または食品成分若しくは食品成分の候補品である[7]に記載の方法。
[10]
分析用検体またはSC4MOLの基質となり得る化合物が、ジメチル-5α-コレスト-8-エン-3β-オール、テストステロン、エルデカルシトール、セサミン、またはエピセサミンである[6]〜[9]のいずれかに記載の方法。
(1)本発明のヒト由来SC4MOL発現微生物は、医薬品・食品成分・環境物質などがヒト体内で、どのような代謝を受けるのか予測するために利用することができる。
(2)代謝物を大量に製造し、その安全性や生理機能を調べることが可能である。
(3)これらの代謝物の中には元の化合物にはない有用な性質を示すことがあるため、新たな医薬品開発のためのツールになると考えられる。
本発明の組換体は、ヒト由来メチルステロール酸化酵素(SC4MOL)遺伝子を宿主微生物細胞に発現可能な状態で、かつSC4MOL活性を発現し得る状態で導入した組換体である。ヒト由来SC4MOL遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は以下のサイトから入手可能であり、また、配列表に配列番号1及び2として記載した。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/5803157
NCBI Reference Sequence: NP_006736.1
本発明は、分析用検体のSC4MOLによる反応生成物の分析方法を包含する。この分析方法は、分析用検体を本発明の組換体と共にインキュベーションして、分析用検体のSC4MOLによる反応生成物を得、得られた反応生成物を分析することを含む方法である。
増殖中の菌体培養液に分析用検体を添加する場合、組換え酵母(AH22株)においては、SD液体培地(2% グルコース、0.67% N-base w/o アミノ酸、20μg/ml L-ヒスチジン)で30℃、24時間インキュベートする。組換え大腸菌においては、アンピシリン50μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むTB 培地(トリプトン12 g、イーストエキストラクト 24 g、グリセロール 5 gを蒸留水900mLに溶解後、1Mリン酸バッファー(pH 7.0)を100mL添加し、1Lの培地とする)37℃、24時間インキュベートする。また、遠心分離等の方法により集めた組換え酵母あるいは組換え大腸菌の菌体を8% グルコースを含む0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH 7.4)に懸濁し、分析用検体を添加し、数時間〜24時間インキュベートすることにより反応生成物を得ることができる。
本発明は、SC4MOLの基質となり得る化合物がSC4MOLによって変換されることにより得られる反応生成物の製造方法を包含する。この製造方法は、SC4MOLの基質となり得る化合物を、本発明の組換体と共にインキュベーションして、SC4MOLの基質となり得る化合物のSC4MOLによる反応生成物を得、得られた反応生成物を収集することを含む。
SC4MOLをコードする遺伝子を、ヒト肝cDNAライブラリーを鋳型とし、プライマー1および2 (配列番号3および4)を用いPCRにより増幅した。PCRは、反応1(94℃ 2分後、94℃ 15秒、52℃ 30秒、68℃ 1分、30サイクル;鋳型DNA 10 ng、反応液、dNTP 0.2 mM、KOD-plus-DNA polymerase (TOYOBO) 1 U、10x PCR Buffer for KOD -Plus- 5μl、プライマー各0.2μM、最終液量50μl)の条件で行った。PCR産物を1%アガロースゲルにより電気泳動した結果、目的サイズ(約0.9kb)に特異的な増幅がみられた(以下、1%アガロースゲルでの電気泳動は、単に電気泳動と略称する)。TArget CloneTM -Plus-(TOYOBO)の取扱説明書に従い、PCR産物をpTA2ベクターに連結した。塩化カルシウム法 〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地(ポリペプトン10 g、イーストエキストラクト 5 g、NaCl 5 gおよび寒天15 gを蒸留水1Lに溶解)に塗布した。得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、それらを鋳型としてコロニーPCRを行った。PCRは、EmeraldAmp(登録商標) PCR Master Mix (Takara) の取扱説明書に従い、反応2(98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 1分、30サイクル;反応液、EmeraldAmp PCR Master Mix(2×Premix) (Takara) 5μl、M13-M3プライマーおよびM13-Rvプライマー各0.2μM、最終液量10μl)の条件で行った。得られたPCR産物の電気泳動を行い、予想サイズ(約1.0 kb)に特異的な増幅が見られるクローンを数個得た。得られたクローンのインサート配列にPCRによる変異が入っていないことを確認するためにシーケンスを行った。まず、得られた大腸菌コロニーを5mlのLB 培地(アンピシリン50μg/ml含有)に植菌し、37℃、200rpmで16時間振盪培養を行った。その後、Wizard(登録商標) Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega)を用いてプラスミドを抽出し、プラスミド濃度を260nmの吸光度を用いて測定し、テンプレートDNAとした。サイクルシークエンス反応は、BigDye(登録商標) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いて行った。配列決定を行った結果、SC4MOLをコードする遺伝子特有の正確な配列であることが確認できた。このプラスミドをpTA2-SC4MOLと命名した。
配列番号4:5'-ATATAAGCTTTTATTCAGTCTTTTTCTC-3'
1で作成したpTA2-SC4MOLプラスミド約1μgを37℃で1時間、HindIII処理し、電気泳動を行った。約0.9kbのDNA断片を電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いてゲルから回収し、インサート断片とした。酵母発現ベクターとしては小胞体膜酵素であるシトクロムP450の発現で実績のあるpGYRを用いた(非特許文献2*)。pGYRベクターを37℃で1時間HindIII処理し、約11kbのDNA断片を電気泳動により分離し、ゲルから回収した。HindIII処理されたpGYRベクターをCalf Intestinal Alkaline Phosphatase(Takara) により脱リン酸化処理し、QIAquick PCR Purification Kit(Takara)を用いてベクター断片を調製した。インサート断片とpGYRベクター断片の濃度を電気泳動で確認後、それらのモル比が3:1〜10:1程度になるように混合し、等量のDNA Ligation Kit Ver. 2 (TaKaRa)のsolution Iを加え、16℃、30分反応を行った。その後、塩化カルシウム法により大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布した。得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、それらを鋳型としてコロニーPCRを行った。PCRは、EmeraldAmp(登録商標) PCR Master Mix (Takara) の取扱説明書に従い、反応2の条件で行った。プライマー1及び3(配列番号3と配列番号5)を用いた。得られたPCR産物の電気泳動を行い、予想サイズ(約1.8 kb)に特異的な増幅が見られるクローンを数個得た。得られた大腸菌コロニーを5mlのLB 培地(アンピシリン50μg/ml含有)に植菌し、37℃、200rpmで16時間振盪培養を行った。その後、Wizard(登録商標)Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega)を用いてプラスミドを抽出しその一部を37℃で1時間、HindIII処理し、電気泳動をしてインサートの導入を確認した。このプラスミドをpGYR-SC4MOLと命名した。塩化リチウム法によりサッカロマイセス・セレビシエAH22株を形質転換し、SD寒天培地(2%グルコース、0.67% N-base w/o アミノ酸、1.5%寒天、20μg/ml L-ヒスチジン)に塗布した。得られたコロニーをSC4MOL遺伝子発現酵母として、以下の生産試験に用いた。
配列番号5:5'- GACGTTGTAAAACGACGGCAGTG -3'
1で作成したpTA2-SC4MOLプラスミドを鋳型とし、プライマー2および4(配列番号4および6)を用いPCRにより反応1の条件で増幅した。得られたPCR産物を電気泳動した結果、目的サイズ(約0.9kb)に特異的な増幅がみられた。TArget CloneTM -Plus-(TOYOBO)の取扱説明書に従い、PCR産物をpTA2ベクターに連結した。塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布した。得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、それらを鋳型としてコロニーPCRを行った。PCRは、EmeraldAmp(登録商標)PCR Master Mix (Takara)の取扱説明書に従い、反応2の条件で行った。得られたPCR産物の電気泳動を行い、予想サイズ(約1.0 kb)に特異的な増幅が見られるクローンを数個得た。得られたクローンのインサート配列にPCRによる変異が入っていないことを確認するためにシーケンスを行った。まず、得られた大腸菌コロニーを5mlのLB 培地(アンピシリン50μg/ml含有)に植菌し、37℃、200rpmで16時間振盪培養を行った。その後、Wizard(登録商標) Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega)を用いてプラスミドを抽出し、プラスミド濃度を260nmの吸光度を用いて測定し、テンプレートDNAとした。サイクルシークエンス反応は、BigDye(登録商標) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いて行った。配列決定を行った結果、SC4MOLをコードする遺伝子特有の正確な配列であることが確認できた。得られたプラスミド約1μgを37℃で1時間、NdeIおよびHindIIIで処理し、電気泳動を行った。約0.9kbのDNA断片を電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を用いてゲルから回収し、インサート断片とした。pET17bベクターを37℃で1時間NdeIおよびHindIII処理し、約3kbのDNA断片を電気泳動により分離した後に、ゲルから回収しQIAquick PCR Purification Kit(Takara)を用いてベクター断片を調製した。インサート断片とpET17bベクター断片の濃度を電気泳動で確認後、それらのモル比が3:1〜10:1程度になるように混合し、等量のDNA Ligation Kit Ver. 2 (TaKaRa)のsolution Iを加え、16℃、30分反応を行った。その後、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布した。得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、それらを鋳型としてコロニーPCRを行った。PCRは、EmeraldAmp(登録商標)PCR Master Mix (Takara)の取扱説明書に従い、プライマーの配列のみを変えた反応2の条件で行った。プライマーはT7-プロモータープライマーとT7-ターミネータープライマーを用いた。得られたPCR産物の電気泳動を行い、予想サイズ(約1.1 kb)に特異的な増幅が見られるクローンを数個得た。得られた大腸菌コロニーを5mlのLB 培地(アンピシリン50μg/ml含有)に植菌し、37℃、200rpmで16時間振盪培養を行った。その後、Wizard(登録商標) Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega)を用いてプラスミドを抽出しその一部を37℃で1時間、NdeIおよびHindIII処理し、電気泳動をしてインサートの導入を確認した。このプラスミドをpET17b-SC4MOLと命名した。GroEL/ES発現ベクターであるpGro12(非特許文献3)が導入された大腸菌BL21株を塩化カルシウム法により形質転換し、pET17b-SC4MOLプラスミドを導入した。アンピシリン50μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むLB寒天培地に塗布して、得られたコロニーをSC4MOL遺伝子発現大腸菌として、以下の生産試験に用いた。
配列番号6:5'-ATATCATATGGCAACAAATGAAAGTGTCAGCATCTTTA-3'
SC4MOL遺伝子発現酵母を5mLのSD液体培地(2% グルコース、0.67% N-base w/o アミノ酸、20μg/ml L-ヒスチジン)に植菌し、30℃、200rpmで振盪培養を行った。OD610値が0.25〜0.3に到達した時点で、基質を終濃度10μMで添加した。今回用いた基質はエルデカルシトール(中外製薬(株))、テストステロン、パクリタキセル、セサミン、エピセサミンの5種類であるが、これらに限定されるものではない。基質添加後、さらに培養を続け、24時間後の培養液500μLに2mLのクロロホルム:メタノール=3:1を添加し、激しく攪拌した後、クロロホルム層を回収、減圧乾固した。これをアセトニトリルに溶解した後に14500rpm、15分遠心し、その上清をHPLCにより分析した。(条件:カラム:YMC社製 YMC−Pack ODS−AM (内径4.6mm×長さ300mm);流速:1.0ml/min;カラム温度:40℃、検出波長および溶離条件は以下のとおり基質により異なる。)
水/アセトニトリル系;25−95% アセトニトリル直線濃度勾配(25分間)検出波長:265nm
HPLC条件2:テストステロン
水/アセトニトリル系;20−100 %アセトニトリル直線濃度勾配(25分間)検出波長:290nm
HPLC条件3:パクリタキセル
水/メタノール系;10−95% 0.01%トリフルオロ酢酸を含むメタノール直線濃度勾配(16分間)後、0.01%トリフルオロ酢酸を含むメタノール95%(8分間)検出波長:227nm
HPLC条件4:セサミン、エピセサミン
水/メタノール系;10−90% メタノール直線濃度勾配(30分間)検出波長:280nm
SC4MOL遺伝子発現大腸菌をアンピシリン50μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含む5mLのTB 培地(トリプトン12 g、イーストエキストラクト 24 g、グリセロール 5 gを蒸留水900mLに溶解後、1Mリン酸バッファー(pH 7.0)を100mL添加し、1Lの培地とした)に植菌し、37℃、200rpmで振盪培養を行った。OD610が0.5〜1.0に到達した時点で、IPTG(終濃度1mM)、アラビノースを終濃度(4mg/mL)、基質としてエルデカルシトール(終濃度10μM)を添加した。さらに培養を続け、24時間後の培養液500μLに2mLのクロロホルム:メタノール=3:1を添加し、激しく攪拌した後、クロロホルム層を回収、減圧乾固した。これをアセトニトリルに溶解した後に14500rpm、15分遠心し、その上清をHPLCにより分析した。
SC4MOL cDNAを含まないベクターpGYRを導入したコントロール株では、いずれの活性も認められなかった。この結果から、上記実施例におけるエルデカルシトールの代謝物は、酵母内で発現したSC4MOLに由来する活性と考えられる。
SC4MOL cDNAを含まないベクター pET17bを導入したコントロール株では、活性が認められなかった。この結果から、上記実施例におけるエルデカルシトールの代謝物は、大腸菌内で発現したSC4MOLに由来する活性と考えられる。
Claims (10)
- ヒト由来メチルステロール酸化酵素(SC4MOL)遺伝子を宿主微生物細胞に発現可能な状態で、かつSC4MOL活性を発現し得る状態で導入した組換体。
- 宿主微生物が出芽酵母である請求項1に記載の組換体。
- SC4MOL遺伝子を載せたプラスミドベクターpGYRを導入して形質転換した出芽酵母である請求項2に記載の組換体。
- 宿主微生物が大腸菌である請求項1に記載の組換体。
- SC4MOL遺伝子を載せたプラスミドベクターpET17bを導入して形質転換した大腸菌である請求項4に記載の組換体。
- 分析用検体を請求項1〜5のいずれかに記載の組換体と共にインキュベーションして、分析用検体のSC4MOLによる反応生成物を得、得られた反応生成物を分析することを含む分析用検体のSC4MOLによる反応生成物の分析方法。
- 分析用検体が、医薬品若しくは医薬品の候補品、または食品成分若しくは食品成分の候補品である請求項6に記載の方法。
- SC4MOLの基質となり得る化合物を、請求項1〜5いずれかに記載の組換体と共にインキュベーションして、前記化合物のSC4MOLによる反応生成物を得、得られた反応生成物を収集することを含む、SC4MOLの基質となり得る化合物のSC4MOLによる反応生成物の製造方法。
- SC4MOLの基質となり得る化合物、医薬品若しくは医薬品の候補品、または食品成分若しくは食品成分の候補品である請求項7に記載の方法。
- 分析用検体またはSC4MOLの基質となり得る化合物が、ジメチル-5α-コレスト-8-エン-3β-オール、テストステロン、エルデカルシトール、セサミン、またはエピセサミンである請求項6〜9のいずれかに記載の方法。
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CN112326820A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-02-05 | 大连美创药业有限公司 | 一种艾地骨化醇血药浓度的高效液相色谱-质谱联用检测方法 |
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US6479733B1 (en) * | 1998-11-13 | 2002-11-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Sterol metabolism enzymes |
US20100021892A1 (en) * | 2006-07-19 | 2010-01-28 | Galderma Research & Development | Modulators of SC4MOL for treating acne or hyperseborrhea |
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