JP2013059295A - siRNA, ANTIGEN-PRESENTING CELL, REGULATORY T CELL, AND THERAPEUTIC DRUG - Google Patents

siRNA, ANTIGEN-PRESENTING CELL, REGULATORY T CELL, AND THERAPEUTIC DRUG Download PDF

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new and useful means for using siRNA, antigen-presenting cells, and regulatory T cells.SOLUTION: A modified APC, i.e., an antigen-presenting cell (siRNA-modified, antigen-sensitized APC) modified with siRNA and sensitized with an antigen, is disclosed. An antigen-specific regulatory T cell (antigen-specific Treg) which is antigen-specific and which is derived from a naive T cell using the siRNA-modified, antigen-sensitized APC is disclosed. A therapeutic drug having the antigen-specific Treg (regulatory T cell) as an effective component is disclosed, and others.

Description

本発明はsiRNA、抗原提示細胞、制御性Ｔ細胞及び治療薬に関する。更に詳しくは本発明は、抗原提示細胞修飾用のsiRNAと、siRNAによる抗原提示細胞の修飾方法と、siRNAで修飾した抗原提示細胞と、siRNAで修飾し又はsiRNAで修飾すると共に抗原を感作させた抗原提示細胞を用いる制御性Ｔ細胞の誘導方法と、この方法により誘導される抗原特異的又は抗原非特異的な制御性Ｔ細胞と、それらを利用した治療薬に関する。   The present invention relates to siRNA, antigen presenting cells, regulatory T cells and therapeutic agents. More specifically, the present invention relates to siRNA for modifying an antigen-presenting cell, a method for modifying an antigen-presenting cell with siRNA, an antigen-presenting cell modified with siRNA, and modified with siRNA or modified with siRNA and sensitized with an antigen. The present invention relates to a method for inducing regulatory T cells using antigen-presenting cells, an antigen-specific or non-antigen-specific regulatory T cell induced by this method, and a therapeutic agent using them.

抗原提示細胞（APC:Antigen
Presenting Cell）は血球の一種であり、生体内に侵入した細菌、ウイルス感染細胞等の抗原を取込んでペプチドに分解・断片化し、これを細胞表面上の主要組織適合抗原複合体（MHC:Major Histcompatibility Complex）に提示してＴ細胞を活性化する細胞である。抗原提示に特化した細胞として、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージが代表的に例示される。 Antigen presenting cell (APC: Antigen)
Presenting Cell is a type of blood cell that takes in antigens from bacteria and virus-infected cells that have entered the body, breaks them down into fragments, and breaks them down into major histocompatibility complex (MHC: Major) on the cell surface. Histcompatibility Complex) to activate T cells. Representative examples of cells specialized for antigen presentation include dendritic cells, B cells, and macrophages.

上記した抗原提示細胞との接触により、Ｔ細胞から、「Treg」とも略称される制御性Ｔ細胞（Regulatory T Cell）が誘導される。制御性Ｔ細胞は免疫寛容の機構に関与するＴ細胞である。   By contact with the antigen-presenting cells described above, regulatory T cells, also abbreviated as “Treg”, are induced from T cells. Regulatory T cells are T cells involved in the mechanism of immune tolerance.

一方、ＲＮＡ干渉（RNAi:RNA
interference）と呼ばれる遺伝子の転写後発現抑制が知られている。ＲＮＡ干渉とは、二本鎖RNAと相補的な塩基配列をもつmRNAが分解される現象であって、任意の遺伝子をターゲットとする二本鎖RNAを生体内に導入すると、当該遺伝子のmRNAを介する転写後発現が阻害・抑制される。哺乳動物に関してはsiRNA(small
interfering RNA)と呼ばれる２１塩基の短い二本鎖RNAを用いてＲＮＡ干渉を起こさせることが可能であり、siRNAを生体外で動物の培養細胞へ導入することもできる。 Meanwhile, RNA interference (RNAi: RNA
Inhibition of post-transcriptional expression of a gene called interference) is known. RNA interference is a phenomenon in which mRNA having a base sequence complementary to double-stranded RNA is degraded. When double-stranded RNA targeting an arbitrary gene is introduced into a living body, the mRNA of that gene is reduced. Mediated post-transcriptional expression is inhibited / suppressed. For mammals, siRNA (small
RNA interference can be caused by using a short double-stranded RNA of 21 bases called interfering RNA), and siRNA can also be introduced into cultured cells of animals in vitro.

下記の特許文献１は、脊椎動物個体内での抗原特異的な制御性Ｔ細胞分化誘導方法に関するもので、対象とする抗原を認識するＴ細胞に対し、野生型抗原とはＴ細胞の活性化能の強さが異なる変異型抗原を作成し、変異型抗原におけるＴ細胞活性化能の野生型抗原に対する相対的な強さに応じて、当該変異型抗原を脊椎動物個体の胸腺に投与し、あるいは脊椎動物個体の末梢組織に投与する方法を開示している。しかし、その開示内容は、要するに「変異型抗原の作成とその利用」にとどまる。   Patent Document 1 below relates to an antigen-specific regulatory T cell differentiation inducing method in a vertebrate individual. A T cell that recognizes a target antigen is a wild type antigen and T cell activation. A mutant antigen having different potency is prepared, and the mutant antigen is administered to the thymus of a vertebrate individual according to the relative strength of the mutant antigen relative to the wild-type antigen of T cell activation, Alternatively, a method of administration to peripheral tissues of vertebrate individuals is disclosed. However, the disclosure content is limited to “creation of mutant antigen and use thereof”.

下記の特許文献２は、アレルギー性鼻炎および喘息のためのRNAiベースの治療に関するもので、例えばIgE媒介性過敏症によって媒介される病状および疾患の処置のための１以上のRNAi因子（例えばsiRNA、sh
RNAまたはRNAiベクター）を含有する組成物ならびにこの目的に有効なRNAi因子を同定するための系について開示している。しかしその開示内容は、要するに「アレルギー性鼻炎や喘息等の疾患に対するRNAi因子の直接的投与」にとどまる。 The following US Pat. No. 6,057,038 relates to RNAi-based therapies for allergic rhinitis and asthma, such as one or more RNAi factors (eg, siRNA, for the treatment of medical conditions and diseases mediated by IgE-mediated hypersensitivity). sh
A composition containing an RNA or RNAi vector) and a system for identifying RNAi factors effective for this purpose are disclosed. However, the disclosure content is limited to “direct administration of RNAi factor for diseases such as allergic rhinitis and asthma”.

又、抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、TGF-β等を用いて、生体外で制御性Ｔ細胞を誘導するという方法が報告され、現在研究されている。しかし、例えば下記の非特許文献１に示唆されるように、この方法では抗原非特異的な制御性Ｔ細胞が誘導されるのみである。更に、上記の方法では、抗CD3抗体や抗CD28抗体が投与時に制御性Ｔ細胞に混入して、抗体による副作用が出現する可能性もある。実際、下記の非特許文献２に示すように、糖尿病治療における抗CD3モノクローナル抗体の短期間投与によって伝染性単核球症様の症候発症の報告がある。上記の副作用が抗CD3抗体そのものによる副作用か、抗CD3抗体によって誘導された抗原非特異的制御性Ｔ細胞によるものか不詳であるが、より安全な治療法が期待されている。   A method of inducing regulatory T cells in vitro using anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, IL-2, TGF-β, etc. has been reported and is currently being studied. However, for example, as suggested in Non-Patent Document 1 below, this method only induces non-antigen-specific regulatory T cells. Furthermore, in the above method, anti-CD3 antibody or anti-CD28 antibody may be mixed into regulatory T cells at the time of administration, and side effects due to the antibody may appear. In fact, as shown in Non-Patent Document 2 below, there has been a report of onset of infectious mononucleosis-like symptoms by short-term administration of an anti-CD3 monoclonal antibody in the treatment of diabetes. Although it is unclear whether the above side effects are due to anti-CD3 antibodies themselves or non-antigen-specific regulatory T cells induced by anti-CD3 antibodies, a safer treatment is expected.

下記の非特許文献３は、siRNAで修飾した骨髄由来の抗原提示細胞にアレルギーを引起こす特定の抗原を感作させ、これを利用してマウスのアレルギーの治療を試みたことが開示されている。但し、siRNAとしてはCD40特異的siRNAを用いており、抗原提示細胞としては樹状細胞を用いている。   Non-Patent Document 3 below discloses that a specific antigen that causes allergy is sensitized to bone marrow-derived antigen-presenting cells modified with siRNA, and an attempt was made to treat mouse allergy using this antigen. . However, CD40-specific siRNA is used as siRNA, and dendritic cells are used as antigen-presenting cells.

特開２００７−１３７７７２号公報JP 2007-137772 A 特表２００７−５２７２４０号公報Special table 2007-527240 gazette

HoffmannP, Eder R, Kunz-Schughart LA, Andreesen R, Edinger M. “Large-scalein vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25 high regulatory T cells.” Blood. 2004 Aug1;104(3):895-903. Epub 2004 Apr 15.HoffmannP, Eder R, Kunz-Schughart LA, Andreesen R, Edinger M. “Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4 (+) CD25 high regulatory T cells.” Blood. 2004 Aug1; 104 (3): 895-903. Epub 2004 Apr 15. KeymeulenB, Vandemeulebroucke E, Ziegler AG, Mathieu C, Kaufman L, Hale G, Gorus F,Goldman M, Walter M, Candon S, Schandene L, Crenier L, De Block C, SeigneurinJM, De Pauw P, Pierard D, Weets I, Rebello P, Bird P, Berrie E, Frewin M,Waldmann H, Bach JF, Pipeleers D, Chatenoud L. “Insulin needs after CD3-antibodytherapy in new-onset type 1 diabetes.” N Engl J Med. 2005 Jun 23;352(25):2598-608.KeymeulenB, Vandemeulebroucke E, Ziegler AG, Mathieu C, Kaufman L, Hale G, Gorus F, Goldman M, Walter M, Candon S, Schandene L, Crenier L, De Block C, SeigneurinJM, De Pauw P, Pierard D, Weets I , Rebello P, Bird P, Berrie E, Frewin M, Waldmann H, Bach JF, Pipeleers D, Chatenoud L. “Insulin needs after CD3-antibodytherapy in new-onset type 1 diabetes.” N Engl J Med. 2005 Jun 23; 352 (25): 2598-608. M.Suzuki, X. Zheng, X. Zhang, Z. Zhang, T. E. Ichim, H. Sun, Y. Nakamura, A.Inagaki, M. Beduhn, A. Shunnar, B. Garcia, and W. P. Min. “A novel allergen-specific therapy forallergy using CD40-silenced dendritic cells” J. Allergy Clin. Immunol. March 2010 737-743M. Suzuki, X. Zheng, X. Zhang, Z. Zhang, TE Ichim, H. Sun, Y. Nakamura, A. Inagaki, M. Beduhn, A. Shunnar, B. Garcia, and WP Min. “A novel allergen-specific therapy forallergy using CD40-silenced dendritic cells ”J. Allergy Clin. Immunol. March 2010 737-743

前記のように、ＲＮＡ干渉を利用した特定遺伝子の転写後発現抑制が知られており、siRNAは哺乳動物のＲＮＡ干渉における重要な技術的手段である。一方、制御性Ｔ細胞はアレルギー、膠原病、糖尿病、ウイルス疾患等の様々な疾患における治療手段として期待されており、抗原提示細胞は制御性Ｔ細胞の誘導に関与していると考えられている。   As described above, suppression of post-transcriptional expression of a specific gene using RNA interference is known, and siRNA is an important technical means in mammalian RNA interference. On the other hand, regulatory T cells are expected as therapeutic means in various diseases such as allergy, collagen disease, diabetes, and viral diseases, and antigen-presenting cells are considered to be involved in the induction of regulatory T cells. .

そこで本発明は、アレルギー、膠原病、糖尿病、ウイルス疾患等の各種疾患の治療におけるsiRNA、抗原提示細胞及び制御性Ｔ細胞の新規で有用な利用手段を提供することを、解決すべき課題とする。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel and useful means for using siRNA, antigen-presenting cells and regulatory T cells in the treatment of various diseases such as allergies, collagen diseases, diabetes, and viral diseases. .

本願発明者は、上記課題の解決手段を追求する過程で、（１）特定遺伝子に特異的なsiRNAで修飾された抗原提示細胞においても標的遺伝子の転写後発現の選択的抑制が起こること、（２）siRNAで修飾されると共に抗原に感作された抗原提示細胞は抗原特異的な制御性Ｔ細胞を誘導できること、（３）抗原特異的な制御性Ｔ細胞は極めて強力な疾患抑制効果を持ち、副作用もないこと、（４）従って修飾用siRNAと感作抗原との種類を適切にマッチングさせて得られた抗原特異的制御性Ｔ細胞は、特定疾患に対する非常に効果的な治療手段となること、等の重要な知見を得るに至り、本発明を完成した。   In the process of pursuing the means for solving the above problems, the inventor of the present invention (1) that selective suppression of post-transcriptional expression of a target gene occurs in an antigen-presenting cell modified with siRNA specific to a specific gene. 2) Antigen-presenting cells modified with siRNA and sensitized to antigen can induce antigen-specific regulatory T cells, and (3) antigen-specific regulatory T cells have a very powerful disease-suppressing effect. (4) Therefore, antigen-specific regulatory T cells obtained by appropriately matching the types of siRNA for modification and sensitizing antigen provide a very effective therapeutic means for specific diseases. As a result, the present invention has been completed.

（第１発明の構成）
上記課題を解決するための第１発明の構成は、siRNAで修飾された抗原提示細胞（siRNA修飾APC）である修飾APCである。 (Configuration of the first invention)
The configuration of the first invention for solving the above problem is a modified APC that is an antigen-presenting cell (siRNA-modified APC) modified with siRNA.

「抗原提示細胞」とは、主要組織適合抗原複合体（MHC）又はその部分に結合する抗原を細胞表面上に提示する細胞を言う。抗原提示細胞には、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞、血管内皮細胞、甲状腺濾胞細胞等が包含される。   “Antigen-presenting cell” refers to a cell that presents on the cell surface an antigen that binds to a major histocompatibility complex (MHC) or portion thereof. Antigen presenting cells include dendritic cells, B cells, macrophages, monocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells, thyroid follicular cells, and the like.

「siRNA」とは、生体内又は細胞内に導入されたとき、標的遺伝子のmRNAを分解させ遺伝子の転写後発現を抑制する機能を持つ短鎖の二本鎖RNAをいう。標的遺伝子の種類は、抗原提示細胞が備える遺伝子である限りにおいて限定されないが、本発明の前記課題を考慮した場合、例えば第４発明に関して後述するように、抗原提示細胞とＴ細胞との相互作用に関与する各種の遺伝子をターゲットとするsiRNAが好ましく例示される。   “SiRNA” refers to a short double-stranded RNA having a function of degrading the mRNA of a target gene and suppressing the post-transcriptional expression of the gene when introduced into a living body or cell. The type of the target gene is not limited as long as it is a gene provided in the antigen-presenting cell, but when considering the above-mentioned problem of the present invention, for example, as described later with reference to the fourth invention, the interaction between the antigen-presenting cell and the T cell Preferably, siRNA targeting various genes involved in.

siRNAによる抗原提示細胞の修飾は、培養中の動物細胞等について、生体外で行うことができる。生体外での抗原提示細胞に対するsiRNA修飾を行う際には、例えばGeneSilence reagent（Gene Therapy Systems社）、TransIT-TKOやRiboJuice siRNA Transfection Reagent（共にタカラバイオ社）等の市販のsiRNA導入用試薬を利用することができる。   Modification of antigen-presenting cells with siRNA can be performed in vitro for animal cells and the like in culture. When performing siRNA modification on antigen-presenting cells in vitro, use commercially available siRNA introduction reagents such as GeneSilence reagent (Gene Therapy Systems), TransIT-TKO and RiboJuice siRNA Transfection Reagent (both Takara Bio) can do.

又、siRNAによる抗原提示細胞の修飾を、例えば動物体内、特に好ましくは非ヒト動物体内で行うことができる。このような動物体内での抗原提示細胞の修飾は、siRNAの注射、内服、点鼻その他の投与手段によって行うことができる。又、動物体内で修飾されたsiRNA修飾APCは、例えば当該動物体又はその血液から分離して回収することができる。このように、非ヒト動物体内でsiRNAによる抗原提示細胞の修飾を行い、siRNAで修飾された抗原提示細胞を回収することは可能である。   Further, modification of antigen-presenting cells with siRNA can be performed in, for example, an animal body, particularly preferably in a non-human animal body. Such modification of the antigen-presenting cells in the animal can be performed by siRNA injection, internal use, nasal administration or other administration means. In addition, siRNA-modified APC modified in the animal body can be collected and separated from the animal body or blood thereof, for example. In this way, it is possible to modify antigen-presenting cells with siRNA in a non-human animal body and recover antigen-presenting cells modified with siRNA.

このような非ヒト動物体内での操作は、後述する第２発明で述べる「非ヒト動物体内でのAPC又はsiRNA修飾APCに対する抗原感作」、第５発明で述べる「非ヒト動物体内での抗原特異的Tregの誘導」、第９発明で述べる「非ヒト動物体内での抗原非特異的Tregの誘導」においても、基本的に同様に行うことができる。   Such an operation in the non-human animal body is described in “antigen sensitization to APC or siRNA-modified APC in the non-human animal body” described in the second invention described later, “antigen in the non-human animal body” described in the fifth invention. “Induction of specific Treg” and “Induction of antigen non-specific Treg in a non-human animal” described in the ninth invention can be basically performed in the same manner.

非ヒト動物体内でのsiRNAによる抗原提示細胞の修飾は、例えば研究目的、siRNAで修飾された抗原提示細胞の回収目的等で行うことができる。   Modification of antigen-presenting cells with siRNA in a non-human animal can be performed, for example, for research purposes or for collecting antigen-presenting cells modified with siRNA.

本発明において「非ヒト動物」の範囲は限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ブタその他の非ヒト哺乳動物が好ましく例示される。非ヒト動物としては、その他にもカエル、魚等の非哺乳類動物も例示される。   In the present invention, the range of “non-human animals” is not limited, but preferred examples include mouse, rat, rabbit, monkey, dog, pig and other non-human mammals. Other examples of non-human animals include non-mammalian animals such as frogs and fish.

「siRNA修飾APC」においては、一定の遺伝子をターゲットとするsiRNAが抗原提示細胞内に導入され、当該細胞内における当該遺伝子の転写後発現の抑制（サイレンシング）が行われている。   In “siRNA-modified APC”, siRNA targeting a specific gene is introduced into an antigen-presenting cell, and the post-transcriptional expression of the gene in the cell is suppressed (silencing).

（第２発明の構成）
上記課題を解決するための第２発明の構成は、siRNAで修飾されると共に抗原を感作された抗原提示細胞（siRNA修飾・抗原感作APC）である修飾APCである。 (Configuration of the second invention)
The configuration of the second invention for solving the above problem is a modified APC that is an antigen-presenting cell (siRNA-modified / antigen-sensitized APC) that has been modified with siRNA and sensitized with an antigen.

抗原提示細胞に感作する抗原の種類は限定されず、野生型抗原、天然抗原、ウイルス抗原、自己抗原、変化抗原、合成抗原あるいは腫瘍関連抗原等が適宜に選択して用いられる。抗原としては、各種のアレルゲン等が好ましく例示される。アレルゲンとしては、卵白アルブミン（OVA）、KLH（keyhole
limpet hemocyanin）、スギ花粉、ダニ、犬や猫等の動物、真菌、昆虫等の具体例が挙げられる。 The type of antigen sensitized to the antigen-presenting cell is not limited, and a wild-type antigen, natural antigen, virus antigen, self antigen, altered antigen, synthetic antigen, tumor-associated antigen, or the like is appropriately selected and used. Preferred examples of the antigen include various allergens. Allergens include ovalbumin (OVA), KLH (keyhole
Specific examples include limpet hemocyanin), cedar pollen, mites, animals such as dogs and cats, fungi and insects.

siRNA修飾・抗原感作APCの調製においては、予めsiRNAで修飾された抗原提示細胞（siRNA修飾APC）に対して抗原を感作させることができるが、予め抗原を感作させた抗原提示細胞（抗原感作APC）に対してsiRNAによる修飾を行うこともできる。   In the preparation of siRNA-modified / antigen-sensitized APC, antigen-presenting cells previously modified with siRNA (siRNA-modified APC) can be sensitized, but antigen-presenting cells previously sensitized with antigen ( Antigen-sensitized APC) can also be modified with siRNA.

抗原提示細胞又はsiRNA修飾APCに対する抗原の感作は、培養中の動物細胞等について、生体外で抗原と接触させることにより行うことができる。又、例えば動物体内、特に好ましくは非ヒト動物体内で行うことができる。非ヒト動物体内での抗原の感作は、例えば研究目的、抗原感作APCの回収目的等で行うことができる。   Sensitization of an antigen to an antigen-presenting cell or siRNA-modified APC can be performed by bringing an animal cell or the like in culture into contact with the antigen in vitro. For example, it can be carried out in an animal body, particularly preferably in a non-human animal body. Sensitization of an antigen in a non-human animal can be performed, for example, for research purposes or for the purpose of collecting antigen-sensitized APC.

（第３発明の構成）
上記課題を解決するための第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係るsiRNA修飾APCにおいて、抗原提示細胞が樹状細胞又はＢ細胞である。 (Configuration of the third invention)
The configuration of the third invention for solving the above problem is that in the siRNA-modified APC according to the first invention or the second invention, the antigen-presenting cell is a dendritic cell or a B cell.

抗原提示細胞としては、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ等の抗原提示機能を有する細胞が包含されるが、樹状細胞又はＢ細胞が特に好ましい。   Antigen-presenting cells include cells having an antigen-presenting function such as dendritic cells, B cells, and macrophages, and dendritic cells or B cells are particularly preferred.

（第４発明の構成）
上記課題を解決するための第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかに係るsiRNA修飾APCにおいて、siRNAが抗原提示細胞とＴ細胞との相互作用に関与する遺伝子に特異的なsiRNAである。 (Configuration of the fourth invention)
The configuration of a fourth invention for solving the above-described problem is that, in the siRNA modified APC according to any one of the first to third inventions, the siRNA is specific to a gene involved in an interaction between an antigen presenting cell and a T cell. SiRNA.

siRNA修飾APCにおける抗原提示細胞を修飾しているsiRNAの種類は、抗原提示細胞が備える任意の遺伝子に特異的なsiRNAである限りにおいて限定されないが、本発明の課題を考慮すると、第４発明に規定するsiRNAが好ましい。特に好ましい具体例として、CD86特異的siRNA、TNF-α特異的siRNA、CD80特異的siRNA、VCAM-1特異的siRNA、ICAM-1特異的siRNA、CD40特異的siRNA、IL-4特異的siRNA等を例示することができる。   The type of siRNA that modifies the antigen-presenting cell in siRNA-modified APC is not limited as long as it is an siRNA specific to an arbitrary gene provided in the antigen-presenting cell, but considering the problem of the present invention, the fourth invention The defined siRNA is preferred. Particularly preferred specific examples include CD86-specific siRNA, TNF-α-specific siRNA, CD80-specific siRNA, VCAM-1-specific siRNA, ICAM-1-specific siRNA, CD40-specific siRNA, IL-4-specific siRNA, etc. It can be illustrated.

上記の具体例の内、例えばCD86は「細胞表面抗原（表面マーカー）の一種であって、Ｔ細胞活性化の共刺激分子である」とされており、TNF-αは「細胞が放出する腫瘍壊死因子であり、免疫等に関与するサイトカインである」とされている。そして、後述の実施例では、CD86特異的siRNA、及び／又は、TNF-α特異的siRNAで修飾されたOVA抗原特異的Tregを用いた場合、CD86やTNF-αの発現が抑制されると共に、Foxp3 mRNAの発現量が有意に増大する。Foxp3は「自己免疫疾患抑制機能を有するCD4+CD25+ Tregの分子マーカーであり、Treg分化のマスター遺伝子である」とされている。以上の結果、実施例ではOVAアレルギーに対する高い治療効果を得ている。 Among the above specific examples, for example, CD86 is “a kind of cell surface antigen (surface marker) and is a costimulatory molecule for T cell activation”, and TNF-α is “a tumor released by cells”. It is a necrosis factor and a cytokine involved in immunity ". In the examples described later, when using CD86-specific siRNA and / or OVA antigen-specific Treg modified with TNF-α-specific siRNA, the expression of CD86 and TNF-α is suppressed, The expression level of Foxp3 mRNA is significantly increased. Foxp3 is said to be “a molecular marker of CD4 + CD25 + Treg having an autoimmune disease suppressing function and a master gene of Treg differentiation”. As a result, a high therapeutic effect for OVA allergy is obtained in the examples.

（第５発明の構成）
上記課題を解決するための第５発明の構成は、第２発明〜第４発明のいずれかに記載のsiRNA修飾・抗原感作APCを用いてナイーブＴ細胞から抗原特異的な制御性Ｔ細胞（抗原特異的Treg）を誘導するTreg誘導方法である。 (Structure of the fifth invention)
The structure of the fifth invention for solving the above-mentioned problem is that an antigen-specific regulatory T cell (from an naive T cell using the siRNA-modified / antigen-sensitized APC according to any of the second to fourth inventions) ( This is a Treg induction method that induces antigen-specific Treg).

前記したように、抗原感作APCを用いてナイーブＴ細胞からTregを誘導することは知られているが、その場合に得られるのは抗原非特異的（ポリクローナル）なTregであり、治療目的に用いた場合の効果が低く、しかも非特異的に免疫細胞に作用するため副作用や新たな疾患発症の懸念がある。これに対して、第５発明のようにsiRNA修飾・抗原感作APCを用いると、ナイーブＴ細胞から抗原特異的Tregを誘導できるという極めて重要な知見が得られた。抗原特異的Tregは、従来の抗原非特異的Tregに比較して治療目的に用いた場合の効果が数十倍も強く、しかも「抗原特異的」であるため副作用や新たな疾患発症の懸念もない。   As described above, it is known to induce Treg from naive T cells using antigen-sensitized APC. In this case, non-antigen-specific (polyclonal) Treg is obtained for therapeutic purposes. When used, the effect is low, and since it acts on immune cells non-specifically, there are concerns about side effects and the development of new diseases. In contrast, the use of siRNA-modified / antigen-sensitized APC as in the fifth aspect of the invention has yielded an extremely important finding that antigen-specific Treg can be induced from naive T cells. Antigen-specific Tregs are dozens of times more effective when used for therapeutic purposes than conventional non-antigen-specific Tregs, and because they are “antigen-specific”, there are concerns about side effects and the development of new diseases. Absent.

「ナイーブＴ細胞」とは、未だ抗原提示細胞の作用を受けたことがなく、抗原提示細胞よって活性化される以前のＴ細胞をいう。   A “naive T cell” refers to a T cell that has not yet been acted upon by an antigen presenting cell and is activated by the antigen presenting cell.

siRNA修飾・抗原感作APCを用いた抗原特異的Tregの誘導は、培養中の動物細胞等について、生体外で行うことができる。又、上記の抗原特異的Tregの誘導を、例えば動物体内、特に好ましくは非ヒト動物体内で行うこともできる。このような動物体内での操作は、例えば研究目的、抗原特異的Tregの回収目的等で行うことができる。   Induction of antigen-specific Treg using siRNA-modified / antigen-sensitized APC can be performed in vitro on animal cells and the like in culture. The induction of antigen-specific Treg can also be performed in, for example, an animal body, particularly preferably in a non-human animal body. Such an operation in the animal body can be performed, for example, for research purposes, for the purpose of collecting antigen-specific Tregs, and the like.

（第６発明の構成）
上記課題を解決するための第６発明の構成は、第５発明に記載のTreg誘導方法により得られる抗原特異的Tregである。 (Structure of the sixth invention)
The structure of the 6th invention for solving the said subject is antigen-specific Treg obtained by the Treg induction method as described in the 5th invention.

（第７発明の構成）
上記課題を解決するための第７発明の構成は、第６発明に記載の抗原特異的Tregを有効成分とする治療薬である。 (Structure of the seventh invention)
The structure of 7th invention for solving the said subject is a therapeutic agent which uses the antigen specific Treg as described in 6th invention as an active ingredient.

本願の各発明において「治療薬」とは、有効成分である細胞のみからなり、又は有効成分である細胞を含む組成物であり、あるいは上記の細胞又は細胞含有組成物を含んで構成される治療薬キットである。「細胞を含む組成物」とはin vitro又はin vivoでの診断あるいは治療での使用に適する剤型の組成物であって、医薬的に許容可能なキャリアーとして、例えばリン酸バッファー塩類溶液、水、油／水系あるいは水／油系のエマルジョン、湿性剤、安定剤、保存剤等を含むものをいう。   In each invention of the present application, the “therapeutic agent” is a composition comprising only cells that are active ingredients or containing cells that are active ingredients, or a treatment comprising the above-described cells or cell-containing compositions. It is a medicine kit. “Composition containing cells” is a composition in a dosage form suitable for use in diagnosis or treatment in vitro or in vivo, and as a pharmaceutically acceptable carrier, for example, phosphate buffer saline, water , Oil / water or water / oil emulsions, wetting agents, stabilizers, preservatives and the like.

抗原特異的Tregを有効成分とする治療薬は、感作させる抗原の選択により、種々の適応症を持つ強力な治療薬とすることができる。例えばスギ花粉症の治療においては、スギ抗原特異的Tregを有効成分とする治療薬を投与することができる。卵白アルブミン（OVA）アレルギーの治療においては、OVA抗原特異的Tregを有効成分とする治療薬を投与することができる。   A therapeutic agent containing an antigen-specific Treg as an active ingredient can be made into a powerful therapeutic agent having various indications by selecting an antigen to be sensitized. For example, in the treatment of cedar pollinosis, a therapeutic agent containing cedar antigen-specific Treg as an active ingredient can be administered. In the treatment of ovalbumin (OVA) allergy, a therapeutic agent containing OVA antigen-specific Treg as an active ingredient can be administered.

第７発明の治療薬の対象疾患は抗原特異的Tregの治療効果に応じて定まり、特段に限定されないが、広義には自己免疫疾患、癌、アレルギー、移植、ウイルス疾患等と言ったカテゴリーの疾患群が例示される。更に具体的に述べれば、それらの疾患群の内でも、喘息、花粉症、膠原病等の疾患が例示される。   The target disease of the therapeutic agent of the seventh invention is determined according to the therapeutic effect of the antigen-specific Treg and is not particularly limited, but in a broad sense, diseases of the categories such as autoimmune disease, cancer, allergy, transplantation, viral disease, etc. Groups are illustrated. More specifically, among these disease groups, diseases such as asthma, hay fever and collagen disease are exemplified.

（第７発明の参考発明の構成）
上記課題を解決するための第７発明の参考発明の構成は、第７発明に記載の治療薬を用いて疾患の予防、治療又は診断を行う方法である。「疾患」の内容は、第７発明の場合と同様である。 (Configuration of Reference Invention of Seventh Invention)
The constitution of the reference invention of the seventh invention for solving the above problems is a method for preventing, treating or diagnosing a disease using the therapeutic agent described in the seventh invention. The contents of “disease” are the same as in the seventh invention.

（第８発明の構成）
上記課題を解決するための第８発明の構成は、第６発明に記載の抗原特異的Tregを抗体で増幅したものを有効成分とする治療薬である。 (Configuration of the eighth invention)
The structure of the 8th invention for solving the said subject is a therapeutic agent which uses as an active ingredient what amplified the antigen-specific Treg of the 6th invention with the antibody.

上記第８発明において「抗原特異的Tregを抗体で増幅する」とは、例えば抗ＣＤ３抗体等にてTregを刺激して増幅するような操作をいう。   In the above eighth invention, “amplifying antigen-specific Treg with an antibody” refers to an operation of stimulating and amplifying Treg with, for example, an anti-CD3 antibody.

このようにして増幅された有効成分を含む治療薬においては、前記第７発明の効果が一層増強される。   In the therapeutic agent containing the active ingredient thus amplified, the effect of the seventh invention is further enhanced.

第８発明の治療薬の対象疾患は抗原特異的Tregの治療効果に応じて定まり、特段に限定されないが、基本的に第７発明に関して述べたところと同様である。   The target disease of the therapeutic agent of the eighth invention is determined according to the therapeutic effect of the antigen-specific Treg and is not particularly limited, but is basically the same as that described for the seventh invention.

（第８発明の参考発明の構成）
上記課題を解決するための第８発明の参考発明の構成は、第８発明に記載の治療薬を用いて疾患の予防、治療又は診断を行う方法である。「疾患」の内容は、第８発明の場合と同様である。 (Configuration of Reference Invention of Eighth Invention)
The configuration of the reference invention of the eighth invention for solving the above problem is a method for preventing, treating or diagnosing a disease using the therapeutic agent described in the eighth invention. The content of “disease” is the same as in the eighth invention.

（第９発明の構成）
上記課題を解決するための第９発明の構成は、第１発明、第３発明、第４発明のいずれかに記載のsiRNA修飾APCを用いてナイーブＴ細胞から抗原非特異的な制御性Ｔ細胞（抗原非特異的Treg）を誘導するTreg誘導方法である。 (Structure of the ninth invention)
The structure of the ninth invention for solving the above-mentioned problem is that a regulatory T cell that is non-antigen-specific from a naive T cell using the siRNA-modified APC according to any one of the first, third, and fourth inventions. This is a Treg induction method for inducing (antigen non-specific Treg).

siRNA修飾APCを用いた抗原非特異的Tregの誘導は、培養中の動物細胞等について、生体外で行うことができる。又、上記の抗原非特異的Tregの誘導を、例えば動物体内、特に好ましくは非ヒト動物体内で行うこともできる。このような動物体内での操作は、例えば研究目的、抗原非特異的Tregの回収目的等で行うことができる。   Induction of non-antigen-specific Treg using siRNA-modified APC can be performed in vitro on animal cells and the like in culture. In addition, the induction of antigen non-specific Treg can be performed in, for example, an animal body, particularly preferably in a non-human animal body. Such manipulation in the animal body can be carried out for the purpose of research, for example, for the purpose of recovering antigen-nonspecific Treg.

（第１０発明の構成）
上記課題を解決するための第１０発明の構成は、第９発明に記載のTreg誘導方法により得られる抗原非特異的Tregである。 (Configuration of the tenth invention)
The configuration of the tenth invention for solving the above problem is an antigen non-specific Treg obtained by the Treg induction method according to the ninth invention.

抗原非特異的Treg自体は公知であるが、第１０発明に係る抗原非特異的なTregにおいては、siRNAに誘導されたTregであるという点において、従来の抗原非特異的Tregと異なる。   Antigen non-specific Treg itself is known, but the antigen non-specific Treg according to the tenth invention differs from conventional antigen non-specific Treg in that it is Treg induced by siRNA.

（第１１発明の構成）
上記課題を解決するための第１１発明の構成は、第１０発明に記載の抗原非特異的Tregを有効成分とする治療薬である。 (Structure of 11th invention)
The constitution of the eleventh invention for solving the above-mentioned problems is a therapeutic agent comprising the antigen non-specific Treg described in the tenth invention as an active ingredient.

第１１発明の治療薬は、抗原非特異的Tregを有効成分とする点を逆に利用して、例えば原因抗原が不詳な疾患や複数の抗原による疾患（例えばスギ花粉、ダニ抗原、真菌抗原等の多数に感作されているアレルギー疾患）に対する治療薬として用いることができる。   The therapeutic agent of the eleventh invention uses, on the contrary, the point that non-antigen-specific Treg is an active ingredient, for example, a disease whose cause antigen is unknown or a disease caused by a plurality of antigens (for example, cedar pollen, mite antigen, fungal antigen, It can be used as a therapeutic agent for allergic diseases sensitized by a large number of patients.

（第１１発明の参考発明の構成）
上記課題を解決するための第１１発明の参考発明の構成は、第１１発明に記載の治療薬を用いて疾患の予防、治療又は診断を行う方法である。「疾患」の内容は第１１発明の場合と同様である。 (Configuration of Reference Invention of Eleventh Invention)
The constitution of the reference invention of the eleventh invention for solving the above problems is a method for preventing, treating or diagnosing a disease using the therapeutic agent described in the eleventh invention. The contents of “disease” are the same as in the case of the eleventh invention.

（第１２発明の構成）
上記課題を解決するための第１２発明の構成は、第６発明に記載の抗原特異的Treg又は第１０発明に記載の抗原非特異的Tregを用いて修飾された免疫細胞を有効成分とする治療薬である。 (Configuration of the twelfth invention)
The structure of the twelfth invention for solving the above-mentioned problem is a treatment comprising an immune cell modified with the antigen-specific Treg according to the sixth invention or the antigen-nonspecific Treg according to the tenth invention as an active ingredient. It is a medicine.

上記の第１２発明において、「抗原特異的Treg又は抗原非特異的Tregを用いて免疫細胞を修飾する」とは、抗原特異的Treg又は抗原非特異的Tregによってin
vitroでＢ細胞等の免疫細胞を免疫寛容状態とすることを言う。そして、その免疫寛容状態となった免疫細胞を治療薬として投与することができる。 In the twelfth aspect of the present invention, “modifying immune cells using antigen-specific Treg or antigen-nonspecific Treg” means that antigen-specific Treg or antigen-nonspecific Treg
This refers to making immune cells such as B cells immune tolerant in vitro. The immune cells that have entered the immunological tolerance state can then be administered as a therapeutic agent.

このような修飾を受けた免疫細胞は生体内で抗原特異的Treg又は抗原非特異的Tregの作用を受けた場合と同様の活性化示すため、Treg投与によって生じる副作用の軽減等の点において有利な治療薬となる。   Such modified immune cells are activated in the same manner as those treated with antigen-specific Treg or non-antigen-specific Treg in vivo, which is advantageous in reducing side effects caused by Treg administration. It becomes a therapeutic drug.

第１２発明の治療薬の対象疾患は抗原特異的Treg又は抗原非特異的Tregの治療効果に応じて定まり、特段に限定されないが、基本的には第７発明又は第１１発明の治療薬の場合と同等である。   The target disease of the therapeutic agent of the twelfth invention is determined according to the therapeutic effect of antigen-specific Treg or non-antigen-specific Treg and is not particularly limited, but is basically the case of the therapeutic agent of the seventh invention or eleventh invention Is equivalent to

（第１２発明の参考発明の構成）
上記課題を解決するための第１２発明の参考発明の構成は、第１２発明に記載の治療薬を用いて疾患の予防、治療又は診断を行う方法である。「疾患」の内容は、第１２発明の場合と同様である。 (Configuration of Reference Invention of Twelfth Invention)
The constitution of the reference invention of the twelfth invention for solving the above problems is a method for preventing, treating or diagnosing a disease using the therapeutic agent described in the twelfth invention. The contents of “disease” are the same as in the twelfth invention.

上記した本願の各発明により、siRNA、抗原提示細胞及び制御性Ｔ細胞の新規で有用な利用形態が提供される。より具体的には、以下に列挙する効果が得られる。   According to each invention of the present application described above, novel and useful forms of use of siRNA, antigen-presenting cells and regulatory T cells are provided. More specifically, the effects listed below can be obtained.

（１）APC修飾用siRNAにおける標的遺伝子は限定されないので、目的に応じて、抗原提示細胞が備える任意の遺伝子をノックダウンさせることができる。従って、siRNAの種類を変えることにより、様々なタイプのTregを誘導できる可能性がある。更に、siRNAを直接生体に投与しなくても実施できるので、安全性が高い。   (1) Since the target gene in the siRNA for APC modification is not limited, any gene provided in the antigen-presenting cell can be knocked down depending on the purpose. Therefore, various types of Tregs may be induced by changing the type of siRNA. Furthermore, since it can implement even if siRNA is not directly administered to a biological body, it is highly safe.

（２）非特許文献１に開示される、抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、TGF-β等を用いて生体外で制御性Ｔ細胞を誘導する方法とは異なり、生体への投与時、抗CD3抗体、抗CD28抗体の混入がなく、抗CD3抗体、抗CD28抗体による副作用の可能性もなく、安全である。   (2) Unlike the method of inducing regulatory T cells in vitro using anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, IL-2, TGF-β, etc. disclosed in Non-Patent Document 1, administration to the living body At times, there is no contamination with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody, and there is no possibility of side effects caused by anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody.

（３）siRNA修飾APCにより抗原非特異的Tregの誘導が可能である。抗原非特異的Tregは、例えば、原因抗原が不詳な疾患や複数の抗原による疾患（例えばスギ花粉、ダニ抗原、真菌抗原等の多数に感作されているアレルギー疾患）の治療薬として利用できる。   (3) Antigen-specific Treg can be induced by siRNA-modified APC. Antigen non-specific Treg can be used, for example, as a therapeutic agent for diseases in which the causative antigen is unknown or diseases caused by a plurality of antigens (for example, allergic diseases sensitized to a large number of cedar pollen, mite antigen, fungal antigen, etc.).

（４）抗原を感作したsiRNA修飾APCにより抗原特異的Tregの誘導が可能である。抗原特異的Tregは抗原非特異的（ポリクローナル）なTregよりも数十倍強力な抑制効果を持つ。又、抗原非特異的Tregのように非特異的に免疫細胞に作用することがないため、副作用や新しい疾患発症を考えなくても良い。   (4) Antigen-specific Treg can be induced by siRNA modified APC sensitized with antigen. Antigen-specific Treg has a suppressive effect several tens of times stronger than antigen-nonspecific (polyclonal) Treg. In addition, since it does not act on immune cells nonspecifically like antigen nonspecific Treg, it is not necessary to consider side effects and onset of new diseases.

（５）本発明に係る治療薬は、その有効成分である抗原特異的Treg又は抗原非特異的Tregを誘導するsiRNA修飾APCにおけるsiRNAの種類の選択、あるいはsiRNA修飾APCに感作させる抗原の種類の選択により、種々の対象疾患に対する治療薬とすることができる。従って、治療薬の好ましい適応症は一律には規定できないが、例えば以下のものを例示できる。   (5) The therapeutic agent according to the present invention is a selection of siRNA type in siRNA modified APC that induces antigen-specific Treg or antigen non-specific Treg, which is an active ingredient, or type of antigen to be sensitized to siRNA modified APC By selection, it can be set as a therapeutic agent for various target diseases. Accordingly, preferred indications for therapeutic agents cannot be uniformly defined, but examples include the following.

該当し得る適応症
I型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病、全身性ループス、クローン病、心筋症、溶血性貧血、線維筋痛、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、好中球減少症、乾癬、慢性疲労症候群、若年性関節炎、若年性糖尿病、強皮症、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、橋本病、複合性結合織疾患、間質性膀胱炎、悪性貧血、白質脳炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、原発性胆汁性肝硬変、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、自己免疫性アジソン病、慢性活動性肝炎、尋常性白斑、自己免疫性高脂血症、自己免疫性心筋炎、側頭動脈炎、自己免疫性甲状腺疾患、軸索型および神経性ニューロパシー、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、骨関節炎、シャーガス病、ブドウ膜炎、慢性炎症性脱髄性多発性根神経障害（CIDP）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、脱髄性ニューロパシー、皮膚筋炎、円板状ルーパス、レンズ抗原性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、ドレスラー症候群、本態性混合性クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、グッドパスチャー症候群、アレルギー性鼻炎、ギラン・バレー症候群、低γグロブリン血症、封入体筋炎、小水疱水疱性皮膚症、ヴェゲナー肉芽腫症、メニエール病、ランバート-イートン症候群、モーレン潰瘍、非典型的セリアック病、眼球瘢痕性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎、心膜切開後症候群、強膜炎、精子および睾丸自己免疫、全身強直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、交感性眼炎、横断性脊髄炎および壊死性ミエロパシー、多腺性自己免疫性症候群1型、多腺性自己免疫性症候群2型、悪性貧血、子宮内膜症。 Applicable indications
Type I diabetes or insulin-dependent diabetes mellitus, systemic lupus, Crohn's disease, cardiomyopathy, hemolytic anemia, fibromyalgia, Graves' disease, ulcerative colitis, vasculitis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myositis, Neutropenia, psoriasis, chronic fatigue syndrome, juvenile arthritis, juvenile diabetes, scleroderma, psoriatic arthritis, Sjogren's syndrome, rheumatic fever, rheumatoid arthritis, sarcoidosis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , Hashimoto's disease, complex connective tissue disease, interstitial cystitis, pernicious anemia, leukoencephalitis, alopecia areata, ankylosing spondylitis, primary biliary cirrhosis, anti-GBM nephritis, anti-TBM nephritis, antiphospholipid syndrome, Polymyalgia rheumatica, polymyositis, autoimmune Addison disease, chronic active hepatitis, vitiligo vulgaris, autoimmune hyperlipidemia, autoimmune myocarditis, temporal arteritis, autoimmune thyroid disease, Axon type and nerve Neuropathy, Behcet's disease, bullous pemphigoid, allergic asthma, atopic dermatitis, osteoarthritis, Chagas disease, uveitis, chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy (CIDP), scar pemphigoid / Benign mucous membrane pemphigoid, Corgan syndrome, congenital heart block, coxsackie myocarditis, demyelinating neuropathy, dermatomyositis, discoid lupus, lens antigenic uveitis, nodular polyarteritis, dresser syndrome, essential Mixed cryoglobulinemia, Evans syndrome, Goodpasture syndrome, allergic rhinitis, Guillain-Barre syndrome, hypogammaglobulinemia, inclusion body myositis, vesicular bullous dermatosis, Wegener's granulomatosis, Meniere's disease, Lambert- Eaton syndrome, Mohren ulcer, atypical celiac disease, ocular scar pemphigoid, pemphigus vulgaris, perivenous Encephalomyelitis, postpericardiotomy syndrome, scleritis, sperm and testicular autoimmunity, systemic ankylosing syndrome, subacute bacterial endocarditis (SBE), sympathetic ophthalmitis, transverse myelitis and necrotic myelopathy, Multigland autoimmune syndrome type 1, multigland autoimmune syndrome type 2, pernicious anemia, endometriosis.

CD86 siRNAによるCD86発現の抑制（樹状細胞）を示す。Fig. 3 shows suppression of CD86 expression (dendritic cells) by CD86 siRNA. CD86 siRNAによるTNF-α発現への影響（樹状細胞）を示す。The influence (dendritic cell) on TNF- (alpha) expression by CD86 siRNA is shown. CD86 siRNAによるCD40発現への影響（樹状細胞）を示す。The influence (dendritic cell) on CD40 expression by CD86 siRNA is shown. TNF-αsiRNAによるTNF-α発現の抑制（樹状細胞）を示す。Fig. 2 shows suppression of TNF-α expression (dendritic cells) by TNF-α siRNA. TNF-αsiRNAによるCD86発現への影響（樹状細胞）を示す。The influence (dendritic cell) on CD86 expression by TNF-αsiRNA is shown. TNF-αsiRNAによるCD40発現への影響（樹状細胞）を示す。The influence (dendritic cell) on CD40 expression by TNF-αsiRNA is shown. TNF-αsiRNAとCD86 siRNAによるTNF-α発現の抑制（樹状細胞）を示す。Fig. 2 shows suppression of TNF-α expression (dendritic cells) by TNF-α siRNA and CD86 siRNA. TNF-αsiRNAとCD86 siRNAによるCD86発現の抑制（樹状細胞）を示す。Fig. 3 shows suppression of CD86 expression (dendritic cells) by TNF-α siRNA and CD86 siRNA. 樹状細胞によるFoxp3発現の誘導を示す。Induction of Foxp3 expression by dendritic cells. OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞による抗原特異的Ｔ細胞反応への影響を示す。The influence on the antigen-specific T cell response by OVA antigen-specific regulatory T cells is shown. OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞によるOVA誘発鼻症状の抑制を示す。Fig. 2 shows suppression of OVA-induced nasal symptoms by OVA antigen-specific regulatory T cells. OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞による血清中IgEの抑制を示す。Fig. 2 shows suppression of serum IgE by OVA antigen-specific regulatory T cells. OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞による脾臓産生サイトカインの抑制を示す。Fig. 2 shows suppression of spleen-producing cytokines by OVA antigen-specific regulatory T cells. OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞によるOVA誘発鼻粘膜浸潤好酸球の抑制を示す。Fig. 2 shows suppression of OVA-induced nasal mucosa infiltrating eosinophils by OVA antigen-specific regulatory T cells. OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞によるKLH誘発鼻症状への影響を示す。The influence on KLH-induced nasal symptoms by OVA antigen-specific regulatory T cells is shown. OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞によるKLH特異的IgEへの影響を示す。The influence on KLH-specific IgE by OVA antigen-specific regulatory T cells is shown. OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞によるKLH誘発鼻粘膜好酸球浸潤への影響を示す。The influence on KLH-induced nasal mucosal eosinophil infiltration by OVA antigen-specific regulatory T cells is shown. CD86 siRNAによるCD86発現への影響（Ｂ細胞）を示す。The influence (B cell) on CD86 expression by CD86 siRNA is shown. CD86 siRNAによるCD40発現への影響（Ｂ細胞）を示す。The influence (B cell) on CD40 expression by CD86 siRNA is shown. CD40 siRNAによるCD40発現への影響（Ｂ細胞）を示す。The influence (B cell) on CD40 expression by CD40 siRNA is shown. CD40 siRNAによるCD86発現への影響（Ｂ細胞）を示す。The influence (B cell) on CD86 expression by CD40 siRNA is shown. Ｂ細胞によるFoxp3発現の誘導を示す。Induction of Foxp3 expression by B cells is shown. Ｂ細胞により誘導されたOVA抗原特異的制御性Ｔ細胞の効果を示す。The effect of OVA antigen-specific regulatory T cells induced by B cells is shown. Ｂ細胞により誘導された制御性Ｔ細胞によるOVA誘発鼻症状の抑制を示す。FIG. 5 shows suppression of OVA-induced nasal symptoms by regulatory T cells induced by B cells. Ｂ細胞により誘導された制御性Ｔ細胞による血清中IgEの抑制を示す。Fig. 5 shows suppression of serum IgE by regulatory T cells induced by B cells.

次に本発明の実施形態を、その最良の形態を含めて説明する。   Next, embodiments of the present invention will be described including the best mode.

〔第１発明〜第１２発明の実施形態〕
抗原提示細胞は、例えばヒト又は適宜な非ヒト動物（例えばマウス）から採取した血液より分離したり、ヒトの例えば胸骨等の骨髄の骨髄前駆細胞から樹立したり、更には適宜な非ヒト動物（例えばマウス）から採取した脾臓から分離したり、適宜な非ヒト動物（例えばマウス）から採取した肺、鼻、皮膚等の局所組織から分離することによって得ることができる。 [Embodiments of the first invention to the twelfth invention]
Antigen-presenting cells can be isolated from blood collected from, for example, humans or appropriate non-human animals (eg, mice), established from bone marrow progenitor cells of human bone marrow, such as sternum, or appropriate non-human animals ( For example, it can be obtained by separating from a spleen collected from a mouse) or from a local tissue such as lung, nose or skin collected from a suitable non-human animal (eg mouse).

血液からの抗原提示細胞の分離には、抗体やビーズ等の手段を用いることができる。骨髄前駆細胞から樹状細胞を樹立するにあたっては、マウス等の例えば大腿骨、脛骨、上腕骨、前腕骨等を用い、これをフラッシュして骨髄前駆細胞を採取すると共に、この骨髄前駆細胞をサイトカインと一緒に培養することにより、樹立することができる。   For separation of antigen-presenting cells from blood, means such as antibodies and beads can be used. When establishing dendritic cells from bone marrow progenitor cells, for example, the femur, tibia, humerus, forearm bone, etc. of mice etc. are used to collect bone marrow progenitor cells by flushing them, Can be established by cultivating together.

得られた抗原提示細胞に、例えば生体外にてsiRNA導入用試薬を用いてsiRNAを導入し、抗原提示細胞を修飾する。   For example, siRNA is introduced into the obtained antigen-presenting cells in vitro using a reagent for introducing siRNA to modify the antigen-presenting cells.

次に、siRNAにより修飾された抗原提示細胞（siRNA修飾APC）と、血液より採取したＴ細胞（例えばCD4+CD25-T細胞）を例えば生体外にて混ぜあわせ、反応させる。「生体外にて」とは、例えばFCSを含むRPMI 1640中、CO2インキュベーター中等でsiRNA修飾APCとＴ細胞を接触させることをいう。反応させることによって、制御性Ｔ細胞（Treg）が誘導される。誘導されたTregを、抗体（CD4、CD25抗体等）、ビーズ等を用いて取り出す。こうして取り出したTregを直接体内に投与して、疾患を治療する。もしくはTregを用いて生体外で修飾し、修飾した免疫細胞を用いて治療する。siRNAは全ての遺伝子をターゲットにできる。Tregにも様々なタイプが存在するが、siRNAの種類を変えることによって、様々なTregを誘導できる可能性がある。 Next, antigen-presenting cells modified with siRNA (siRNA-modified APC) and T cells collected from blood (for example, CD4 + CD25 − T cells) are mixed and reacted in vitro, for example. “In vitro” refers to contacting siRNA-modified APC with T cells in RPMI 1640 containing FCS, in a CO 2 incubator, or the like. By reacting, regulatory T cells (Treg) are induced. The induced Treg is taken out using an antibody (CD4, CD25 antibody, etc.), beads or the like. The extracted Treg is administered directly into the body to treat the disease. Alternatively, it is modified in vitro with Treg and treated with the modified immune cells. siRNA can target all genes. There are various types of Tregs, but various Tregs may be induced by changing the type of siRNA.

以上は抗原非特異的Tregに関するが、siRNA修飾APCに抗原を感作すれば、抗原特異的抗原提示細胞を作製できる。上記と同様のプロセスにより、抗原特異的抗原提示細胞とＴ細胞を生体外にて混ぜあわせ、反応させることによって、抗原特異的なTregが誘導される。誘導された抗原特異的Tregを抗体やビーズ等を用いて取り出す。この抗原特異的Tregを治療薬として生体内に投与することができる。抗原特異的なTregであるため、抗原特異的な治療が可能である。   The above is related to antigen non-specific Treg, but antigen-specific antigen-presenting cells can be prepared by sensitizing the antigen to siRNA-modified APC. By the same process as described above, antigen-specific antigen-presenting cells and T cells are mixed in vitro and reacted to induce antigen-specific Treg. The induced antigen-specific Treg is removed using an antibody or a bead. This antigen-specific Treg can be administered in vivo as a therapeutic agent. Antigen-specific treatment is possible because it is antigen-specific Treg.

また、抗原特異的Tregは抗原非特異的（ポリクローナル）Tregよりも数十倍強力な抑制効果をもつことが報告されている。例えばスギ花粉症の患者にスギ抗原特異的Tregを投与すればスギ花粉症に対する特異的な治療となる。抗原非特異的Tregは非特異的に免疫細胞に作用するため、様々な副作用が起こり得る。従って、抗原非特異的Tregを生体に投与した場合、目的とする疾患は改善されるが、新たな疾患が発症する可能性がある。これらの問題点を考えた場合、抗原特異的Tregは非常に有用な手段である。   In addition, it has been reported that antigen-specific Treg has an inhibitory effect several tens of times stronger than antigen-nonspecific (polyclonal) Treg. For example, administration of cedar antigen-specific Treg to a cedar pollinosis patient provides a specific treatment for cedar pollinosis. Antigen non-specific Treg acts on immune cells non-specifically, so various side effects can occur. Therefore, when an antigen non-specific Treg is administered to a living body, the target disease is improved, but a new disease may develop. In view of these problems, antigen-specific Treg is a very useful tool.

〔第１発明〜第１２発明の特徴〕
前記した本願の第１発明〜第１２発明の特徴として、以下の点が挙げられる。 [Features of the first to twelfth inventions]
The following points are mentioned as features of the first to twelfth inventions of the present application.

（１）抗原特異的Tregの誘導が可能である。   (1) Induction of antigen-specific Treg is possible.

（２）抗原特異的Tregは抗原非特異的（ポリクローナル）Tregよりも数十倍強力な抑制効果を持つ。   (2) Antigen-specific Treg has an inhibitory effect several tens of times stronger than antigen-nonspecific (polyclonal) Treg.

（３）抗原特異的Tregは特異的に免疫細胞に作用するので、抗原非特異的Tregによる副作用や新しい疾患発症を考えなくても良い。   (3) Since antigen-specific Tregs specifically act on immune cells, there is no need to consider side effects and new disease development due to antigen-nonspecific Tregs.

（４）抗CD3抗体、抗CD28抗体を使用しないので安全である。即ち、生体への投与時に抗CD3抗体、抗CD28抗体の混入がない。   (4) Since no anti-CD3 antibody or anti-CD28 antibody is used, it is safe. That is, there is no contamination with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody when administered to a living body.

（５）抗CD3抗体、抗CD28抗体による副作用の可能性がない。   (5) There is no possibility of side effects caused by anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody.

（６）siRNAを直接生体に投与しないので、安全性が高い。   (6) Since siRNA is not directly administered to a living body, safety is high.

（７）Tregにも様々なタイプが存在するが、siRNAの種類を変えることによって、様々なTregを誘導できる可能性がある。   (7) There are various types of Tregs, but various Tregs may be induced by changing the type of siRNA.

次に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されない。
〔第１実施例：樹状細胞〕
（実験の概要）
マウスの骨髄細胞より樹状細胞を樹立し、樹立した樹状細胞にCD86特異的siRNA、TNF-α特異的siRNAを導入した後、OVA（卵白アルブミン）を感作して、ノックダウンOVA特異的樹状細胞（CD86ノックダウンOVA樹状細胞、TNF-αノックダウンOVA樹状細胞、CD86-TNF-αノックダウンOVA樹状細胞）を作製した。 Next, examples of the present invention will be described. The technical scope of the present invention is not limited by the following examples.
[First Example: Dendritic cells]
(Summary of experiment)
After dendritic cells are established from mouse bone marrow cells, CD86-specific siRNA and TNF-α-specific siRNA are introduced into the established dendritic cells, then sensitized with OVA (ovalbumin) and knockdown OVA-specific Dendritic cells (CD86 knockdown OVA dendritic cells, TNF-α knockdown OVA dendritic cells, CD86-TNF-α knockdown OVA dendritic cells) were prepared.

脾臓より分離したCD4+T細胞とノックダウン樹状細胞を共に６穴プレートに入れ、反応させた。５日後、ノックダウンOVA樹状細胞群はコントロール群より有意にFoxp3陽性制御性Ｔ細胞の陽性率とFoxp3 mRNAの発現を増やしていた。CD86-TNF-αノックダウンOVA樹状細胞、CD86ノックダウンOVA樹状細胞、TNF-αノックダウンOVA樹状細胞の中では、CD86-TNF-αノックダウンOVA樹状細胞が最も高率にFoxp3 mRNAの発現を増やしていた（図７）。 Both CD4 + T cells and knockdown dendritic cells isolated from the spleen were placed in a 6-well plate and allowed to react. Five days later, the knockdown OVA dendritic cell group significantly increased the positive rate of Foxp3 positive regulatory T cells and the expression of Foxp3 mRNA than the control group. Among CD86-TNF-α knockdown OVA dendritic cells, CD86 knockdown OVA dendritic cells, and TNF-α knockdown OVA dendritic cells, Foxp3 has the highest rate of CD86-TNF-α knockdown OVA dendritic cells. The expression of mRNA was increased (FIG. 7).

ノックダウンOVA樹状細胞によって誘導された制御性Ｔ細胞（OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞）はOVA特異的Ｔ細胞反応を抑制した。しかし、OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞はKLH特異的Ｔ細胞反応、スギ特異的Ｔ細胞反応等の他のＴ細胞反応は抑制しなかった（図８）。   Regulatory T cells (OVA antigen-specific regulatory T cells) induced by knockdown OVA dendritic cells suppressed OVA-specific T cell responses. However, OVA antigen-specific regulatory T cells did not suppress other T cell responses such as KLH-specific T cell responses and cedar-specific T cell responses (FIG. 8).

OVA抗原によるアレルギー性鼻炎モデルマウスにノックダウンOVA抗原特異的制御性抗原提示細胞によって誘導された制御性Ｔ細胞（OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞）を投与してその効果を検討した。OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞を投与した群、CD4＋CD25-細胞を投与した群、PBSのみを投与した群の3群を作製して、比較検討した。OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞は他のコントロール２群と比べて有意に血中OVA特異的IgE抗体、OVA刺激によって脾臓細胞から産生されるIL-4、IL-5、鼻粘膜の好酸球浸潤、くしゃみ回数、鼻掻き回数を抑制した。また、OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞はKLH抗原によるアレルギー性鼻炎モデルマウスのKLH特異的IgE抗体、KLH刺激によって脾臓細胞から産生されるIL-4、IL-5、鼻粘膜の好酸球浸潤、くしゃみ回数、鼻掻き回数を抑制しなかった（図９〜図１５）。 Regulatory T cells induced by knockdown OVA antigen-specific regulatory antigen-presenting cells (OVA antigen-specific regulatory T cells) were administered to model mice with allergic rhinitis caused by OVA antigen, and their effects were examined. Three groups, a group to which OVA antigen-specific regulatory T cells were administered, a group to which CD4 + CD25 − cells were administered, and a group to which only PBS was administered were prepared for comparison. OVA antigen-specific regulatory T cells are significantly more blood OVA-specific IgE antibody than IL-2, IL-4 and IL-5 produced from spleen cells by OVA stimulation, and eosinophils in the nasal mucosa Suppression of infiltration, sneezing and nasal scratching. In addition, OVA antigen-specific regulatory T cells are KLH-specific allergic rhinitis model mouse KLH-specific IgE antibodies, IL-4 and IL-5 produced from spleen cells by KLH stimulation, and nasal mucosal eosinophil infiltration The number of sneezing and nasal scratching was not suppressed (FIGS. 9 to 15).

（実験方法）
骨髄細胞由来樹状細胞の樹立
下記参考文献１の記載に準じて、樹状細胞は骨髄前駆細胞から作製した。即ち、マウスの大腿骨、脛骨をフラッシュして骨髄前駆細胞を採取した。骨髄前駆細胞を洗浄した後、24穴プレートにて培養した。コンプリートミディアム2ml（2 mM L-glutamine、100 U/ml penicillin、100μg/ml streptomycin、50μM 2-ME、10％FCSを含むRPMI 1640）に10 ng/mlリコンビナントGM-CSFとＩＬ-4を加え、4 x 106の骨髄前駆細胞を入れて、37℃ 5％CO2インキュベーターの中で培養することにより樹状細胞を樹立した。 (experimental method)
Establishment of bone marrow cell-derived dendritic cells According to the description in Reference 1 below, dendritic cells were prepared from bone marrow progenitor cells. Specifically, bone marrow progenitor cells were collected by flushing the femur and tibia of mice. Bone marrow progenitor cells were washed and cultured in a 24-well plate. Add 10 ng / ml recombinant GM-CSF and IL-4 to 2 ml of complete medium (RPMI 1640 containing 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 50 μM 2-ME, 10% FCS), Dendritic cells were established by placing 4 × 10 6 bone marrow progenitor cells and culturing them in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator.

（参考文献１）M. Suzuki, X. Zheng, X. Zhang, M. Li, C. Vladau, T. E. Ichim, H.
Sun, L. R. Min, B. Garcia, and W. P. Min. 2008. “Novel vaccination for allergy
through gene silencing of CD40 using small interfering RNA” J. Immunol. 180:8461。 (Reference 1) M. Suzuki, X. Zheng, X. Zhang, M. Li, C. Vladau, TE Ichim, H.
Sun, LR Min, B. Garcia, and WP Min. 2008. “Novel vaccination for allergy
through gene silencing of CD40 using small interfering RNA ”J. Immunol. 180: 8461.

siRNAの感作
GeneSilencer
reagent (Gene Therapy Systems)を用いてsiRNAを抗原提示細胞に感作した。siRNA (2 μg)、GeneSilencer
reagent（20μl）を50μl のRPMI 1640に混ぜ30分間、室温にて留置した。留置後、この混合液を12穴プレート中にある400μlの抗原提示細胞に加えた。siRNAとしてはCD86に対して特異的なsiRNA（CD86 siRNA）、TNF-αに対して特異的なsiRNA（TNF-αsiRNA）、コントロールとしてコントロールsiRNAを用いた。また、もう一つのコントロールとしてsiRNAを使用しないコントロール群（No siRNA）も作製した。４時間後、同量のミディアム（20％FBS, 20 ng/ml GM-CSF
(PeproTech)、20 ng/ml IL-4を含んだRPMI 1640を加えた。 sensitization of siRNA
GeneSilencer
reagent (Gene SiRNA was sensitized to antigen-presenting cells using Therapy Systems). siRNA (2 μg), GeneSilencer
Reagent (20 μl) was mixed with 50 μl of RPMI 1640 and left at room temperature for 30 minutes. After placement, this mixed solution was added to 400 μl of antigen-presenting cells in a 12-well plate. As siRNA, siRNA specific for CD86 (CD86 siRNA), siRNA specific for TNF-α (TNF-α siRNA), and control siRNA were used as controls. Moreover, the control group (No siRNA) which does not use siRNA as another control was also produced. 4 hours later, the same amount of medium (20% FBS, 20 ng / ml GM-CSF
(PeproTech), RPMI 1640 containing 20 ng / ml IL-4 was added.

制御性Ｔ細胞の作製
樹立した樹状細胞に配列表の配列番号１に示すCD86特異的siRNA(CD86, 5′-AUAAUUGAUCCUGUGGGUGGC-3）、配列表の配列番号２に示すTNF-α特異的siRNA（5-GACAACCAACUAGUGGUGC-3）を導入し、OVA（卵白アルブミン）を感作して、ノックダウンOVA特異的樹状細胞（CD86ノックダウンOVA樹状細胞、TNF-αノックダウンOVA樹状細胞、CD86-TNF-αノックダウンOVA樹状細胞）を作製した。脾臓より分離したT細胞（1X105/ウェル)とノックダウンOVA樹状細胞（1X105/ウェル）を共に６穴プレートに入れ、5日間反応させた。 Preparation of regulatory T cells In the established dendritic cells, a CD86-specific siRNA (CD86, 5'-AUAAUUGAUCCUGUGGGUGGC-3) shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a TNF-α-specific siRNA shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing ( 5-GACAACCAACUAGUGGUGC-3), sensitized OVA (ovalbumin), knockdown OVA-specific dendritic cells (CD86 knockdown OVA dendritic cells, TNF-α knockdown OVA dendritic cells, CD86- TNF-α knockdown OVA dendritic cells) were prepared. T cells (1 × 10 5 / well) isolated from the spleen and knockdown OVA dendritic cells (1 × 10 5 / well) were placed in a 6-well plate and allowed to react for 5 days.

Real-time PCR
TRIzol
(Invitrogen)を用いて樹状細胞よりTotal RNAを抽出した（参考文献１参照）。10 U DNase I を用いて20μg RNAを分解（37℃下で30分間）、phenol:chloroform (3:1)で抽出、ethanolで凝結、70％ ethanolで洗浄した。その後、20 μl 水（Rnaseを除去した水）を用いて溶解した。SuperScript
Preamplification System (Invitrogen)を用いてＦirst-strand cDNAを作製した。Real-time PCRはSYBR Green PCR Master
mix (Stratagene)と100 nM 遺伝子特異的プライマーを用いて施行した。PCRのコンディションは95℃ 10 分, 95℃ 30秒, 58℃ 1分, 72℃ 30秒 (40 サイクル)とした。コントロールとしてはGAPDHプライマーを使用した。以下の(1)〜(5)に示す１０種の塩基配列を、その順に、配列表の配列番号３〜１２に示す。 Real-time PCR
TRIzol
Total RNA was extracted from dendritic cells using (Invitrogen) (see Reference 1). 20 Ug RNA was degraded using 10 U DNase I (30 minutes at 37 ° C), extracted with phenol: chloroform (3: 1), coagulated with ethanol, and washed with 70% ethanol. Then, it melt | dissolved using 20 microliters water (water which removed Rnase). Superscript
First-strand cDNA was prepared using Preamplification System (Invitrogen). Real-time PCR is SYBR Green PCR Master
It was performed using mix (Stratagene) and 100 nM gene-specific primers. PCR conditions were 95 ° C for 10 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 30 seconds (40 cycles). GAPDH primer was used as a control. The 10 types of base sequences shown in the following (1) to (5) are shown in SEQ ID Nos. 3 to 12 in the sequence list in that order.

(1) CD40 5’-TCTAGAGTCCCGGATGCGAG-3’ （forward）
5’-GGATCCTCAAGGCTATGCTGTC G-3’ (reverse)
(2) CD86 5’-GTATGTCACAAGAAGCCGAATCA-3’ (forward)
5’-TTAAACAAAGCAAGACAAATAGA-3’ (reverse)
(3) TNF-α
5’-CTCCCTCCAGAAAAGACACCAT-3’ (forward)
5’-ATCACCCCGAAGTTCAGTAGACAG-3’ (reverse
(4) Foxp3 5’-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3’ (forward)
5’-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3’ (reverse)
(5) GAPDH 5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAA-3’ (forward)
5’-TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT-3’ (reverse)
制御性Ｔ細胞（Treg）の分離
制御性Ｔ細胞（Treg）としてCD4+CD25+ T細胞を分離した。MACS system を用いてCD4+CD25+ T細胞を抗原提示細胞とＴ細胞の共培養液より採取した。まずMACS negative selection CD4 isolation kit (Miltenyi Biotec)を用いてCD4+ T細胞を分離した。次に、anti-CD25 MACS beads (Miltenyi Biotec)を用いてCD4+CD25+Ｔ細胞とCD4+CD25- T細胞を分離した。 (1) CD40 5'-TCTAGAGTCCCGGATGCGAG-3 '(forward)
5'-GGATCCTCAAGGCTATGCTGTC G-3 '(reverse)
(2) CD86 5'-GTATGTCACAAGAAGCCGAATCA-3 '(forward)
5'-TTAAACAAAGCAAGACAAATAGA-3 '(reverse)
(3) TNF-α
5'-CTCCCTCCAGAAAAGACACCAT-3 '(forward)
5'-ATCACCCCGAAGTTCAGTAGACAG-3 '(reverse
(4) Foxp3 5'-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3 '(forward)
5'-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3 '(reverse)
(5) GAPDH 5'-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAA-3 '(forward)
5'-TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT-3 '(reverse)
Isolation of regulatory T cells (Treg) CD4 + CD25 + T cells were isolated as regulatory T cells (Treg). Using the MACS system, CD4 + CD25 + T cells were collected from a co-culture of antigen presenting cells and T cells. First, CD4 + T cells were isolated using MACS negative selection CD4 isolation kit (Miltenyi Biotec). Next, CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25 − T cells were separated using anti-CD25 MACS beads (Miltenyi Biotec).

感作、免疫と治療
8週齢の雄BALB/cマウスを用いた。10 μg OVA と 4 mg Al(OH3)をDay 0とDay 14の2回腹腔内に投与した。Day 21からDay 27 に毎日卵白アルブミン（ovalbumin、OVA、600 μg)を点鼻投与して、OVAに対するアレルギー性鼻炎モデルマウスを作製した。 Sensitization, immunity and treatment
Eight week old male BALB / c mice were used. 10 μg OVA and 4 mg Al (OH 3 ) were administered intraperitoneally twice on Day 0 and Day 14. From day 21 to day 27, ovalbumin (Ovalbumin, OVA, 600 μg) was administered nasally every day to prepare allergic rhinitis model mice for OVA.

Day28にOVA特異的CD4+CD25+制御性Ｔ細胞(1X106)を静脈投与した（CD4+CD25+制御性Ｔ細胞投与群、CD4+CD25-Ｔ細胞投与群、PBS投与群の3群を作製した）。Day 28からDay 34に再度卵白アルブミン（OVA、 600 μg)を点鼻投与した。下記参考文献２の記載に準じてDay34の点鼻チャレンジの後、20分間の鼻掻き回数とくしゃみ回数を数えて、比較検討した。Day35に血液、脾臓、鼻粘膜組織を採取した。 On Day 28, OVA-specific CD4 + CD25 + regulatory T cells (1X10 6 ) were intravenously administered (CD4 + CD25 + regulatory T cell administration group, CD4 + CD25 − T cell administration group, PBS administration group, 3 groups were prepared. did). From day 28 to day 34, ovalbumin (OVA, 600 μg) was administered nasally again. In accordance with the description in Reference 2 below, after the nasal nose challenge on Day 34, the number of nasal scratches and the number of sneezes for 20 minutes were counted and compared. On Day 35, blood, spleen, and nasal mucosa were collected.

（参考文献２）M. Suzuki, N. Ohta,
W. P. Min, T. Matsumoto, R. Min, X. Zhang, K. Toida, and S. Murakami. 2007.
“Immunotherapy with CpG DNA conjugated with T-cell epitope peptide of an
allergenic Cry j 2 protein is useful for control of allergic conditions in
mice” Int. Immunopharmacol. 7:46。 (Reference 2) M. Suzuki, N. Ohta,
WP Min, T. Matsumoto, R. Min, X. Zhang, K. Toida, and S. Murakami. 2007.
“Immunotherapy with CpG DNA conjugated with T-cell epitope peptide of an
allergenic Cry j 2 protein is useful for control of allergic conditions in
mice ”Int. Immunopharmacol. 7:46.

又、KLHに対するアレルギー性鼻炎モデルマウスも作製して、同様の実験を行った。具体的には10 μg KLH と 4 mg Al(OH3)をDay0とDay 14の2回腹腔内に投与した。Day 21からDay 27 に毎日KLH（30 μg)を点鼻投与して、KLHに対するアレルギー性鼻炎モデルマウスを作製した。 In addition, allergic rhinitis model mice for KLH were also prepared and subjected to the same experiment. Specifically, 10 μg KLH and 4 mg Al (OH 3 ) were administered intraperitoneally twice on Day 0 and Day 14. From day 21 to day 27, KLH (30 μg) was administered nasally every day to produce a model mouse for allergic rhinitis to KLH.

Day28にOVA特異的CD4+CD25+制御性Ｔ細胞(1X106)を静脈投与した（CD4+CD25+制御性Ｔ細胞投与群、CD4+CD25-Ｔ細胞投与群、PBS投与群の3群を作製した）。Day 28からDay 34に再度KLH（30 μg)を点鼻投与した。Day34の点鼻チャレンジの後、20分間鼻掻き回数とくしゃみ回数を数えた。Day35に血液、脾臓、鼻粘膜組織を採取した。 On Day 28, OVA-specific CD4 + CD25 + regulatory T cells (1X10 6 ) were intravenously administered (CD4 + CD25 + regulatory T cell administration group, CD4 + CD25 − T cell administration group, PBS administration group, 3 groups were prepared. did). From Day 28 to Day 34, KLH (30 μg) was administered again nasally. After Day 34 nasal challenge, we counted the number of nasal strokes and sneezes for 20 minutes. On Day 35, blood, spleen, and nasal mucosa were collected.

血清特異的IgEの測定
ELISAを用いてマウス血清特異的IgEを測定した。抗マウス特異的IgE抗体をELISA プレートにコートした後、ブロッキングバッファーを加え非特異的結合を防いだ。血清を加え37℃で2時間インキュベイトした後、3回洗浄した。ビオチン化スギ抗原を加え、洗浄した。アビジン−パーオキシダ−ゼを加えインキュベイトした後、洗浄した。TMB Microwell
Peroxidase Substrate systemを用いて発色させた。ＯＤは450nmで測定した。 Serum-specific IgE measurement
Mouse serum specific IgE was measured using ELISA. After coating an anti-mouse specific IgE antibody on an ELISA plate, blocking buffer was added to prevent non-specific binding. Serum was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours, followed by washing 3 times. Biotinylated cedar antigen was added and washed. Avidin-peroxidase was added and incubated, followed by washing. TMB Microwell
Color was developed using the Peroxidase Substrate system. OD was measured at 450 nm.

OVA抗原特異的Ｔ細胞反応
アレルギーモデルマウスより採取した脾臓からFicoll-Paqueを用いてＴ細胞を分離した。分離したＴ細胞をコンプリートミディアムに溶かし、96穴プレートに入れ（4 x 105 cells/1ウェル）、OVA（100 μg/ml）抗原の存在下で72時間培養した。1 μCi の[3H]thymidineを加え、16時間培養した。[3H]thymidineの取り込みはシンチレーションカウンターを用いて測定した。３回測定して、cpm（counts per minute）の平均を結果として用いた。 T cells were isolated from the spleen collected from an OVA antigen-specific T cell reaction allergic model mouse using Ficoll-Paque. The separated T cells were dissolved in complete medium, placed in a 96-well plate (4 × 10 5 cells / 1 well), and cultured for 72 hours in the presence of OVA (100 μg / ml) antigen. 1 μCi of [ 3 H] thymidine was added and cultured for 16 hours. [ 3 H] thymidine incorporation was measured using a scintillation counter. Three measurements were taken and the average cpm (counts per minute) was used as the result.

OVA抗原特異的Ｔ細胞反応によって産生されるIL-4、IL-5の測定
OVA抗原特異的Ｔ細胞反応培養上清中のIL-4、IL-5を特異的抗体を用いたサンドイッチELISAにて測定した。抗IL-4モノクローナル抗体もしくは抗IL-5モノクローナル抗体をプレートに吸着後、培養上清を加えた。洗浄後、ビオチン化した抗IL-4モノクローナル抗体もしくは抗IL-5モノクローナル抗体を加え、アビジン−パーオキシダ−ゼ、TMB Microwell
Peroxidase Substrate systemを用いて発色させた。リコンビナントサイトカインを用いて、スタンダードカーブを作製した。 Measurement of IL-4 and IL-5 produced by OVA antigen-specific T cell reaction
IL-4 and IL-5 in the culture supernatant of the OVA antigen-specific T cell reaction were measured by sandwich ELISA using specific antibodies. After the anti-IL-4 monoclonal antibody or anti-IL-5 monoclonal antibody was adsorbed to the plate, the culture supernatant was added. After washing, biotinylated anti-IL-4 monoclonal antibody or anti-IL-5 monoclonal antibody was added, and avidin-peroxidase, TMB Microwell
Color was developed using the Peroxidase Substrate system. A standard curve was prepared using recombinant cytokines.

TregによるOVA特異的Ｔ細胞反応の抑制
アレルギーマウスの脾臓より分離したＴ細胞を96穴プレートに入れ（5 x 105/ウェル）、400 μg/ml OVAと反応させた（OVA抗原特異的Ｔ細胞反応）。CD4+CD25+ 制御性T細胞もしくはCD4+CD25- T細胞を加え、制御性T細胞のＴ細胞反応抑制能力を[3H]thymidineの取り込みにて評価した。 Inhibition of OVA-specific T cell reaction by Treg T cells isolated from the spleen of allergic mice were placed in a 96-well plate (5 × 10 5 / well) and reacted with 400 μg / ml OVA (OVA antigen-specific T cells) reaction). CD4 + CD25 + regulatory T cells or CD4 + CD25 − T cells were added, and the ability of regulatory T cells to suppress the T cell response was evaluated by [ 3 H] thymidine incorporation.

病理
頭部を切り離して10％ formalinで固定した後、脱灰して、薄片に切り分けた。鼻組織を3μMの厚さで切った後、Luna染色で染めた。鼻中隔に存在する好酸球の数をカウントした。強拡(10 x 40)で認められる好酸球数を測定した。 After the pathological head was cut off and fixed with 10% formalin, it was decalcified and cut into thin pieces. The nasal tissue was cut to a thickness of 3 μM and dyed with Luna staining. The number of eosinophils present in the nasal septum was counted. The number of eosinophils observed with strong expansion (10 × 40) was measured.

統計学的解析
one-way ANOVA（Newman-Keuls Test）を用いて解析した。P < 0.05の場合、統計学的に有意と判断した。 Statistical analysis
One-way ANOVA (Newman-Keuls Test) was used for analysis. When P <0.05, it was judged to be statistically significant.

（結果）
siRNA感作による遺伝子ノックダウン効果
樹立した樹状細胞にCD86 siRNA、TNF-αsiRNAもしくはCD86 siRNAとTNF-αsiRNAの両方を感作した後、OVA抗原を導入、CD86ノックダウンOVA樹状細胞、TNF-αノックダウンOVA樹状細胞、CD86-TNF-αノックダウンOVA樹状細胞を作製した。ノックダウンOVA樹状細胞のRNAを抽出、Real time PCRを施行した。 (result)
Gene knockdown effect by siRNA sensitization CD86 siRNA, TNF-αsiRNA or both CD86 siRNA and TNF-αsiRNA are sensitized to established dendritic cells, then OVA antigen is introduced, CD86 knockdown OVA dendritic cells, TNF- α knockdown OVA dendritic cells and CD86-TNF-α knockdown OVA dendritic cells were prepared. RNA of knockdown OVA dendritic cells was extracted and subjected to Real time PCR.

その結果、図１に示すように、CD86 ノックダウンOVA樹状細胞では有意にCD86発現が抑制していた。しかし、CD86 ノックダウンOVA樹状細胞ではTNF-α（図２）、CD40（図３）、CD80等の他の遺伝子の発現を抑制していなかった。又、図４に示すように、TNF-α
ノックダウンOVA樹状細胞ではTNF-αの発現が抑制していた。しかし、TNF-α ノックダウンOVA樹状細胞ではCD86（図５）、CD40（図６）、CD80等の他の遺伝子発現を抑制していなかった。 As a result, as shown in FIG. 1, CD86 expression was significantly suppressed in CD86 knockdown OVA dendritic cells. However, CD86 knockdown OVA dendritic cells did not suppress the expression of other genes such as TNF-α (FIG. 2), CD40 (FIG. 3), and CD80. In addition, as shown in FIG.
Expression of TNF-α was suppressed in knockdown OVA dendritic cells. However, expression of other genes such as CD86 (FIG. 5), CD40 (FIG. 6), and CD80 was not suppressed in TNF-α knockdown OVA dendritic cells.

更に、CD86siRNAとTNF-αsiRNAの双方を用いて両方をノックダウンさせたOVA樹状細胞であるCD86TNF-αノックダウンOVA樹状細胞では、図７に示すようにTNF-αの発現が抑制し、かつ、図８に示すようにCD86の発現が抑制していた。   Furthermore, in CD86TNF-α knockdown OVA dendritic cells, which are OVA dendritic cells knocked down using both CD86siRNA and TNF-αsiRNA, the expression of TNF-α is suppressed as shown in FIG. And as shown in FIG. 8, the expression of CD86 was suppressed.

なお、図１〜図８において、「No siRNA」の表記はsiRNAを感作していない樹状細胞を意味し、「Scrambled siRNA」の表記は効果のないsiRNAを感作したコントロールとしての樹状細胞を意味する。   In FIG. 1 to FIG. 8, “No siRNA” represents a dendritic cell that has not been sensitized with siRNA, and “Scrambled siRNA” represents a dendritic cell as a control sensitized with ineffective siRNA. Means a cell.

樹状細胞によるFoxp3発現の誘導
脾臓より分離したT細胞とノックダウンOVA樹状細胞を共にプレートに入れ反応させた。5日後、ノックダウンOVA樹状細胞群はコントロール群より有意にFoxp3 mRNAの発現を増やしていた。また、ノックダウンOVA樹状細胞の中では、CD86-TNF-αノックダウンOVA樹状細胞が最も高率にFoxp3 mRNAの発現を増やしていた（図９）。 Induction of Foxp3 expression by dendritic cells T cells isolated from the spleen and knockdown OVA dendritic cells were placed in a plate and reacted. Five days later, the knockdown OVA dendritic cell group significantly increased the expression of Foxp3 mRNA than the control group. Moreover, among knockdown OVA dendritic cells, CD86-TNF-α knockdown OVA dendritic cells increased Foxp3 mRNA expression at the highest rate (FIG. 9).

なお、図９において、「CD86」の表記はCD86 siRNAによって感作された樹状細胞を、「TNF-α」の表記はTNF-α siRNAによって感作された樹状細胞を、「CD86 TNF-α半量」の表記は上記「CD86」の場合の半量のCD86 siRNA及び上記「TNF-α」の場合の半量のTNF-α siRNAによって感作された樹状細胞を、「CD86
TNF-α同量」の表記は上記「CD86」の場合と同量のCD86
siRNA及び上記「TNF-α」の場合と同量のTNF-α siRNAによって感作された樹状細胞を、それぞれ示す。 In FIG. 9, “CD86” represents dendritic cells sensitized by CD86 siRNA, and “TNF-α” represents dendritic cells sensitized by TNF-α siRNA, “CD86 TNF- The notation of `` α half amount '' indicates dendritic cells sensitized by half the amount of CD86 siRNA in the case of `` CD86 '' and half amount of TNF-α siRNA in the case of `` TNF-α ''.
TNF-α is the same amount as CD86 above
Dendritic cells sensitized with siRNA and the same amount of TNF-α siRNA as in the case of “TNF-α” are shown.

制御性Ｔ細胞による抗原特異的Ｔ細胞反応への影響
抗原（OVA、KLHもしくはスギ花粉）特異的Ｔ細胞に、CD86-TNF-αノックダウン樹状細胞に誘導された制御性Ｔ細胞（CD4+CD25+制御性Ｔ細胞）を加えて、抗原特異的Ｔ細胞反応への影響をIn vitroにて検討した。 Effect of regulatory T cells on antigen-specific T cell responses Regulatory T cells induced by CD86-TNF-α knockdown dendritic cells (CD4 + ) on antigen (OVA, KLH or cedar pollen) specific T cells CD25 + regulatory T cells) were added, and the effect on antigen-specific T cell responses was examined in vitro.

CD86-TNF-αノックダウンOVA樹状細胞によって誘導されたCD4+CD25+制御性Ｔ細胞はOVA抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制したが、KLH抗原特異的Ｔ細胞反応やスギ花粉抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制しなかった（図１０）。 CD4 + CD25 + regulatory T cells induced by CD86-TNF-α knockdown OVA dendritic cells suppressed OVA antigen-specific T cell responses, but KLH antigen-specific T cell responses and cedar pollen antigen-specific T cells The cell reaction was not suppressed (FIG. 10).

なお、図１０において、「Responder」とはＴ細胞反応に関与するＴ細胞を意味し、具体的にはCD4+CD25-Ｔ細胞である。「Inhibitor」とはＴ細胞反応を抑制するＴ細胞を意味し、具体的にはCD4+CD25+制御性Ｔ細胞である。従って「Ratio of Responders to Inhibitors」、即ちResponderに対するInhibitorの比率が高まるにつれてCPM（Counts per minutes：Ｔ細胞反応を意味するサイミジンの取り込みを示す値）が低下する場合、抗原特異的Ｔ細胞反応が有効に抑制されていることを示す。 In FIG. 10, “Responder” means a T cell involved in the T cell reaction, specifically, a CD4 + CD25 − T cell. “Inhibitor” means a T cell that suppresses the T cell response, specifically, a CD4 + CD25 + regulatory T cell. Therefore, when CPM (Counts per minutes: a value indicating thymidine uptake, meaning T cell reaction) decreases as the ratio of Inhibitor to Responder increases, antigen-specific T cell reaction is effective Indicates that it is suppressed.

制御性Ｔ細胞による症状の抑制
CD86TNF-αノックダウンOVA樹状細胞によって誘導されたCD4+CD25+制御性Ｔ細胞（OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞）の効果をIn vivoにて検討した。OVA抗原によるアレルギー性鼻炎モデルマウスにOVA抗原特異的制御性Ｔ細胞を投与した。 Suppression of symptoms by regulatory T cells
The effect of CD4 + CD25 + regulatory T cells (OVA antigen-specific regulatory T cells) induced by CD86TNF-α knockdown OVA dendritic cells was examined in vivo. OVA antigen-specific regulatory T cells were administered to model mice with allergic rhinitis caused by OVA antigen.

即ち、以下の３群を作製して、比較検討した。   That is, the following three groups were prepared and compared.

（１）抗原特異的制御性Ｔ細胞（CD4+CD25+Ｔ細胞）を投与した群。この群はCD86-TNF-αノックダウン樹状細胞に誘導されたCD4+CD25+Ｔ細胞を投与した群であり、図１１〜図１７においては「CD4+CD25+」と表記されている。 (1) A group administered with antigen-specific regulatory T cells (CD4 + CD25 + T cells). This group is a group to which CD4 + CD25 + T cells induced by CD86-TNF-α knockdown dendritic cells were administered, and are denoted as “CD4 + CD25 + ” in FIGS.

（２）CD4＋CD25-Ｔ細胞を投与した群。この群はScrambled siRNA感作樹状細胞に誘導されたCD4＋CD25-Ｔ細胞を投与したコントロール群であり、図１１〜図１７においては「CD4＋CD25-」と表記されている。 (2) A group to which CD4 + CD25 − T cells were administered. This group is a control group to which CD4 + CD25 − T cells induced by Scrambled siRNA-sensitized dendritic cells were administered. In FIG. 11 to FIG. 17, “CD4 + CD25 − ” is indicated.

（３）PBS（Phosphate buffered saline）のみを投与したコントロール群。この群は図１１〜図１７においては「PBS alone」と表記されている。   (3) A control group to which only PBS (Phosphate buffered saline) was administered. This group is described as “PBS alone” in FIGS.

その結果、OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞は、他のコントロール２群と比べて有意にくしゃみ回数、鼻掻き回数（図１１）、血中OVA特異的IgE抗体（図１２）、OVA刺激によって脾臓細胞から産生されるIL-4、IL-5（図１３）、鼻粘膜の好酸球浸潤（図１４）を抑制した。また、OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞はKLH抗原によるアレルギー性鼻炎モデルマウスのくしゃみ回数、鼻掻き回数、KLH特異的IgE抗体、鼻粘膜の好酸球浸潤を抑制しなかった（図１５〜図１７）。
〔第２実施例：Ｂ細胞〕
（実験の概要）
マウスの脾臓細胞よりＢ細胞を分離し、分離したＢ細胞にCD86特異的siRNA、CD40特異的siRNAを導入した。次いでこれらのＢ細胞にOVA（卵白アルブミン）を感作して、ノックダウンOVA特異的Ｂ細胞（CD86ノックダウンOVA Ｂ細胞、CD40ノックダウンOVA Ｂ細胞）を作製した。CD86ノックダウンOVA Ｂ細胞、CD40ノックダウンOVA
Ｂ細胞にＴ細胞を反応させると、有意にOVA抗原特異的制御性Ｔ細胞が誘導された。また誘導された抗原特異的制御性Ｔ細胞はOVA抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制したが、KLH抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制しなかった（後述する図２３）。 As a result, OVA antigen-specific regulatory T cells were significantly sneezed, nasally scratched (Fig. 11), blood OVA-specific IgE antibody (Fig. 12), and spleen by OVA stimulation compared to the other two control groups. IL-4 and IL-5 produced from the cells (FIG. 13) and eosinophil infiltration of the nasal mucosa (FIG. 14) were suppressed. In addition, OVA antigen-specific regulatory T cells did not suppress sneezing frequency, nasal scratching frequency, KLH-specific IgE antibody, nasal mucosal eosinophil infiltration in KLH antigen-induced allergic rhinitis model mice (FIG. 15 to FIG. 15). 17).
[Second Example: B cell]
(Summary of experiment)
B cells were isolated from mouse spleen cells, and CD86-specific siRNA and CD40-specific siRNA were introduced into the isolated B cells. These B cells were then sensitized with OVA (ovalbumin) to produce knockdown OVA specific B cells (CD86 knockdown OVA B cells, CD40 knockdown OVA B cells). CD86 knockdown OVA B cell, CD40 knockdown OVA
When T cells were reacted with B cells, OVA antigen-specific regulatory T cells were significantly induced. Further, the induced antigen-specific regulatory T cells suppressed the OVA antigen-specific T cell reaction, but did not suppress the KLH antigen-specific T cell reaction (FIG. 23 described later).

（実験方法）
Ｂ細胞の分離
正常マウスの脾臓を採取し、脾臓よりCD19マイクロビーズを用いてＢ細胞を分離した。 (experimental method)
Isolation of B cells Normal mouse spleens were collected, and B cells were isolated from the spleens using CD19 microbeads.

siRNAの感作
GeneSilencer
reagent (Gene Therapy Systems)を用いてsiRNAをＢ細胞に感作した。siRNA (2 μg)、GeneSilencer
reagent（20μl）を50μl のRPMI 1640に混ぜ30分間、室温にて留置した。留置後、この混合液を12穴プレート中にある400μlのＢ細胞に加えた。siRNAとしてはCD86に対して特異的なsiRNA（CD86 siRNA）、CD40に対して特異的なsiRNA（CD40 siRNA）を用いた。又、もう一つのコントロールとしてsiRNAを使用しないコントロール群（No siRNA）も作製した。４時間後、同量のミディアム（20％FBS, 20 ng/ml GM-CSF
(PeproTech)、20 ng/ml IL-4を含んだRPMI 1640を加えた。 sensitization of siRNA
GeneSilencer
reagent (Gene SiRNA was sensitized to B cells using Therapy Systems). siRNA (2 μg), GeneSilencer
Reagent (20 μl) was mixed with 50 μl of RPMI 1640 and left at room temperature for 30 minutes. After placement, this mixture was added to 400 μl of B cells in a 12-well plate. As siRNA, siRNA specific for CD86 (CD86 siRNA) and siRNA specific for CD40 (CD40 siRNA) were used. Moreover, the control group (No siRNA) which does not use siRNA as another control was also produced. 4 hours later, the same amount of medium (20% FBS, 20 ng / ml GM-CSF
(PeproTech), RPMI 1640 containing 20 ng / ml IL-4 was added.

制御性Ｔ細胞の作製
分離したＢ細胞に、前記した配列表の配列番号１に示すCD86特異的siRNA、配列表の配列番号１３に示すCD40特異的siRNA（5- UUCUCAGCCCAGUGGAACA -3）と配列表の配列番号１４に示すCD86特異的siRNA（5- AUAAUUGAUCCUGUGGGUGGC -3）を導入し、OVA（卵白アルブミン）を感作して、ノックダウンOVA特異的Ｂ細胞（CD86ノックダウンOVA Ｂ細胞、CD40ノックダウンOVA Ｂ細胞）を作製した。脾臓より分離したＢ細胞（1X105/ウェル)とノックダウンOVA Ｂ細胞（1X105/ウェル）を共に６穴プレートに入れ、5日間反応させた。 Preparation of regulatory T cells To the isolated B cells, the CD86-specific siRNA shown in SEQ ID NO: 1 in the above sequence listing, the CD40-specific siRNA (5-UUCUCAGCCCAGUGGAACA-3) shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing and the sequence listing CD86-specific siRNA (5-AUAAUUGAUCCUGUGGGUGGC-3) shown in SEQ ID NO: 14 is introduced, sensitized with OVA (ovalbumin), and knockdown OVA-specific B cells (CD86 knockdown OVA B cells, CD40 knockdown OVA) B cells) were prepared. B cells (1 × 10 5 / well) isolated from the spleen and knockdown OVA B cells (1 × 10 5 / well) were placed in a 6-well plate and allowed to react for 5 days.

Real-time PCR
TRIzol (Invitrogen)を用いてＢ細胞よりTotal RNAを抽出した（参考文献１参照）。10 U DNase I を用いて20μg RNAを分解（37℃下で30分間）、phenol:chloroform (3:1)で抽出、ethanolで凝結、70％ ethanolで洗浄した。その後、20 μl 水（Rnaseを除去した水）を用いて溶解した。SuperScript
Preamplification System (Invitrogen)を用いてＦirst-strand cDNAを作製した。Real-time PCRはSYBR Green PCR Master mix (Stratagene)と100 nM 遺伝子特異的プライマーを用いて施行した。PCRのコンディションは95℃ 10 分, 95℃ 30秒, 58℃ 1分, 72℃ 30秒 (40 サイクル)とした。コントロールとしてはGAPDHプライマーを使用した。プライマーの塩基配列は、前記した第１実施例における「Real-time PCR」の欄で示した(1)、(2)、(4)、(5)の通りである。 Real-time PCR
Total RNA was extracted from B cells using TRIzol (Invitrogen) (see Reference 1). 20 Ug RNA was degraded using 10 U DNase I (30 minutes at 37 ° C), extracted with phenol: chloroform (3: 1), coagulated with ethanol, and washed with 70% ethanol. Then, it melt | dissolved using 20 microliters water (water which removed Rnase). Superscript
First-strand cDNA was prepared using Preamplification System (Invitrogen). Real-time PCR was performed using SYBR Green PCR Master mix (Stratagene) and 100 nM gene-specific primers. PCR conditions were 95 ° C for 10 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 30 seconds (40 cycles). GAPDH primer was used as a control. The base sequence of the primer is as shown in (1), (2), (4) and (5) shown in the column of “Real-time PCR” in the first embodiment.

制御性Ｔ細胞（Treg）の分離
制御性Ｔ細胞（Treg）としてCD4+CD25+ Ｔ細胞を分離した。MACS system を用いてCD4+CD25+ T細胞を抗原提示細胞とＴ細胞の共培養液より採取した。まずMACS negative
selection CD4 isolation kit (Miltenyi Biotec)を用いてCD4+ Ｔ細胞を分離した。次に、anti-CD25 MACS beads
(Miltenyi Biotec)を用いてCD4+CD25+Ｔ細胞とCD4+CD25- Ｔ細胞を分離した。 Isolation of regulatory T cells (Treg) CD4 + CD25 + T cells were isolated as regulatory T cells (Treg). Using the MACS system, CD4 + CD25 + T cells were collected from a co-culture of antigen presenting cells and T cells. First MACS negative
CD4 + T cells were isolated using a selection CD4 isolation kit (Miltenyi Biotec). Next, anti-CD25 MACS beads
CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25 − T cells were separated using (Miltenyi Biotec).

感作、免疫と治療
8週齢の雄BALB/cマウスを用いた。10 μg OVA と 4 mg Al(OH3)をDay 0とDay 14の2回腹腔内に投与した。Day 21からDay 27 に毎日卵白アルブミン（ovalbumin、OVA、600 μg)を点鼻投与して、OVAに対するアレルギー性鼻炎モデルマウスを作製した。 Sensitization, immunity and treatment
Eight week old male BALB / c mice were used. 10 μg OVA and 4 mg Al (OH 3 ) were administered intraperitoneally twice on Day 0 and Day 14. From day 21 to day 27, ovalbumin (Ovalbumin, OVA, 600 μg) was administered nasally every day to prepare allergic rhinitis model mice for OVA.

Day28にOVA特異的CD4+CD25+制御性Ｔ細胞(1X106)を静脈投与した（CD4+CD25+制御性Ｔ細胞投与群、CD4+CD25-Ｔ細胞投与群、PBS投与群の3群を作製した）。Day 28からDay 34に再度卵白アルブミン（OVA、 600 μg)を点鼻投与した。下記参考文献２の記載に準じてDay34の点鼻チャレンジの後、20分間の鼻掻き回数とくしゃみ回数を数えて、比較検討した。Day35に血液、脾臓、鼻粘膜組織を採取した。 On Day 28, OVA-specific CD4 + CD25 + regulatory T cells (1X10 6 ) were intravenously administered (CD4 + CD25 + regulatory T cell administration group, CD4 + CD25 − T cell administration group, PBS administration group, 3 groups were prepared. did). From day 28 to day 34, ovalbumin (OVA, 600 μg) was administered nasally again. In accordance with the description in Reference 2 below, after the nasal nose challenge on Day 34, the number of nasal scratches and the number of sneezes for 20 minutes were counted and compared. On Day 35, blood, spleen, and nasal mucosa were collected.

血清特異的IgEの測定
ELISAを用いてマウス血清特異的IgEを測定した。抗マウス特異的IgE抗体をELISA プレートにコートした後、ブロッキングバッファーを加え非特異的結合を防いだ。血清を加え37℃で2時間インキュベイトした後、3回洗浄した。ビオチン化スギ抗原を加え、洗浄した。アビジン−パーオキシダ−ゼを加えインキュベイトした後、洗浄した。TMB Microwell Peroxidase Substrate
systemを用いて発色させた。ＯＤは450nmで測定した。 Serum-specific IgE measurement
Mouse serum specific IgE was measured using ELISA. After coating an anti-mouse specific IgE antibody on an ELISA plate, blocking buffer was added to prevent non-specific binding. Serum was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours, followed by washing 3 times. Biotinylated cedar antigen was added and washed. Avidin-peroxidase was added and incubated, followed by washing. TMB Microwell Peroxidase Substrate
Color was developed using system. OD was measured at 450 nm.

OVA抗原特異的Ｔ細胞反応
アレルギーモデルマウスより採取した脾臓からFicoll-Paqueを用いてＴ細胞を分離した。分離したＴ細胞をコンプリートミディアムに溶かし、96穴プレートに入れ（4 x 105 cells/1ウェル）、OVA（100 μg/ml）抗原の存在下で72時間培養した。1 μCi の[3H]thymidineを加え、16時間培養した。[3H]thymidineの取り込みはシンチレーションカウンターを用いて測定した。３回測定して、cpm（count per minute）の平均を結果として用いた。 T cells were isolated from the spleen collected from an OVA antigen-specific T cell reaction allergic model mouse using Ficoll-Paque. The separated T cells were dissolved in complete medium, placed in a 96-well plate (4 × 10 5 cells / 1 well), and cultured for 72 hours in the presence of OVA (100 μg / ml) antigen. 1 μCi of [ 3 H] thymidine was added and cultured for 16 hours. [ 3 H] thymidine incorporation was measured using a scintillation counter. Three measurements were taken and the average cpm (count per minute) was used as the result.

TregによるOVA特異的Ｔ細胞反応の抑制
アレルギーマウスの脾臓より分離したＴ細胞を96穴プレートに入れ（5 x 105/ウェル）、400 μg/ml OVAと反応させた（OVA抗原特異的Ｔ細胞反応）。CD4+CD25+ 制御性T細胞もしくはCD4+CD25- T細胞を加え、制御性T細胞のＴ細胞反応抑制能力を[3H]thymidineの取り込みにて評価した。 Inhibition of OVA-specific T cell reaction by Treg T cells isolated from the spleen of allergic mice were placed in a 96-well plate (5 × 10 5 / well) and reacted with 400 μg / ml OVA (OVA antigen-specific T cells) reaction). CD4 + CD25 + regulatory T cells or CD4 + CD25 − T cells were added, and the ability of regulatory T cells to suppress the T cell response was evaluated by [ 3 H] thymidine incorporation.

統計学的解析
one-way ANOVA（Newman-Keuls Test）を用いて解析した。P < 0.05の場合、統計学的に有意と判断した。 Statistical analysis
One-way ANOVA (Newman-Keuls Test) was used for analysis. When P <0.05, it was judged to be statistically significant.

（結果）
siRNA感作による遺伝子ノックダウン効果
分離したＢ細胞にCD86
siRNA又はCD40 siRNAを感作した後、OVA抗原を導入して、CD86ノックダウンOVA Ｂ細胞、CD40ノックダウンOVA Ｂ細胞を作製した。ノックダウンOVA Ｂ細胞のRNAを抽出し、Real time PCRを施行した。 (result)
Gene knockdown effect by siRNA sensitization CD86 on isolated B cells
After sensitizing siRNA or CD40 siRNA, OVA antigen was introduced to prepare CD86 knockdown OVA B cells and CD40 knockdown OVA B cells. Knockdown OVA B cell RNA was extracted and subjected to real time PCR.

その結果、図１８に示すように、CD86ノックダウンOVA Ｂ細胞では有意にCD86発現が抑制していた。しかし、CD86 ノックダウンOVA Ｂ細胞ではCD40の遺伝子の発現を抑制していなかった（図１９）。又、図２０に示すように、CD40ノックダウンOVA Ｂ細胞ではCD40の発現が抑制していた。しかし、CD40ノックダウンOVA Ｂ細胞ではCD86の遺伝子発現を抑制していなかった（図２１）。   As a result, as shown in FIG. 18, CD86 expression was significantly suppressed in CD86 knockdown OVA B cells. However, CD40 gene expression was not suppressed in CD86 knockdown OVA B cells (FIG. 19). Further, as shown in FIG. 20, CD40 expression was suppressed in CD40 knockdown OVA B cells. However, CD86 knockdown OVA B cells did not suppress CD86 gene expression (FIG. 21).

Ｂ細胞によるFoxp3発現の誘導
この実験では、CD86ノックダウンOVA Ｂ細胞、CD40ノックダウンOVA Ｂ細胞に加えて、分離したＢ細胞にCD86 siRNA及びCD40 siRNAを感作した後、OVA抗原を導入してなるCD40-CD86-ノックダウンOVA Ｂ細胞も用いた。 Induction of Foxp3 expression by B cells In this experiment, in addition to CD86 knockdown OVA B cells and CD40 knockdown OVA B cells, CD86 siRNA and CD40 siRNA were sensitized to isolated B cells, and then OVA antigen was introduced. The following CD40-CD86-knockdown OVA B cells were also used.

脾臓より分離したＴ細胞とノックダウンOVA Ｂ細胞を共にプレートに入れ反応させた。5日後、ノックダウンOVA Ｂ細胞群はコントロール群より有意にFoxp3 mRNAの発現を増やしていた。又、ノックダウンOVA Ｂ細胞群の中では、CD40-CD86-ノックダウンOVA Ｂ細胞が最も高率にFoxp3 mRNAの発現を増やしていた（図２２）。   Both T cells isolated from the spleen and knockdown OVA B cells were placed in a plate and allowed to react. Five days later, the knockdown OVA B cell group significantly increased the expression of Foxp3 mRNA than the control group. In addition, among the knockdown OVA B cell group, CD40-CD86-knockdown OVA B cells increased Foxp3 mRNA expression at the highest rate (FIG. 22).

なお、図２２において、「CD86」の表記はCD86 siRNAによって感作されたＢ細胞を、「CD40」の表記はCD40 siRNAによって感作されたＢ細胞を、「CD40 CD86半量」の表記は上記「CD40」の場合の半量のCD40 siRNA及び上記「CD86」の場合の半量のCD86 siRNAによって感作されたＢ細胞を、「CD40
CD86同量」の表記は上記「CD40」の場合と同量のCD40 siRNA及び上記「CD86」の場合と同量のCD86 siRNAによって感作されたＢ細胞を、それぞれ示す。 In FIG. 22, “CD86” represents B cells sensitized by CD86 siRNA, “CD40” represents B cells sensitized by CD40 siRNA, and “CD40 CD86 half amount” represents the above “ B cells sensitized by half the amount of CD40 siRNA in the case of “CD40” and half of the CD86 siRNA in the case of “CD86” above,
The notation of “same amount of CD86” indicates B cells sensitized by the same amount of CD40 siRNA as in the case of “CD40” and the same amount of CD86 siRNA as in the case of “CD86”.

制御性Ｔ細胞による抗原特異的Ｔ細胞反応への影響
抗原（OVA又はKLH）特異的Ｔ細胞に、CD40-CD86-ノックダウンOVA Ｂ細胞に誘導された制御性Ｔ細胞（CD4＋CD25+制御性Ｔ細胞）を加えて、抗原特異的Ｔ細胞反応への影響をIn vitroにて検討した。CD40-CD86-ノックダウンOVA Ｂ細胞によって誘導されたCD4＋CD25+制御性Ｔ細胞はOVA抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制したが、KLH抗原特異的Ｔ細胞反応を抑制しなかった（図２３）。 Effect of regulatory T cells on antigen-specific T cell responses Regulatory T cells induced by CD40-CD86-knockdown OVA B cells (CD4 + CD25 + regulatory properties) on antigen (OVA or KLH) specific T cells T cells) were added, and the influence on antigen-specific T cell responses was examined in vitro. CD4 + CD25 + regulatory T cells induced by CD40-CD86-knockdown OVA B cells suppressed the OVA antigen-specific T cell response but did not suppress the KLH antigen specific T cell response (FIG. 23). .

なお、図２３において、「Responder」、「Inhibitor」の意味は図１０に関して説明した通りである。   In FIG. 23, the meanings of “Responder” and “Inhibitor” are as described with reference to FIG.

感作、免疫と治療
前記「（実験方法）」中の「感作、免疫と治療」の項における鼻掻き回数とくしゃみ回数を数えた結果を図２４に示す。図２４において、「PBS
alone」はPBS投与群を、「CD25-」はCD4+CD25-Ｔ細胞投与群を、「CD25+」はCD4+CD25+制御性Ｔ細胞投与群をそれぞれ示すが、OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞は他のコントロール２群と比べて有意にくしゃみ回数、鼻掻き回数を抑制した。 Sensitization, Immunization and Treatment FIG. 24 shows the results of counting the number of nasal scratches and sneezing in “ Sensitization, Immunization and Treatment ” in the “(Experimental Method)”. In FIG. 24, “PBS
“alone” indicates the PBS administration group, “CD25−” indicates the CD4 + CD25 − T cell administration group, and “CD25 +” indicates the CD4 + CD25 + regulatory T cell administration group, but OVA antigen-specific regulatory T cells. Significantly reduced the number of sneezes and nasal scratches compared to the other two control groups.

制御性Ｔ細胞による症状の抑制
CD40-CD86-ノックダウンOVA Ｂ細胞によって誘導されたCD4+CD25+制御性Ｔ細胞（OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞）の効果をIn vivoにて検討した(図２５)。OVA抗原によるアレルギー性鼻炎モデルマウスにOVA抗原特異的制御性Ｔ細胞を投与した。 Suppression of symptoms by regulatory T cells
The effect of CD4 + CD25 + regulatory T cells (OVA antigen-specific regulatory T cells) induced by CD40-CD86-knockdown OVA B cells was examined in vivo (FIG. 25). OVA antigen-specific regulatory T cells were administered to model mice with allergic rhinitis caused by OVA antigen.

即ち、以下の３群を作製して、比較検討した。   That is, the following three groups were prepared and compared.

（１）抗原特異的制御性Ｔ細胞（CD4+CD25+Ｔ細胞）を投与した群。この群はCD40-CD86-ノックダウンOVA Ｂ細胞に誘導されたCD4+CD25+Ｔ細胞を投与した群であり、図２５においては「CD4+CD25+」と表記されている。 (1) A group administered with antigen-specific regulatory T cells (CD4 + CD25 + T cells). This group is a group to which CD4 + CD25 + T cells induced by CD40-CD86-knockdown OVA B cells were administered, and is represented as “CD4 + CD25 + ” in FIG.

（２）CD4＋CD25-Ｔ細胞を投与した群。この群はScrambled siRNA感作Ｂ細胞に誘導されたCD4＋CD25-Ｔ細胞を投与したコントロール群であって、図２５においては「CD4＋CD25-」と表記されている。 (2) A group to which CD4 + CD25 − T cells were administered. This group is a control group to which CD4 + CD25 − T cells induced by Scrambled siRNA-sensitized B cells were administered, and is represented as “CD4 + CD25 − ” in FIG.

（３）PBSのみを投与したコントロール群。この群は図２５において「PBS alone」と表記されている。   (3) A control group to which only PBS was administered. This group is labeled “PBS alone” in FIG.

その結果、OVA抗原特異的制御性Ｔ細胞は、他のコントロール２群と比べて、アレルギー性鼻炎モデルマウスの血中OVA特異的IgE抗体を有意に抑制した（図２５）。   As a result, OVA antigen-specific regulatory T cells significantly suppressed blood OVA-specific IgE antibodies in allergic rhinitis model mice as compared to the other two control groups (FIG. 25).

本発明により、siRNA、抗原提示細胞及び制御性Ｔ細胞の新規で有用な利用手段が提供される。   The present invention provides a novel and useful means of using siRNA, antigen-presenting cells and regulatory T cells.

Claims (12)

siRNAで修飾された抗原提示細胞（siRNA修飾APC）である修飾APC。 Modified APC, which is an antigen-presenting cell modified with siRNA (siRNA-modified APC). siRNAで修飾されると共に抗原を感作された抗原提示細胞（siRNA修飾・抗原感作APC）である修飾APC。 A modified APC that is an antigen presenting cell (siRNA modified / antigen sensitized APC) that has been modified with siRNA and sensitized with antigen. 前記抗原提示細胞が樹状細胞又はＢ細胞である請求項１又は請求項２に記載の修飾APC。 The modified APC according to claim 1 or 2, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell or a B cell. 前記siRNAが抗原提示細胞とＴ細胞との相互作用に関与する遺伝子に特異的なsiRNAである請求項１〜請求項３のいずれかに記載の修飾APC。 The modified APC according to any one of claims 1 to 3, wherein the siRNA is a siRNA specific to a gene involved in an interaction between an antigen-presenting cell and a T cell. 請求項２〜請求項４のいずれかに記載のsiRNA修飾・抗原感作APCを用いてナイーブＴ細胞から抗原特異的な制御性Ｔ細胞（抗原特異的Treg）を誘導するTreg誘導方法。 A Treg induction method for inducing antigen-specific regulatory T cells (antigen-specific Treg) from naive T cells using the siRNA-modified / antigen-sensitized APC according to any one of claims 2 to 4. 請求項５に記載のTreg誘導方法により得られる抗原特異的Treg。 Antigen-specific Treg obtained by the Treg induction method according to claim 5. 請求項６に記載の抗原特異的Tregを有効成分とする治療薬。 A therapeutic agent comprising the antigen-specific Treg according to claim 6 as an active ingredient. 請求項６に記載の抗原特異的Tregを抗体で増幅したものを有効成分とする治療薬。 Therapeutic agent which uses as an active ingredient what amplified the antigen-specific Treg of Claim 6 with the antibody. 請求項１、請求項３、請求項４のいずれかに記載のsiRNA修飾APCを用いてナイーブＴ細胞から抗原非特異的な制御性Ｔ細胞（抗原非特異的Treg）を誘導するTreg誘導方法。 A Treg induction method for inducing antigen-nonspecific regulatory T cells (antigen-nonspecific Treg) from naive T cells using the siRNA-modified APC according to any one of claims 1, 3, and 4. 請求項９に記載のTreg誘導方法により得られる抗原非特異的Treg。 Antigen-nonspecific Treg obtained by the Treg induction method according to claim 9. 請求項１０に記載の抗原非特異的Tregを有効成分とする治療薬。 The therapeutic agent which uses the antigen nonspecific Treg of Claim 10 as an active ingredient. 請求項６に記載の抗原特異的Treg又は請求項１０に記載の抗原非特異的Tregを用いて修飾された免疫細胞を有効成分とする治療薬。 A therapeutic agent comprising, as an active ingredient, an immune cell modified with the antigen-specific Treg according to claim 6 or the antigen-nonspecific Treg according to claim 10.
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