JP2013042697A - 変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質およびそれを用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】微生物由来のPHA結合タンパク質のN末端から20番目までのアミノ酸領域において1以上のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。特に、Aeromonas属微生物由来のPHA結合タンパク質のN末端から4番目のアミノ酸が置換される。また、該タンパク質をコードする遺伝子、及び、更にプロモーターとターミネーターを含む遺伝子発現カセットを提供する。更には該遺伝子又は該遺伝子発現カセットを微生物に導入して得られる形質転換微生物、及び、該形質転換微生物を用いたPHAの製造方法を提供する。
【選択図】なし
Description
(1)pBBR1phaPCJAcABRe
本プラスミドは、E.coliを宿主とした糖からのPHBホモポリマー合成および脂肪酸からのPHBH合成の両方に利用できるプラスミドである。Kichise等によって作製されたプラスミドpBSEE32phbAB(Kichise等,Appl.Env.Microbiol.,vol68,2411(2002))を制限酵素(HindIIIおよびXbaI)で処理することで調製した発現ユニットphaPCJAcABReを、制限酵素(HindIIIおよびXbaI)で切断した広域ベクターpBBR1MCS−2に挿入することで作製した。当該発現ユニットの上流にはA.caviae由来のプロモーター、および、E.coliでより転写活性の高いlacプロモーターが配置されている。その構造を図1に示す。
pBBR1phaPCJAcABReのA.caviae由来phaC(PHA合成酵素遺伝子)のD171位(171番目のアスパラギン酸)に対してPCRを用いた部位特異的ランダム変異導入(Nucleic Acids Res.,vol19,2785(1991))を行った後、BKLキット(タカラバイオ製)による平衡末端化、リン酸化及び自己ライゲーション反応を行った。PCRの条件を図2に示す。
(1)形質転換体の培養方法
実施例1において作製した4種類のプラスミド(pBBR1phaPCJAcABRe、pBBR1phaPCJAcABReD171L、pBBR1phaP(D4N)CJAcABReWT、pBBR1phaP(D4N)CJAcABReD171L)をE.coli LS5218に形質転換し、カナマイシン(50mg/L)を含むLB寒天培地に塗り広げ、37℃で一晩培養することでそれぞれの形質転換体を培養した。
上記(1)の培養液を250ml遠沈管に移し、振とうフラスコ内を適量のヘキサンで1回、純水で3回すすいだ。この洗液も遠沈管に加えて激しく撹拌した後、4℃、6000rpmで10min遠心分離し、上清を除いた。菌体ペレットを適量の純水で懸濁して激しく撹拌した後、4℃、6000rpmで10min遠心分離し、上清を除いた。ペレットを適量の純水(5ml未満)に懸濁し、風袋を秤量済みの5ml集菌チューブに移して凍結乾燥した。乾燥後のチューブを秤量することで乾燥菌体重量を得た。
(3−1)ガスクロマトグラフィー(GC)
培養菌体が合成したPHAの含有率とモノマー組成比は、ガスクロマトグラフィー(GC)を用いて内部標準法により求めた。この方法では、メタノリシス反応により生じた乾燥菌体内PHA分解物であるメチルエステルを測定する。
GC装置:ガスクロマトグラフGC−14B(島津製作所製)
キャピラリーカラム:100%メチルポリシロキサン無極性カラム1010−11143(架橋タイプ、内径 0.25mm × 30m、膜厚 0.4μm)(ジーエルサイエンス製)
検出器:水素炎イオン化検出器(FID)
オートインジェクタ:AOC−20iオートインジェクタ221−44527−30(島津製作所製)
オートサンプラ:AOC−20sオートサンプラ221−44880−30(島津製作所製)
解析装置:クロマトパックC−R7A plus(島津製作所製)
(GC測定条件)
GC測定条件を、表2および表3に示す。
pBBR1phaPCJAcABReのphaPのD4位(4番目のアスパラギン酸)に対してPCRを用いた部位特異的ランダム変異導入(Nucleic Acids Res.,vol19,2785(1991))を行った後、BKLキット(タカラバイオ製)による平衡末端化、リン酸化及び自己ライゲーション反応を行った。PCRの条件を図3に示す。次に自己ライゲーション反応液をE.coli JM109またはE.coli LS5218のコンピテントセルに形質転換することで種々のD171位の変異体を取得した。導入された変異は、当該プラスミドのphaPの塩基配列を決定することで解析した。
Claims (21)
- 微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のN末端から20番目までのアミノ酸領域において1以上のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
- 前記微生物がAeromonas属微生物である、請求項1に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、請求項2に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
- 前記Aeromonas属微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のN末端から4番目のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列を有する、請求項2又は3に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
- 前記Aeromonas属微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質のN末端から4番目のアミノ酸が、アスパラギン酸を除く19種類の天然アミノ酸の一つに置換されてなるアミノ酸配列を有する、請求項4に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
- 前記アスパラギン酸を除く19種類の天然アミノ酸が、非電荷の極性天然アミノ酸である、請求項5に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
- 前記非電荷の極性天然アミノ酸がアスパラギンである、請求項6に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
- 前記Aeromonas属微生物が、A.caviae、A.hydrophila、A.salmonicida、A.allosaccharophila、A.bestiarum、A.encheleia、A.enteropelogenes、A.eucrenophila、A.ichthiosmia、A.jandaei、A.media、A.popoffii、A.punctata、A.schubertti、A.sobria、又はA.trotaである、請求項2〜7のいずれか一項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
- 前記Aeromonas属微生物が、A.caviae又はA.hydrophilaである、請求項8に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
- 前記Aeromonas属微生物がA.caviaeである、請求項9に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質をコードする遺伝子。
- ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物において機能するプロモーター及びターミネーターと、請求項11に記載の遺伝子と、を含む、遺伝子発現カセット。
- 請求項11に記載の遺伝子又は請求項12に記載の遺伝子発現カセットをポリヒドロキシアルカン酸生産微生物に導入して得られる形質転換微生物。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、Aeromonas属、Alcaligenes属、Bacillus属、Chromobacterium属、Cupriavidus属、Escherichia属、Pseudomonas属、Rhodobacter属、又は、Rhodospirillum属に属する微生物である、請求項13に記載の形質転換微生物。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、Aeromonas caviae、A.hydrophila、Alcaligenes latus、Bacillus megaterium、Chromobacterium violaceum、Cupriavidus necator、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、P.putida、P.oleovorans、Rhodobacter sphaeroides、又は、Rhodospirillum rubrumに属する微生物である、請求項14に記載の形質転換微生物。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、C4〜C16のヒドロキシアルカン酸からなる群から選ばれる1以上のヒドロキシアルカン酸をモノマー単位として含むポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項13〜15のいずれか一項に記載の形質転換微生物。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、C4〜C16のヒドロキシアルカン酸からなる群から選ばれる2以上のヒドロキシアルカン酸をモノマー単位として含む共重合ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項16に記載の形質転換微生物。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物がポリヒドロキシ酪酸を生産する微生物である、請求項16に記載の形質転換微生物。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が3−ヒドロキシ酪酸をモノマー単位として含む共重合ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項17に記載の形質転換微生物。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物が、3−ヒドロキシ酪酸と3−ヒドロキシヘキサン酸をモノマー単位として含む共重合ポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物である、請求項19に記載の形質転換微生物。
- 請求項13〜20のいずれか一項に記載の形質転換微生物を培養してポリヒドロキシアルカン酸を発酵生産する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
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