JP2013040148A - Sialyloligosaccharide peptide immobilization bead - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アミノ基でビーズと結合した糖ペプチドに関する The present invention relates to glycopeptides bound to beads with amino groups
近年、生命分子として、ＤＮＡなどの核酸及びタンパク質に加え、糖鎖が注目されている。膜タンパク質や細胞外などに存在する糖鎖は、細胞間の認識及び相互作用に関わる働きを有すると考えられている。そして、細胞間の認識や相互作用における変化が癌、慢性疾患、感染症、及び老化などを引き起こす原因であると考えられている。例えば、癌化した細胞においては、糖鎖に構造変化が起こっていることが知られている。また、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。そこで、疾患時における生体中の糖鎖の構造変化を検出することができれば慢性疾患や感染症の有用な診断につながるものと考えられる。 In recent years, sugar chains have attracted attention as biomolecules in addition to nucleic acids such as DNA and proteins. Membrane proteins and sugar chains existing outside the cell are considered to have functions related to recognition and interaction between cells. And it is considered that changes in recognition and interaction between cells cause cancer, chronic diseases, infectious diseases, and aging. For example, it is known that structural changes occur in sugar chains in cancerous cells. In addition, pathogenic viruses such as influenza viruses are known to invade and infect cells by recognizing and binding to a specific sugar chain. Therefore, if it is possible to detect a structural change of a sugar chain in a living body at the time of a disease, it is considered to lead to a useful diagnosis of a chronic disease or an infectious disease.
鶏卵卵黄から抽出精製されるシアリルオリゴ糖ペプチドは、その糖鎖構造がヒト型であること、またウイルス感染における受容体と同一の糖鎖構造を有することから、これまでサルモネラ菌やインフルエンザウイルスの感染阻害剤としての利用が検討された（非特許文献１、非特許文献２）。
Sialyl oligoglycopeptide extracted and purified from chicken egg yolk has a human sugar chain structure and has the same sugar chain structure as the receptor in viral infection, so far it has inhibited the infection of Salmonella and influenza viruses. The use as an agent was examined (Non-patent
ヒト型糖鎖結合タンパクと糖鎖との特異的相互作用を活用するために、糖鎖をビーズに固定することで、このバイオデバイスをウイルスやヒト型糖鎖結合タンパクの精製や吸着に用いることが期待される。しかし、シアリルオリゴ糖ペプチドのペプチド部分のアミノ基を用いてビーズと結合したものは開示されていない。 Use this biodevice for purification and adsorption of viruses and human-type glycan-binding proteins by immobilizing glycans to beads in order to utilize the specific interaction between human-type glycan-binding proteins and glycans. There is expected. However, there is no disclosure of a sialyloligosaccharide peptide that binds to beads using the amino group of the peptide portion.
本発明は、医療及び医薬品開発の分野において有効なリサーチツールを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an effective research tool in the fields of medical and pharmaceutical development.
本発明は、以下のとおりである。
[１]
下記式（１）で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合する糖ペプチド誘導体。
式（１）：
The present invention is as follows.
[1]
A glycopeptide derivative in which beads are bonded to at least one free amino group of Lys (lysine) residues of a glycopeptide represented by the following formula (1) via a linker.
Formula (1):
[２]
前記ビーズと結合したリンカーが下記式（２）で表されるリンカーである、[１]に記載の糖ペプチド誘導体。
式（２）：
[2]
The glycopeptide derivative according to [1], wherein the linker bound to the bead is a linker represented by the following formula (2).
Formula (2):
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、Ｘは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。）
[３]
前記ビーズと結合したリンカーが下記式（３）〜（７）で表されるリンカーである、[１]に記載の糖ペプチド誘導体。
式（３）：
(In the formula, (B) represents beads, and X represents a hydrocarbon having 4 to 14 carbon atoms.)
[3]
The glycopeptide derivative according to [1], wherein the linker bound to the beads is a linker represented by the following formulas (3) to (7).
Formula (3):
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、ｍは１〜８の整数を表す。）
式（４）：
(In the formula, (B) represents beads, and m represents an integer of 1 to 8.)
Formula (4):
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表し、ｎは１〜８の整数を表す。）
式（５）：
(In the formula, (B) represents beads, and n represents an integer of 1 to 8.)
Formula (5):
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
式（６）：
(In the formula, (B) represents beads.)
Formula (6):
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
式（７）：
(In the formula, (B) represents beads.)
Formula (7):
（式中、（Ｂ）は、ビーズを表す。）
[４]
前記糖ペプチドが、下記式（８）で表される構造である、[１]〜[３]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
式（８）：
(In the formula, (B) represents beads.)
[4]
The glycopeptide derivative according to any one of [1] to [3], wherein the glycopeptide has a structure represented by the following formula (8).
Formula (8):
[５]
前記ビーズがアガロースまたはセルロースである[１]〜[４]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
[６]
前記ビーズと結合したリンカーを前記遊離アミノ基に導入して糖ペプチド誘導体を得る導入工程を含む、[１]〜[５]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体の製造方法。
[７]
[１]〜[６]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体が、ビーズ表面に保持されている担体。
[８]
[１]〜[７]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体からなるヒト型糖鎖結合型タンパク質精製用担体。
[９]
[１]〜[７]のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体からなるウイルス吸着用担体。
[5]
The glycopeptide derivative according to any one of [1] to [4], wherein the beads are agarose or cellulose.
[6]
The method for producing a glycopeptide derivative according to any one of [1] to [5], comprising an introducing step of introducing a linker bonded to the bead into the free amino group to obtain a glycopeptide derivative.
[7]
[1] A carrier in which the glycopeptide derivative according to any one of [6] is held on a bead surface.
[8]
[1] A carrier for purifying a human sugar chain-binding protein, comprising the glycopeptide derivative according to any one of [7].
[9]
A carrier for adsorbing a virus comprising the glycopeptide derivative according to any one of [1] to [7].
本発明はヒト型糖鎖結合タンパクの精製や濃縮、あるいはウイルスを吸着するために用いる糖ペプチド固定化ビーズに関する。 The present invention relates to a glycopeptide-immobilized bead used for purification and concentration of a human-type sugar chain-binding protein or for adsorbing a virus.
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
（糖ペプチド誘導体）
本実施の形態の糖ペプチドは、下記式（１）で表される糖ペプチドのＬｙｓ(リジン)残基の遊離アミノ基のうち、少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合する糖ペプチド誘導体である（以下、単に、「糖ペプチド誘導体」と記載する場合がある。）。
式（１）：
Hereinafter, a mode for carrying out the present invention (hereinafter referred to as “the present embodiment”) will be described in detail. In addition, this invention is not limited to the following embodiment, It can implement by changing variously within the range of the summary.
(Glycopeptide derivatives)
The glycopeptide of the present embodiment is a saccharide in which beads are bound to at least one free amino group of Lys (lysine) residues of a glycopeptide represented by the following formula (1) via a linker. It is a peptide derivative (hereinafter sometimes simply referred to as “glycopeptide derivative”).
Formula (1):
式（１）で表される糖ペプチド（以下、単に、「糖ペプチド」と記載する場合がある。）の糖鎖の還元末端には、アミノ酸６残基からなるペプチド鎖がＡｓｎを介して結合している。Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。 A peptide chain consisting of 6 amino acid residues is bonded via Asn to the reducing end of the sugar chain of the glycopeptide represented by the formula (1) (hereinafter sometimes simply referred to as “glycopeptide”). doing. Lys, Val, Ala, Asn, and Thr are three letter codes for amino acids, meaning lysine, valine, alanine, asparagine, and threonine, respectively.
アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、ラセミ体などを含め、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。 The amino acid may be an L-amino acid or a D-amino acid, and may be a mixture of L-amino acid and D-amino acid in any ratio including a racemate. Preferably there is. Each amino acid may be a derivative equivalent to each amino acid.
上記式（１）で表される糖ペプチドは、ペプチド配列中に、２つのＬｙｓ残基を有する。Ｎ末端のＬｙｓ残基は、２つの遊離したアミノ基を有し、アスパラギン（Ａｓｎ）とスレオニン（Ｔｈｒ）に結合するＬｙｓ残基は、１つの遊離アミノ基を有する。 The glycopeptide represented by the above formula (1) has two Lys residues in the peptide sequence. The N-terminal Lys residue has two free amino groups, and the Lys residue that binds to asparagine (Asn) and threonine (Thr) has one free amino group.
すなわち、式（１）で表される糖ペプチドにおいて、Ｌｙｓ残基の遊離アミノ基は、下記構造における−ＮＨ2のいずれかとして存在している。 That is, in the glycopeptide represented by the formula (1), the free amino group of the Lys residue exists as any of —NH 2 in the following structure.
したがって、本実施の形態の糖ペプチド誘導体においては、Ｌｙｓ残基に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つの遊離アミノ基にリンカーを介してビーズが結合している。
式（１）で表される糖ペプチドとしては、下記式（１０）で表される構造であることが好ましい。
式（１０）：
Therefore, in the glycopeptide derivative of the present embodiment, beads are bound to at least one free amino group out of a total of three free amino groups derived from the Lys residue via a linker.
The glycopeptide represented by the formula (1) preferably has a structure represented by the following formula (10).
Formula (10):
本実施の形態の糖ペプチド誘導体においては、下記式（１１）で表される糖ペプチド誘導体として、少なくとも一つのＲがリンカーを介したビーズであることが好ましい。
式（１１）：
In the glycopeptide derivative of the present embodiment, as the glycopeptide derivative represented by the following formula (11), at least one R is preferably a bead through a linker.
Formula (11):
式（１１）で表される構造において、Ｒが全てＨ（水素原子）である場合には、本実施の形態における好適な形態としての糖ペプチドを意味する。 In the structure represented by the formula (11), when all R are H (hydrogen atom), it means a glycopeptide as a preferred form in the present embodiment.
上記式で示されているように、糖ペプチドの糖鎖は、１１個の糖残基からなる２分岐複合型糖鎖であり、２ヶ所の非還元末端にシアル酸を有する。 As shown in the above formula, the sugar chain of the glycopeptide is a two-branch complex type sugar chain consisting of 11 sugar residues, and has sialic acid at two non-reducing ends.
例えば式（１１）で表される糖ペプチド誘導体において、Ｒの例として、下記に構造式を示す。（Ｂ）はビーズを表し、糖ペプチドのアミノ基がリンカーを介してビーズと結合している。
式（１２）
For example, in the glycopeptide derivative represented by the formula (11), the following structural formula is shown as an example of R. (B) represents a bead, in which the amino group of the glycopeptide is bound to the bead via a linker.
Formula (12)
ここでＸは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。
式（１３）
Here, X represents a hydrocarbon having 4 to 14 carbon atoms.
Formula (13)
ここでｍは１〜８の整数を表す。
式（１４）
Here, m represents an integer of 1 to 8.
Formula (14)
ここでｎは１〜８の整数を表す。
式（１５）
Here, n represents an integer of 1 to 8.
Formula (15)
本実施の形態の糖ペプチド固定化ビーズとしては、Ｎ末端Ｌｙｓ残基の構造として下記構造のいずれかであり得る。 The glycopeptide-immobilized beads of the present embodiment may have any of the following structures as the structure of the N-terminal Lys residue.
上記構造中、Ｒはリンカーを介して結合するビーズを表している。 In the above structure, R represents a bead bound through a linker.
本実施の形態の糖ペプチド誘導体としては、ペプチド鎖中で、Ａｓｎ残基とＴｈｒ残基に結合するＬｙｓ残基の構造として下記構造のいずれかであり得る。 The glycopeptide derivative of the present embodiment may have any of the following structures as the structure of the Lys residue that binds to the Asn residue and the Thr residue in the peptide chain.
上記構造中、Ｒはリジン残基の遊離アミノ基とリンカーを介して結合するビーズを表し、Ｒが、上記式（１２）〜式（１５）で表される構造であることが好ましい。 In said structure, R represents the bead couple | bonded via the linker with the free amino group of a lysine residue, and it is preferable that R is a structure represented by the said Formula (12)-Formula (15).
各構造におけるＲは、同一であっても、異なっていてもよい。
（糖ペプチド固定化ビーズの製造方法）
本実施の形態の糖ペプチド誘導体の製造方法は、下記式（１６）〜（１１）で表される、一端がビーズに結合し、他端が活性化された官能基を含むリンカーを、活性基により糖ペプチドのリジン残基の遊離アミノ基に導入する導入工程を含む。
R in each structure may be the same or different.
(Method for producing glycopeptide-immobilized beads)
The method for producing a glycopeptide derivative of the present embodiment includes a linker containing a functional group represented by the following formulas (16) to (11), one end bound to a bead and the other end activated. To introduce the free amino group of the lysine residue of the glycopeptide.
導入工程により、糖ペプチドがリンカーを介してビーズと結合した糖ペプチド誘導体を得ることができる。
（導入工程）
導入工程とは、ビーズに結合した活性化された官能基を糖ペプチドのペプチド部分に存在する３個の遊離アミノ基のうちの少なくとも１個の遊離アミノ基に導入する工程をいう。用いる活性基含有ビーズの量、反応液の種類、反応液のｐＨ、反応時間、反応温度などの反応条件を選択することにより、糖ペプチドの有する３個の遊離アミノ基に対し活性基含有リンカーを遊離アミノ基の１〜３ヶ所に導入することができる。
Through the introduction step, a glycopeptide derivative in which the glycopeptide is bound to the beads via a linker can be obtained.
(Introduction process)
The introduction step refers to a step of introducing an activated functional group bound to a bead into at least one free amino group out of three free amino groups present in the peptide portion of the glycopeptide. By selecting the reaction conditions such as the amount of active group-containing beads to be used, the type of reaction solution, the pH of the reaction solution, the reaction time, the reaction temperature, etc., the active group-containing linker is attached to the three free amino groups of the glycopeptide. It can introduce | transduce into 1-3 places of a free amino group.
本実施の形態において、「リンカーを介してビーズと結合する」とは、糖ペプチドにおけるリジン残基中の３ヶ所の遊離アミノ基の少なくとも一つが、リンカーを介してビーズと結合していることを意味する。ここで、ビーズとしてはアガロースやセルロースなどの天然物質が好ましく、水酸基を多く含むことで親水性が高ければこれらに限定されることはない。またビーズに結合したリンカーとしては、他端が遊離アミノ基と結合し得る能力を有するリンカーである事が好ましい。ここで糖ペプチドの遊離アミノ基と結合し得る部分が、リンカー内に存在していれば特に限定されるものでないが、ビーズに結合したリンカーは、リンカー全体として、炭素数２〜２０、好ましくは、炭素数１５以下のリンカーであることが好適である。一方、遊離アミノ基と結合しうる官能基としては、下式（１６）または（１７）で示されるN-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）が導入された基、下式（１８）で示されるエポキシが導入された基、更に下式（１９）で示されるブロモシアン(CNBr)で活性化されたイミド基などが好ましい。
式（１６）：
In the present embodiment, “binding to a bead via a linker” means that at least one of three free amino groups in a lysine residue in a glycopeptide is bonded to a bead via a linker. means. Here, the beads are preferably natural substances such as agarose and cellulose, and are not limited to these as long as they contain many hydroxyl groups and have high hydrophilicity. Further, the linker bonded to the beads is preferably a linker having the ability to bond the other end to a free amino group. Here, the portion capable of binding to the free amino group of the glycopeptide is not particularly limited as long as it exists in the linker. However, the linker bound to the bead has 2 to 20 carbon atoms as a whole, preferably A linker having 15 or less carbon atoms is preferred. On the other hand, examples of the functional group capable of binding to a free amino group include a group into which N-hydroxysuccinimide (NHS) represented by the following formula (16) or (17) is introduced, and an epoxy represented by the following formula (18). And an imide group activated with bromocyanide (CNBr) represented by the following formula (19) are preferred.
Formula (16):
ここでＢはビーズを表し、Ｘは炭素数４〜１４からなる炭化水素を表す。
式（１７）：
Here, B represents a bead and X represents a hydrocarbon having 4 to 14 carbon atoms.
Formula (17):
式（１８）： Formula (18):
式（１９）： Formula (19):
例えば上記式（１６）〜式（１９）で表されるビーズに結合したリンカーの官能基をペプチドの遊離アミノ基に導入する方法は、特に限定されないが、通常のペプチド合成に用いる縮合方法を用いればよい。 For example, the method for introducing the functional group of the linker bonded to the beads represented by the above formulas (16) to (19) into the free amino group of the peptide is not particularly limited, but a condensation method used for usual peptide synthesis is used. That's fine.
例えば、式（１６）又は式（１７）で表されるビーズに結合したリンカーのカルボン酸の、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドなどの活性エステルを用いた場合、必要に応じて、当該活性エステルを溶解できるアセトン、アセトニトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒と水との混合溶媒中、あるいは水溶液中で有機アミンなどの有機塩基、炭酸水素ナトリウム、リン酸緩衝液又は炭酸緩衝液などの無機塩基の存在下、氷冷下もしくは室温下で１５分〜１日、糖ペプチドと反応させてもよい。 For example, when an active ester such as N-hydroxysuccinimide of a linker carboxylic acid bonded to a bead represented by formula (16) or formula (17) is used, the active ester is dissolved as necessary. Inorganic solvents such as organic bases such as organic amines, sodium bicarbonate, phosphate buffer or carbonate buffer in a mixed solvent of water and organic solvent such as acetone, acetononitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, or aqueous solution You may make it react with glycopeptide in presence of a base under ice-cooling or room temperature for 15 minutes-1 day.
本実施の形態の糖ペプチド固定化ビーズ製造において、導入工程におけるビーズの有する官能基をペプチドの遊離アミノ基に導入後、過剰の官能基を無効化するために50mMのモノエタノールアミン等を添加する工程をさらに含んでいてもよい。 In the production of the glycopeptide-immobilized beads of the present embodiment, after introducing the functional group of the bead in the introduction step into the free amino group of the peptide, 50 mM monoethanolamine or the like is added to invalidate the excess functional group A process may be further included.
インフルエンザウイルス表面には、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼが存在する。インフルエンザウイルスは、これらのたんぱく質の種類の違いによって鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１型を含む１４４の亜種に分類されている。インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス表面たんぱく質であるヘマグルチニンが細胞表面のシアル酸含有糖鎖を受容体として認識して結合することによって開始される。ヒトインフルエンザウイルスはＮ−アセチルノイラミン酸−α−２，６−ガラクトースを有する糖鎖に対し高い結合親和性を示す。このことから、本実施の形態における糖ペプチド固定化ビーズはインフルエンザウイルスとの親和性が強く、低濃度のインフルエンザウイルス液であっても濃縮効果が期待され、高感度分析を可能にすることが期待される。また本実施の形態におけるビーズによればヒト型インフルエンザウイルス除去効果が期待される。 Hemagglutinin and neuraminidase are present on the surface of the influenza virus. Influenza viruses are classified into 144 subtypes including the avian influenza virus H5N1 type by the difference in the types of these proteins. Infection of influenza virus into host cells is initiated by hemagglutinin, a virus surface protein, which recognizes and binds to the cell surface sialic acid-containing sugar chains as receptors. Human influenza virus shows high binding affinity for sugar chains having N-acetylneuraminic acid-α-2,6-galactose. Therefore, the glycopeptide-immobilized beads in the present embodiment have a strong affinity for influenza virus, and are expected to have a concentration effect even with a low concentration of influenza virus solution, enabling high-sensitivity analysis. Is done. Moreover, according to the beads in the present embodiment, a human influenza virus removal effect is expected.
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施の形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。 Hereinafter, the present embodiment will be described more specifically with reference to examples and comparative examples, but the present embodiment is not limited to only these examples. In addition, the measuring method used for this Embodiment is as follows.
［ＨＰＬＣ分析］
糖ペプチドの分析例
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件（製造例１）：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
[HPLC analysis]
Analysis example of glycopeptide HPLC analysis was performed under the following measurement conditions using a GL Science HPLC GL-7400 system equipped with a column (Cadenza CD-C18 (Imtakt, 150 × 2 mm)).
Measurement conditions (Production Example 1):
Gradient: 2% → 17% (15 min), CH 3 CN in aquase 0.1% TFA solution
Flow rate: 0.3 mL / min
UV; 214 nm
［1Ｈ−ＮＭＲ測定］
糖ペプチドの分析例
Ｄ2Ｏ ０．４ｍＬに試料 ２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で1Ｈ−ＮＭＲを測定した。
[ 1 H-NMR measurement]
Analysis example of
［製造例１］鶏卵卵黄からの糖ペプチドの製造
鶏卵卵黄１０個にエタノール３５０ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を３回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄１５０ｇを得た。
[Production Example 1] Production of glycopeptide from chicken egg yolk 350 mL of ethanol was added to 10 chicken egg yolks and stirred well. Centrifugation was performed at 8,000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was removed by decantation to obtain a precipitate. The operation of adding 300 mL of ethanol to the obtained precipitate, stirring well, centrifuging, and removing the supernatant was repeated three times to obtain 150 g of defatted egg yolk as a precipitate.
得られた脱脂卵黄１５０ｇに水２００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水１００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、１００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール７００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド１．５８ｇを得た。 To 150 g of the obtained defatted egg yolk, 200 mL of water was added and stirred well. Centrifugation was performed at 8,000 rpm for 20 minutes, and a supernatant was obtained by decantation. The operation of adding 100 mL of water to the precipitate obtained by decantation, stirring well, centrifuging, and collecting the supernatant was repeated three times. The collected supernatant was filtered through a glass filter and concentrated under reduced pressure to 100 mL. Thereafter, the obtained concentrated solution was poured into 700 mL of ethanol, and the resulting precipitate was centrifuged at 8,000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was removed by decantation. The resulting precipitate was dissolved in water and poured again into ethanol. This operation was repeated three times. By collecting the resulting precipitate, 1.58 g of a crude purified glycopeptide was obtained.
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド１．５ｇを水５ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで１１７ｍｇの糖ペプチドを得た。 A glass column was filled with 25 g of silica gel resin Wakogel (100C18) as an ODS resin, and the resin was washed with methanol and then replaced with water. Crude purified glycopeptide 1.5 g was dissolved in 5 mL of water and added to the resin after replacement with water. The resin to which the crude purified glycopeptide was added was washed with 100 mL of water, and then the glycopeptide was eluted with a 2% aqueous acetonitrile solution. The eluate was freeze-dried to obtain 117 mg of glycopeptide.
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ及び1Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図１及び２に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により上記式（４）で表される構造であることが分かった。 The measurement results by HPLC and 1 H-NMR of the obtained glycopeptide are shown in FIGS. 1 and 2, respectively. The purity by HPLC was 95%. The obtained glycopeptide was found to have a structure represented by the above formula (4) by comparison with a standard product (manufactured by Tokyo Chemical Industry).
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。得られた糖ペプチド５０ｍｇを水１ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に再度添加した。糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで３０ｍｇの糖ペプチドを得た。 A glass column was filled with 25 g of silica gel resin Wakogel (100C18) as an ODS resin, and the resin was washed with methanol and then replaced with water. 50 mg of the obtained glycopeptide was dissolved in 1 mL of water and added again to the resin after replacement with water. After washing the resin to which the glycopeptide was added with 100 mL of water, the glycopeptide was eluted with a 2% acetonitrile aqueous solution. The eluate was freeze-dried to obtain 30 mg of glycopeptide.
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。ＨＰＬＣによる純度では９９％であった。 The measurement result by HPLC of the obtained glycopeptide is shown in FIG. The purity by HPLC was 99%.
［実施例１］糖ペプチド固定化ビーズの製造
ＮＨＳ(N-hydroxy-succinimide)−activated Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア製）ゲルを１．４ｍＬ計り取り、次に氷冷した1mM塩酸水溶液１０ｍＬで洗浄した。その後、０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液でゲルを洗浄した。
[Example 1] Production of glycopeptide-immobilized beads 1.4 mL of NHS (N-hydroxy-succinimide) -activated
次に製造例１で得た糖ペプチド１０．０ｍｇを０．９ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液に溶解しゲルに加え４℃で終夜静置した。次に８ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液にてゲルを洗浄し、次に８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液にてゲルを洗浄した。次に、６ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加え４℃で終夜静置した。
Next, 10.0 mg of the glycopeptide obtained in Production Example 1 was dissolved in 0.9 mL of 0.2
次いで上記ゲルを、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの蒸留水、そして１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃で保存した。 The gel was then washed with 10 mL 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl aqueous solution, 10 mL 0.5 M monoethanolamine, 10 mL 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl aqueous solution, 10 mL distilled water, and 10 mL PBS. Washed and stored at 4 ° C.
[実施例２]コントロールビーズの製造
ＮＨＳ(N-hydroxy-succinimide)−activated Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア製）ゲルを２ｍＬ計り取り、次に氷冷した1mM塩酸水溶液１０ｍＬで洗浄した。その後、０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液でゲルを洗浄した。
[Example 2] Manufacture of
次に８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液にてゲルを洗浄した。次に、６ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加え４℃で終夜静置した。 Next, the gel was washed with 8 mL of 0.1 M sodium acetate and 0.5 M NaCl aqueous solution. Next, 6 mL of 0.5 M monoethanolamine and 0.5 M NaCl aqueous solution were added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight.
次いで上記ゲルを、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの蒸留水、そして１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃で保存し比較対照ゲルとした。 The gel was then washed with 10 mL 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl aqueous solution, 10 mL 0.5 M monoethanolamine, 10 mL 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl aqueous solution, 10 mL distilled water, and 10 mL PBS. Washed and stored at 4 ° C. as a comparative gel.
［実施例３］糖ペプチド固定化ビーズの製造
ＣＮＢｒ−activated SepharoseTM 4 Fast Flow（GEヘルスケア製）ゲルを１．０ｇ計り取り、次に氷冷した1mM塩酸水溶液５０ｍＬを加え膨潤させた後、静置しその後、上清を除去した。その後、氷冷した1mM塩酸水溶液５０ｍＬを加え、静置し上清を除去した。この操作を繰り返すことでゲルを洗浄した。
[Example 3] Production of glycopeptide-immobilized beads 1.0 g of CNBr-activated
次に製造例１で得た糖ペプチド１０．０ｍｇを０．９ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液に溶解しゲルに加え４℃で終夜静置した。次に８ｍＬの０．２Ｍ NaHCO3, 0.5M NaCl水溶液にてゲルを洗浄し、次に８ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液にてゲルを洗浄した。次に、６ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、０．５ＭＮａＣｌ水溶液を加え４℃で終夜静置した。
Next, 10.0 mg of the glycopeptide obtained in Production Example 1 was dissolved in 0.9 mL of 0.2
次いで上記ゲルを、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、１０ｍＬの０．５Ｍモノエタノールアミン、１０ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ水溶液、そして１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４℃で保存した。 The gel was then washed with 10 mL 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl aqueous solution, 10 mL 0.5 M monoethanolamine, 10 mL 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl aqueous solution, and 10 mL PBS, Saved with.
[実施例４]レクチンとの反応
上記実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズ２１６ｍｇおよび比較対照ゲル２２５ｍｇ秤量した。それぞれのゲルに、それぞれのゲルに、１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したJ-OILMILLS製Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＳＡ（Sambucus sieboldiana Biotin conjugated）０．５ｍＬを加え４℃で終夜静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ビオチンが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。
[Example 4] Reaction with lectin 216 mg of the glycopeptide-immobilized beads obtained in Example 1 and 225 mg of a comparative control gel were weighed. To each gel was added 0.5 mL of J-OILMILLS Biotin-SSA (Sambucus sieboldiana Biotin conjugated), diluted with PBS to 10 μg / mL, and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Thereafter, the tube containing each sample was centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes to precipitate beads bound with glycopeptide-biotin, and the supernatant was removed. Thereafter, 500 μL of PBS was added to the precipitate, stirred, centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed to wash the beads. This operation was repeated 4 times.
沈殿したビーズに対し、６．２５ｘ１０-2μｇ／ｍＬとなるように希釈したStreptavidin-HRP（Peroxidase-conjugated Streptavidin, Jackson ImmunoResearch Laboratories 製）溶液を０．７５ｍL加えて室温下２時間静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ビオチン−ストレプトアビジン−ＨＲＰが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。 0.75 mL of Streptavidin-HRP (Peroxidase-conjugated Streptavidin, manufactured by Jackson ImmunoResearch Laboratories) solution diluted to 6.25 × 10 −2 μg / mL was added to the precipitated beads, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. Thereafter, the tube containing each sample was centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes to precipitate beads bound with glycopeptide-biotin-streptavidin-HRP, and the supernatant was removed. Thereafter, 500 μL of PBS was added to the precipitate, stirred, centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed to wash the beads. This operation was repeated 4 times.
沈殿したビーズに対しクエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)及び過酸化水素水を加えて調製した発色基質溶液を加え発色させ、その後１Ｎ ＨＣｌを添加することで反応を停止させ、８，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を９６穴プレートに移し、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図４に示す。 A colored substrate solution prepared by adding citrate phosphate buffer, orthophenylenediamine (OPD) and aqueous hydrogen peroxide is added to the precipitated beads to develop color, and then the reaction is stopped by adding 1N HCl. 8 The supernatant was transferred to a 96-well plate, and the absorbance at 490 nm was measured with a plate reader. The result is shown in FIG.
その結果、実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズと反応させた群は、比較対照群に比べて有意にＳＳＡとの結合能が高いことが確認された。このことから糖ペプチド誘導体と結合したビーズはその特異性がＮｅｕ５Ａｃ(α２−６)Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃであると報告されているレクチンＳＳＡ(Sambucus sieboldiana)と結合している可能性が示唆された。更にリンカーを介して糖ペプチドと結合したビーズはヒト型インフルエンザＡウイルスと結合する可能性が示唆された。 As a result, it was confirmed that the group reacted with the glycopeptide-immobilized beads obtained in Example 1 had significantly higher binding ability to SSA than the control group. This suggests that the beads bound to the glycopeptide derivative may be bound to lectin SSA (Sambucus sieboldiana) whose specificity is reported to be Neu5Ac (α2-6) Gal / GalNAc. Furthermore, it was suggested that beads bound to a glycopeptide via a linker may bind to human influenza A virus.
［実施例５］ヘマグルチニンとの反応
上記実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズ２２３ｍｇおよび比較対照ゲル２３０ｍｇ秤量した。それぞれのゲルに、ＰＢＳで希釈したアブカム（ａｂｃａｍ）製Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｈ１ ｐｒｏｔｅｉｎ(ＨＡと表記する)の５μｇ／ｍＬ溶液を５００μＬ加え４℃で終夜静置した。
[Example 5] Reaction with hemagglutinin 223 mg of the glycopeptide-immobilized beads obtained in Example 1 and 230 mg of a comparative control gel were weighed. To each gel, 500 μL of 5 μg / mL solution of Recombinant Influenza A virus Hemagglutinin H1 protein (abbreviated as HA) diluted with PBS was added and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。 Thereafter, the tube containing each sample was centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes to precipitate beads bound with glycopeptide-HA, and the supernatant was removed. Thereafter, 500 μL of PBS was added to the precipitate, stirred, centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed to wash the beads. This operation was repeated 4 times.
沈殿したビーズに対し、アブカム（ａｂｃａｍ）製の抗ＨＡ−マウスＩｇＧモノクローナル抗体５０μｇ／ｍＬ溶液を２５０μＬ加え室温で１時間静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡ−抗ＨＡマウス抗体が結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。 To the precipitated beads, 250 μL of 50 μg / mL anti-HA-mouse IgG monoclonal antibody manufactured by Abcam was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, the tube containing each sample was centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes to precipitate beads bound with glycopeptide-HA-anti-HA mouse antibody, and the supernatant was removed. Thereafter, 500 μL of PBS was added to the precipitate, stirred, centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed to wash the beads. This operation was repeated 4 times.
沈殿したビーズに対し、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ−ウサギポリクローナル抗体０．２５μｇ／ｍＬ溶液をチューブに４５０μＬ加え室温で１時間静置した。その後各サンプルの入ったチューブを８，０００ｒｐｍで５分間遠心することで糖ペプチド−ＨＡ−抗ＨＡマウス抗体−抗マウス抗体ウサギ抗体−ＨＲＰが結合したビーズを沈殿させ上清を除去した。その後沈殿に５００μＬのＰＢＳを加え撹拌し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、さらに上清を除去することでビーズを洗浄した。この操作を４回繰り返した。 To the precipitated beads, 450 μL of 0.25 μg / mL solution of HRP-labeled anti-mouse IgG-rabbit polyclonal antibody was added to the tube and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, the tube containing each sample was centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes to precipitate beads bound with glycopeptide-HA-anti-HA mouse antibody-anti-mouse antibody rabbit antibody-HRP, and the supernatant was removed. Thereafter, 500 μL of PBS was added to the precipitate, stirred, centrifuged at 8,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed to wash the beads. This operation was repeated 4 times.
このビーズに対しクエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)及び過酸化水素水を加えて調製した発色基質溶液を加え発色させ、その後１Ｎ ＨＣｌを添加することで反応を停止させ、８，０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を９６穴プレートに移し、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図５に示す。 To this bead, a chromogenic substrate solution prepared by adding citrate phosphate buffer, orthophenylenediamine (OPD) and hydrogen peroxide solution was added to cause color development, and then the reaction was stopped by adding 1N HCl. After centrifugation at 000 rpm for 3 minutes, the supernatant was transferred to a 96-well plate, and the absorbance at 490 nm was measured with a plate reader. The result is shown in FIG.
その結果、実施例１で得られた糖ペプチド固定化ビーズと反応させた群は、ＨＡとの結合に関して、比較対照群に比べて有意に結合能が高いことが確認された。このことからリンカーを介して糖ペプチドと結合したビーズはヒト型インフルエンザＡウイルスと結合している可能性が示唆された。 As a result, it was confirmed that the group reacted with the glycopeptide-immobilized beads obtained in Example 1 has significantly higher binding ability than the comparative control group in terms of binding to HA. From this, it was suggested that beads bound to a glycopeptide via a linker may be bound to human influenza A virus.
本発明の糖ペプチド誘導体は、ヒト型糖鎖結合タンパクの精製や濃縮、あるいはウイルスを吸着するために有効な手段として産業上の利用可能性を有する。 The glycopeptide derivative of the present invention has industrial applicability as an effective means for purifying and concentrating human-type sugar chain binding proteins or adsorbing viruses.
Claims (9)
式（１）：
Formula (1):
式（２）：
The glycopeptide derivative according to claim 1, wherein the linker bound to the bead is a linker represented by the following formula (2).
Formula (2):
式（３）：
式（４）：
式（５）：
式（６）：
式（７）：
The glycopeptide derivative according to claim 1, wherein the linker bound to the beads is a linker represented by the following formulas (3) to (7).
Formula (3):
Formula (4):
Formula (5):
Formula (6):
Formula (7):
式（８）：
Formula (8):
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