JP2013034459A - Natural killer t cell and method for acquiring the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するナチュラルキラーＴ細胞およびその取得方法に関する。 The present invention relates to a natural killer T cell involved in the development of nonalcoholic steatohepatitis and a method for obtaining the same.
現在、非アルコール性脂肪性肝疾患(non-alcoholic fatty liver disease:ＮＡＦＬＤ)および非アルコール性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis:ＮＡＳＨ)は、メタボリックシンドローム罹患人口の増大に加え、その疾患の重篤性から臨床的・社会的な問題として注目を集めている。ＮＡＳＨに関しては、その疾患概念が病理診断所見から生まれた概念であるため、病理所見の変化については臨床一般にコンセンサスが得られているものの、分子病態機構についての詳細は未だ明らかになっておらず、効果的な治療法や診断法は未だ確立されていないのが現状である。 Currently, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH) are not only an increase in the population affected by metabolic syndrome, but also the severity of the disease. It is attracting attention as a clinical and social problem due to its sex. Regarding NASH, the disease concept is a concept born from the pathological diagnosis findings, so although consensus has been obtained in general about changes in pathological findings, details about the molecular pathological mechanism have not yet been clarified, At present, effective treatments and diagnostic methods have not yet been established.
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）とＴ細胞の両方の特性を有した、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞に次ぐ第４のリンパ球である(非特許文献１）。ＮＫＴ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（major histo- compatibility；ＭＨＣ）クラスIｂ分子に属するＣＤ１ｄにより提示される糖脂質や疎水性ペプチドを認識することが示され、生体内においてもＣＤ１ｄにより胸腺内ポジティブセレクションされていると考えられている。胸腺内分化したＮＫＴ細胞は成熟に伴って末梢に遊走し、脾臓、骨髄そして肝臓に比較的多く存在している。特に、肝臓においては肝臓に存在する単核球細胞のうち１０％〜２０％がＮＫＴ細胞として存在しており、肝免疫系を制御している。 Natural killer T cells (NKT cells) are the fourth lymphocytes after T cells, B cells, and NK cells, which have characteristics of both natural killer cells (NK cells) and T cells (Non-patent Document 1). ). NKT cells have been shown to recognize glycolipids and hydrophobic peptides presented by CD1d belonging to the major histo-compatibility (MHC) class Ib molecule, and in vivo also in the thymus by CD1d. It is thought to be positively selected. Intrathymic differentiated NKT cells migrate to the periphery as they mature, and are relatively abundant in the spleen, bone marrow, and liver. In particular, in the liver, 10% to 20% of mononuclear cells existing in the liver are present as NKT cells, and control the liver immune system.
ケモカインは、免疫細胞の遊走能力に特化したサイトカインの一群である。現在までにヒトでは約５０種類のケモカインとそれに複数対応する受容体が同定されており、生体内における免疫細胞の恒常的な局在・移動を厳密に制御している。また、この厳密な制御機構の破綻が多くの免疫性の疾患の発症、および進展に関与しており、その疾患における重要性が認知されている。
ケモカインＣＸＣＬ１６は、比較的最近同定されたケモカインの１つであり、樹状細胞、Ｂ細胞などの抗原提示細胞に加え、肝臓の類洞内皮細胞に発現していることが報告されている（非特許文献２）。ＣＸＣＬ１６は大変ユニークな機能性分子であり、一般的なケモカインと同様に可溶型ケモカインとして細胞遊走活性を有することに加えて、細胞の膜結合型ケモカインとしても発現し、細胞接着分子、抗原提示の際の共刺激分子、そしてスカベンジャー受容体としての機能することも報告（非特許文献３）されており、多機能性ケモカインとして知られている。
Chemokines are a group of cytokines that specialize in the ability of immune cells to migrate. To date, about 50 types of chemokines and a plurality of corresponding receptors have been identified in humans, and the constitutive localization and migration of immune cells in vivo are strictly controlled. Moreover, the failure of this strict control mechanism is involved in the onset and progression of many immune diseases, and its importance in the diseases is recognized.
The chemokine CXCL16 is one of relatively recently identified chemokines and has been reported to be expressed in hepatic sinusoidal endothelial cells in addition to antigen-presenting cells such as dendritic cells and B cells (non-) Patent Document 2). CXCL16 is a very unique functional molecule. In addition to having a cell migration activity as a soluble chemokine as well as a general chemokine, CXCL16 is also expressed as a membrane-bound chemokine of a cell. It is also reported that it functions as a costimulatory molecule and a scavenger receptor (Non-patent Document 3), and is known as a multifunctional chemokine.
肝臓において、類洞内皮細胞は恒常的にＣＸＣＬ１６を発現し、肝細胞では炎症時にＣＸＣＬ１６の発現が誘導される。特に、類洞内皮細胞に発現しているＣＸＣＬ１６は肝のＮＫＴ細胞を類洞内にトラップし、類洞内の免疫学的監視機構を行うために必須の分子であるとされている（非特許文献４）。
通常、ＮＫＴ細胞はα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）刺激に伴って迅速かつ大量のサイトカインを産生することから、生体免疫の制御細胞として機能すると考えられているが、ＣＸＣＬ１６欠損マウスでは、肝臓のＮＫＴ細胞数の減少に加え、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＴｈ１応答性が減弱している。また、ＣＸＣＬ１６の受容体ＣＸＣＲ６欠損マウスでも、同様に肝臓、肺におけるＮＫＴ細胞数の減少、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４産生能の低下が認められており、ＮＫＴ細胞の質および量の減弱が報告されている（非特許文献５）。
In the liver, sinusoidal endothelial cells constitutively express CXCL16, and hepatocytes induce CXCL16 expression during inflammation. In particular, CXCL16 expressed in sinusoidal endothelial cells is considered to be an essential molecule for trapping hepatic NKT cells in sinusoids and performing an immunological monitoring mechanism in sinusoids (non-patented). Reference 4).
In general, NKT cells are thought to function as regulatory cells for biological immunity because they produce rapid and large amounts of cytokines upon stimulation with α-galactosylceramide (α-GalCer), but in CXCL16-deficient mice, In addition to the decrease in the number of NKT cells, Th1 responsiveness by α-GalCer stimulation is attenuated. In addition, in CXCL16 receptor CXCR6-deficient mice, the number of NKT cells in the liver and lungs was similarly decreased, and the ability to produce IFN-γ and IL-4 by α-GalCer stimulation was also observed. A decrease in the amount has been reported (Non-patent Document 5).
本発明者らは、これまでケモカインによる種々疾病制御機構の解明を行ってきた。ケモカインは免疫細胞の動態を制御する一連のサイトカイン群であるため、特に炎症性疾患との関連性が強い。中でもＣＸＣＬ１６は、肝臓のｉＮＫＴ細胞の動態・機能制御を行うことで、肝免疫系の恒常性維持や肝炎症性疾患に関わっているが、ＣＸＣＬ１６と肝慢性炎症疾患であるＮＡＳＨとの直接的な関連性は全く報告がない。
本発明の課題は、ＮＡＳＨにおけるＣＸＣＬ１６の関与の検討を行い、新たにＮＡＳＨの治療薬や治療法の構築に有用なツールを提供することにある。
The present inventors have so far clarified various disease control mechanisms by chemokines. Since chemokines are a series of cytokines that control immune cell dynamics, they are particularly relevant to inflammatory diseases. Among them, CXCL16 is involved in maintaining the homeostasis of the liver immune system and liver inflammatory diseases by controlling the dynamics and functions of iNKT cells in the liver. However, CXCL16 is directly related to NASH, which is a chronic inflammatory disease of liver. No relevance has been reported.
An object of the present invention is to examine the involvement of CXCL16 in NASH, and to provide a tool useful for newly constructing a therapeutic drug or therapy for NASH.
本発明者らは、ＣＸＣＬ１６欠損マウスを用いたＮＡＳＨモデルの作製を行い、病理所見など臨床的な評価方法によってＮＡＳＨにおけるＣＸＣＬ１６の関与の検討した。さらに、ＣＸＣＬ１６と肝ｉＮＫＴ細胞の関係に着目し、ＮＡＳＨモデルマウスの肝ｉＮＫＴ細胞の動態・機能解析を行い、病態に寄与する可能性を検証した。加えて、解析したｉＮＫＴ細胞を介した病態形成機序を検証するために養子移植実験およびエキソビボ(ex vivo)での解析を行った結果、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するインバリアントナチュラルキラーＴ細胞を見出し、本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
The present inventors made a NASH model using CXCL16-deficient mice and examined the involvement of CXCL16 in NASH by clinical evaluation methods such as pathological findings. Furthermore, paying attention to the relationship between CXCL16 and hepatic iNKT cells, we analyzed the dynamics and functions of hepatic iNKT cells in NASH model mice to verify the possibility of contributing to the pathological condition. In addition, as a result of adoptive transplantation experiments and ex vivo (ex vivo) analysis to verify the pathogenesis mechanism through the iNKT cells analyzed, invariant natural involved in the development of nonalcoholic steatohepatitis A killer T cell was found and the present invention was completed.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物の肝臓から単離される肝臓単核球からのＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。より具体的には、本発明のナチュラルキラーＴ細胞は、肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物から単離される肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。 The present invention is a natural killer T cell characterized by enhancing TNF-α and IFN-γ production from liver mononuclear cells isolated from the liver of a non-alcoholic steatohepatitis model animal. More specifically, the natural killer T cells of the present invention can be obtained from TNF- from liver mononuclear cells isolated from a disease model animal of non-alcoholic steatohepatitis in which expression of chemokine CXCL16 in the liver is not reduced or expressed. It is a natural killer T cell characterized by enhancing α and IFN-γ production.
本発明のナチュラルキラーＴ細胞とは、Ｔ細胞受容体（T
cell receptor：ＴＣＲ）により、ＭＨＣクラスIｂ分子に属するＣＤ１ｄにより提示される糖脂質や疎水性ペプチドを認識し、さらに、肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。
The natural killer T cell of the present invention is a T cell receptor (T
Cell receptor (TCR) recognizes glycolipids and hydrophobic peptides presented by CD1d belonging to MHC class Ib molecules, and further enhances TNF-α and IFN-γ production from liver mononuclear cells It is a natural killer T cell.
本発明のナチュラルキラーＴ細胞は、例えば、以下の方法によって取得することができる。
（１）肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない病態モデル動物にコリン欠乏食などの脂肪肝を誘導する餌を摂食させる。
（２）病態モデル動物から肝臓を摘出する。
（３）摘出した肝臓から肝単核球を単離する。
（４）単離した肝単核球からにナチュラルキラーＴ細胞を分離する。
The natural killer T cell of the present invention can be obtained, for example, by the following method.
(1) A disease state model animal in which expression of chemokine CXCL16 in the liver is not reduced or expressed is fed a diet that induces fatty liver such as choline-deficient diet.
(2) The liver is removed from the disease model animal.
(3) Isolate hepatic mononuclear cells from the removed liver.
(4) Isolate natural killer T cells from isolated liver mononuclear cells.
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞により、ＮＡＳＨの初期病態（例えば、肝細胞への中性脂肪蓄積など）を誘導することができる。具体的には、例えば、肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞を養子移植することが挙げられる。この場合、例えば、レシピエントとしてＪα１８ノックアウトマウスなどのＮＫＴ細胞を欠損させたマウスを用いればよい。 The natural killer T cells that enhance TNF-α and IFN-γ production from the liver mononuclear cells of the present invention induce the initial pathology of NASH (eg, neutral fat accumulation in hepatocytes). can do. Specifically, for example, adoptive transplantation of natural killer T cells characterized by enhancing TNF-α and IFN-γ production from liver mononuclear cells can be mentioned. In this case, for example, a mouse deficient in NKT cells such as a Jα18 knockout mouse may be used as a recipient.
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞により、ＮＡＳＨにおける肝細胞への中性脂肪蓄積などの初期病態を誘導することができる。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ノックアウトマウスは、ＮＡＳＨの初期病態を誘導するモデル動物として、肝臓における異常免疫応答を基盤とする慢性炎症の研究に用いることができる。 The natural killer T cells characterized by enhancing the production of TNF-α and IFN-γ from liver mononuclear cells of the present invention can induce early pathological conditions such as neutral fat accumulation in hepatocytes in NASH. it can. In addition, the CDAA-fed CXCL16 knockout mouse can be used as a model animal for inducing an initial pathological condition of NASH for the study of chronic inflammation based on an abnormal immune response in the liver.
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞の取得に用いられる病態モデル動物として、肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしないマウス、ラットなどのげっ歯類が挙げられる。好ましいものとして、ケモカインＣＸＣＬ１６の発現が健常マウスの1/１００以下に低下しているマウス、ＣＸＣＬ１６欠損マウス、グルタミン酸ナトリウム誘発マウス（ＭＳＧマウス）などが挙げられる。 As a disease state model animal used for obtaining natural killer T cells characterized by enhancing TNF-α and IFN-γ production from liver mononuclear cells of the present invention, expression of chemokine CXCL16 in the liver is reduced or expressed. Examples include rodents such as mice and rats. Preferred examples include mice in which the expression of chemokine CXCL16 is reduced to 1/100 or less of healthy mice, CXCL16-deficient mice, and sodium glutamate-induced mice (MSG mice).
コリン欠乏食としては、例えば、コリン欠乏・Ｌ−アミノ酸規定食（Choline deficient
L-amino acid defined diet：ＣＤＡＡ)、メチオニン・コリン欠乏食（Methionine- and Choline
deficien diet：ＭＣＤ)などが挙げられるが、好ましいものとして、ＣＤＡＡが挙げられる。
コリン欠乏食を摂取させる期間としては、例えば、ＣＸＣＬ１６欠損マウスでは、１週間以上、好ましくは２週間以上である。
Examples of choline deficient diets include choline deficiency and L-amino acid diet (Choline deficient
L-amino acid defined diet (CDAA), Methionine- and Choline-deficient diet
deficien diet (MCD) and the like are preferable, and CDAA is preferable.
The period for ingesting the choline-deficient diet is, for example, 1 week or longer, preferably 2 weeks or longer in CXCL16-deficient mice.
肝単核球からにナチュラルキラーＴ細胞を分離するには、例えば、ＣＤ１ｄとβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）の複合体を蛍光色素のアロフイコシアニン（ＡＰＣ）やフィコエリスチン（ＰＥ）で標識されたストレプトアビジンにより４量体化した試薬（例えば、Ｃｄ１ｄ
Ｔｅｔｒａｍｅｒなど）で肝単核球を標識した後、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）などを用いて行えばよい。
To separate natural killer T cells from hepatic mononuclear cells, for example, a complex of CD1d and β2-microglobulin (β2m) is labeled with the fluorescent dyes allophycocyanin (APC) or phycoerythin (PE). Reagents tetramerized with prepared streptavidin (eg, Cd1d
After labeling hepatic mononuclear cells with Tetramer or the like, magnetic cell separation (MACS) or the like may be used.
以下、実施例で説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例１
＜コリン欠乏食食餌誘導性ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルの作製＞
（１）ＣＸＣＬ１６欠損マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウスバックグラウンドのＣＸＣＬ１６（ＳＲ−ＰＳＯＸ）欠損マウス（ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス）は、Ｊ. Immunol., 179, 8172-8179(2007)に記載の方法に準じて作製した。すなわち、定法に従い、ネオマイシン耐性遺伝子をコードしたターゲットベクターをエレクトロポレーション法によりＥＳ細胞に遺伝子導入し、ネオマイシン耐性株のうちＣＸＣＬ１６遺伝子欠損株をサザンブロット法にてスクリーニングすることで樹立した。
Hereinafter, although an Example demonstrates, this invention is not limited by these.
Example 1
<Preparation of choline-deficient diet-induced NAFLD / NASH model>
(1) CXCL16-deficient mouse BALB / c mouse background CXCL16 (SR-PSOX) -deficient mouse (CXCL16KO mouse) was prepared according to the method described in J. Immunol., 179, 8172-8179 (2007). That is, according to a conventional method, a target vector encoding a neomycin resistance gene was introduced into ES cells by electroporation, and among the neomycin resistance strains, the CXCL16 gene-deficient strain was screened by Southern blotting.
（２）動物飼育環境
野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス（wild
type:ＷＴマウス）およびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスは、富山大学和漢医薬学総合研究所病態生化学分野の動物飼育室にて飼育した。水および固形飼料は自由摂食とした。本実験は、国立大学法人富山大学動物実験取扱規則に基づき、動物実験委員会の承認後、動物倫理に十分配慮し行った。
(2) Animal breeding environment wild type BALB / c mouse (wild
type: WT mice) and CXCL16KO mice were bred in the animal breeding room of the Department of Pathology and Biochemistry, University of Toyama, Institute of Pharmaceutical Sciences, Wanhan. Water and chow were freely fed. This experiment was conducted with due consideration for animal ethics after approval by the Animal Experiment Committee based on the rules for handling animal experiments at the University of Toyama.
（３）コリン欠乏食食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウス
コリン欠乏食は、Choline
deficient L-amino acid defined diet (ＣＤＡＡ：Ｄｙｅｔｓ社製) を用い、４〜５週齢、雄性のＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスに２週間自由摂食させた。また、対照群として通常飼育食（Labo MR Stock, 日本農産工業製）を同様にＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの両マウスに摂食させた。
摂食開始から２週間後、マウスを犠牲死させ、血液、肝臓、脾臓、精巣上体部脂肪組織を採取した。血液は腹部下大静脈から採血をおこない、常温で1時間、４℃で一晩静置し、卓上遠心機にて４℃、３０００回転、２０分間遠心分離後、上清を血清サンプルとした。血清サンプルは解析に用いるまでディープフリーザー（−８０℃）内で保存した。肝臓は、一部ＲＴ−ＰＣＲ（後述）用サンプルとしてＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＲＮＡ ｌａｔｅｒ：キアゲン社）に浸けて解析に用いるまで−２０℃で保存した。また病理組織及び免疫染色用に１０ ％中性緩衝ホルマリン中にて４℃で保存した。精巣上体部脂肪組織は液体窒素にて瞬間凍結後、ディープフリーザーにて保管した。
(3) Choline-deficient diet CXCL16-deficient mouse choline-deficient diet
Using deficient L-amino acid defined diet (CDAA: manufactured by Dyets), 4 to 5 weeks old male WT mice and CXCL16KO mice were allowed to eat freely for 2 weeks. In addition, as a control group, a normal rearing food (Labo MR Stock, manufactured by Nippon Nosan Kogyo Co., Ltd.) was similarly fed to both WT mice and CXCL16KO mice.
Two weeks after the start of feeding, the mice were sacrificed, and blood, liver, spleen, and epididymal fat tissue were collected. The blood was collected from the abdominal inferior vena cava and allowed to stand at room temperature for 1 hour and at 4 ° C. overnight. After centrifugation at 4 ° C. and 3000 rpm for 20 minutes in a tabletop centrifuge, the supernatant was used as a serum sample. Serum samples were stored in a deep freezer (−80 ° C.) until used for analysis. The liver was partially immersed in RNA Stabilization Reagent (RNA later: Qiagen) as a sample for RT-PCR (described later) and stored at −20 ° C. until used for analysis. Further, it was stored at 4 ° C. in 10% neutral buffered formalin for pathological tissue and immunostaining. The epididymal adipose tissue was snap frozen in liquid nitrogen and stored in a deep freezer.
ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではわずか２週間のＣＤＡＡ食摂食により、脂肪肝に特徴的な強い白色性の肝臓肉眼所見（図１Ａ）および肝肥大を認めた（図１Ｂ）。 In CXCL16KO mice, a strong white liver macroscopic characteristic (FIG. 1A) and hepatic hypertrophy (FIG. 1B) characteristic of fatty liver were observed after feeding CDAA for only 2 weeks.
（４）肝臓の病理組織学的所見とその評価
ホルマリン固定した肝臓はパラフィン包埋し、４μｍの連続切片を作製した。薄切した組織サンプルはヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、病理組織像をもとに組織学的診断に供した。
ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの病理組織学的評価は、ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍに基づいてＮＡＦＬＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）を算出した（Hepatology, 41, 1313-1321(2005))。ＮＡＳ≧５をＮＡＳＨ、ＮＡＳ＞３をＮＡＳＨ進行性脂肪肝と判断した。
このスコアリングシステムは、脂肪沈着を０〜３、肝小葉の細胞浸潤を０〜３、そして肝細胞のｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ変性の程度を０〜２として段階評価し、その合計値をＮＡＳ値として、ＮＡＳ値＜３を除外診断、ＮＡＳ値≧５をＮＡＳＨと診断するものである。
(4) Histopathological findings and evaluation of liver The formalin-fixed liver was embedded in paraffin, and 4 μm serial sections were prepared. The sliced tissue samples were stained with hematoxylin and eosin (HE) and subjected to histological diagnosis based on histopathological images.
For histopathological evaluation of NAFLD / NASH, NAFLD Activity Score (NAS) was calculated based on NASH Clinical Network Scoring System (Hepatology, 41, 1313-1321 (2005)). NAS ≧ 5 was judged as NASH, and NAS> 3 was judged as NASH progressive fatty liver.
This scoring system is graded with 0 to 3 fat deposition, 0 to 3 cell infiltration of hepatic lobule, and 0 to 2 degree of hepatocyte balloning degeneration, and the total value is NAS value. <3 is an exclusion diagnosis, and NAS value ≧ 5 is diagnosed as NASH.
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスでは肝臓への著しい大滴性脂肪沈着を認め（図２Ａ）、さらに脂質構成成分として中性脂肪が有意に増加している（図２Ｂ）。 In CDAA-fed CXCL16KO mice, marked large lipid deposits were observed in the liver (FIG. 2A), and neutral fat as a lipid component was significantly increased (FIG. 2B).
ＣＤＡＡ食餌ＷＴではＮＡＳ値が３を越える個体が１匹も該当しなかったのに対し（平均ＮＡＳ値：２.４）、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＮＡＳ値が５以上の個体が全体の半数存在した（図２Ｃ）。 In the CDAA diet WT, none of the individuals with NAS values exceeding 3 was applicable (mean NAS value: 2.4), whereas in CDAA diet CXCL16KO mice, half of the individuals with NAS values of 5 or more were present. (FIG. 2C).
（５）肝臓組織中中性脂肪の定量
肝臓組織中中性脂肪の抽出はＦｏｌｃｈらの方法（J. Biol. Chem., 497-509(1987))を一部改変して行った。すなわち、１００ｍｇ〜２００ｍｇ肝臓に４ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）を加え、ガラスホモジナイザーでホモジナイズした後、ポリプロピレン製ファルコンチューブに移して、５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を１ｍＬ添加し、１分間ボルテックスした。室温、１５００×ｇ、１０分間遠心分離し、パスツールピペットを用いて下層のクロロホルム層を別のファルコンチューブに移した。さらに収量を増やすため、上層に１容のクロロホルムを加えて同様にボルッテクス、遠心分離した後、下層を先の下層と合わせた。合わせたクロロホルム層のうち、１００μＬに２０μＬのイソプロピルアルコール／トリトンＸ（９：１，ｖ／ｖ）を加え、ドラフト内で自然乾燥させた。乾燥したものをイソプロピルアルコール／トリトンＸ（９：１，ｖ／ｖ）に溶かし、トリグリセライドＥ−テストワコー （和光純薬工業製）を用い、単位肝重量当たりの中性脂肪量を算出した（図２Ｂ）。
(5) Quantification of neutral fat in liver tissue Extraction of neutral fat in liver tissue was performed by partially modifying the method of Folch et al. (J. Biol. Chem., 497-509 (1987)). Specifically, 4 mL of chloroform / methanol (2: 1, v / v) was added to 100 mg to 200 mg liver, homogenized with a glass homogenizer, transferred to a polypropylene falcon tube, 1 mL of 50 mM sodium chloride aqueous solution was added, and 1 minute Vortexed. Centrifugation was performed at room temperature, 1500 × g for 10 minutes, and the lower chloroform layer was transferred to another falcon tube using a Pasteur pipette. In order to further increase the yield, 1 volume of chloroform was added to the upper layer, vortexed and centrifuged in the same manner, and then the lower layer was combined with the previous lower layer. Of the combined chloroform layers, 20 μL of isopropyl alcohol / Triton X (9: 1, v / v) was added to 100 μL and air-dried in a fume hood. The dried product was dissolved in isopropyl alcohol / Triton X (9: 1, v / v), and triglyceride E-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used to calculate the amount of neutral fat per unit liver weight (Fig. 2B).
実施例２
＜コリン欠乏食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウスにおける肝ｉＮＫＴ細胞＞
（１）マウス肝単核球の単離
通常食またはＣＤＡＡ食を２週間摂食したＷＴおよびＣＸＣＬ１６欠損マウスの肝臓を温ハンクス平衡塩類液（Hanks' Balanced Salt Solutions：ＨＢＳＳ）にて還流後、摘出細断し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で洗いこみながらナイロンメッシュ 上でホモジナイズして細胞懸濁液を得た。４℃、２０００回転、１０分間の条件下で細胞懸濁液を遠心分離した後、細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁して、３３％Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア製）上に重層し、室温、２０００回転、３０分間の条件下、比重分離して単核球分画を得た。さらに、低張処理により赤血球を除去した。その後、細胞を１０％ＦＣＳ含有ＰＲＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１０６〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁した。
Example 2
<Liver iNKT cells in choline-deficient diet CXCL16-deficient mice>
(1) Isolation of mouse liver mononuclear cells The livers of WT and CXCL16-deficient mice fed with a normal diet or a CDAA diet for 2 weeks were refluxed with warm Hanks' Balanced Salt Solutions (HBSS) and then removed. The cell suspension was chopped and homogenized on a nylon mesh while washing with RPMI 1640 medium containing 10% FCS to obtain a cell suspension. After centrifuging the cell suspension under conditions of 4 ° C., 2,000 rpm for 10 minutes, the cells were resuspended in RPMI 1640 medium containing 10% FCS and overlaid on 33% Percoll (manufactured by GE Healthcare), A mononuclear cell fraction was obtained by specific gravity separation at room temperature, 2000 rpm, and 30 minutes. Furthermore, erythrocytes were removed by hypotonic treatment. Thereafter, the cells were washed twice with 10% FCS-containing RPMI 1640 medium and suspended in phosphate buffered saline (PBS) at a cell density of 10 6 to 10 7 cells / mL.
（２）ｉＮＫＴ細胞の単離
磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）用いて肝単核球からｉＮＫＴ細胞を単離した。ＭＡＣＳには Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のｍｉｎｉ ＭＡＣＳ ｋｉｔ（Ａｎｔｉ−ＰＥマイクロビーズ、ＭＳカラム、ＭＡＣＳセパレーター）を用いた。すなわち、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥ（ＭＢＬ社製）によりｉＮＫＴ細胞をラベルした後、ｉＮＫＴ細胞を８０μＬのＭＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳを脱気したもの）に懸濁し、Ａｎｔｉ−ＰＥマイクロビーズを２０μＬ添加した。氷上にて１５分間インキュベートした後、ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄して５００μＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、細胞懸濁液を調製した。ＭＡＣＳ ＭＳカラムをＭＡＣＳ緩衝液にてリンスした後、Ｍｉｎｉ ＭＡＣＳセパレーターを用いて調製した細胞懸濁液からｉＮＫＴ細胞をポジティブセレクションした。また純度を高めるために、２回ＭＳカラムに細胞を通し、純度が８０％以上のものを実験及び解析に用いた。さらに細胞洗浄による細胞の損失を抑えるため、一部セルローション（日本全薬工業製）を用いて細胞の洗浄を行った。
(2) Isolation of iNKT cells iNKT cells were isolated from hepatic mononuclear cells using magnetic cell separation (MACS). For MACS, mini MACS kit (Anti-PE microbeads, MS column, MACS separator) manufactured by Miltenyi Biotech was used. That is, after labeling iNKT cells with CD1d Tetramer-PE (manufactured by MBL), iNKT cells were suspended in 80 μL of MACS buffer (2% FCS, PBS degassed with 2 mM EDTA), and Anti-PE micro 20 μL of beads were added. After incubating on ice for 15 minutes, the cells were washed with MACS buffer and resuspended in 500 μL of MACS buffer to prepare a cell suspension. After rinsing the MACS MS column with MACS buffer, iNKT cells were positively selected from the cell suspension prepared using the Mini MACS separator. In order to increase the purity, the cells were passed twice through the MS column, and those having a purity of 80% or more were used for experiments and analyses. Furthermore, in order to suppress cell loss due to cell washing, cells were washed using a partial cell lotion (manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.).
（３）ｉＮＫＴ細胞ポピュレーションの解析
肝単核球（５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）を１.５ｍＬエッペンドルフチューブに分注し、卓上遠心機にて４℃、２０００回転、５分間遠心し、洗浄した。沈殿した細胞を５０μＬの２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ（ＦＣＭ緩衝液）に再懸濁した後、ＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体（クローン２.４Ｇ２）０.５ｍｇ／ｍＬを１μＬ添加し、氷上にて１０分間インキュベートした。ＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体によるＦｃ受容体のブロッキングの後、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥを１０ｍＬ添加し、室温にて３０分間インキュベートしてｉＮＫＴ細胞を蛍光標識した。続いて、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識抗マウスＣＤ３εモノクローナル抗体を加え、氷上にて３０分間インキュベートした。ＦＣＭ緩衝液を１ｍＬ加え、４℃、２０００回転、５分間遠心して洗浄し、３００μＬのＦＣＭ緩衝液に懸濁した後、フローサイトメーターを用いて細胞表面上の蛍光強度を解析した。
(3) Analysis of iNKT cell population Hepatic mononuclear cells (5 × 10 5 cells / 100 μL) are dispensed into 1.5 mL Eppendorf tubes, centrifuged at 4 ° C., 2000 rpm for 5 minutes, and washed. did. After resuspending the precipitated cells in 50 μL of PBS containing 2% FCS (FCM buffer), 1 μL of CD16 / CD32 monoclonal antibody (clone 2.4G2) 1 μL is added and incubated on ice for 10 minutes. did. After blocking the Fc receptor with the CD16 / CD32 monoclonal antibody, 10 mL of CD1d Tetramer-PE was added, and incubated at room temperature for 30 minutes to fluorescently label iNKT cells. Subsequently, PerCP-Cy5.5 labeled anti-mouse CD3ε monoclonal antibody was added and incubated on ice for 30 minutes. After adding 1 mL of FCM buffer and washing by centrifugation at 4 ° C., 2000 rpm for 5 minutes and suspending in 300 μL of FCM buffer, the fluorescence intensity on the cell surface was analyzed using a flow cytometer.
ＷＴではＣＤＡＡ食摂食による肝ｉＮＫＴ細胞比率の変化は認められなかったのに対し、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスでは通常食摂食時に比べて、ＣＤＡＡ食餌により肝ｉＮＫＴ細胞が２倍近く増加している（図３Ａ）。 In WT, there was no change in the liver iNKT cell ratio due to feeding with CDAA, whereas in the CXCL16KO mice, liver iNKT cells were increased almost twice as much by CDAA feeding compared to normal feeding (FIG. 3A). ).
（４）ｉＮＫＴ細胞のサブポピュレーションの解析
ｉＮＫＴ細胞ポピュレーション解析と同様に、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥにてｉＮＫＴ細胞を蛍光標識し、その後ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識抗マウスＣＤ４モノクローナルとＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８モノクローナル抗体を加え、氷上で30分間インキュベートした。続いて、磁気細胞分離法によりｉＮＫＴ細胞を単離し、フローサイトメーターを用いてｉＮＫＴ細胞のサブポピュレーションの解析を行った。
(4) Subpopulation analysis of iNKT cells As in the iNKT cell population analysis, iNKT cells are fluorescently labeled with CD1d Tetramer-PE, and then PerCP-Cy5.5-labeled anti-mouse CD4 monoclonal and FITC-labeled anti-mouse CD8. Monoclonal antibody was added and incubated on ice for 30 minutes. Subsequently, iNKT cells were isolated by magnetic cell separation, and the subpopulation of iNKT cells was analyzed using a flow cytometer.
ＷＴマウス、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスともＣＤＡＡ食摂食によりｉＮＫＴ細胞数がベースラインよりも増加していたが、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞の増加率の方が顕著であった（図３Ｂ）。また、ＣＤＡＡ食餌ＷＴマウスとＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞集団は構成しているｉＮＫＴ細胞のサブポピュレーションが異なっていた（図３Ｃ）。 Although the number of iNKT cells increased from baseline in both WT and CXCL16KO mice, the rate of increase in liver iNKT cells in CDAA-fed CXCL16KO mice was more pronounced (FIG. 3B). In addition, the subpopulation of iNKT cells constituting the liver iNKT cell populations of CDAA-fed WT mice and CXCL16KO mice was different (FIG. 3C).
実施例３
＜コリン欠乏食食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝ｉＮＫＴ細胞の機能解析＞
（１）in vitroにおける肝単核球培養とβ-ガラクトシルセラミド（β-GalCer）刺激
実施例２（１）の方法に従い、肝単核球を単離した後、細胞を１０％ＦＣＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬの細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。
ｉＮＫＴ細胞の特異的なリガンドであるβ−ガラクトシルセラミド（β−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ：β−ＧａｌＣｅｒ）は、ジメチルスルスルホキシドにて１ ｍｇ／ｍＬに調製し、肝単核球刺激の際には終濃度１００ｎｇ／ｍＬとして用いた。
Example 3
<Functional analysis of choline-deficient diet CXCL16KO mouse liver iNKT cells>
(1) In vitro liver mononuclear cell culture and β-galactosylceramide (β-GalCer) stimulation After isolating liver mononuclear cells according to the method of Example 2 (1), the cells were treated with 10% FCS, 50 μM 2. -Suspended in RPMI 1640 medium supplemented with mercaptoethanol and seeded in a 96-well plate at a cell density of 2 × 10 5 cells / 100 μL.
β-Galactosylceramide (β-GalCer), a specific ligand of iNKT cells, is adjusted to 1 mg / mL with dimethylsulfoxide, and a final concentration of 100 ng / mL is obtained upon stimulation with hepatic mononuclear cells. Used as mL.
（２）酵素免疫測定法（Enzymed-linked
Immunosorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）によるサイトカイン産生量
肝単核球の培養上清、およびマウスの血清サンプル中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αはそれぞれ市販のＥＬＩＳＡキット（ベイバイオサイエンス社製）を用いて定量した。
(2) Enzymed-linked assay
Amount of cytokine produced by Immunosorbent Assay (ELISA) IFN-γ, IL-2, IL-4, and TNF-α in the culture supernatant of liver mononuclear cells and mouse serum samples are commercially available ELISA kits (Bay Bioscience) Quantitative analysis was performed.
（３）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるβ−ガラクトシルセラミド（β−ＧａｌＣｅｒ）刺激
０.５％ポリソルベイト２０添加生理食塩水によりＤＭＳＯ溶解β−ＧａｌＣｅｒを希釈し、２μｇ／２００μＬとして、各ＷＴマウス、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスに経尾静脈投与した。投与から１．５時間後に各マウスを犠牲死させて肝単核球を採取し、ｉＮＫＴ細胞の細胞内サイトカイン染色を行った。
(3) In vivo stimulation with β-galactosylceramide (β-GalCer) 0.5% polysorbate 20 added DMSO-diluted β-GalCer was diluted to 2 μg / 200 μL to each WT mouse and CXCL16KO mouse. It was administered intravenously. 1.5 hours after administration, each mouse was sacrificed and liver mononuclear cells were collected, and intracellular cytokine staining of iNKT cells was performed.
β−ＧａｌＣｅｒ刺激によるサイトカイン産生プロファイルの結果、ＷＴマウスではＣＤＡＡ食の摂食によっていずれのサイトカインにも有意な産生能の変化は見られなかった。一方、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＣＤＡＡ食餌により、いずれのサイトカインにおいてもベースラインよりもサイトカイン産生能が上昇していた。 As a result of the cytokine production profile by β-GalCer stimulation, no significant change in the production ability was observed in any cytokine in the WT mice by feeding the CDAA diet. On the other hand, in CXCL16KO mice, the ability to produce cytokines was higher than baseline in any cytokine due to the CDAA diet.
（４）ｉＮＫＴ細胞内サイトカイン染色によるサイトカイン産生プロファイル変化
細胞固定／細胞膜浸透化キット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、細胞内部のサイトカインの保持、細胞固定、細胞膜透過処理を行った。
すなわち、単離した肝単核球を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で２４ウェルプレート（コースター）に播種し、ゴルジ体からの小胞輸送阻害剤であるモネンシン存在下で、３時間培養して細胞内にサイトカインを蓄積させ、その後、細胞を回収し、前述のようにＦＣＭ緩衝液で洗浄した後、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識ラット抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＭ４−５）およびＣＤ１ｄ ＴｅｔｒａｍｅｒによりｉＮＫＴ細胞の細胞表面抗原を蛍光標識した。続いて、キットのプロトコールに従って細胞固定、細胞膜透過処理を行い、細胞内の各種サイトカインを蛍光標識抗サイトカイン抗体にて染色した後、ＣＤ１ｄ ｔｅｔｒａｍｅｒ陽性細胞をゲートし、フローサイトメーターにより解析を行った。なお、染色用抗サイトカイン抗体として、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＦＮ−γ（クローン：ＸＭＧ１.２）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＬ−１７Ａ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０.１）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＬ−４（ＢＶＤ６−２４Ｇ２）、ＦＩＴＣ標識抗マウス／ラットＴＮＦ−α（ＴＮ３−１９）、また同位体対照としてＦＩＴＣ標識ラットＩｇＧ１κ抗体を用いた。
(4) Cytokine production profile change by iNKT intracellular cytokine staining Cell retention / cell fixation and cell membrane permeabilization treatment were performed using a cell fixation / cell membrane permeabilization kit (BD Bioscience).
That is, isolated hepatic mononuclear cells were seeded in a 24-well plate (coaster) at a cell density of 1 × 10 6 cells / mL, and cultured for 3 hours in the presence of monensin, an inhibitor of vesicular transport from the Golgi apparatus. Cytokines are then accumulated in the cells, after which the cells are collected and washed with FCM buffer as described above, followed by PerCP-Cy5.5 labeled rat anti-mouse CD4 monoclonal antibody (RM4-5) and CD1d Tetramer. The cell surface antigen of iNKT cells was fluorescently labeled. Subsequently, cell fixation and cell membrane permeabilization were performed according to the protocol of the kit, and various cytokines in the cells were stained with a fluorescently labeled anti-cytokine antibody, and then CD1d tetramer positive cells were gated and analyzed with a flow cytometer. As anti-cytokine antibodies for staining, FITC-labeled anti-mouse IFN-γ (clone: XMG1.2), FITC-labeled anti-mouse IL-17A (TC11-18H10.1), FITC-labeled anti-mouse IL-4 (BVD6-24G2) ), FITC-labeled anti-mouse / rat TNF-α (TN3-19), and FITC-labeled rat IgG1κ antibody as an isotope control.
その結果、ＣＤＡＡ食摂食によりＷＴマウスのＣＤ４＋ｉＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ−γ（１８.２％→２５.２％）、ＩＬ−４（３.７％→８.４％）の発現が亢進していた。
ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＣＤＡＡ摂食によるＣＤ４＋ｉＮＫＴ細胞のサイトカイン産生亢進の程度がＩＦＮ−γ（９.６％→１７.９％）、ＩＬ−４（４.３％→１３.８％）共にＷＴよりも顕著であった（図５）。
As a result, the expression of IFN-γ (18.2% → 25.2%) and IL-4 (3.7% → 8.4%) was increased in CD4 + iNKT cells of WT mice by feeding CDAA. Was.
In CXCL16KO mice, the level of CD4 + iNKT cell cytokine production by CDAA ingestion was higher for both IFN-γ (9.6% → 17.9%) and IL-4 (4.3% → 13.8%) than WT. Was also remarkable (FIG. 5).
実施例４
＜コリン欠乏食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウスのＮＡＳＨ病態形成における機能変異ｉＮＫＴ細胞の寄与＞
（１）養子移植
通常食またはＣＤＡＡ食を摂食したＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウス（ドナー）の肝ｉＮＫＴ細胞をＭＡＣＳにより単離した。単離したｉＮＫＴ細胞をＰＢＳで洗浄した後、トリパンブルー染色により生細胞数をカウントし、５.５×１０５ｃｅｌｌ／２００μＬ
ＰＢＳをｉＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｊα１８ノックアウトマウス：レシピエント）に経尾静脈移入した。細胞移入から２週間後にマウスを犠牲死させ、血清、肝臓、精巣上体部脂肪組織を採取し、保存した。なお、肝臓へのｉＮＫＴ細胞生着の有無については、フローサイトメーターによりレシピエント肝単核球中のｉＮＫＴ細胞を検出することで確認した（図６）。
Example 4
<Contribution of function-mutated iNKT cells in NASH pathogenesis in choline-deficient dietary CXCL16-deficient mice>
(1) Adoptive transplantation Liver iNKT cells of WT mice and CXCL16KO mice (donor) fed a normal diet or a CDAA diet were isolated by MACS. After washing the isolated iNKT cells with PBS, the number of viable cells was counted by trypan blue staining, and 5.5 × 10 5 cells / 200 μL.
PBS was transferred into iNKT cell-deficient mice (Jα18 knockout mice: recipients) via the tail vein. Two weeks after cell transfer, the mice were sacrificed, and serum, liver, and epididymal adipose tissue were collected and stored. The presence or absence of iNKT cell engraftment in the liver was confirmed by detecting iNKT cells in recipient liver mononuclear cells using a flow cytometer (FIG. 6).
（２）肝臓の病理組織学的所見
ホルマリン固定した肝臓はパラフィン包埋し、４μｍの連続切片を作製した。薄切した組織サンプルはヘマトキシリン染色を行い、病理組織像をもとに組織学的診断に供した。また、ヘマトキシリンとスダンIVの対比染色により肝臓への脂肪沈着を評価した。
(2) Histopathological findings of the liver The formalin-fixed liver was embedded in paraffin and 4 μm serial sections were prepared. The sliced tissue samples were stained with hematoxylin and subjected to histological diagnosis based on histopathological images. In addition, hepatic fat deposition was evaluated by counterstaining hematoxylin and Sudan IV.
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞を養子移植したレシピエント肝では、他ドナーマウスから単離した肝ｉＮＫＴ細胞を移植した場合と比較しても、脂肪肝に特徴的な白色肝が明らかに認められた（図７Ａ上）。この時、各群のレシピエント肝重量比を算出すると、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞の移植した場合、通常食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスのｉＮＫＴ細胞を移植した場合より有意に高値を示し、ＣＤＡＡ食餌ＷＴ群の肝ｉＮＫＴ細胞を移植した場合より、高い傾向を示した（図７Ｂ）。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞を移植したレシピエント肝では脂質蓄積が誘導された（図７Ａ下）。 In recipient liver transplanted with liver iNKT cells from CDAA-fed CXCL16KO mice, white liver characteristic of fatty liver is clearly observed even when transplanted with liver iNKT cells isolated from other donor mice. (FIG. 7A top). At this time, when the recipient liver weight ratio of each group was calculated, when transplanted with liver iNKT cells of CDAA diet CXCL16KO mice, the value was significantly higher than when transplanted with iNKT cells of normal diet CXCL16KO mice, and the CDAA diet WT group It showed a higher tendency than the case of transplanting the liver iNKT cells (FIG. 7B). In addition, lipid accumulation was induced in recipient livers transplanted with liver iNKT cells of CDAA-fed CXCL16KO mice (bottom of FIG. 7A).
（３）肝臓組織中脂質
肝臓組織中の中性脂肪、コレステロール、遊離コレステロール、リン脂質量はリポタンパク質の受託解析サービス（スカイライト・バイオテック社）により解析を行った。なお、解析にはホルマリン固定肝臓サンプルを用いた。
(3) Lipid in liver tissue The amount of neutral fat, cholesterol, free cholesterol, and phospholipid in liver tissue was analyzed by a lipoprotein contract analysis service (Skylite Biotech). For the analysis, a formalin-fixed liver sample was used.
その結果、遊離コレステロール、総コレステロール、リン脂質はどのドナー由来の肝ｉＮＫＴ細胞を移植しても変化が認められないのに対し、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞を移入した場合には、レシピエントマウスの肝臓に有意な中性脂肪の蓄積の誘導があった（図８）。 As a result, free cholesterol, total cholesterol, and phospholipid did not change when transplanted from any donor-derived liver iNKT cells, whereas when transplanted with liver iNKT cells from CDAA-fed CXCL16KO mice, There was a significant induction of triglyceride accumulation in the liver of mice (FIG. 8).
（４）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる肝臓組織の各種遺伝子発現変動の評価
［ＲＮＡ抽出］
肝組織中ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて抽出した。すなわち、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ中で保存した肝組織５０ｍｇを１．５ｍＬチューブ （ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ）にとり、６００μＬのＲＬＴ緩衝液（２−メルカプトエタノール添加（１％，ｖ／ｖ））を加えて氷上にてホモジナイズした。肝ホモジネートをキット付属のプロトコールにしたがってシリカゲルカラムに通し、ＲＮＡを溶出させた。得られたＲＮＡ濃度を吸光光度計にて測定し、各サンプル１ｎｇ／１０μＬに調製した。調製したＲＮＡサンプルは解析に用いるまで−３０℃で保存した。
［逆転写反応］
ＯＬＩＧＯ ＤＴプライマー（インビトロジェン）を用いてＭＲＮＡを増幅した後、逆転写反応はＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ II ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （インビトロジェン）を使用して行った。
［リアルタイムＰＣＲ］
逆転写反応によりｃＤＮＡを得た後、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）と Ｍｘ３０００ｐ（ストラタジーン社）および測定・解析ソフト ＭｘＰｒｏ（ストラタジーン社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。測定結果はすべてハウスキーピング遺伝子であるｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）の発現量により比較Ｃｔ法にて補正した。
(4) Evaluation of various gene expression fluctuations in liver tissue by real-time RT-PCR [RNA extraction]
Liver tissue RNA was extracted using RNeasy mini kit (Qiagen). That is, 50 mg of liver tissue stored in RNA later was placed in a 1.5 mL tube (RNase-free), and 600 μL of RLT buffer (2-mercaptoethanol added (1%, v / v)) was added and homogenized on ice. did. The liver homogenate was passed through a silica gel column according to the protocol attached to the kit to elute the RNA. The obtained RNA concentration was measured with an absorptiometer, and each sample was prepared to 1 ng / 10 μL. The prepared RNA sample was stored at −30 ° C. until used for analysis.
[Reverse transcription reaction]
After amplifying MRNA using OLIGO DT primer (Invitrogen), reverse transcription reaction was performed using Super Script II reverse transcription (Invitrogen).
[Real-time PCR]
After cDNA was obtained by reverse transcription reaction, real-time PCR was performed using SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio) and Mx3000p (Stratagene) and measurement / analysis software MxPro (Stratagene). All the measurement results were corrected by the comparative Ct method according to the expression level of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), which is a housekeeping gene.
ＮＡＳＨ病態形成と関連の深い、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βといった炎症性サイトカインの発現を指標に炎症状態を評価した。その結果、異常ｉＮＫＴ細胞を移入することで、レシピエントの肝臓でもＴＮＦ−α、ＩＬ−１βの発現誘導が確認された（図９）。 The inflammatory state was evaluated using the expression of inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β, which are closely related to NASH pathogenesis. As a result, it was confirmed that TNF-α and IL-1β expression was induced in the recipient's liver by transferring abnormal iNKT cells (FIG. 9).
（５）肝単核球の活性化状態解析
各レシピエントの肝単核球を単離し、ＲＰＥ標識抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ６９モノクローナル抗体（クローンＨ１.２Ｆ３）で染色した後、ＣＤ６９の発現レベルをフローサイトメーターで解析し、単核球活性化の指標とした。
(5) Activation state analysis of liver mononuclear cells The liver mononuclear cells of each recipient were isolated and stained with RPE-labeled anti-mouse F4 / 80 monoclonal antibody and FITC-labeled anti-mouse CD69 monoclonal antibody (clone H1.2F3). Thereafter, the expression level of CD69 was analyzed with a flow cytometer and used as an index of mononuclear cell activation.
ドナー由来ｉＮＫＴ細胞をレシピエントに移入後、肝単核球の共通活性化マーカーであるＣＤ６９の発現レベルをフローサイトメーターにより解析した。その結果、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス由来の機能異常ｉＮＫＴ細胞を移入した場合には、ＣＤ６９発現細胞の増加が認められた（図１０Ａ）。 After the donor-derived iNKT cells were transferred to the recipient, the expression level of CD69, a common activation marker for hepatic mononuclear cells, was analyzed using a flow cytometer. As a result, when dysfunctional iNKT cells derived from CDAA diet CXCL16KO mice were transferred, an increase in CD69-expressing cells was observed (FIG. 10A).
ｋｕｐｆｆｅｒ細胞のマーカーとしてＦ４／８０を用い、ＣＤ６９との二重染色によってｉＮＫＴ細胞の移入によるｋｕｐｆｆｅｒ細胞の活性化の程度をフローサイトメーターにより解析した。その結果、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス由来の肝ｉＮＫＴ細胞移入によって、ＣＤ６９陽性ｋｕｐｐｅｒ細胞の割合が増加していた（図１０Ｂ）。 Using F4 / 80 as a marker for kupffer cells, the degree of activation of kupffer cells by iNKT cell transfer was analyzed by a flow cytometer by double staining with CD69. As a result, the ratio of CD69-positive kupper cells was increased by the transfer of liver iNKT cells derived from CDAA-fed CXCL16KO mice (FIG. 10B).
実施例５
＜機能変異ｉＮＫＴ細胞を起点とした肝細胞への脂肪蓄積機構＞
（１）肝ｉＮＫＴ細胞とその他肝単核球による共培養系
肝ｉＮＫＴ細胞は、それぞれ通常食またはＣＤＡＡ食を２週間摂食させたＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝臓からＭＡＣＳを用いて単離した。また、ｉＮＫＴ細胞との共培養に用いた肝単核球はｉＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｊα１８ノックアウトマウス）の肝臓より単離し、これにより他のｉＮＫＴ細胞による影響を排除した実験系を組み立てた。共培養系は、ｉＮＫＴ細胞：肝単核球＝２×１０４ｃｅｌｌｓ：８×１０４ｃｅｌｌｓを１０％ＦＣＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して９６ウェルプレートに播種し、３７℃、炭酸ガスインキュベーター内で７２時間培養した。
Example 5
<Fat accumulation mechanism in hepatocytes starting from functional mutant iNKT cells>
(1) Co-cultured liver iNKT cells with liver iNKT cells and other liver mononuclear cells were isolated from the livers of WT mice and CXCL16KO mice fed with a normal diet or a CDAA diet for 2 weeks, respectively, using MACS. In addition, hepatic mononuclear cells used for co-culture with iNKT cells were isolated from the liver of iNKT cell-deficient mice (Jα18 knockout mice), thereby assembling an experimental system in which the influence of other iNKT cells was excluded. In the co-culture system, iNKT cells: liver mononuclear cells = 2 × 10 4 cells: 8 × 10 4 cells were suspended in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS, 50 μM 2-mercaptoethanol, and seeded in a 96-well plate at 37 ° C. The cells were cultured for 72 hours in a carbon dioxide incubator.
（２）マウス初代肝細胞培養
肝細胞を捲き込む前日に、９６ウェルプレートをマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でコーティングしておく。実際には、１ｍｇ／ｍＬマトリゲルをＰＢＳにより５０μｇ／ｍＬに希釈し、４０μＬ／ウェルをプレートに添加した。続いて、クリーンベンチ内で一晩風乾し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１度洗浄した後に培養に用いた。
無処置ＷＴマウスまたはｉＮＫＴ細胞欠損マウスの肝臓をＥＧＴＡ添加ＨＢＳＳで還流後、肝臓を摘出し、１２５μｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（シグマ社）／ＨＢＳＳ溶液に浸けて細断して、３７℃温浴シェーカー中で１５分間インキュベートした。その後、肝組織をナイロンメッシュ（１００μｍ）に通して細胞浮遊液を得た。細胞浮遊液を、４℃、５００回転、１分間遠心し、上清をアスピレーターにより除去した後、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞を３回程洗浄し、上清が澄んできたら無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を１〜２回洗浄して肝細胞を得た。３×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬの細胞密度に調整し、マトリゲルでコーティングした９６ウェルプレートに播種した。
(2) The day before the mouse primary hepatocyte culture hepatocytes are seeded, a 96-well plate is coated with Matrigel (Matrigel, BD Biosciences). In practice, 1 mg / mL Matrigel was diluted to 50 μg / mL with PBS and 40 μL / well was added to the plate. Subsequently, it was air-dried overnight in a clean bench, washed once with serum-free RPMI 1640 medium, and used for culture.
The liver of an untreated WT mouse or iNKT cell-deficient mouse was refluxed with EGTA-added HBSS, then the liver was excised, soaked in 125 μg / mL collagenase IV (Sigma) / HBSS solution, and shredded in a 37 ° C. warm bath shaker. Incubated for 15 minutes. Thereafter, the liver tissue was passed through a nylon mesh (100 μm) to obtain a cell suspension. The cell suspension is centrifuged at 4 ° C., 500 rpm for 1 minute, and the supernatant is removed with an aspirator. The cells are washed about 3 times with 10% FCS-added RPMI1640 medium, and when the supernatant is clear, serum-free RPMI1640 medium is obtained. The cells were washed once or twice to obtain hepatocytes. The cell density was adjusted to 3 × 10 4 cells / 100 μL and seeded in a 96-well plate coated with matrigel.
（３）共培養系上清
（馴化培地）によるマウス初代肝細胞への脂肪蓄積誘導
肝細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１６時間培養し飢餓状態にしておく。肝細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し、共培養系馴化培地にて肝細胞を２４ 時間培養した。
(3) Fat accumulation-inducing hepatocytes in mouse primary hepatocytes by co-culture system supernatant (conditioned medium) are cultured in serum-free RPMI 1640 medium for 16 hours and kept in a starved state. Hepatocytes were washed once with serum-free RPMI 1640 medium, and hepatocytes were cultured for 24 hours in a co-culture conditioned medium.
（４）肝細胞脂質染色
共培養系馴化培地下で２４時間培養した後、培養上清を除去して４％パラホルムアルデヒドで肝細胞を固定し、Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いて肝細胞中の脂質を染色した（Ｏｉｌ ｒｅｄ−Ｏ染色）。
(4) After culturing in a conditioned medium for hepatocyte lipid staining co-culture system for 24 hours, the culture supernatant is removed, and hepatocytes are fixed with 4% paraformaldehyde, and liver using Adipogenesis Assay Kit (Cayman Chemical Co.). Lipids in the cells were stained (Oil red-O staining).
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来の機能変異ｉＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養によって得られたＣＭでマウス初代肝細胞を培養することで非常に強力な脂質蓄積が誘導された（図１１Ａ）。 A very strong lipid accumulation was induced by culturing mouse primary hepatocytes with CM obtained by co-culture of functional mutant iNKT cells derived from the liver of CDAA diet CXCL16KO mice and liver mononuclear cells (FIG. 11A).
（５）共培養系におけるサイトカイン産生量
共培養系上清中に産生された液性因子として、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αはそれぞれ市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒｅａｄｙ Ｓｅｔ Ｇｏ！， ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。
(5) Cytokine production in co-culture system As humoral factors produced in the co-culture supernatant, IFN-γ, IL-2, IL-4, and TNF-α are commercially available ELISA kits (Ready Set Go). !, EBioscience).
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞は肝単核球との共培養を行わずとも、それ単独でもＣＤＡＡ食餌ＷＴマウス、通常食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ｉＮＫＴ細胞よりも高いＴＮＦ−α産生能を有していた（図１１Ｂ）。 Liver iNKT cells of CDAA-fed CXCL16KO mice alone have higher TNF-α production capacity than liver iNKT cells of CDAA-fed WT mice and normal diet CXCL16KO mice alone, without co-culture with liver mononuclear cells. (FIG. 11B).
（６）中和抗体によるサイトカイン機能阻害実験
Ｐｕｔｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ ＴＮＦ−α（ＴＮ３−１９）、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはコントロールＩｇＧ（ラットＩｇＧ、Ｉｎｔｅｒ−Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｙ）を終濃度１μｇ／ｍＬとして、馴化培地を用いた初代肝細胞培養系に添加した。
(6) Cytokine function inhibition experiment with neutralizing antibody: Puffed anti-mouse / rat TNF-α (TN3-19), anti-mouse IFN-γ (XMG1.2) (eBioscience) or control IgG (rat IgG, Inter-Cell) Technology) was added at a final concentration of 1 μg / mL to the primary hepatocyte culture system using conditioned medium.
その結果、機能変異ｉＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養ＣＭに抗ＩＦＮ−γ中和抗体、抗ＴＮＦ−α中和抗体をそれぞれ単独で添加させるだけで、共培養ＣＭによる脂質蓄積作用はほぼ完全に阻害された（図１２）。 As a result, by adding anti-IFN-γ neutralizing antibody and anti-TNF-α neutralizing antibody alone to the co-culture CM of function-mutated iNKT cells and hepatic mononuclear cells, the lipid accumulation action of the co-culture CM is almost the same. It was completely inhibited (Figure 12).
本発明のＴＮＦ−αの産生能を有することを特徴とするインバリンアントナチュラルキラーＴ細胞は、ＮＡＳＨにおける異常免疫応答を解明するためのツールとして有用である。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ノックアウトマウスは、ＮＡＳＨの初期病態を誘導するモデル動物として有用である。 The invaline ant natural killer T cell having the ability to produce TNF-α of the present invention is useful as a tool for elucidating an abnormal immune response in NASH. Moreover, the CDAA diet CXCL16 knockout mouse is useful as a model animal for inducing an initial pathological condition of NASH.
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するナチュラルキラーＴ細胞およびその取得方法に関する。 The present invention relates to a natural killer T cell involved in the development of nonalcoholic steatohepatitis and a method for obtaining the same.
現在、非アルコール性脂肪性肝疾患(non-alcoholic fatty liver disease:ＮＡＦＬＤ)および非アルコール性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis:ＮＡＳＨ)は、メタボリックシンドローム罹患人口の増大に加え、その疾患の重篤性から臨床的・社会的な問題として注目を集めている。ＮＡＳＨに関しては、その疾患概念が病理診断所見から生まれた概念であるため、病理所見の変化については臨床一般にコンセンサスが得られているものの、分子病態機構についての詳細は未だ明らかになっておらず、効果的な治療法や診断法は未だ確立されていないのが現状である。 Currently, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH) are not only an increase in the population affected by metabolic syndrome, but also the severity of the disease. It is attracting attention as a clinical and social problem due to its sex. Regarding NASH, the disease concept is a concept born from the pathological diagnosis findings, so although consensus has been obtained in general about changes in pathological findings, details about the molecular pathological mechanism have not yet been clarified, At present, effective treatments and diagnostic methods have not yet been established.
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）とＴ細胞の両方の特性を有した、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞に次ぐ第４のリンパ球である(非特許文献１）。ＮＫＴ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（major histo-
compatibility；ＭＨＣ）クラスIｂ分子に属するＣＤ１ｄにより提示される糖脂質や疎水性ペプチドを認識することが示され、生体内においてもＣＤ１ｄにより胸腺内ポジティブセレクションされていると考えられている。胸腺内分化したＮＫＴ細胞は成熟に伴って末梢に遊走し、脾臓、骨髄そして肝臓に比較的多く存在している。特に、肝臓においては肝臓に存在する単核球細胞のうち１０％〜２０％がＮＫＴ細胞として存在しており、肝免疫系を制御している。
Natural killer T cells (NKT cells) are the fourth lymphocytes after T cells, B cells, and NK cells, which have characteristics of both natural killer cells (NK cells) and T cells (Non-patent Document 1). ). NKT cells are the major histocompatibility complex (major histo-
compatibility: MHC) It has been shown to recognize glycolipids and hydrophobic peptides presented by CD1d belonging to class Ib molecules, and is considered to be positively selected in the thymus by CD1d in vivo. Intrathymic differentiated NKT cells migrate to the periphery as they mature, and are relatively abundant in the spleen, bone marrow, and liver. In particular, in the liver, 10% to 20% of mononuclear cells existing in the liver are present as NKT cells, and control the liver immune system.
ケモカインは、免疫細胞の遊走能力に特化したサイトカインの一群である。現在までにヒトでは約５０種類のケモカインとそれに複数対応する受容体が同定されており、生体内における免疫細胞の恒常的な局在・移動を厳密に制御している。また、この厳密な制御機構の破綻が多くの免疫性の疾患の発症、および進展に関与しており、その疾患における重要性が認知されている。
ケモカインＣＸＣＬ１６は、比較的最近同定されたケモカインの１つであり、樹状細胞、Ｂ細胞などの抗原提示細胞に加え、肝臓の類洞内皮細胞に発現していることが報告されている（非特許文献２）。ＣＸＣＬ１６は大変ユニークな機能性分子であり、一般的なケモカインと同様に可溶型ケモカインとして細胞遊走活性を有することに加えて、細胞の膜結合型ケモカインとしても発現し、細胞接着分子、抗原提示の際の共刺激分子、そしてスカベンジャー受容体としての機能することも報告（非特許文献３）されており、多機能性ケモカインとして知られている。
Chemokines are a group of cytokines that specialize in the ability of immune cells to migrate. To date, about 50 types of chemokines and a plurality of corresponding receptors have been identified in humans, and the constitutive localization and migration of immune cells in vivo are strictly controlled. Moreover, the failure of this strict control mechanism is involved in the onset and progression of many immune diseases, and its importance in the diseases is recognized.
The chemokine CXCL16 is one of relatively recently identified chemokines and has been reported to be expressed in hepatic sinusoidal endothelial cells in addition to antigen-presenting cells such as dendritic cells and B cells (non-) Patent Document 2). CXCL16 is a very unique functional molecule. In addition to having a cell migration activity as a soluble chemokine as well as a general chemokine, CXCL16 is also expressed as a membrane-bound chemokine of a cell. It is also reported that it functions as a costimulatory molecule and a scavenger receptor (Non-patent Document 3), and is known as a multifunctional chemokine.
肝臓において、類洞内皮細胞は恒常的にＣＸＣＬ１６を発現し、肝細胞では炎症時にＣＸＣＬ１６の発現が誘導される。特に、類洞内皮細胞に発現しているＣＸＣＬ１６は肝のＮＫＴ細胞を類洞内にトラップし、類洞内の免疫学的監視機構を行うために必須の分子であるとされている（非特許文献４）。
通常、ＮＫＴ細胞はα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）刺激に伴って迅速かつ大量のサイトカインを産生することから、生体免疫の制御細胞として機能すると考えられているが、ＣＸＣＬ１６欠損マウスでは、肝臓のＮＫＴ細胞数の減少に加え、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＴｈ１応答性が減弱している。また、ＣＸＣＬ１６の受容体ＣＸＣＲ６欠損マウスでも、同様に肝臓、肺におけるＮＫＴ細胞数の減少、α−ＧａｌＣｅｒ刺激によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４産生能の低下が認められており、ＮＫＴ細胞の質および量の減弱が報告されている（非特許文献５）。
In the liver, sinusoidal endothelial cells constitutively express CXCL16, and hepatocytes induce CXCL16 expression during inflammation. In particular, CXCL16 expressed in sinusoidal endothelial cells is considered to be an essential molecule for trapping hepatic NKT cells in sinusoids and performing an immunological monitoring mechanism in sinusoids (non-patented). Reference 4).
In general, NKT cells are thought to function as regulatory cells for biological immunity because they produce rapid and large amounts of cytokines upon stimulation with α-galactosylceramide (α-GalCer), but in CXCL16-deficient mice, In addition to the decrease in the number of NKT cells, Th1 responsiveness by α-GalCer stimulation is attenuated. In addition, in CXCL16 receptor CXCR6-deficient mice, the number of NKT cells in the liver and lungs was similarly decreased, and the ability to produce IFN-γ and IL-4 by α-GalCer stimulation was also observed. A decrease in the amount has been reported (Non-patent Document 5).
本発明者らは、これまでケモカインによる種々疾病制御機構の解明を行ってきた。ケモカインは免疫細胞の動態を制御する一連のサイトカイン群であるため、特に炎症性疾患との関連性が強い。中でもＣＸＣＬ１６は、肝臓のＮＫＴ細胞の動態・機能制御を行うことで、肝免疫系の恒常性維持や肝炎症性疾患に関わっているが、ＣＸＣＬ１６と肝慢性炎症疾患であるＮＡＳＨとの直接的な関連性は全く報告がない。
本発明の課題は、ＮＡＳＨにおけるＣＸＣＬ１６の関与の検討を行い、新たにＮＡＳＨの治療薬や治療法の構築に有用なツールを提供することにある。
The present inventors have so far clarified various disease control mechanisms by chemokines. Since chemokines are a series of cytokines that control immune cell dynamics, they are particularly relevant to inflammatory diseases. Among them, CXCL16 is involved in maintaining the homeostasis of the liver immune system and liver inflammatory diseases by controlling the dynamics and functions of hepatic NKT cells. However, CXCL16 is directly associated with NASH, which is a chronic inflammatory disease of liver. No relevance has been reported.
An object of the present invention is to examine the involvement of CXCL16 in NASH, and to provide a tool useful for newly constructing a therapeutic drug or therapy for NASH.
本発明者らは、ＣＸＣＬ１６欠損マウスを用いたＮＡＳＨモデルの作製を行い、病理所見など臨床的な評価方法によってＮＡＳＨにおけるＣＸＣＬ１６の関与の検討した。さらに、ＣＸＣＬ１６と肝ＮＫＴ細胞の関係に着目し、ＮＡＳＨモデルマウスの肝ＮＫＴ細胞の動態・機能解析を行い、病態に寄与する可能性を検証した。加えて、解析したＮＫＴ細胞を介した病態形成機序を検証するために養子移植実験およびエキソビボ(ex vivo)での解析を行った結果、非アルコール性脂肪性肝炎の発症に関与するインバリアントナチュラルキラーＴ細胞を見出し、本発明を完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。
The present inventors made a NASH model using CXCL16-deficient mice and examined the involvement of CXCL16 in NASH by clinical evaluation methods such as pathological findings. Furthermore, paying attention to the relationship between CXCL16 and hepatic NKT cells, the dynamic and functional analysis of hepatic NKT cells in NASH model mice was performed, and the possibility of contributing to the pathological condition was verified. In addition, as a result of adoptive transfer experiments and ex vivo (ex vivo) analysis to verify the mechanism of pathogenesis through the analyzed NKT cells, invariant natural involved in the development of nonalcoholic steatohepatitis A killer T cell was found and the present invention was completed.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物の肝臓から単離される肝臓単核球からのＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。より具体的には、本発明のナチュラルキラーＴ細胞は、肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物から単離される肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。 The present invention is a natural killer T cell characterized by enhancing TNF-α and IFN-γ production from liver mononuclear cells isolated from the liver of a non-alcoholic steatohepatitis model animal. More specifically, the natural killer T cells of the present invention can be obtained from TNF- from liver mononuclear cells isolated from a disease model animal of non-alcoholic steatohepatitis in which expression of chemokine CXCL16 in the liver is not reduced or expressed. It is a natural killer T cell characterized by enhancing α and IFN-γ production.
本発明のナチュラルキラーＴ細胞とは、Ｔ細胞受容体（T cell
receptor：ＴＣＲ）により、ＭＨＣクラスIｂ分子に属するＣＤ１ｄにより提示される糖脂質や疎水性ペプチドを認識し、さらに、肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞である。
The natural killer T cell of the present invention is a T cell receptor (T cell).
Receptor (TCR) recognizes glycolipids and hydrophobic peptides presented by CD1d belonging to MHC class Ib molecules, and further enhances TNF-α and IFN-γ production from liver mononuclear cells Natural killer T cells.
本発明のナチュラルキラーＴ細胞は、例えば、以下の方法によって取得することができる。
（１）肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしない病態モデル動物にコリン欠乏食などの脂肪肝を誘導する餌を摂食させる。
（２）病態モデル動物から肝臓を摘出する。
（３）摘出した肝臓から肝単核球を単離する。
（４）単離した肝単核球からにナチュラルキラーＴ細胞を分離する。
The natural killer T cell of the present invention can be obtained, for example, by the following method.
(1) A disease state model animal in which expression of chemokine CXCL16 in the liver is not reduced or expressed is fed a diet that induces fatty liver such as choline-deficient diet.
(2) The liver is removed from the disease model animal.
(3) Isolate hepatic mononuclear cells from the removed liver.
(4) Isolate natural killer T cells from isolated liver mononuclear cells.
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞により、ＮＡＳＨの初期病態（例えば、肝細胞への中性脂肪蓄積など）を誘導することができる。具体的には、例えば、肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞を養子移植することが挙げられる。この場合、例えば、レシピエントとしてＪα１８ノックアウトマウスなどのＮＫＴ細胞を欠損させたマウスを用いればよい。 The natural killer T cells that enhance TNF-α and IFN-γ production from the liver mononuclear cells of the present invention induce the initial pathology of NASH (eg, neutral fat accumulation in hepatocytes). can do. Specifically, for example, adoptive transplantation of natural killer T cells characterized by enhancing TNF-α and IFN-γ production from liver mononuclear cells can be mentioned. In this case, for example, a mouse deficient in NKT cells such as a Jα18 knockout mouse may be used as a recipient.
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞により、ＮＡＳＨにおける肝細胞への中性脂肪蓄積などの初期病態を誘導することができる。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ノックアウトマウスは、ＮＡＳＨの初期病態を誘導するモデル動物として、肝臓における異常免疫応答を基盤とする慢性炎症の研究に用いることができる。 The natural killer T cells characterized by enhancing the production of TNF-α and IFN-γ from liver mononuclear cells of the present invention can induce early pathological conditions such as neutral fat accumulation in hepatocytes in NASH. it can. In addition, the CDAA-fed CXCL16 knockout mouse can be used as a model animal for inducing an initial pathological condition of NASH for the study of chronic inflammation based on an abnormal immune response in the liver.
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞の取得に用いられる病態モデル動物として、肝臓におけるケモカインＣＸＣＬ１６の発現が低下または発現してしないマウス、ラットなどのげっ歯類が挙げられる。好ましいものとして、ケモカインＣＸＣＬ１６の発現が健常マウスの1/１００以下に低下しているマウス、ＣＸＣＬ１６欠損マウス、グルタミン酸ナトリウム誘発マウス（ＭＳＧマウス）などが挙げられる。 As a disease state model animal used for obtaining natural killer T cells characterized by enhancing TNF-α and IFN-γ production from liver mononuclear cells of the present invention, expression of chemokine CXCL16 in the liver is reduced or expressed. Examples include rodents such as mice and rats. Preferred examples include mice in which the expression of chemokine CXCL16 is reduced to 1/100 or less of healthy mice, CXCL16-deficient mice, and sodium glutamate-induced mice (MSG mice).
コリン欠乏食としては、例えば、コリン欠乏・Ｌ−アミノ酸規定食（Choline deficient
L-amino acid defined diet：ＣＤＡＡ)、メチオニン・コリン欠乏食（Methionine- and Choline
deficien diet：ＭＣＤ)などが挙げられるが、好ましいものとして、ＣＤＡＡが挙げられる。
コリン欠乏食を摂取させる期間としては、例えば、ＣＸＣＬ１６欠損マウスでは、１週間以上、好ましくは２週間以上である。
Examples of choline deficient diets include choline deficiency and L-amino acid diet (Choline deficient
L-amino acid defined diet (CDAA), Methionine- and Choline-deficient diet
deficien diet (MCD) and the like are preferable, and CDAA is preferable.
The period for ingesting the choline-deficient diet is, for example, 1 week or longer, preferably 2 weeks or longer in CXCL16-deficient mice.
肝単核球からにナチュラルキラーＴ細胞を分離するには、例えば、ＣＤ１ｄとβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）の複合体を蛍光色素のアロフイコシアニン（ＡＰＣ）やフィコエリスチン（ＰＥ）で標識されたストレプトアビジンにより４量体化した試薬（例えば、Ｃｄ１ｄ
Ｔｅｔｒａｍｅｒなど）で肝単核球を標識した後、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）などを用いて行えばよい。
To separate natural killer T cells from hepatic mononuclear cells, for example, a complex of CD1d and β2-microglobulin (β2m) is labeled with the fluorescent dyes allophycocyanin (APC) or phycoerythin (PE). Reagents tetramerized with prepared streptavidin (eg, Cd1d
After labeling hepatic mononuclear cells with Tetramer or the like, magnetic cell separation (MACS) or the like may be used.
以下、実施例で説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例１
＜コリン欠乏食食餌誘導性ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルの作製＞
（１）ＣＸＣＬ１６欠損マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウスバックグラウンドのＣＸＣＬ１６（ＳＲ−ＰＳＯＸ）欠損マウス（ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス）は、Ｊ. Immunol., 179, 8172-8179(2007)に記載の方法に準じて作製した。すなわち、定法に従い、ネオマイシン耐性遺伝子をコードしたターゲットベクターをエレクトロポレーション法によりＥＳ細胞に遺伝子導入し、ネオマイシン耐性株のうちＣＸＣＬ１６遺伝子欠損株をサザンブロット法にてスクリーニングすることで樹立した。
Hereinafter, although an Example demonstrates, this invention is not limited by these.
Example 1
<Preparation of choline-deficient diet-induced NAFLD / NASH model>
(1) CXCL16-deficient mouse BALB / c mouse background CXCL16 (SR-PSOX) -deficient mouse (CXCL16KO mouse) was prepared according to the method described in J. Immunol., 179, 8172-8179 (2007). That is, according to a conventional method, a target vector encoding a neomycin resistance gene was introduced into ES cells by electroporation, and among the neomycin resistance strains, the CXCL16 gene-deficient strain was screened by Southern blotting.
（２）動物飼育環境
野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス（wild
type:ＷＴマウス）およびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスは、富山大学和漢医薬学総合研究所病態生化学分野の動物飼育室にて飼育した。水および固形飼料は自由摂食とした。本実験は、国立大学法人富山大学動物実験取扱規則に基づき、動物実験委員会の承認後、動物倫理に十分配慮し行った。
(2) Animal breeding environment wild type BALB / c mouse (wild
type: WT mice) and CXCL16KO mice were bred in the animal breeding room of the Department of Pathology and Biochemistry, University of Toyama, Institute of Pharmaceutical Sciences, Wanhan. Water and chow were freely fed. This experiment was conducted with due consideration for animal ethics after approval by the Animal Experiment Committee based on the rules for handling animal experiments at the University of Toyama.
（３）コリン欠乏食食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウス
コリン欠乏食は、Choline
deficient L-amino acid defined diet (ＣＤＡＡ：Ｄｙｅｔｓ社製) を用い、４〜５週齢、雄性のＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスに２週間自由摂食させた。また、対照群として通常飼育食（Labo MR Stock, 日本農産工業製）を同様にＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの両マウスに摂食させた。
摂食開始から２週間後、マウスを犠牲死させ、血液、肝臓、脾臓、精巣上体部脂肪組織を採取した。血液は腹部下大静脈から採血をおこない、常温で1時間、４℃で一晩静置し、卓上遠心機にて４℃、３０００回転、２０分間遠心分離後、上清を血清サンプルとした。血清サンプルは解析に用いるまでディープフリーザー（−８０℃）内で保存した。肝臓は、一部ＲＴ−ＰＣＲ（後述）用サンプルとしてＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＲＮＡ ｌａｔｅｒ：キアゲン社）に浸けて解析に用いるまで−２０℃で保存した。また病理組織及び免疫染色用に１０ ％中性緩衝ホルマリン中にて４℃で保存した。精巣上体部脂肪組織は液体窒素にて瞬間凍結後、ディープフリーザーにて保管した。
(3) Choline-deficient diet CXCL16-deficient mouse choline-deficient diet
Using deficient L-amino acid defined diet (CDAA: manufactured by Dyets), 4 to 5 weeks old male WT mice and CXCL16KO mice were allowed to eat freely for 2 weeks. In addition, as a control group, a normal rearing food (Labo MR Stock, manufactured by Nippon Nosan Kogyo Co., Ltd.) was similarly fed to both WT mice and CXCL16KO mice.
Two weeks after the start of feeding, the mice were sacrificed, and blood, liver, spleen, and epididymal fat tissue were collected. The blood was collected from the abdominal inferior vena cava and allowed to stand at room temperature for 1 hour and at 4 ° C. overnight. After centrifugation at 4 ° C. and 3000 rpm for 20 minutes in a tabletop centrifuge, the supernatant was used as a serum sample. Serum samples were stored in a deep freezer (−80 ° C.) until used for analysis. The liver was partially immersed in RNA Stabilization Reagent (RNA later: Qiagen) as a sample for RT-PCR (described later) and stored at −20 ° C. until used for analysis. Further, it was stored at 4 ° C. in 10% neutral buffered formalin for pathological tissue and immunostaining. The epididymal adipose tissue was snap frozen in liquid nitrogen and stored in a deep freezer.
ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではわずか２週間のＣＤＡＡ食摂食により、脂肪肝に特徴的な強い白色性の肝臓肉眼所見（図１Ａ）および肝肥大を認めた（図１Ｂ）。 In CXCL16KO mice, a strong white liver macroscopic characteristic (FIG. 1A) and hepatic hypertrophy (FIG. 1B) characteristic of fatty liver were observed after feeding CDAA for only 2 weeks.
（４）肝臓の病理組織学的所見とその評価
ホルマリン固定した肝臓はパラフィン包埋し、４μｍの連続切片を作製した。薄切した組織サンプルはヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、病理組織像をもとに組織学的診断に供した。
ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの病理組織学的評価は、ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍに基づいてＮＡＦＬＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）を算出した（Hepatology, 41, 1313-1321(2005))。ＮＡＳ≧５をＮＡＳＨ、ＮＡＳ＞３をＮＡＳＨ進行性脂肪肝と判断した。
このスコアリングシステムは、脂肪沈着を０〜３、肝小葉の細胞浸潤を０〜３、そして肝細胞のｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ変性の程度を０〜２として段階評価し、その合計値をＮＡＳ値として、ＮＡＳ値＜３を除外診断、ＮＡＳ値≧５をＮＡＳＨと診断するものである。
(4) Histopathological findings and evaluation of liver The formalin-fixed liver was embedded in paraffin, and 4 μm serial sections were prepared. The sliced tissue samples were stained with hematoxylin and eosin (HE) and subjected to histological diagnosis based on histopathological images.
For histopathological evaluation of NAFLD / NASH, NAFLD Activity Score (NAS) was calculated based on NASH Clinical Network Scoring System (Hepatology, 41, 1313-1321 (2005)). NAS ≧ 5 was judged as NASH, and NAS> 3 was judged as NASH progressive fatty liver.
This scoring system is graded with 0 to 3 fat deposition, 0 to 3 cell infiltration of hepatic lobule, and 0 to 2 degree of hepatocyte balloning degeneration, and the total value is NAS value. <3 is an exclusion diagnosis, and NAS value ≧ 5 is diagnosed as NASH.
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスでは肝臓への著しい大滴性脂肪沈着を認め（図２Ａ）、さらに脂質構成成分として中性脂肪が有意に増加している（図２Ｂ）。 In CDAA-fed CXCL16KO mice, marked large lipid deposits were observed in the liver (FIG. 2A), and neutral fat as a lipid component was significantly increased (FIG. 2B).
ＣＤＡＡ食餌ＷＴではＮＡＳ値が３を越える個体が１匹も該当しなかったのに対し（平均ＮＡＳ値：２.４）、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＮＡＳ値が５以上の個体が全体の半数存在した（図２Ｃ）。 In the CDAA diet WT, none of the individuals with NAS values exceeding 3 was applicable (mean NAS value: 2.4), whereas in CDAA diet CXCL16KO mice, half of the individuals with NAS values of 5 or more were present. (FIG. 2C).
（５）肝臓組織中中性脂肪の定量
肝臓組織中中性脂肪の抽出はＦｏｌｃｈらの方法（J. Biol. Chem., 497-509(1987))を一部改変して行った。すなわち、１００ｍｇ〜２００ｍｇ肝臓に４ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）を加え、ガラスホモジナイザーでホモジナイズした後、ポリプロピレン製ファルコンチューブに移して、５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を１ｍＬ添加し、１分間ボルテックスした。室温、１５００×ｇ、１０分間遠心分離し、パスツールピペットを用いて下層のクロロホルム層を別のファルコンチューブに移した。さらに収量を増やすため、上層に１容のクロロホルムを加えて同様にボルッテクス、遠心分離した後、下層を先の下層と合わせた。合わせたクロロホルム層のうち、１００μＬに２０μＬのイソプロピルアルコール／トリトンＸ（９：１，ｖ／ｖ）を加え、ドラフト内で自然乾燥させた。乾燥したものをイソプロピルアルコール／トリトンＸ（９：１，ｖ／ｖ）に溶かし、トリグリセライドＥ−テストワコー （和光純薬工業製）を用い、単位肝重量当たりの中性脂肪量を算出した（図２Ｂ）。
(5) Quantification of neutral fat in liver tissue Extraction of neutral fat in liver tissue was performed by partially modifying the method of Folch et al. (J. Biol. Chem., 497-509 (1987)). Specifically, 4 mL of chloroform / methanol (2: 1, v / v) was added to 100 mg to 200 mg liver, homogenized with a glass homogenizer, transferred to a polypropylene falcon tube, 1 mL of 50 mM sodium chloride aqueous solution was added, and 1 minute Vortexed. Centrifugation was performed at room temperature, 1500 × g for 10 minutes, and the lower chloroform layer was transferred to another falcon tube using a Pasteur pipette. In order to further increase the yield, 1 volume of chloroform was added to the upper layer, vortexed and centrifuged in the same manner, and then the lower layer was combined with the previous lower layer. Of the combined chloroform layers, 20 μL of isopropyl alcohol / Triton X (9: 1, v / v) was added to 100 μL and air-dried in a fume hood. The dried product was dissolved in isopropyl alcohol / Triton X (9: 1, v / v), and triglyceride E-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used to calculate the amount of neutral fat per unit liver weight (Fig. 2B).
実施例２
＜コリン欠乏食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウスにおける肝ＮＫＴ細胞＞
（１）マウス肝単核球の単離
通常食またはＣＤＡＡ食を２週間摂食したＷＴおよびＣＸＣＬ１６欠損マウスの肝臓を温ハンクス平衡塩類液（Hanks' Balanced Salt Solutions：ＨＢＳＳ）にて還流後、摘出細断し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で洗いこみながらナイロンメッシュ 上でホモジナイズして細胞懸濁液を得た。４℃、２０００回転、１０分間の条件下で細胞懸濁液を遠心分離した後、細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁して、３３％Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア製）上に重層し、室温、２０００回転、３０分間の条件下、比重分離して単核球分画を得た。さらに、低張処理により赤血球を除去した。その後、細胞を１０％ＦＣＳ含有ＰＲＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１０６〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁した。
Example 2
<Hepatic NKT cells in choline-deficient diet CXCL16-deficient mice>
(1) Isolation of mouse liver mononuclear cells The livers of WT and CXCL16-deficient mice fed with a normal diet or a CDAA diet for 2 weeks were refluxed with warm Hanks' Balanced Salt Solutions (HBSS) and then removed. The cell suspension was chopped and homogenized on a nylon mesh while washing with RPMI 1640 medium containing 10% FCS to obtain a cell suspension. After centrifuging the cell suspension under conditions of 4 ° C., 2,000 rpm for 10 minutes, the cells were resuspended in RPMI 1640 medium containing 10% FCS and overlaid on 33% Percoll (manufactured by GE Healthcare), A mononuclear cell fraction was obtained by specific gravity separation at room temperature, 2000 rpm, and 30 minutes. Furthermore, erythrocytes were removed by hypotonic treatment. Thereafter, the cells were washed twice with 10% FCS-containing RPMI 1640 medium and suspended in phosphate buffered saline (PBS) at a cell density of 10 6 to 10 7 cells / mL.
（２）ＮＫＴ細胞の単離
磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）用いて肝単核球からＮＫＴ細胞を単離した。ＭＡＣＳには Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のｍｉｎｉ ＭＡＣＳ ｋｉｔ（Ａｎｔｉ−ＰＥマイクロビーズ、ＭＳカラム、ＭＡＣＳセパレーター）を用いた。すなわち、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥ（ＭＢＬ社製）によりＮＫＴ細胞をラベルした後、ＮＫＴ細胞を８０μＬのＭＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳを脱気したもの）に懸濁し、Ａｎｔｉ−ＰＥマイクロビーズを２０μＬ添加した。氷上にて１５分間インキュベートした後、ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄して５００μＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、細胞懸濁液を調製した。ＭＡＣＳ ＭＳカラムをＭＡＣＳ緩衝液にてリンスした後、Ｍｉｎｉ ＭＡＣＳセパレーターを用いて調製した細胞懸濁液からＮＫＴ細胞をポジティブセレクションした。また純度を高めるために、２回ＭＳカラムに細胞を通し、純度が８０％以上のものを実験及び解析に用いた。さらに細胞洗浄による細胞の損失を抑えるため、一部セルローション（日本全薬工業製）を用いて細胞の洗浄を行った。
(2) Isolation of NKT cells NKT cells were isolated from hepatic mononuclear cells using magnetic cell separation (MACS). For MACS, mini MACS kit (Anti-PE microbeads, MS column, MACS separator) manufactured by Miltenyi Biotech was used. Specifically, after labeling NKT cells with CD1d Tetramer-PE (MBL), NKT cells were suspended in 80 μL of MACS buffer (2% FCS, PBS degassed with 2 mM EDTA), and Anti-PE micro 20 μL of beads were added. After incubating on ice for 15 minutes, the cells were washed with MACS buffer and resuspended in 500 μL of MACS buffer to prepare a cell suspension. After rinsing the MACS MS column with MACS buffer, NKT cells were positively selected from the cell suspension prepared using the Mini MACS separator. In order to increase the purity, the cells were passed twice through the MS column, and those having a purity of 80% or more were used for experiments and analyses. Furthermore, in order to suppress cell loss due to cell washing, cells were washed using a partial cell lotion (manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.).
（３）ＮＫＴ細胞ポピュレーションの解析
肝単核球（５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）を１.５ｍＬエッペンドルフチューブに分注し、卓上遠心機にて４℃、２０００回転、５分間遠心し、洗浄した。沈殿した細胞を５０μＬの２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ（ＦＣＭ緩衝液）に再懸濁した後、ＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体（クローン２.４Ｇ２）０.５ｍｇ／ｍＬを１μＬ添加し、氷上にて１０分間インキュベートした。ＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体によるＦｃ受容体のブロッキングの後、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥを１０ｍＬ添加し、室温にて３０分間インキュベートしてＮＫＴ細胞を蛍光標識した。続いて、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識抗マウスＣＤ３εモノクローナル抗体を加え、氷上にて３０分間インキュベートした。ＦＣＭ緩衝液を１ｍＬ加え、４℃、２０００回転、５分間遠心して洗浄し、３００μＬのＦＣＭ緩衝液に懸濁した後、フローサイトメーターを用いて細胞表面上の蛍光強度を解析した。
(3) Analysis of NKT cell population Liver mononuclear cells (5 × 10 5 cells / 100 μL) were dispensed into 1.5 mL Eppendorf tubes, centrifuged at 4 ° C., 2000 rpm for 5 minutes, and washed. did. After resuspending the precipitated cells in 50 μL of PBS containing 2% FCS (FCM buffer), 1 μL of CD16 / CD32 monoclonal antibody (clone 2.4G2) 1 μL is added and incubated on ice for 10 minutes. did. After blocking the Fc receptor with the CD16 / CD32 monoclonal antibody, 10 mL of CD1d Tetramer-PE was added and incubated at room temperature for 30 minutes to fluorescently label NKT cells. Subsequently, PerCP-Cy5.5 labeled anti-mouse CD3ε monoclonal antibody was added and incubated on ice for 30 minutes. After adding 1 mL of FCM buffer and washing by centrifugation at 4 ° C., 2000 rpm for 5 minutes and suspending in 300 μL of FCM buffer, the fluorescence intensity on the cell surface was analyzed using a flow cytometer.
ＷＴマウスではＣＤＡＡ食摂食による肝ＮＫＴ細胞比率の変化は認められなかったのに対し、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスでは通常食摂食時に比べて、ＣＤＡＡ食餌により肝ＮＫＴ細胞が２倍近く増加している（図３Ａ）。 In WT mice, no change was observed in the liver NKT cell ratio by feeding CDAA, whereas in CXCL16KO mice, liver NKT cells increased nearly twice as much by CDAA feeding compared to normal feeding (Fig. 3A).
（４）ＮＫＴ細胞のサブポピュレーションの解析
ＮＫＴ細胞ポピュレーション解析と同様に、ＣＤ１ｄ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥにてＮＫＴ細胞を蛍光標識し、その後ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識抗マウスＣＤ４モノクローナルとＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８モノクローナル抗体を加え、氷上で30分間インキュベートした。続いて、磁気細胞分離法によりＮＫＴ細胞を単離し、フローサイトメーターを用いてＮＫＴ細胞のサブポピュレーションの解析を行った。
(4) Analysis of subpopulation of NKT cells Similar to the analysis of NKT cell population, NKT cells are fluorescently labeled with CD1d Tetramer-PE, and then PerCP-Cy5.5-labeled anti-mouse CD4 monoclonal and FITC-labeled anti-mouse CD8 Monoclonal antibody was added and incubated on ice for 30 minutes. Subsequently, NKT cells were isolated by magnetic cell separation, and subpopulation analysis of NKT cells was performed using a flow cytometer.
ＷＴマウス、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスともＣＤＡＡ食摂食によりＮＫＴ細胞数がベースラインよりも増加していたが、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞の増加率の方が顕著であった（図３Ｂ）。また、ＣＤＡＡ食餌ＷＴマウスとＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞集団は構成しているＮＫＴ細胞のサブポピュレーションが異なっていた（図３Ｃ）。 In both WT and CXCL16KO mice, the number of NKT cells increased from the baseline by feeding with CDAA, but the increase rate of liver NKT cells in CDAA-fed CXCL16KO mice was more remarkable (FIG. 3B). In addition, the subpopulations of NKT cells constituting the liver NKT cell populations of CDAA-fed WT mice and CXCL16KO mice were different (FIG. 3C).
実施例３
＜コリン欠乏食食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝ＮＫＴ細胞の機能解析＞
（１）in vitroにおける肝単核球培養とβ-ガラクトシルセラミド（β-GalCer）刺激
実施例２（１）の方法に従い、肝単核球を単離した後、細胞を１０％ＦＣＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬの細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。
ＮＫＴ細胞の特異的なリガンドであるβ−ガラクトシルセラミド（β−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ：β−ＧａｌＣｅｒ）は、ジメチルスルスルホキシドにて１ｍｇ／ｍＬに調製し、肝単核球刺激の際には終濃度１００ｎｇ／ｍＬとして用いた。
Example 3
<Functional analysis of choline-deficient diet CXCL16KO mouse liver NKT cells>
(1) In vitro liver mononuclear cell culture and β-galactosylceramide (β-GalCer) stimulation After isolating liver mononuclear cells according to the method of Example 2 (1), the cells were treated with 10% FCS, 50 μM 2. -Suspended in RPMI 1640 medium supplemented with mercaptoethanol and seeded in a 96-well plate at a cell density of 2 × 10 5 cells / 100 μL.
Β-Galactosylceramide (β-GalCer), a specific ligand of NKT cells, is adjusted to 1 mg / mL with dimethyl sulfsulfoxide, and at a final concentration of 100 ng / mL when stimulating hepatic mononuclear cells. Used as.
（２）酵素免疫測定法（Enzymed-linked
Immunosorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）によるサイトカイン産生量
肝単核球の培養上清、およびマウスの血清サンプル中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αはそれぞれ市販のＥＬＩＳＡキット（ベイバイオサイエンス社製）を用いて定量した。
(2) Enzymed-linked assay
Amount of cytokine produced by Immunosorbent Assay (ELISA) IFN-γ, IL-2, IL-4, and TNF-α in the culture supernatant of liver mononuclear cells and mouse serum samples are commercially available ELISA kits (Bay Bioscience) Quantitative analysis was performed.
（３）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるβ−ガラクトシルセラミド（β−ＧａｌＣｅｒ）刺激
０.５％ポリソルベイト２０添加生理食塩水によりＤＭＳＯ溶解β−ＧａｌＣｅｒを希釈し、２μｇ／２００μＬとして、各ＷＴマウス、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスに経尾静脈投与した。投与から１．５時間後に各マウスを犠牲死させて肝単核球を採取し、ＮＫＴ細胞の細胞内サイトカイン染色を行った。
(3) In vivo stimulation with β-galactosylceramide (β-GalCer) 0.5% polysorbate 20 added DMSO-diluted β-GalCer was diluted to 2 μg / 200 μL to each WT mouse and CXCL16KO mouse. It was administered intravenously. 1.5 hours after administration, each mouse was sacrificed and liver mononuclear cells were collected, and intracellular cytokine staining of NKT cells was performed.
β−ＧａｌＣｅｒ刺激によるサイトカイン産生プロファイルの結果、ＷＴマウスではＣＤＡＡ食の摂食によっていずれのサイトカインにも有意な産生能の変化は見られなかった。一方、ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＣＤＡＡ食餌により、いずれのサイトカインにおいてもベースラインよりもサイトカイン産生能が上昇していた。 As a result of the cytokine production profile by β-GalCer stimulation, no significant change in the production ability was observed in any cytokine in the WT mice by feeding the CDAA diet. On the other hand, in CXCL16KO mice, the ability to produce cytokines was higher than baseline in any cytokine due to the CDAA diet.
（４）ＮＫＴ細胞内サイトカイン染色によるサイトカイン産生プロファイル変化
細胞固定／細胞膜浸透化キット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、細胞内部のサイトカインの保持、細胞固定、細胞膜透過処理を行った。
すなわち、単離した肝単核球を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で２４ウェルプレート（コースター）に播種し、ゴルジ体からの小胞輸送阻害剤であるモネンシン存在下で、３時間培養して細胞内にサイトカインを蓄積させ、その後、細胞を回収し、前述のようにＦＣＭ緩衝液で洗浄した後、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５.５標識ラット抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体（ＲＭ４−５）およびＣＤ１ｄ ＴｅｔｒａｍｅｒによりＮＫＴ細胞の細胞表面抗原を蛍光標識した。続いて、キットのプロトコールに従って細胞固定、細胞膜透過処理を行い、細胞内の各種サイトカインを蛍光標識抗サイトカイン抗体にて染色した後、ＣＤ１ｄ ｔｅｔｒａｍｅｒ陽性細胞をゲートし、フローサイトメーターにより解析を行った。なお、染色用抗サイトカイン抗体として、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＦＮ−γ（クローン：ＸＭＧ１.２）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＬ−１７Ａ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０.１）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩＬ−４（ＢＶＤ６−２４Ｇ２）、ＦＩＴＣ標識抗マウス／ラットＴＮＦ−α（ＴＮ３−１９）、また同位体対照としてＦＩＴＣ標識ラットＩｇＧ１κ抗体を用いた。
(4) Cytokine production profile change by NKT intracellular cytokine staining Cell fixation / cell fixation and cell membrane permeabilization treatment were performed using a cell fixation / cell membrane permeabilization kit (BD Bioscience).
That is, isolated hepatic mononuclear cells were seeded in a 24-well plate (coaster) at a cell density of 1 × 10 6 cells / mL, and cultured for 3 hours in the presence of monensin, an inhibitor of vesicular transport from the Golgi apparatus. Cytokines are then accumulated in the cells, after which the cells are collected and washed with FCM buffer as described above, followed by PerCP-Cy5.5 labeled rat anti-mouse CD4 monoclonal antibody (RM4-5) and CD1d Tetramer. NKT cell surface antigens were fluorescently labeled. Subsequently, cell fixation and cell membrane permeabilization were performed according to the protocol of the kit, and various cytokines in the cells were stained with a fluorescently labeled anti-cytokine antibody, and then CD1d tetramer positive cells were gated and analyzed with a flow cytometer. As anti-cytokine antibodies for staining, FITC-labeled anti-mouse IFN-γ (clone: XMG1.2), FITC-labeled anti-mouse IL-17A (TC11-18H10.1), FITC-labeled anti-mouse IL-4 (BVD6-24G2) ), FITC-labeled anti-mouse / rat TNF-α (TN3-19), and FITC-labeled rat IgG1κ antibody as an isotope control.
その結果、ＣＤＡＡ食摂食によりＷＴマウスのＣＤ４＋ＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ−γ（１８.２％→２５.２％）、ＩＬ−４（３.７％→８.４％）の発現が亢進していた。
ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスではＣＤＡＡ摂食によるＣＤ４＋ＮＫＴ細胞のサイトカイン産生亢進の程度がＩＦＮ−γ（９.６％→１７.９％）、ＩＬ−４（４.３％→１３.８％）共にＷＴマウスよりも顕著であった（図５）。
As a result, the expression of IFN-γ (18.2% → 25.2%) and IL-4 (3.7% → 8.4%) was enhanced in CD4 + NKT cells of WT mice by feeding CDAA. Was.
In CXCL16KO mice, the level of CD4 + NKT cell cytokine production by CDAA feeding was increased in both IFN-γ (9.6% → 17.9%) and IL-4 (4.3% → 13.8%) WT mice. (Fig. 5).
実施例４
＜コリン欠乏食餌ＣＸＣＬ１６欠損マウスのＮＡＳＨ病態形成における機能変異ＮＫＴ細胞の寄与＞
（１）養子移植
通常食またはＣＤＡＡ食を摂食したＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウス（ドナー）の肝ＮＫＴ細胞をＭＡＣＳにより単離した。単離したＮＫＴ細胞をＰＢＳで洗浄した後、トリパンブルー染色により生細胞数をカウントし、５.５×１０５ｃｅｌｌ／２００μＬ
ＰＢＳをＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｊα１８ノックアウトマウス：レシピエント）に経尾静脈移入した。細胞移入から２週間後にマウスを犠牲死させ、血清、肝臓、精巣上体部脂肪組織を採取し、保存した。なお、肝臓へのＮＫＴ細胞生着の有無については、フローサイトメーターによりレシピエント肝単核球中のＮＫＴ細胞を検出することで確認した（図６）。
Example 4
<Contribution of functional mutant NKT cells in NASH pathogenesis in choline-deficient dietary CXCL16-deficient mice>
(1) Adoptive transplantation Liver NKT cells of WT mice and CXCL16KO mice (donor) fed with a normal diet or a CDAA diet were isolated by MACS. After washing the isolated NKT cells with PBS, the number of viable cells was counted by trypan blue staining, and 5.5 × 10 5 cells / 200 μL.
PBS was transferred into the NKT cell-deficient mouse (Jα18 knockout mouse: recipient) via the tail vein. Two weeks after cell transfer, the mice were sacrificed, and serum, liver, and epididymal adipose tissue were collected and stored. The presence or absence of NKT cell engraftment in the liver was confirmed by detecting NKT cells in the recipient liver mononuclear cells with a flow cytometer (FIG. 6).
（２）肝臓の病理組織学的所見
ホルマリン固定した肝臓はパラフィン包埋し、４μｍの連続切片を作製した。薄切した組織サンプルはヘマトキシリン染色を行い、病理組織像をもとに組織学的診断に供した。また、ヘマトキシリンとスダンIVの対比染色により肝臓への脂肪沈着を評価した。
(2) Histopathological findings of the liver The formalin-fixed liver was embedded in paraffin and 4 μm serial sections were prepared. The sliced tissue samples were stained with hematoxylin and subjected to histological diagnosis based on histopathological images. In addition, hepatic fat deposition was evaluated by counterstaining hematoxylin and Sudan IV.
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞を養子移植したレシピエント肝では、他ドナーマウスから単離した肝ＮＫＴ細胞を移植した場合と比較しても、脂肪肝に特徴的な白色肝が明らかに認められた（図７Ａ上）。この時、各群のレシピエント肝重量比を算出すると、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞の移植した場合、通常食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスのＮＫＴ細胞を移植した場合より有意に高値を示し、ＣＤＡＡ食餌ＷＴ群の肝ＮＫＴ細胞を移植した場合より、高い傾向を示した（図７Ｂ）。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞を移植したレシピエント肝では脂質蓄積が誘導された（図７Ａ下）。 Recipient livers adopting transplanted liver NKT cells from CDAA-fed CXCL16KO mice clearly have white liver characteristic of fatty liver compared to transplanted liver NKT cells isolated from other donor mice. (FIG. 7A top). At this time, when the recipient liver weight ratio of each group was calculated, when transplanted with liver NKT cells of CDAA diet CXCL16KO mice, the value was significantly higher than when transplanted with normal diet CXCL16KO mice NKT cells, and the CDAA diet WT group It showed a higher tendency than the case of transplanting the liver NKT cells (FIG. 7B). In addition, lipid accumulation was induced in recipient livers transplanted with liver NKT cells of CDAA diet CXCL16KO mice (bottom of FIG. 7A).
（３）肝臓組織中脂質
肝臓組織中の中性脂肪、コレステロール、遊離コレステロール、リン脂質量はリポタンパク質の受託解析サービス（スカイライト・バイオテック社）により解析を行った。なお、解析にはホルマリン固定肝臓サンプルを用いた。
(3) Lipid in liver tissue The amount of neutral fat, cholesterol, free cholesterol, and phospholipid in liver tissue was analyzed by a lipoprotein contract analysis service (Skylite Biotech). For the analysis, a formalin-fixed liver sample was used.
その結果、遊離コレステロール、総コレステロール、リン脂質はどのドナー由来の肝ＮＫＴ細胞を移植しても変化が認められないのに対し、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞を移入した場合には、レシピエントマウスの肝臓に有意な中性脂肪の蓄積の誘導があった（図８）。 As a result, free cholesterol, total cholesterol, and phospholipids did not change when hepatic NKT cells derived from any donor were transplanted, whereas when transplanted with liver NKT cells from CDAA-fed CXCL16KO mice, There was a significant induction of triglyceride accumulation in the liver of mice (FIG. 8).
（４）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる肝臓組織の各種遺伝子発現変動の評価
［ＲＮＡ抽出］
肝組織中ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて抽出した。すなわち、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ中で保存した肝組織５０ｍｇを１．５ｍＬチューブ （ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ）にとり、６００μＬのＲＬＴ緩衝液（２−メルカプトエタノール添加（１％，ｖ／ｖ））を加えて氷上にてホモジナイズした。肝ホモジネートをキット付属のプロトコールにしたがってシリカゲルカラムに通し、ＲＮＡを溶出させた。得られたＲＮＡ濃度を吸光光度計にて測定し、各サンプル１ｎｇ／１０μＬに調製した。調製したＲＮＡサンプルは解析に用いるまで−３０℃で保存した。
［逆転写反応］
ＯＬＩＧＯ ＤＴプライマー（インビトロジェン）を用いてＭＲＮＡを増幅した後、逆転写反応はＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ II ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （インビトロジェン）を使用して行った。
［リアルタイムＰＣＲ］
逆転写反応によりｃＤＮＡを得た後、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）と Ｍｘ３０００ｐ（ストラタジーン社）および測定・解析ソフト ＭｘＰｒｏ（ストラタジーン社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。測定結果はすべてハウスキーピング遺伝子であるｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）の発現量により比較Ｃｔ法にて補正した。
(4) Evaluation of various gene expression fluctuations in liver tissue by real-time RT-PCR [RNA extraction]
Liver tissue RNA was extracted using RNeasy mini kit (Qiagen). That is, 50 mg of liver tissue stored in RNA later was placed in a 1.5 mL tube (RNase-free), and 600 μL of RLT buffer (2-mercaptoethanol added (1%, v / v)) was added and homogenized on ice. did. The liver homogenate was passed through a silica gel column according to the protocol attached to the kit to elute the RNA. The obtained RNA concentration was measured with an absorptiometer, and each sample was prepared to 1 ng / 10 μL. The prepared RNA sample was stored at −30 ° C. until used for analysis.
[Reverse transcription reaction]
After amplifying MRNA using OLIGO DT primer (Invitrogen), reverse transcription reaction was performed using Super Script II reverse transcription (Invitrogen).
[Real-time PCR]
After cDNA was obtained by reverse transcription reaction, real-time PCR was performed using SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio) and Mx3000p (Stratagene) and measurement / analysis software MxPro (Stratagene). All the measurement results were corrected by the comparative Ct method according to the expression level of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), which is a housekeeping gene.
ＮＡＳＨ病態形成と関連の深い、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βといった炎症性サイトカインの発現を指標に炎症状態を評価した。その結果、異常ＮＫＴ細胞を移入することで、レシピエントの肝臓でもＴＮＦ−α、ＩＬ−１βの発現誘導が確認された（図９）。 The inflammatory state was evaluated using the expression of inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β, which are closely related to NASH pathogenesis. As a result, it was confirmed that TNF-α and IL-1β expression was induced in the recipient's liver by transferring abnormal NKT cells (FIG. 9).
（５）肝単核球の活性化状態解析
各レシピエントの肝単核球を単離し、ＲＰＥ標識抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ６９モノクローナル抗体（クローンＨ１.２Ｆ３）で染色した後、ＣＤ６９の発現レベルをフローサイトメーターで解析し、単核球活性化の指標とした。
(5) Activation state analysis of liver mononuclear cells The liver mononuclear cells of each recipient were isolated and stained with RPE-labeled anti-mouse F4 / 80 monoclonal antibody and FITC-labeled anti-mouse CD69 monoclonal antibody (clone H1.2F3). Thereafter, the expression level of CD69 was analyzed with a flow cytometer and used as an index of mononuclear cell activation.
ドナー由来ＮＫＴ細胞をレシピエントに移入後、肝単核球の共通活性化マーカーであるＣＤ６９の発現レベルをフローサイトメーターにより解析した。その結果、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス由来の機能異常ＮＫＴ細胞を移入した場合には、ＣＤ６９発現細胞の増加が認められた（図１０Ａ）。 After the donor-derived NKT cells were transferred to the recipient, the expression level of CD69, a common activation marker for hepatic mononuclear cells, was analyzed using a flow cytometer. As a result, an increase in CD69-expressing cells was observed when dysfunctional NKT cells derived from CDAA diet CXCL16KO mice were transferred (FIG. 10A).
ｋｕｐｆｆｅｒ細胞のマーカーとしてＦ４／８０を用い、ＣＤ６９との二重染色によってＮＫＴ細胞の移入によるｋｕｐｆｆｅｒ細胞の活性化の程度をフローサイトメーターにより解析した。その結果、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス由来の肝ＮＫＴ細胞移入によって、ＣＤ６９陽性ｋｕｐｐｅｒ細胞の割合が増加していた（図１０Ｂ）。 Using F4 / 80 as a marker for kupffer cells, the degree of activation of kupffer cells by NKT cell transfer was analyzed by a flow cytometer by double staining with CD69. As a result, the ratio of CD69-positive kupper cells was increased by the transfer of hepatic NKT cells derived from CDAA-fed CXCL16KO mice (FIG. 10B).
実施例５
＜機能変異（機能異常）ＮＫＴ細胞を起点とした肝細胞への脂肪蓄積機構＞
（１）肝ＮＫＴ細胞とその他肝単核球による共培養系
肝ＮＫＴ細胞は、それぞれ通常食またはＣＤＡＡ食を２週間摂食させたＷＴマウスおよびＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝臓からＭＡＣＳを用いて単離した。また、ＮＫＴ細胞との共培養に用いた肝単核球はＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｊα１８ノックアウトマウス）の肝臓より単離し、これにより他のＮＫＴ細胞による影響を排除した実験系を組み立てた。共培養系は、ＮＫＴ細胞：肝単核球＝２×１０４ｃｅｌｌｓ：８×１０４ｃｅｌｌｓを１０％ＦＣＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール添加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して９６ウェルプレートに播種し、３７℃、炭酸ガスインキュベーター内で７２時間培養した。
Example 5
<Mechanism of fat accumulation in hepatocytes starting from functional mutation (abnormal function) NKT cells>
(1) Hepatic NKT cells and other hepatic mononuclear cells co-cultured hepatic NKT cells were isolated from the livers of WT mice and CXCL16KO mice fed with a normal diet or a CDAA diet for 2 weeks, respectively, using MACS. In addition, hepatic mononuclear cells used for co-culture with NKT cells were isolated from the liver of an NKT cell-deficient mouse (Jα18 knockout mouse), thereby constructing an experimental system in which the influence of other NKT cells was eliminated. In the co-culture system, NKT cells: liver mononuclear cells = 2 × 10 4 cells: 8 × 10 4 cells were suspended in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS, 50 μM 2-mercaptoethanol, and seeded in a 96-well plate at 37 ° C. The cells were cultured for 72 hours in a carbon dioxide incubator.
（２）マウス初代肝細胞培養
肝細胞を捲き込む前日に、９６ウェルプレートをマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でコーティングしておく。実際には、１ｍｇ／ｍＬマトリゲルをＰＢＳにより５０μｇ／ｍＬに希釈し、４０μＬ／ウェルをプレートに添加した。続いて、クリーンベンチ内で一晩風乾し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１度洗浄した後に培養に用いた。
無処置ＷＴマウスまたはＮＫＴ細胞欠損マウスの肝臓をＥＧＴＡ添加ＨＢＳＳで還流後、肝臓を摘出し、１２５μｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（シグマ社）／ＨＢＳＳ溶液に浸けて細断して、３７℃温浴シェーカー中で１５分間インキュベートした。その後、肝組織をナイロンメッシュ（１００μｍ）に通して細胞浮遊液を得た。細胞浮遊液を、４℃、５００回転、１分間遠心し、上清をアスピレーターにより除去した後、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞を３回程洗浄し、上清が澄んできたら無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を１〜２回洗浄して肝細胞を得た。３×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬの細胞密度に調整し、マトリゲルでコーティングした９６ウェルプレートに播種した。
(2) The day before the mouse primary hepatocyte culture hepatocytes are seeded, a 96-well plate is coated with Matrigel (Matrigel, BD Biosciences). In practice, 1 mg / mL Matrigel was diluted to 50 μg / mL with PBS and 40 μL / well was added to the plate. Subsequently, it was air-dried overnight in a clean bench, washed once with serum-free RPMI 1640 medium, and used for culture.
The livers of untreated WT mice or NKT cell-deficient mice were refluxed with EGTA-added HBSS, and then the livers were excised, soaked in 125 μg / mL collagenase IV (Sigma) / HBSS solution, and shredded in a 37 ° C. warm bath shaker Incubated for 15 minutes. Thereafter, the liver tissue was passed through a nylon mesh (100 μm) to obtain a cell suspension. The cell suspension is centrifuged at 4 ° C., 500 rpm for 1 minute, and the supernatant is removed with an aspirator. The cells are washed about 3 times with 10% FCS-added RPMI1640 medium, and when the supernatant is clear, serum-free RPMI1640 medium is obtained. The cells were washed once or twice to obtain hepatocytes. The cell density was adjusted to 3 × 10 4 cells / 100 μL and seeded in a 96-well plate coated with matrigel.
（３）共培養系上清
（馴化培地）によるマウス初代肝細胞への脂肪蓄積誘導
肝細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１６時間培養し飢餓状態にしておく。肝細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し、共培養系馴化培地にて肝細胞を２４ 時間培養した。
(3) Fat accumulation-inducing hepatocytes in mouse primary hepatocytes by co-culture system supernatant (conditioned medium) are cultured in serum-free RPMI 1640 medium for 16 hours and kept in a starved state. Hepatocytes were washed once with serum-free RPMI 1640 medium, and hepatocytes were cultured for 24 hours in a co-culture conditioned medium.
（４）肝細胞脂質染色
共培養系馴化培地下で２４時間培養した後、培養上清を除去して４％パラホルムアルデヒドで肝細胞を固定し、Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いて肝細胞中の脂質を染色した（Ｏｉｌ ｒｅｄ−Ｏ染色）。
(4) After culturing in a conditioned medium for hepatocyte lipid staining co-culture system for 24 hours, the culture supernatant is removed, and hepatocytes are fixed with 4% paraformaldehyde, and liver using Adipogenesis Assay Kit (Cayman Chemical Co.). Lipids in the cells were stained (Oil red-O staining).
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウス肝臓由来の機能変異ＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養によって得られたＣＭでマウス初代肝細胞を培養することで非常に強力な脂質蓄積が誘導された（図１１Ａ）。 A very strong lipid accumulation was induced by culturing mouse primary hepatocytes with CM obtained by co-culture of functional mutant NKT cells derived from liver of CDAA diet CXCL16KO mice and liver mononuclear cells (FIG. 11A).
（５）共培養系におけるサイトカイン産生量
共培養系上清中に産生された液性因子として、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αはそれぞれ市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒｅａｄｙ Ｓｅｔ Ｇｏ！， ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。
(5) Cytokine production in co-culture system As humoral factors produced in the co-culture supernatant, IFN-γ, IL-2, IL-4, and TNF-α are commercially available ELISA kits (Ready Set Go). !, EBioscience).
ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞は肝単核球との共培養を行わずとも、それ単独でもＣＤＡＡ食餌ＷＴマウス、通常食餌ＣＸＣＬ１６ＫＯマウスの肝ＮＫＴ細胞よりも高いＴＮＦ−α産生能を有していた（図１１Ｂ）。 Hepatic NKT cells of CDAA-fed CXCL16KO mice have higher TNF-α-producing ability than hepatic NKT cells of CDAA-fed WT mice and normal-fed diet CXCL16KO mice alone, without co-culture with liver mononuclear cells. (FIG. 11B).
（６）中和抗体によるサイトカイン機能阻害実験
Ｐｕｔｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ ＴＮＦ−α（ＴＮ３−１９）、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはコントロールＩｇＧ（ラットＩｇＧ、Ｉｎｔｅｒ−Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｙ）を終濃度１μｇ／ｍＬとして、馴化培地を用いた初代肝細胞培養系に添加した。
(6) Cytokine function inhibition experiment with neutralizing antibody: Puffed anti-mouse / rat TNF-α (TN3-19), anti-mouse IFN-γ (XMG1.2) (eBioscience) or control IgG (rat IgG, Inter-Cell) Technology) was added at a final concentration of 1 μg / mL to the primary hepatocyte culture system using conditioned medium.
その結果、機能変異ＮＫＴ細胞と肝単核球の共培養ＣＭに抗ＩＦＮ−γ中和抗体、抗ＴＮＦ−α中和抗体をそれぞれ単独で添加させるだけで、共培養ＣＭによる脂質蓄積作用はほぼ完全に阻害された（図１２）。 As a result, by adding anti-IFN-γ neutralizing antibody and anti-TNF-α neutralizing antibody alone to the co-culture CM of function-mutated NKT cells and hepatic mononuclear cells, the lipid accumulation action of the co-culture CM is almost the same. It was completely inhibited (Figure 12).
本発明の肝臓単核球からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を亢進することを特徴とするナチュラルキラーＴ細胞は、ＮＡＳＨにおける異常免疫応答を解明するためのツールとして有用である。また、ＣＤＡＡ食餌ＣＸＣＬ１６ノックアウトマウスは、ＮＡＳＨの初期病態を誘導するモデル動物として有用である。 Natural killer T cells characterized by enhancing TNF-α and IFN-γ production from liver mononuclear cells of the present invention are useful as a tool for elucidating abnormal immune responses in NASH. Moreover, the CDAA diet CXCL16 knockout mouse is useful as a model animal for inducing an initial pathological condition of NASH.
Claims (7)
The method for obtaining natural killer T cells that enhance TNF-α and IFN-γ production from liver mononuclear cells according to claim 6, wherein the disease state model animal is a rodent.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2016013672A1 (en) * | 2014-07-25 | 2016-01-28 | 国立研究開発法人理化学研究所 | Memory invariant nkt cell marker |
-
2011
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