JP2013017434A - Method for coculturing neurocyte and glia cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞増殖因子の存在下で単一個体由来の神経幹細胞から分化誘導された神経細胞とグリア細胞とを共培養する方法に関する。 The present invention relates to a method of co-culturing neural cells and glial cells that have been induced to differentiate from neural stem cells derived from a single individual in the presence of a cell growth factor.
中枢神経系は、神経細胞とグリア細胞（アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイト）などにより主に構成されている。中枢神経系における記憶・学習などの神経活動、あるいは脳梗塞やアルツハイマー病などの各種神経疾患の所為は、神経細胞を含む各種細胞間に構築されるネットワークより行われると考えられている。中枢神経系を構成する細胞群の機能解析は、インビトロ実験系では、高い純度の各種細胞の単独培養系により実施されている場合が多い。実際の生体内で構築される神経細胞とグリア細胞間の情報ネットワークを維持する観点からの機能解析は、各種細胞の共培養系により行われる必要がある。 The central nervous system is mainly composed of nerve cells and glial cells (astrocytes, microglia, oligodendrocytes) and the like. It is considered that neural activities such as memory and learning in the central nervous system, and various neurological diseases such as cerebral infarction and Alzheimer's disease are performed by a network constructed between various cells including nerve cells. In many in vitro experimental systems, functional analysis of a group of cells constituting the central nervous system is performed by a single culture system of various cells of high purity. Functional analysis from the viewpoint of maintaining an information network between nerve cells and glial cells constructed in an actual living body needs to be performed by a co-culture system of various cells.
各種細胞の共培養系は、高純度の神経細胞やアストロサイト等の各種細胞を用意してから、共培養のためにそれぞれの細胞集団を混ぜることにより構築する必要がある。しかしながら、この方法ではそれぞれの細胞集団を用意するのに時間と労力を有する。さらに、それぞれの細胞集団を異なる週齢の実験動物（マウスやラット）から調製する必要があり、経済的および労力的に大きな負担がある。またアストロサイトの場合は、細胞の性質上、単独培養系ではほとんどが扁平形状のタイプI（type I）のアストロサイトに変化してしまい、生体脳内で見られるような多数の突起を持つタイプII（type II）のアストロサイトが皆無となってしまう。 It is necessary to construct a co-culture system for various cells by preparing various cells such as high-purity nerve cells and astrocytes, and then mixing each cell population for co-culture. However, this method takes time and effort to prepare each cell population. Furthermore, it is necessary to prepare each cell population from experimental animals (mice and rats) of different ages, which is a great burden in terms of economy and labor. In the case of astrocytes, due to the nature of the cells, most of them become flat type I astrocytes in a single culture system, and have a large number of protrusions as seen in the living brain. There are no II (type II) astrocytes.
非特許文献１では、成体マウスの脳室下帯から取り出した細胞組織にEGFを添加し、分裂増殖させることにより、神経細胞やグリア細胞を生み出す細胞塊を分離したことが報告されている。特許文献２には、ニューロスフェア（神経塊）を、EGFおよびbFGFの存在下において培養することにより、神経細胞とアストロサイトを分化誘導したことが開示されている。さらに非特許文献２および３では、FGFが神経幹細胞の増殖・維持に重要であることが報告されている。神経幹細胞は、in vitroで未分化性を維持するために浮遊培養を行った場合、塊状態のニューロスフェアを形成する。生体内では神経幹細胞はニューロスフェアを介さずに神経細胞やグリア細胞に分化誘導されるが、生体脳に近い条件で神経細胞とグリア細胞とを共培養可能な系についての報告はない。 In Non-Patent Document 1, it is reported that EGF is added to cell tissue taken from the subventricular zone of an adult mouse, and cell masses that produce nerve cells and glial cells are separated by dividing and proliferating. Patent Document 2 discloses that neurospheres (nerve mass) are cultured in the presence of EGF and bFGF to induce differentiation of neurons and astrocytes. Furthermore, Non-Patent Documents 2 and 3 report that FGF is important for the proliferation and maintenance of neural stem cells. Neural stem cells form clumped neurospheres when suspension culture is performed to maintain undifferentiation in vitro. In vivo, neural stem cells are induced to differentiate into nerve cells and glial cells without going through neurospheres, but there is no report on a system that can co-culture nerve cells and glial cells under conditions close to those of the living brain.
本発明は、生体における中枢神経系の情報伝達ネットワークをより反映し得るような、神経細胞とグリア細胞との共培養系を、低コストかつ簡便に確立することを目的とし、単一個体由来の神経幹細胞から分化誘導された神経細胞とグリア細胞とを共培養する方法を提供することを課題とする。 The present invention aims to establish a co-culture system of nerve cells and glial cells that can more reflect the information transmission network of the central nervous system in a living body at a low cost and is derived from a single individual. It is an object of the present invention to provide a method for co-culturing neuronal cells and glial cells that have been induced to differentiate from neural stem cells.
本発明者らは鋭意検討した結果、細胞増殖因子の存在下で、単一個体由来の神経幹細胞を培養することにより、同一容器内で当該神経幹細胞から神経細胞とグリア細胞とを分化誘導し得ることを見出し、単一個体由来の神経細胞とグリア細胞との共培養が可能となることに着目し、本発明を達成した。 As a result of intensive studies, the present inventors can induce differentiation of neural cells and glial cells from the neural stem cells in the same container by culturing neural stem cells derived from a single individual in the presence of a cell growth factor. The present invention has been achieved by focusing on the fact that co-culture of neurons and glial cells derived from a single individual is possible.
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の工程を含む、単一個体由来の神経幹細胞から分化誘導された神経細胞とグリア細胞とを共培養する方法：
１）単一個体から採取された組織を用いて、神経幹細胞の分散した試料を調製する工程；
２）神経幹細胞の分散した試料を培地に添加し、神経幹細胞を細胞増殖因子を含む培地にて培養する工程；および、
３）同一容器内で、神経幹細胞から分化誘導された神経細胞およびグリア細胞を培養する工程。
２．細胞増殖因子がＥＧＦおよびＦＧＦを含む、前項１に記載の共培養方法。
３．グリア細胞がアストロサイトである、前項１または２に記載の共培養方法。
４．アストロサイトがタイプIIアストロサイトを含む、前項３に記載の共培養方法。
５．培養が接着培養法により行われる、前項１〜４のいずれか１に記載の共培養方法。
６．神経幹細胞が、マウスの脳組織から採取されたものである、前項１〜５のいずれか１に記載の共培養方法。
７．前項１〜６のいずれか１に記載の共培養方法により得られる、神経細胞とグリア細胞を含む組成物。
８．前項７に記載の組成物を用いて、神経細胞および／またはグリア細胞の機能を解析する方法。
９．アデノウイルスを用いて、グリア細胞の内在遺伝子に変異を導入する、および／または、グリア細胞に外来遺伝子を導入することを含む、前項８に記載の神経細胞および／またはグリア細胞の機能を解析する方法。
That is, the present invention is as follows.
1. A method of co-culturing neuronal cells and glial cells that are induced to differentiate from neural stem cells derived from a single individual, comprising the following steps:
1) A step of preparing a dispersed sample of neural stem cells using a tissue collected from a single individual;
2) adding a sample in which neural stem cells are dispersed to a medium, and culturing the neural stem cells in a medium containing a cell growth factor; and
3) A step of culturing nerve cells and glial cells induced to differentiate from neural stem cells in the same container.
2. 2. The co-culture method according to item 1 above, wherein the cell growth factor comprises EGF and FGF.
3. 3. The co-culture method according to item 1 or 2, wherein the glial cell is an astrocyte.
4). 4. The co-culture method according to item 3 above, wherein the astrocytes include type II astrocytes.
5. 5. The co-culture method according to any one of items 1 to 4, wherein the culture is performed by an adhesion culture method.
6). 6. The co-culture method according to any one of 1 to 5 above, wherein the neural stem cells are collected from mouse brain tissue.
7). 7. A composition comprising nerve cells and glial cells obtained by the co-culture method according to any one of 1 to 6 above.
8). 8. A method for analyzing the function of nerve cells and / or glial cells using the composition according to item 7 above.
9. The function of the nerve cell and / or glial cell according to item 8 above, comprising introducing a mutation into an endogenous gene of a glial cell and / or introducing a foreign gene into the glial cell using an adenovirus Method.
本発明により、細胞増殖因子（例えばEGFやFGF）を利用することにより、安価かつ簡便に、神経細胞とグリア細胞との共培養系の確立することができた。例えば、同一マウス胎児脳由来の神経幹細胞を利用して本発明の共培養方法を行った場合、生体の脳内において見られるタイプIIアストロサイトを多数分化誘導することができた。本発明の共培養方法によれば、神経細胞とグリア細胞が同一容器内でネットワークを構成している可能性が高く、従来の単培養系と単培養系を混合してなる共培養系に比べて、より生体脳に近い条件での研究を行うことができると考えられる。
さらに本発明の共培養方法では、使用が容易でありかつ、操作が簡便なアデノウイルスを用いて、グリア細胞（特にアストロサイト）特異的に遺伝子工学的な手法により機能を操作することが可能である。よって、本発明の共培養方法を用いてグリア細胞共存下での神経細胞の機能解析や、あるいは逆に神経細共存下でのアストロサイトの機能解析を行うことが可能である。
According to the present invention, by using a cell growth factor (eg, EGF or FGF), a co-culture system of nerve cells and glial cells could be established inexpensively and easily. For example, when the co-culture method of the present invention was performed using neural stem cells derived from the same mouse fetal brain, many type II astrocytes found in the brain of a living body could be induced to differentiate. According to the co-culture method of the present invention, there is a high possibility that nerve cells and glial cells constitute a network in the same container, compared with a co-culture system in which a conventional single culture system and a single culture system are mixed. Therefore, it is considered that the research can be conducted under conditions closer to the living brain.
Furthermore, in the co-culture method of the present invention, the function can be manipulated by a genetic engineering technique specific to glial cells (particularly astrocytes) using an adenovirus that is easy to use and easy to manipulate. is there. Therefore, it is possible to analyze the function of neurons in the presence of glial cells, or conversely, to analyze the function of astrocytes in the presence of neurons.
本発明は、単一個体由来の神経幹細胞から分化誘導された神経細胞とグリア細胞とを共培養する方法であって、以下の工程を含む共培養方法を対象とする。
１）単一個体から採取された組織を用いて、神経幹細胞の分散した試料を調製する工程。
２）神経幹細胞の分散した試料を培地に添加し、神経幹細胞を細胞増殖因子を含む培地にて培養する工程。
３）同一容器内で、神経幹細胞から分化誘導された神経細胞およびグリア細胞を培養する工程。
まず図１を参照しながら各細胞について説明した後、工程１）〜３）について説明する。
The present invention is a method of co-culturing neuronal cells and glial cells that have been induced to differentiate from neural stem cells derived from a single individual, and is directed to a co-culturing method including the following steps.
1) A step of preparing a sample in which neural stem cells are dispersed using a tissue collected from a single individual.
2) A step of adding a sample in which neural stem cells are dispersed to a medium, and culturing the neural stem cells in a medium containing a cell growth factor.
3) A step of culturing nerve cells and glial cells induced to differentiate from neural stem cells in the same container.
First, each cell will be described with reference to FIG. 1, and then steps 1) to 3) will be described.
生体内において情報の伝達と処理を行う一連の器官を神経系と呼ぶ。神経系を構成する細胞としては神経細胞（neuron）とグリア細胞（glial cell）が挙げられ、両者は協働して神経系の維持や情報伝達を行っている。グリア細胞には、アストロサイト（astorocyte）、 オリゴデンドロサイト（oligodendrocyte）、マイクログリア、上衣細胞等が含まれる。神経細胞とグリア細胞は、生体内において神経幹細胞から分化誘導されると考えられている。 A series of organs that transmit and process information in a living body is called a nervous system. The cells that make up the nervous system include neurons and glial cells, both of which cooperate to maintain the nervous system and transmit information. The glial cells include astrocytes, oligodendrocytes, microglia, ependymocytes and the like. Neuronal cells and glial cells are thought to be induced to differentiate from neural stem cells in vivo.
本明細書において神経幹細胞とは、神経細胞や、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトなどのグリア細胞に分化しうる多分化能を有し、かつ自己複製能を有する中枢神経系多能性未分化細胞である。神経幹細胞は生体の脳内において、神経細胞、アストロサイトやオリゴデンドロサイトを供給する役割を担っていると考えられる。本発明において、神経幹細胞は細胞増殖因子を含む培地により培養されることにより、神経細胞およびグリア細胞（特にアストロサイト）に分化誘導される。一般的に神経幹細胞は、神経前駆細胞を経て神経細胞に誘導され、アストロサイト前駆細胞を経てアストロサイトに誘導され、オリゴデントロサイト前駆細胞を経てオリゴデントロサイトに誘導される。神経幹細胞は、ネスチン（Nestin）、RC2、ムサシ１（Musashi1）等のマーカーの発現を指標として、例えば、対応する遺伝子の発現を慣用の核酸の検出方法により調べること又はタンパク質の発現を免疫細胞組織化学的手法により調べることにより同定されうる。 In this specification, the neural stem cell is a central nervous system pluripotent undifferentiated cell having a multipotency capable of differentiating into a neuronal cell or a glial cell such as an astrocyte and an oligodendrocyte and having a self-replicating ability. is there. Neural stem cells are thought to play a role in supplying neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in the brain of the living body. In the present invention, neural stem cells are induced to differentiate into nerve cells and glial cells (particularly astrocytes) by being cultured in a medium containing a cell growth factor. In general, neural stem cells are induced into neural cells via neural progenitor cells, induced to astrocytes via astrocyte progenitor cells, and induced to oligodentrosite via oligodentrocytic progenitor cells. Neural stem cells, for example, by examining the expression of the corresponding gene by a conventional nucleic acid detection method using the expression of a marker such as Nestin, RC2, Musashi1 or the like as an index, or the expression of a protein in an immune cell tissue Can be identified by examination by chemical methods.
神経細胞とは、他の神経細胞または刺激受容細胞からの刺激を受け、別の神経細胞、筋または腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞である。また神経細胞の形態的特徴としては、細胞体、樹状突起、軸索、軸索成長円錐等が挙げられる。 A nerve cell is a cell having a function of receiving a stimulus from another nerve cell or a stimulating receptor cell and transmitting the stimulus to another nerve cell, muscle or gland cell. The morphological features of nerve cells include cell bodies, dendrites, axons, axon growth cones, and the like.
神経細胞は、神経細胞が産生する情報伝達物質の違いにより分類されるが、本発明においては情報伝達物質の種類については特に限定しない。情報伝達物質としては、ペプチド性、非ペプチド性のいずれも包含される。非ペプチド性の情報伝達物質のうち代表的な物質としては、ドーパミン、アセチルコリン、γアミノ酪酸等が挙げられる。より詳しくは、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン、セロトニン、アセチルコリン、γアミノ酪酸、グルタミン酸が挙げられる。ペプチド性の情報伝達物質のうち、代表的な物質としては副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、α-エンドルフィン、β-エンドルフィン、γ-エンドルフィン、バソプレッシン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 Nerve cells are classified according to the difference in information transmission substance produced by the nerve cell, but the type of information transmission substance is not particularly limited in the present invention. As the information transmitting substance, both peptide and non-peptide are included. Typical examples of non-peptide information transmitters include dopamine, acetylcholine, and γ-aminobutyric acid. More specifically, dopamine, noradrenaline, adrenaline, serotonin, acetylcholine, γ-aminobutyric acid, and glutamic acid can be mentioned. Among peptidic signaling substances, representative substances include, but are not limited to, adrenocorticotropic hormone (ACTH), α-endorphin, β-endorphin, γ-endorphin, vasopressin and the like. .
神経細胞は、MAP2、NeuN、NSE、Neurofilament、βIIItubulin等のマーカーの発現を指標として、例えば、対応する遺伝子の発現を慣用の核酸の検出方法により調べること又はタンパク質の発現を免疫細胞組織化学的手法により調べることにより同定されうる。 Nerve cells, for example, using the expression of markers such as MAP2, NeuN, NSE, Neurofilament, βIIItubulin as an index to examine the expression of the corresponding gene by a conventional nucleic acid detection method, or immunocytohistochemical techniques for protein expression Can be identified by examining.
グリア細胞は、神経細胞と神経細胞との隙間を埋め、神経細胞の代謝の仲介をするとともに、支持組織として働く細胞である。グリア細胞としては、中枢神経系では、アストロサイト、オリゴデンドロサイト及びミクログリオサイトが挙げられる。グリア細胞のうちアストロサイトは、単なる神経細胞の支持細胞として捉えられるのではなく、神経情報伝達や各種神経疾患の病態生理に深く積極的に関与することが分かっている。 The glial cell is a cell that fills the gap between the nerve cell and mediates the metabolism of the nerve cell and also acts as a supporting tissue. Examples of glial cells include astrocytes, oligodendrocytes, and microgliocytes in the central nervous system. It has been found that astrocytes among glial cells are not merely regarded as supporting cells of nerve cells, but are deeply and actively involved in the transmission of nerve information and the pathophysiology of various neurological diseases.
アストロサイトには、扁平形状（アメーバ状）の形態を持つタイプIアストロサイトや多数の突起（線維状の形態）を持つタイプIIアストロサイトがある。タイプIアストロサイトは、神経幹細胞からアストロサイトを単独で分化誘導させた培養系において見られる。タイプIIアストロサイトは、生体の脳内において見られるものであるが、神経幹細胞からアストロサイトを単独で分化誘導させた培養系においてはほとんど分化誘導することができない。本発明の共培養方法においてはタイプIIアストロサイトが多数存在する共培養系を得ることができる。 Astrocytes include type I astrocytes having a flat (amoeba) form and type II astrocytes having a large number of protrusions (fibrous forms). Type I astrocytes are found in culture systems in which astrocytes are induced to differentiate solely from neural stem cells. Type II astrocytes are found in the brain of living organisms, but hardly induce differentiation in a culture system in which astrocytes are induced to differentiate from neural stem cells alone. In the coculture method of the present invention, a coculture system in which many type II astrocytes are present can be obtained.
なおアストロサイトは、グリア繊維性酸性タンパク質（GFAP）や、S100β等のマーカーの発現を指標として、オリゴデントロサイトは、O4、GC、GD3、NG2等のマーカーの発現を指標として、例えば、対応する遺伝子の発現を慣用の核酸の検出方法により調べること又はタンパク質の発現を免疫細胞組織化学的手法により調べることにより同定されうる。 In addition, astrocytes are expressed using markers such as glial fibrillary acidic protein (GFAP) and markers such as S100β as indicators, and oligodentrosite is expressed using markers such as O4, GC, GD3, and NG2 as indicators. The gene can be identified by examining the expression of the gene to be detected by a conventional nucleic acid detection method or examining the expression of the protein by an immunocytohistochemical method.
（神経幹細胞の分散した試料を調製する工程）
本発明において、神経幹細胞の分散した試料は、単一の個体（生体）から採取された組織を用いて調製される。神経幹細胞の分散した試料は、単一の個体から、神経幹細胞を含む組織を採取し、当該組織から神経幹細胞を分離し調製すればよい。神経幹細胞を分離する組織としては神経幹細胞を含むものであれば特に限定されない。神経幹細胞を分離する組織としては、胎児の場合は脳組織（例えば大脳、小脳、脳幹）であれば部位は特に限定されず、例えば大脳皮質および／または海馬を用いることができ、成体の場合は海馬を用いることが好ましい。なお、脳組織は、腫瘍化した組織や遺伝子が変異した組織、病変のある組織等でもよいし、正常組織であってもよい。
(Step of preparing a sample in which neural stem cells are dispersed)
In the present invention, a sample in which neural stem cells are dispersed is prepared using a tissue collected from a single individual (living body). A sample in which neural stem cells are dispersed may be prepared by collecting a tissue containing neural stem cells from a single individual and separating the neural stem cells from the tissue. The tissue for separating neural stem cells is not particularly limited as long as it contains neural stem cells. As a tissue for separating neural stem cells, in the case of a fetus, the site is not particularly limited as long as it is a brain tissue (for example, cerebrum, cerebellum, brainstem). For example, cerebral cortex and / or hippocampus can be used. It is preferable to use the hippocampus. The brain tissue may be a tumorous tissue, a tissue with a mutated gene, a lesioned tissue, or the like, or a normal tissue.
神経幹細胞を分離する生体としては、例えば温血動物、好ましくは哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、サル、ヒト等が挙げられる。 Examples of the living body from which the neural stem cells are separated include warm-blooded animals, preferably mammals. Examples of mammals include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, goats, monkeys, humans, etc., preferably mice, rats, monkeys, humans, etc. Is mentioned.
組織から神経幹細胞の分散した試料を調製するためにはまず、組織から神経幹細胞を分離する必要がある。組織から神経幹細胞を分離する方法としては、自体公知の分離方法、例えば酵素処理や機械的処理で分離する方法等が挙げられる。細胞へのダメージや、培養系の安定性を考慮すれば、酵素処理で分離するのが好ましい。酵素処理に用いられる酵素としては、例えば、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、パパイン等が挙げられ、好ましくはトリプシンである。該酵素処理の条件は、細胞にダメージを与えず、本発明の方法により、神経幹細胞から神経細胞とグリア細胞を分化誘導し得るものである限り、特に限定されない。 In order to prepare a sample in which neural stem cells are dispersed from a tissue, it is first necessary to separate the neural stem cells from the tissue. Examples of a method for separating neural stem cells from a tissue include a separation method known per se, such as a method of separating by an enzyme treatment or a mechanical treatment. In view of damage to cells and stability of the culture system, it is preferable to separate the cells by enzyme treatment. Examples of the enzyme used for the enzyme treatment include trypsin, dispase, collagenase, papain and the like, preferably trypsin. The conditions for the enzyme treatment are not particularly limited as long as they do not damage cells and can induce differentiation of neural cells and glial cells from neural stem cells by the method of the present invention.
本発明において、組織から分離された神経幹細胞は、いかなる形態であってもよく、上記酵素処理後に遠心分離され、細胞ペレットの形態として存在しているものであってもよい。当該細胞ペレットには、神経幹細胞以外の細胞が含まれていてもよく、例えば、神経細胞を含むものであってもよい。後述する実施例のように胎生15日齢マウスの大脳皮質を用いて、細胞ペレットを作製した場合は、アストロサイトは実質的に含まれていない。 In the present invention, the neural stem cells separated from the tissue may be in any form, or may be centrifuged after the enzyme treatment and exist as a cell pellet. The cell pellet may contain cells other than neural stem cells. For example, the cell pellet may contain nerve cells. When cell pellets are prepared using the cerebral cortex of embryonic 15-day-old mice as in Examples described later, astrocytes are substantially not contained.
組織から分離された神経幹細胞を使用して、神経幹細胞の分散した試料を調製する。神経幹細胞の分散した試料の調製方法は特に限定されないが、神経幹細胞（例えば細胞ペレット）を、培養に使用する培地に分散させることにより調製することができる。本明細書において「神経幹細胞の分散した」とは、複数の細胞が集まって細胞塊を形成していることがなく、単一の細胞ごとにバラバラに分散している状態を意味する。本発明の神経幹細胞の分散した試料においては、試料中の全細胞が分散していてもよいが、全細胞のうち80%以上、好ましくは90%以上の細胞が分散した状態で存在すればよい。従来、神経幹細胞の未分化性を維持するためにin vitroで浮遊培養を行った場合、複数の細胞が集まった塊状態のニューロスフェアを形成するが、本明細書における神経幹細胞の分散した試料はニューロスフェアを形成しているものではない。本発明においては、組織から調製した神経幹細胞の分散した試料を培地に添加することにより、神経幹細胞が分散した状態での培養が可能となり、個々の細胞が別個に神経細胞やグリア細胞に分化することができる。個々の細胞が別個に神経細胞やグリア細胞に分化することにより、培養系内に神経細胞とグリア細胞が万遍なく混在し、生体の脳内と同様に神経細胞とグリア細胞が情報ネットワークを維持し得るような共培養系が得られるものと考えられる。 Neural stem cells isolated from the tissue are used to prepare a dispersed sample of neural stem cells. A method for preparing a sample in which neural stem cells are dispersed is not particularly limited, but it can be prepared by dispersing neural stem cells (for example, cell pellets) in a medium used for culture. In the present specification, “distributed neural stem cells” means a state in which a plurality of cells are not gathered to form a cell mass and are dispersed separately for each single cell. In the sample in which the neural stem cells of the present invention are dispersed, all cells in the sample may be dispersed, but 80% or more, preferably 90% or more of all cells may be present in a dispersed state. . Conventionally, when suspension culture is performed in vitro in order to maintain the undifferentiated nature of neural stem cells, a neurosphere in a lump state in which a plurality of cells are gathered is formed. It does not form a neurosphere. In the present invention, a neural stem cell-dispersed sample prepared from a tissue is added to the medium, thereby enabling culture in a state where the neural stem cells are dispersed, and individual cells are differentiated into neural cells and glial cells separately. be able to. Individual cells differentiate into nerve cells and glial cells separately, so that neurons and glial cells are mixed together in the culture system, and the neurons and glial cells maintain the information network as in the brain of the living body. It is thought that a co-culture system that can be obtained is obtained.
細胞を分散させる手法はいかなる手法であってもよいが、例えば自体公知のフィルターなどを用いて細胞を分散させることができる。また、ニューロスフェアを用いて神経幹細胞の分散した試料を調製する場合には、細胞を分散させる際に細胞にダメージが加わり細胞死を引き起こす可能性があるとともに、均一に分散した試料を得ることが困難である。よって本発明においては、ニューロスフェアを介さずに神経幹細胞の分散した試料が調製される。なおニューロスフェアとは、およそ50μm〜150μmの大きさの神経幹細胞の塊を意味する。 Any method may be used for dispersing the cells. For example, the cells can be dispersed using a filter known per se. In addition, when preparing a sample in which neural stem cells are dispersed using neurospheres, the cells may be damaged when the cells are dispersed, resulting in cell death and obtaining a uniformly dispersed sample. Have difficulty. Therefore, in the present invention, a sample in which neural stem cells are dispersed is prepared without using a neurosphere. The neurosphere means a mass of neural stem cells having a size of about 50 μm to 150 μm.
（神経幹細胞を培養する工程）
本発明の共培養方法では、上述のようにして得られた神経幹細胞の分散した試料を培地に添加し、神経幹細胞を細胞増殖因子を含む培地にて培養する。培地中における細胞の濃度は、神経幹細胞から神経細胞とグリア細胞を分化誘導し得るものである限り、特に限定されない。例えば、細胞培養プレート上の培地に神経幹細胞の分散した試料を添加する場合は、細胞の密度が約1×104〜1×106cells/cm2、好ましくは約10×104〜100×104cells/cm2、より好ましくは約50×104〜75×104cells/cm2であればよい。
(Process of culturing neural stem cells)
In the co-culture method of the present invention, the neural stem cell-dispersed sample obtained as described above is added to a medium, and the neural stem cells are cultured in a medium containing a cell growth factor. The concentration of cells in the medium is not particularly limited as long as it can induce differentiation of neural cells and glial cells from neural stem cells. For example, when a sample in which neural stem cells are dispersed is added to a medium on a cell culture plate, the density of the cells is about 1 × 10 4 to 1 × 10 6 cells / cm 2 , preferably about 10 × 10 4 to 100 ×. 10 4 cells / cm 2 , more preferably about 50 × 10 4 to 75 × 10 4 cells / cm 2 .
本発明において使用される細胞増殖因子は、神経幹細胞から神経細胞とグリア細胞を分化誘導し得るものである限り、特に限定されない。細胞増殖因子としては、EGF、FGF、Neurotrophin/NGF、Interleukin 6、TGF-βが挙げられるが、中でもEGFやFGFが好ましい。本発明の方法においては、特にEGFを用いることが好ましく、さらにEGFとFGF（好ましくはbFGF）の２種類を用いることが好ましい。 The cell growth factor used in the present invention is not particularly limited as long as it can induce differentiation of neural cells and glial cells from neural stem cells. Examples of cell growth factors include EGF, FGF, Neurotrophin / NGF, Interleukin 6, and TGF-β, among which EGF and FGF are preferred. In the method of the present invention, it is particularly preferable to use EGF, and it is more preferable to use two types of EGF and FGF (preferably bFGF).
培養培地中の細胞増殖因子の濃度は、細胞密度により変動し、特に限定されないが、例えば、EGFが含まれる場合、EGFの濃度としては75×104cells/cm2に対して0.1〜100ng/ml、より好ましくは1〜50ng/ml、FGFが含まれる場合、FGFの濃度としては75×104cells/cm2に対して0.1〜100ng/ml、より好ましくは1〜50ng/mlが例示される。また細胞増殖因子は、培養の開始時に培地に添加されることが好ましい。 The concentration of the cell growth factor in the culture medium varies depending on the cell density and is not particularly limited. For example, when EGF is included, the EGF concentration is 0.1 to 100 ng / cm2 with respect to 75 × 10 4 cells / cm 2 . ml, more preferably 1 to 50 ng / ml, when FGF is included, the concentration of FGF is exemplified by 0.1 to 100 ng / ml, more preferably 1 to 50 ng / ml with respect to 75 × 10 4 cells / cm 2 The The cell growth factor is preferably added to the medium at the start of culture.
本発明の方法に用いられる培地は、本発明の方法により神経幹細胞から神経細胞とグリア細胞を分化誘導し得るものであれば、特に限定されないが、例えば、自体公知の培地（DMEM、EMEM、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10、M-199、HAM、L-15、ERDF等）を挙げることができる。また、神経細胞培養用等に改変された培地（Neurobasal等）を用いてもよく、上記培地の混合物（DMEM/F12等）を用いてもよい。 The medium used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it can induce differentiation of nerve cells and glial cells from neural stem cells by the method of the present invention. For example, a medium known per se (DMEM, EMEM, RPMI) -1640, α-MEM, F-12, F-10, M-199, HAM, L-15, ERDF, and the like. Further, a medium (Neurobasal or the like) modified for neuronal cell culture or the like may be used, or a mixture of the above medium (DMEM / F12 or the like) may be used.
本発明において用いられる培地には、各種のホルモンが添加されていることが好ましい。好適なホルモンとしては、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、β-エストラジオール、トリヨードチロシン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム等が例示される。本発明において用いられる培地には、これらの全てのホルモンが添加されていることが好ましい。 It is preferable that various hormones are added to the medium used in the present invention. Suitable hormones include insulin, transferrin, progesterone, β-estradiol, triiodotyrosine, putrescine, sodium selenite and the like. All of these hormones are preferably added to the medium used in the present invention.
また本発明において用いられる培地には、上記ホルモン以外の自体公知の添加物が含まれ得る。添加物としては、例えば、有機酸（例えばピルビン酸ナトリウム等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール、脂質、セレン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、アルブミン等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。 The medium used in the present invention may contain additives known per se other than the above hormones. Examples of additives include organic acids (eg, sodium pyruvate), amino acids (eg, L-glutamine), reducing agents (eg, 2-mercaptoethanol, lipids, selenium, etc.), buffers (eg, HEPES), antibiotics, and the like. Substances (for example, streptomycin, penicillin, gentamicin, etc.), albumin and the like can be mentioned. Each of the additives is preferably contained within a concentration range known per se.
培地は、血清を含まない無血清培地を用いることが好ましい。無血清培地とは、無調製または未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、細胞増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。 It is preferable to use a serum-free medium without serum. A serum-free medium means a medium that does not contain unprepared or unpurified serum. A medium that contains purified blood-derived components or animal tissue-derived components (for example, cell growth factor) is a serum-free medium. Applicable.
本発明においては、神経幹細胞は接着培養法により培養される。神経幹細胞の未分化性を維持する場合は一般的に接着培養法ではなく浮遊培養法が用いられるが、神経幹細胞を浮遊培養するとニューロスフェアが形成されることが知られているため、本発明においては接着培養法が用いられる。 In the present invention, neural stem cells are cultured by an adhesion culture method. In order to maintain the undifferentiation of neural stem cells, a suspension culture method is generally used instead of an adhesion culture method. However, it is known that neurospheres are formed when neural stem cells are cultured in suspension. Adhesion culture method is used.
接着培養法は、細胞を培地中において、細胞培養器の接触面に対し、接着させた状態で培養する方法である。接着培養法では、細胞は２次元構造で培養され得る。接着の強度は、本発明の方法により神経幹細胞から神経細胞とグリア細胞が分化誘導され得る強度範囲であれば特に限定されないが、好ましくは、タッピング処理、ピペッティング処理等の人為的処理によらなければ、生存性を維持したまま細胞を剥離することができない程度の強度である。 The adhesion culture method is a method of culturing cells in a culture medium in a state of being adhered to the contact surface of the cell culture vessel. In adhesion culture, cells can be cultured in a two-dimensional structure. The strength of adhesion is not particularly limited as long as it is in a strength range in which neural cells and glial cells can be induced to differentiate from neural stem cells by the method of the present invention, but preferably, it should not be by artificial treatment such as tapping treatment or pipetting treatment. For example, the strength is such that cells cannot be detached while maintaining viability.
接着培養法では、接着性を増強させるため、細胞接着性の培養器、例えば細胞外マトリックス（例えばラミニン、テネイシン、フィブロネクチン、コラーゲン）、ポリ−D-リジン、ポリ−L−リジン、ポリエチレンイミン等によりコーティング処理した培養器を使用することが好ましい。 In the adhesion culture method, in order to enhance adhesion, a cell adhesion incubator such as an extracellular matrix (for example, laminin, tenascin, fibronectin, collagen), poly-D-lysine, poly-L-lysine, polyethyleneimine, etc. It is preferred to use a coated incubator.
神経幹細胞の培養条件は特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。例えば、5％CO2雰囲気下、37℃で4〜10日間培養される。培地は、2〜5日間に一度交換することが好ましい。 The culture conditions for neural stem cells are not particularly limited, and can be carried out under conditions that are usually performed in the art. For example, the cells are cultured at 37 ° C. for 4 to 10 days in a 5% CO 2 atmosphere. It is preferable to change the medium once every 2 to 5 days.
（神経細胞およびグリア細胞を培養する工程）
上述のようにして神経幹細胞を培養することにより、神経幹細胞から神経細胞およびグリア細胞を分化誘導することができ、同一容器内における単一個体由来の神経細胞およびグリア細胞の共培養系が構築され、神経細胞およびグリア細胞を共培養することが可能となる。
(Process of culturing nerve cells and glial cells)
By culturing neural stem cells as described above, it is possible to induce differentiation of neural cells and glial cells from neural stem cells, and a co-culture system of neural cells and glial cells derived from a single individual in the same container is constructed. It becomes possible to co-culture nerve cells and glial cells.
本発明にて構築される共培養系は神経細胞とグリア細胞を含む組成物である。本発明における共培養系は、神経細胞とグリア細胞が均一に分散して共存するものであり、同一細胞集団で密集して存在しているものではない。本発明にて構築される共培養系において、神経細胞とグリア細胞の割合は100：50〜1000であり、好ましくは100：100〜300である。 The co-culture system constructed in the present invention is a composition containing nerve cells and glial cells. In the co-culture system in the present invention, nerve cells and glial cells are uniformly dispersed and coexist, and are not densely present in the same cell population. In the co-culture system constructed in the present invention, the ratio of nerve cells to glial cells is 100: 50 to 1000, preferably 100: 100 to 300.
本発明にて構築される共培養系においては、グリア細胞としてアストロサイトが分化誘導されることが好ましい。当該共培養系に存在するアストロサイトは、タイプIアストロサイトがほとんど存在せず、タイプIIアストロサイトが多数存在する。本発明にて構築される共培養系におけるタイプIアストロサイトとタイプIIアストロサイトの割合は1〜5：100であり、好ましくは1〜2：100である。 In the co-culture system constructed in the present invention, it is preferable that astrocytes are induced to differentiate as glial cells. As for the astrocytes present in the co-culture system, there are almost no type I astrocytes and there are many type II astrocytes. The ratio of type I astrocytes and type II astrocytes in the co-culture system constructed in the present invention is 1 to 5: 100, preferably 1 to 2: 100.
（共培養系を用いた解析方法）
本発明により構築された共培養系を用いて、神経細胞および／またはグリア細胞の機能を解析することができる。当該共培養系を用いて、外来遺伝子（例えば遺伝学的に同定された各種神経疾患の原因遺伝子）を神経細胞および／またはグリア細胞に導入し神経細胞および／またはグリア細胞の機能を解析する方法、あるいは、神経細胞またはグリア細胞の内在遺伝子に変異を導入することにより、当該内在遺伝子の神経ネットワーク上での機能を解析する方法などが、解析方法として例示される。神経細胞またはグリア細胞の機能について、自体公知の分析手法により解析すればよい。
(Analysis method using co-culture system)
Using the co-culture system constructed according to the present invention, the function of nerve cells and / or glial cells can be analyzed. Method for analyzing functions of nerve cells and / or glial cells by introducing foreign genes (for example, genes that have been genetically identified to cause various neurological diseases) into nerve cells and / or glial cells using the co-culture system Alternatively, a method of analyzing the function of the endogenous gene on the neural network by introducing a mutation into the endogenous gene of the nerve cell or glial cell is exemplified as the analysis method. What is necessary is just to analyze the function of a nerve cell or a glial cell by a well-known analysis method.
グリア細胞への遺伝子導入はアデノウイルスを用いて行うことができる。アデノウイルスによるグリア細胞への遺伝子導入は自体公知の手法により行えばよい。
例えば、CreLoxPシステムを利用した各種floxマウスを用いて共培養系を構築し、Cre recombinaseアデノウイルス（理化学研究所）を感染させることにより、目的の遺伝子をアストロサイトのみで簡便に欠損させることが可能である。
Gene transfer into glial cells can be performed using adenovirus. Gene transfer into glial cells by adenovirus may be performed by a method known per se.
For example, by constructing a co-culture system using various flox mice using the CreLoxP system and infecting with the Cre recombinase adenovirus (RIKEN), the target gene can be easily deleted only with astrocytes. It is.
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。なお本実施例は金沢大学動物実験指針に基づいて行った。 The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples. In addition, this Example was performed based on the Kanazawa University animal experiment guideline.
（実施例１）神経細胞とアストロサイトの共培養系の構築
１）神経幹細胞を分散した試料の調製と神経幹細胞の培養
神経幹細胞を分散した試料の調製と神経幹細胞の培養において、まず使用した動物および試薬について説明し、その後手法について説明をする。
（ｉ）胎生15日齢マウス(E15マウス)
（ii）10%Hormone mix/DMEM（10%HM/DMEM）
DMEM Powder（Invitrogen, 12100）（NaHCO3 1.125 g、Glucose 5.05 g、HEPES 1.2 g、Glutamine 0.292 g）と、100×antibiotic（Penicillin-Streptomycin, liquid）（Invitrogen, 15140-122）を10 mlと、超純水 900mlとを混合して、フィルトレーションを行った。
6.25 mg/ml インスリン（Insulin） 160 μl (final: 5 ug/ml)、12.5 mg/ml トランスフェリン（Transferrin） 8 ml (final: 0.5 mg/ml)、1 mM プロゲステロン（Progesterone） 40 μl (final: 0.2 uM)、1 nM β-エストラジオール（β-Estradiol） 2 ml (final: 0.01 nM)、3 μM トリヨードチロシン（Triiodothyronine） 2 ml (final: 0.03 μM)、10 mM プトレシン（Putrescine） 20 ml (final: 1 mM)、4 μg/ml 亜セレン酸ナトリウム（Sodium selenite：Na2SeO3)） 4 ml (final: 0.08 ug/ml)、超純水 200 mlを混合し、10×Hormone mixを作製した。6.25 mg/ml インスリンは、Sigma社 I-6634の粉末 6.25 mg と、0.01 N HCl 1 mlを溶解したものである。12.5 mg/ml トランスフェリンは、Sigma社 T-2252の粉末 500 mgを超純水に溶解して40 mlに調整したものである。1 mM プロゲステロンは、Sigma社 P-8738（apo-Transferrin）の粉末3.14 mgをEtOHに溶解して超純水で10 mlに調整したものである。1 nM β-エストラジオールは、Sigma社 E-2758の粉末2.72 mgをEtOHに溶解して超純水で10 mlに調整して1mMの溶液を得て希釈したものである。3 μM トリヨードチロシン（Triiodothyronine）は、Sigma社 T-6397（3,3',5-Triiodo-L-thyronine）の粉末 2.019 mgを0.1 N NaOH 1.0 mlに溶解して3mMの溶液を得て、超純水で希釈したものである。10 mM プトレシンは、Sigma社 P-5780の粉末32.22 mgを超純水20 mlに溶解したものである。4 μg/ml 亜セレン酸ナトリウムは、Sigma社 S-5261の粉末4.0 mgを超純水1.0 mlに溶解して4mg/mlの溶液を得て、超純水で希釈したものである。
（iii）PBS（Phosphate buffered saline）
NaCl（nacalai tesque, 31320-34） 80.0 g、Na2HPO4, anhydrous（Wako, 197-02865） 11.5 g、KCl（Wako, 163-03545） 2.0 g、KH2PO4（Wako, 169-04245） 2.0 g、超純水 1 Lに溶解して、溶液をオートクレーブして、10×PBSを作製した。1×PBSは、10×PBSを希釈して作製した。なお、以下特に記載しない限り「PBS」と記載するものは1×PBSを使用した。
（iv）トリプシン液
1.25 g Trypsin (Difco 1:250)、2.5 g Glucose、50 mL 10×PBS（Ca, Mg-free PBS）を混合し、450ｍLの滅菌水に加えて、４℃で一晩、スターラーで攪拌しながら溶解させた。フィルトレーション後、分注した。
（v）馬血清（Gibco, Cat# 16050-122）
（vi）DNase液
DNase（Sigma, DN-25）を超純水にて10 mg/mlの濃度に調整した。フィルトレーションした後、小分けした。
（vii）Poly-lysine-coated Dish
Poly-L-lysine (Sigma, P-1399)を、超純水にて500μg/mlの濃度に調整し、フィルトレーションした後、使用時まで冷凍保存した。使用時は、75μg/mlに超純水にて希釈し、フィルトレーションした後に使用した。Dishのコーティングは、75μg/mlのPoly-lysine液をDishに添加し、4〜16時間インキュベーターで放置して行った。その後、滅菌精製水で2回洗浄した。16時間以上コーティングした場合は3回洗浄した。
（viii）EGF（human epidermal growth factor）
Biomedical Technologies, BT-102の粉末50μgを、滅菌精製水5 mlに溶解して、フィルトレーションをして、10μg/ml EGF溶液を作製した。
（ix）FGF （human fibroblast growth factor）
Biomedical Technologies, BT-108の粉末10μgを、滅菌精製水1 mlに溶解して、フィルトレーションをして、10μg/ml FGF溶液を作製した。
(Example 1) Construction of a co-culture system of neural cells and astrocytes 1) Preparation of a sample in which neural stem cells are dispersed and culture of neural stem cells First of all, animals used for preparation of a sample in which neural stem cells are dispersed and culture of neural stem cells Then, the reagent will be described, and then the method will be described.
(I) Embryonic 15-day-old mice (E15 mice)
(Ii) 10% Hormone mix / DMEM (10% HM / DMEM)
DMEM Powder (Invitrogen, 12100) (NaHCO 3 1.125 g, Glucose 5.05 g, HEPES 1.2 g, Glutamine 0.292 g), 100 × antibiotic (Penicillin-Streptomycin, liquid) (Invitrogen, 15140-122), more than 10 ml, Filtration was performed by mixing 900 ml of pure water.
6.25 mg / ml Insulin 160 μl (final: 5 ug / ml), 12.5 mg / ml Transferrin 8 ml (final: 0.5 mg / ml), 1 mM Progesterone 40 μl (final: 0.2 uM), 1 nM β-Estradiol 2 ml (final: 0.01 nM), 3 μM Triiodothyronine 2 ml (final: 0.03 μM), 10 mM Putrescine 20 ml (final: 1 mM), 4 μg / ml sodium selenite (Na 2 SeO 3 ) 4 ml (final: 0.08 ug / ml) and ultrapure water 200 ml were mixed to prepare a 10 × Hormone mix. 6.25 mg / ml insulin is obtained by dissolving 6.25 mg of Sigma I-6634 powder and 1 ml of 0.01 N HCl. 12.5 mg / ml transferrin is prepared by dissolving 500 mg of Sigma T-2252 powder in ultrapure water to make 40 ml. 1 mM progesterone was prepared by dissolving 3.14 mg of Sigma P-8738 (apo-Transferrin) powder in EtOH and adjusting to 10 ml with ultrapure water. 1 nM β-estradiol is obtained by dissolving 2.72 mg of Sigma E-2758 powder in EtOH and adjusting to 10 ml with ultrapure water to obtain a 1 mM solution. 3 μM Triiodothyronine was prepared by dissolving 2.019 mg of Sigma T-6397 (3,3 ', 5-Triiodo-L-thyronine) powder in 1.0 ml of 0.1 N NaOH to obtain a 3 mM solution. Diluted with ultrapure water. 10 mM putrescine is obtained by dissolving 32.22 mg of Sigma P-5780 powder in 20 ml of ultrapure water. 4 μg / ml sodium selenite is obtained by dissolving 4.0 mg of Sigma S-5261 powder in 1.0 ml of ultrapure water to obtain a 4 mg / ml solution and diluting with ultrapure water.
(Iii) PBS (Phosphate buffered saline)
NaCl (nacalai tesque, 31320-34) 80.0 g, Na 2 HPO 4 , anhydrous (Wako, 197-02865) 11.5 g, KCl (Wako, 163-03545) 2.0 g, KH 2 PO 4 (Wako, 169-04245) 2.0 g, dissolved in 1 L of ultrapure water, and the solution was autoclaved to prepare 10 × PBS. 1 × PBS was prepared by diluting 10 × PBS. Unless otherwise specified, 1 × PBS was used for “PBS”.
(Iv) Trypsin solution
Mix 1.25 g Trypsin (Difco 1: 250), 2.5 g Glucose, 50 mL 10 × PBS (Ca, Mg-free PBS), add to 450 mL of sterile water, and stir with a stirrer at 4 ° C. overnight. Dissolved. After filtration, it was dispensed.
(V) Horse serum (Gibco, Cat # 16050-122)
(Vi) DNase solution
DNase (Sigma, DN-25) was adjusted to a concentration of 10 mg / ml with ultrapure water. After filtration, it was subdivided.
(Vii) Poly-lysine-coated dish
Poly-L-lysine (Sigma, P-1399) was adjusted to a concentration of 500 μg / ml with ultrapure water, filtered, and stored frozen until use. At the time of use, it was diluted with ultrapure water to 75 μg / ml and used after filtration. Dish coating was performed by adding 75 μg / ml Poly-lysine solution to Dish and leaving it in an incubator for 4 to 16 hours. Then, it was washed twice with sterilized purified water. When coated for 16 hours or more, it was washed 3 times.
(Viii) EGF (human epidermal growth factor)
50 μg of Biomedical Technologies, BT-102 powder was dissolved in 5 ml of sterilized purified water and filtered to prepare a 10 μg / ml EGF solution.
(Ix) FGF (human fibroblast growth factor)
10 μg of Biomedical Technologies, BT-108 powder was dissolved in 1 ml of sterilized purified water and filtered to prepare a 10 μg / ml FGF solution.
本実施例の手法の概略図を図２に示す。
E15マウスを培養室に運び、一匹ずつ脳組織を取り出し、冷PBS中に移した。
顕微鏡下で脳組織から海馬あるいは大脳皮質を切り出し、冷PBS中に移した。
50 mL遠沈管に、海馬あるいは大脳皮質の組織片をそのままいれ、5 mLのトリプシン液を加えて、20分間、37℃でトリプシン処理を行った。トリプシン処理後の遠沈管に、馬血清5 ml（トリプシンと等量）とDNase液 50 μl（1/100量）を加え、1500 rpmで1.5分間、遠心処理を行った。遠心後、上清を除き、0.9 mLの10%HM/DMEMを加えて、ピペッティングして細胞を分散させた。分散させた後、4 mlの10%HM/DMEMを加えて、めがね用フィルター（Kodac）で細胞をろ過し、神経幹細胞を分散した試料を得た。
神経幹細胞を分散した試料について、計数盤を用いて細胞をカウントし、10%HM/DMEMに20 ng/ml EGFおよび20ng/ml FGFを加えた培地を用いて、150x104 cells/mlの濃度になるように希釈して調整した。Poly-lysine-coated Dishに75×104cells/cm2となるよう細胞を播種して、培養を5％CO2気相下、37℃で行った。４日に１回の頻度で培地を全量、新しい培地（10%HM/DMEMに20 ng/ml EGFおよび20ng/ml FGFを加えたもの）に交換し、合計８日間培養を行った。
A schematic diagram of the method of this embodiment is shown in FIG.
E15 mice were brought into the culture room and brain tissues were removed one by one and transferred into cold PBS.
The hippocampus or cerebral cortex was excised from the brain tissue under a microscope and transferred into cold PBS.
A hippocampus or cerebral cortex tissue piece was placed in a 50 mL centrifuge tube as it was, 5 mL trypsin solution was added, and trypsinization was performed at 37 ° C. for 20 minutes. To the centrifuge tube after the trypsin treatment, 5 ml of equine serum (equivalent to trypsin) and 50 μl of DNase solution (1/100 volume) were added and centrifuged at 1500 rpm for 1.5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, 0.9 mL of 10% HM / DMEM was added, and the cells were dispersed by pipetting. After the dispersion, 4 ml of 10% HM / DMEM was added, and the cells were filtered with a filter for glasses (Kodac) to obtain a sample in which neural stem cells were dispersed.
For a sample in which neural stem cells are dispersed, count the cells using a counter and use a medium containing 10% HM / DMEM plus 20 ng / ml EGF and 20 ng / ml FGF to a concentration of 150 x 10 4 cells / ml. It diluted and adjusted so that it might become. Cells were seeded at 75 × 10 4 cells / cm 2 in a poly-lysine-coated dish and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 gas phase. The medium was replaced with a fresh medium (10% HM / DMEM plus 20 ng / ml EGF and 20 ng / ml FGF) once every 4 days, and cultured for a total of 8 days.
２）免疫染色
神経幹細胞の培養後、分化誘導された細胞の分析のために免疫染色を行った。免疫染色に用いた試薬をまず説明し、その後手法について説明をする。
（i）PFA（パラホルムアルデヒド：Paraformaldehyde）溶液
0.2M リン酸緩衝液（PB）を、Na2HPO4 46.28gとNaH2PO4 5.16gを超純水に溶解して、1000mlに調整した。
パラホルムアルデヒド（Wako, 162-16065）40 gを、超純水300mLに加えて、ドラフト内で65℃に加熱しながらスターラーで撹拌した。さらに5N NaOH 160μLを加えて完全に溶解させた。溶解後、超純水を加えて500mLに調整し、再び攪拌を行った後、溶液が透明にし、8%PFA in 超純水を得た。得られた8%PFA in 超純水を使用時まで氷冷して保存した。
8%PFA in 超純水と、0.2M PBを等量混合することにより、4%PFA in 0.1M PBを得た。4%PFA in 0.1M PBは用時調整して用いた。
（ii）PBS/0.1%TritonX-100
10%TritonXを、上記実施例１の１）にて用いたPBSで100倍希釈して、0.1%TritonX-100を作製した。。
（iii）normal goat serum (フナコシ, VEC S-1000)
（iv）一次抗体溶液
マウス抗MAP2抗体（SIGMA, M4403）またはウサギ抗GFAP抗体（SIGMA, G9269）をそれぞれ、3% normal goat serumを含むPBS/0.1%TritonX-100にて1500倍あるいは500倍に希釈した。
（v）二次抗体溶液
Alexa 488標識化抗マウスIgG抗体（Invitrogen, T20912）またはAlexa594標識化抗ウサギIgG抗体（Invitrogen, A31631）をそれぞれ、PBSにて1000倍あるいは500倍に希釈した。
（vi）ヘキスト溶液
Hoechest33342（SIGMA）をPBSにて1000倍に希釈した。
2) Immunostaining After culture of neural stem cells, immunostaining was performed for analysis of differentiated cells. First, the reagents used for immunostaining will be described, followed by a description of the technique.
(I) PFA (paraformaldehyde) solution
A 0.2M phosphate buffer (PB) was prepared by dissolving 46.28 g of Na 2 HPO 4 and 5.16 g of NaH 2 PO 4 in ultrapure water to adjust the volume to 1000 ml.
40 g of paraformaldehyde (Wako, 162-16065) was added to 300 mL of ultrapure water and stirred with a stirrer while heating to 65 ° C. in a fume hood. Further, 160 μL of 5N NaOH was added and completely dissolved. After dissolution, ultrapure water was added to adjust to 500 mL, and after stirring again, the solution became transparent and 8% PFA in ultrapure water was obtained. The obtained 8% PFA in ultrapure water was ice-cooled and stored until use.
4% PFA in 0.1M PB was obtained by mixing an equal amount of 0.2M PB with 8% PFA in ultrapure water. 4% PFA in 0.1M PB was used after adjustment.
(Ii) PBS / 0.1% TritonX-100
10% TritonX was diluted 100 times with PBS used in 1) of Example 1 to prepare 0.1% TritonX-100. .
(Iii) normal goat serum (Funakoshi, VEC S-1000)
(Iv) Primary antibody solution Mouse anti-MAP2 antibody (SIGMA, M4403) or rabbit anti-GFAP antibody (SIGMA, G9269), respectively, 1500 times or 500 times in PBS / 0.1% TritonX-100 containing 3% normal goat serum Diluted.
(V) Secondary antibody solution
Alexa 488-labeled anti-mouse IgG antibody (Invitrogen, T20912) or Alexa594-labeled anti-rabbit IgG antibody (Invitrogen, A31631) was diluted 1000-fold or 500-fold with PBS, respectively.
(Vi) Hoechst solution
Hoechest33342 (SIGMA) was diluted 1000 times with PBS.
実施例１の１）にて８日間培養した細胞を、PBSにて洗浄した。洗浄後、細胞を4%PFA in 0.1M PBにて15分間処理した。その後、PBSで３回洗浄した。さらに洗浄後の細胞を、PBS / 0.1% TritonX-100にて15分間処理を行い、PBSで３回洗浄した。その後、10% normal goat serumを含むPBS / 0.1%TritonX-100にて１時間処理を行った。一次抗体溶液を添加して、4℃にて16時間処理を行い、PBSで１回洗浄した。さらに、二次抗体溶液を添加して、4℃にて16時間処理を行い、PBSで２回洗浄した。ヘキスト溶液にて、室温にて10分間処理を行った。処理後、0.1M PBにて細胞を洗浄した後、0.1M PBを添加し、観察を行った。観察は、共焦点レーザー顕微鏡（LSM710、Carl Zeiss）を用いて行った。 The cells cultured for 8 days in 1) of Example 1 were washed with PBS. After washing, the cells were treated with 4% PFA in 0.1M PB for 15 minutes. Thereafter, it was washed 3 times with PBS. Further, the washed cells were treated with PBS / 0.1% TritonX-100 for 15 minutes and washed 3 times with PBS. Thereafter, treatment with PBS / 0.1% TritonX-100 containing 10% normal goat serum was performed for 1 hour. The primary antibody solution was added, treated at 4 ° C. for 16 hours, and washed once with PBS. Further, a secondary antibody solution was added, treated at 4 ° C. for 16 hours, and washed twice with PBS. Treatment with Hoechst solution at room temperature for 10 minutes. After the treatment, the cells were washed with 0.1 M PB, and then 0.1 M PB was added for observation. Observation was performed using a confocal laser microscope (LSM710, Carl Zeiss).
結果を図３〜６に示す。図３は、Hoechst33342により細胞を染色した写真であり、生細胞を可視化したものである。図４は、抗MAP抗体により細胞を染色した写真であり、神経細胞を可視化したものである。図５は、抗GFAP抗体により細胞を染色した写真であり、アストロサイトを可視化したものである。図６は、図３〜図５を重ね合わせたものである。培地に細胞増殖因子であるEGFとFGFを添加することにより、多数の突起を持ったアストロサイト数の顕著な増加が認められた。観察した結果、アストロサイトと神経細胞は単一細胞で存在し、培地中において偏らずに混在していることがわかった。 The results are shown in FIGS. FIG. 3 is a photograph of cells stained with Hoechst33342, which visualizes live cells. FIG. 4 is a photograph of cells stained with an anti-MAP antibody, which visualizes nerve cells. FIG. 5 is a photograph of cells stained with an anti-GFAP antibody, in which astrocytes are visualized. FIG. 6 is a superposition of FIGS. 3 to 5. By adding EGF and FGF, which are cell growth factors, to the medium, a marked increase in the number of astrocytes with many protrusions was observed. As a result of observation, it was found that astrocytes and nerve cells exist as single cells and are mixed in the medium without being biased.
（実施例２）共培養系におけるアストロサイト特異的な遺伝子の導入
共培養系においてアデノウイルスを用いて感染させることで、アストロサイト特異的に遺伝子を導入し、その後免疫染色を行い細胞を観察した。神経幹細胞を含む試料の調製と神経幹細胞の培養と免疫染色は、実施例１の方法と同様にして行った。実施例１に記載されていない試薬についてまず以下に説明し、その後手法について説明する。
（i）緑色蛍光タンパク質（GFP）過剰発現用アデノウイルス（AdV-GFP）感染溶液
AdV-GFPは、理化学研究所バイオリソースセンターよりAx1 CA gfp（RDB#1727）として購入した。500μLの10%HM/DMEMにAdV-GFP (109 pfu/ml)を10μl 加えてAdV-GFP感染溶液を用いた。
（ii）一次抗体溶液
ウサギ抗MAP2抗体（Abcam, ab32454）あるいはウサギ抗GFAP抗体（SIGMA, G9269）をそれぞれ、3% normal goat serumを含むPBS / 0.1%TritonX-100にて1000倍あるいは500倍に希釈した。
（iii）二次抗体溶液
Alexa 594標識化抗ウサギIgG抗体をPBSにて1000倍に希釈した。
(Example 2) Introduction of an astrocyte-specific gene in a co-culture system Infecting with an adenovirus in a co-culture system, the gene was introduced into an astrocyte-specific gene, followed by immunostaining and observing the cells . Preparation of a sample containing neural stem cells, culture of neural stem cells, and immunostaining were performed in the same manner as in Example 1. Reagents not described in Example 1 are first described below, followed by a method.
(I) Adenovirus (AdV-GFP) infection solution for overexpression of green fluorescent protein (GFP)
AdV-GFP was purchased as Ax1 CA gfp (RDB # 1727) from RIKEN BioResource Center. 10 μl of AdV-GFP (10 9 pfu / ml) was added to 500 μL of 10% HM / DMEM, and an AdV-GFP infection solution was used.
(Ii) Primary antibody solution Rabbit anti-MAP2 antibody (Abcam, ab32454) or rabbit anti-GFAP antibody (SIGMA, G9269) is 1000 times or 500 times in PBS / 0.1% TritonX-100 containing 3% normal goat serum, respectively. Diluted.
(Iii) Secondary antibody solution
Alexa 594-labeled anti-rabbit IgG antibody was diluted 1000 times with PBS.
実施例１の１）と同様の方法により神経幹細胞を分散した試料を調製し、神経幹細胞を培養した。培養８日目に、培地をAdV-GFP感染溶液に置換し、その後5％CO2気相下、37℃で４日間培養を行った。その後、一次抗体溶液と二次抗体溶液を上記のものを用いた以外は実施例１の手法と同様にして免疫染色を行い、細胞の観察を行った。 A sample in which neural stem cells were dispersed was prepared by the same method as in 1) of Example 1, and neural stem cells were cultured. On the 8th day of culture, the medium was replaced with an AdV-GFP infection solution, and then cultured for 4 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 gas phase. Thereafter, immunostaining was performed in the same manner as in Example 1 except that the above-described primary antibody solution and secondary antibody solution were used, and cells were observed.
結果を図８〜１１に示す。図８は、抗MAP2抗体により細胞を染色した写真であり、図９はその拡大図である。図１０は、抗GFAP抗体により細胞を染色した写真であり、図１１はその拡大図である。図８および図１０における写真中のバーは、100μmの大きさを示しており、図９および図１１における写真中のバーは、10μmの大きさを示す。EGFとFGF存在下での培養した細胞に、アデノウイルス（AdV）を用いてGFPを感染させると、GFAP陽性を示すアストロサイト選択的にGFPが発現し、MAP2陽性の神経細胞にはGFPが全く発現しなかった。AdV-GFPを感染させて免疫染色した画像において、30個のGFP陽性細胞のうち、MAP2もしくはGFAPに陽性な細胞の数を計測したところ、MAP2に陽性な細胞の数は0個であり、GFAPに陽性な細胞の数は30個全てであった。従って、実施例１の手法により構築された共培養系においてアストロサイト特異的に外来遺伝子を導入することが可能であることがわかった。 The results are shown in FIGS. FIG. 8 is a photograph of cells stained with anti-MAP2 antibody, and FIG. 9 is an enlarged view thereof. FIG. 10 is a photograph of cells stained with an anti-GFAP antibody, and FIG. 11 is an enlarged view thereof. The bar in the photograph in FIGS. 8 and 10 indicates a size of 100 μm, and the bar in the photograph in FIGS. 9 and 11 indicates a size of 10 μm. When cells cultured in the presence of EGF and FGF are infected with GFP using adenovirus (AdV), GFP is selectively expressed in astrocytes showing GFAP positivity, and GFP is completely present in MAP2-positive neurons. Not expressed. In the image immunostained by infection with AdV-GFP, the number of cells positive for MAP2 or GFAP among 30 GFP positive cells was counted, and the number of cells positive for MAP2 was 0, and GFAP There were all 30 cells positive for. Therefore, it was found that a foreign gene can be introduced in an astrocyte-specific manner in the co-culture system constructed by the method of Example 1.
本発明によれば、生体の脳に近い条件下で、神経細胞とグリア細胞とを共培養することが可能となる。グリア細胞のうちアストロサイトは近年、単なる神経細胞の支持細胞として捉えられるのではなく、神経情報伝達や各種神経疾患の病態生理に深く、積極的に関与することが分かってきた。本発明における共培養系を用いれば、遺伝学的に同定された各種神経疾患の原因遺伝子を、アデノウイルスを用いてアストロサイト選択的に導入して、アストロサイト機能変動に伴う神経細胞の機能解析を行うことが可能である。また本発明の共培養系によれば、神経細胞とアストロサイトの共存条件下で、注目する遺伝子をアストロサイトのみで簡便に欠損させることができ、神経細胞とアストロサイト間の連関を解析することが可能となる。また、本発明により難治性疾患患者から共培養系を構築することにより、神経細胞とアストロサイト間の連関異常に起因する種々の中枢神経系疾患の発症メカニズム解明と、その後の創薬戦略展開に大きく貢献することが可能になると期待される。 According to the present invention, nerve cells and glial cells can be co-cultured under conditions close to those of the living body brain. In recent years, it has been found that astrocytes among glial cells are deeply and actively involved in the transmission of nerve information and the pathophysiology of various neurological diseases, rather than simply being regarded as supporting cells of nerve cells. By using the co-culture system in the present invention, genetically identified causative genes of various neurological diseases are selectively introduced into astrocytes using adenovirus, and functional analysis of nerve cells accompanying astrocyte function fluctuations is performed. Can be done. Further, according to the co-culture system of the present invention, the gene of interest can be easily deleted only with astrocytes under the coexistence conditions of neurons and astrocytes, and the association between neurons and astrocytes is analyzed. Is possible. In addition, by constructing a co-culture system from patients with refractory diseases according to the present invention, elucidation of the onset mechanism of various central nervous system diseases caused by abnormal linkage between nerve cells and astrocytes, and subsequent development of drug discovery strategies It is expected to be able to contribute greatly.
Claims (9)
１）単一個体から採取された組織を用いて、神経幹細胞の分散した試料を調製する工程；
２）神経幹細胞の分散した試料を培地に添加し、神経幹細胞を細胞増殖因子を含む培地にて培養する工程；および、
３）同一容器内で、神経幹細胞から分化誘導された神経細胞およびグリア細胞を培養する工程。 A method of co-culturing neuronal cells and glial cells that are induced to differentiate from neural stem cells derived from a single individual, comprising the following steps:
1) A step of preparing a dispersed sample of neural stem cells using a tissue collected from a single individual;
2) adding a sample in which neural stem cells are dispersed to a medium, and culturing the neural stem cells in a medium containing a cell growth factor; and
3) A step of culturing nerve cells and glial cells induced to differentiate from neural stem cells in the same container.
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