JP2013005756A - Transformant of plasmacytoid dendritic cell property leukemia cell line and use of the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の形質転換体に関する。更に、本発明は、当該形質転換体の作製方法、当該形質転換体を利用した各種方法に関する。 The present invention relates to a transformant of a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line. Furthermore, the present invention relates to a method for producing the transformant and various methods using the transformant.
樹状細胞は、抗原提示細胞として機能する免疫細胞の一種であり、哺乳類の免疫系の一部を担っている。樹状細胞は、抗原を取り込むと活性化され、リンパ節や脾臓等において、取り込んだ抗原に特異的なＴ細胞やＢ細胞を、直接的又は間接的に活性化する。現在、樹状細胞は、発現している表面抗原分子によって、形質細胞様樹状細胞（Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ｐＤＣ）、骨髄系樹状細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ｍＤＣ）等に分類されている。 Dendritic cells are a type of immune cell that functions as an antigen-presenting cell, and are part of the mammalian immune system. Dendritic cells are activated when antigen is taken up, and directly or indirectly activate T cells and B cells specific to the taken-in antigen in lymph nodes, spleen and the like. Currently, dendritic cells are classified into plasmacytoid dendritic cells (pDC), myeloid dendritic cells (mDC), and the like, depending on the surface antigen molecules that are expressed.
形質細胞様樹状細胞は、形質細胞に類似した形態を有し、ＣＤ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１２３、及びＣＤ４５ＲＡが陽性で、分化マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１３、及びＣＤ１１ｃ）が陰性であることが知られている（非特許文献１参照）。また、この形質細胞様樹状細胞は、ＩＦＮ−αを含むインターフェロンの産生を担っており、獲得免疫や自然免疫において、重要な役割を果たすことが明らかにされている（非特許文献１参照）。 Plasmacytoid dendritic cells have a morphology similar to plasma cells, and are positive for CD4, HLA-DR, CD123, and CD45RA and negative for differentiation markers (CD3, CD19, CD13, and CD11c). It is known (see Non-Patent Document 1). Further, this plasmacytoid dendritic cell is responsible for production of interferon including IFN-α, and has been revealed to play an important role in acquired immunity and innate immunity (see Non-Patent Document 1). .
一方、正常な形質細胞様樹状細胞の悪性カウンターパートであるＣＤ４＋ＣＤ５６＋白血病細胞の存在が報告されている（非特許文献２−４参照）。従来、白血病患者から樹立された形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株として、ＧＥＮ２．２株及びＣＡＬ−１株が報告されている（非特許文献５−６参照）。ＧＥＮ２．２株は、急性形質細胞様樹状細胞性白血病（ｐＤＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ｐＤＣＬ）の患者から単離された株であり（非特許文献５参照）、ＣＡＬ−１株は、芽球型ＮＫ細胞リンパ腫患者から単離された株である（非特許文献６参照）。更に、本発明者等は、ｐＤＣ白血病患者から形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株ＰＭＤＣ０５の樹立に成功している（非特許文献７参照）。当該ＰＭＤＣ０５株は、正常な形質細胞様樹状細胞において認められる表面形質、Ｔｏｌｌ様受容体発現、抗原提示能、サイトカイン産生能等を有していることに加え、維持培養の際に支持細胞やサイトカインを必要としないという利点があり、免疫反応における形質細胞様樹状細胞の機能に関する研究や、樹状細胞を用いた腫瘍や感染症の細胞免疫療法への応用が期待できる生物材料として注目を浴びている。 On the other hand, the presence of CD4 + CD56 + leukemia cells, which are malignant counterparts of normal plasmacytoid dendritic cells, has been reported (see Non-Patent Documents 2-4). Conventionally, GEN2.2 strain and CAL-1 strain have been reported as plasmacytoid dendritic cell leukemia cell lines established from leukemia patients (see Non-Patent Documents 5-6). The GEN2.2 strain is a strain isolated from a patient with acute plasmacytoid dendritic leukemia (pDC-derived acute leukemia, pDCL) (see Non-Patent Document 5), and the CAL-1 strain is a blast cell. It is a strain isolated from a patient with type NK cell lymphoma (see Non-Patent Document 6). Furthermore, the present inventors have succeeded in establishing a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line PMDC05 from patients with pDC leukemia (see Non-Patent Document 7). The PMDC05 strain has surface traits observed in normal plasmacytoid dendritic cells, Toll-like receptor expression, antigen presenting ability, cytokine production ability, etc. It has the advantage of not requiring cytokines, and is attracting attention as a biological material that can be expected to be used for research on the functions of plasmacytoid dendritic cells in immune responses and for cellular immunotherapy of tumors and infections using dendritic cells. I'm bathing.
従来樹立されている形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株は、臨床的利用価値を有するものであるが、当該細胞の機能を増強させたり、新たな機能を付加ことによって、その利用価値を高める手法については、十分に検討されていないのが現状である。 Conventionally established plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line has clinical utility value, but enhances its utility value by enhancing the function of the cell or adding a new function. Currently, the method has not been fully studied.
本発明の目的は、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に対して、既に備えている機能を増強したり、新たな機能を付加したりする技術を提供することである。また、本発明は、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の抗原提示能を向上させる技術を提供することも目的とする。 An object of the present invention is to provide a technique for enhancing a function already provided or adding a new function to a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line. Another object of the present invention is to provide a technique for improving the antigen presenting ability of a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line.
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に対して、機能調節タンパク質をコードする遺伝子を導入することによって、当該細胞の機能の増強や新たな機能の付加が可能になることを見出した。特に、本発明者等は、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に対して、共刺激因子又は共刺激に関連する因子をコードする遺伝子を導入することによって、当該細胞の抗原提示能を顕著に向上させ得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討することにより完成したものである。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have surprisingly introduced a gene encoding a functional regulatory protein into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line. The present inventors have found that the functions of the cells can be enhanced and new functions can be added. In particular, the present inventors made remarkable the antigen presenting ability of the cell by introducing a gene encoding a costimulatory factor or a factor related to costimulation into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line. It has been found that it can be improved. The present invention has been completed by further study based on these findings.
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、機能調節タンパク質をコードする遺伝子が導入されてなることを特徴とする、形質転換体。
項２． 形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株が、ＰＭＤＣ０５株である、項１に記載の形質転換体。
項３． 機能調節タンパク質が、共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子である、項１又は２に記載の形質転換体。
項４． 機能調節タンパク質が、ＣＤ８０である、項３に記載の形質転換体。
項５． 形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、機能調節タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を含む、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の形質転換体の作製方法。
項６． 形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株が、ＰＭＤＣ０５である、項５に記載の作製方法。
項７． 形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子をコードする遺伝子を導入する工程を含む、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の抗原提示能を増強する方法。
項８． 形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株が、ＰＭＤＣ０５である、項７に記載の増強方法。
項９． 下記(1)及び(2)工程を含む、細胞障害性Ｔリンパ球の調製方法：
(1)形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体に抗原を接触させる、又は当該形質転換開において抗原をコードしている遺伝子を発現させることにより、抗原提示細胞を調製する工程、並びに
(2)上記工程で得られた抗原提示細胞と、細胞障害性Ｔ細胞前駆細胞とを接触させ、細胞障害性Ｔ細胞を誘導する工程。
項１０． 形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株が、ＰＭＤＣ０５株である、項９に記載の調製方法。
項１１． 下記(I)〜(III)工程を含む、免疫応答に関与する物質のスクリーニング方法：
(I)形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、機能調節タンパク質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体と、被検物質とを接触させる工程、
(II)被験物質を接触させた形質転換体の特性と、被験物質を接触させていない形質転換体の特性とを分析して比較する工程、及び
(III)前記工程(II)を比較結果に基づいて、前記形質転換体の特性を変化させる被験物質を選択する工程。
項１２． 形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株が、ＰＭＤＣ０５株である、項１１にスクリーニング方法。
That is, this invention provides the invention of the aspect hung up below.
Item 1. A transformant obtained by introducing a gene encoding a functional regulatory protein into a plasmacytoid dendritic leukemia cell line.
Item 2. Item 2. The transformant according to Item 1, wherein the plasmacytoid dendritic leukemia cell line is PMDC05.
Item 3. Item 3. The transformant according to Item 1 or 2, wherein the function-regulating protein is a costimulatory factor and / or a factor related to a costimulatory signal.
Item 4. Item 4. The transformant according to Item 3, wherein the function-regulating protein is CD80.
Item 5. A method for producing a transformant of a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, comprising a step of introducing a gene encoding a functional regulatory protein into the plasmacytoid dendritic leukemia cell line.
Item 6. Item 6. The production method according to Item 5, wherein the plasmacytoid dendritic leukemia cell line is PMDC05.
Item 7. An antigen-presenting ability of a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line comprising the step of introducing a gene encoding a costimulatory factor and / or a factor related to a costimulatory signal into a plasmacytoid dendritic leukemia cell line How to strengthen.
Item 8. Item 8. The enhancement method according to Item 7, wherein the plasmacytoid dendritic leukemia cell line is PMDC05.
Item 9. A method for preparing cytotoxic T lymphocytes comprising the following steps (1) and (2):
(1) An antigen is brought into contact with a transformant obtained by introducing a gene encoding a costimulatory factor and / or a factor related to a costimulatory signal into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, or the transformation is performed. Preparing an antigen-presenting cell by expressing a gene encoding the antigen upon opening; and
(2) A step of inducing a cytotoxic T cell by bringing the antigen-presenting cell obtained in the above step into contact with a cytotoxic T cell progenitor cell.
Item 10. Item 10. The preparation method according to Item 9, wherein the plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line is PMDC05.
Item 11. A screening method for a substance involved in immune response, comprising the following steps (I) to (III):
(I) a step of bringing a transformant into which a gene encoding a function-regulating protein is introduced into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, and a test substance;
(II) analyzing and comparing the characteristics of the transformant contacted with the test substance and the characteristics of the transformant not contacted with the test substance; and
(III) A step of selecting a test substance that changes the characteristics of the transformant based on the comparison result of the step (II).
Item 12. Item 12. The screening method according to Item 11, wherein the plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line is PMDC05.
本発明によれば、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に対して、既に備えている機能を増強したり、新たな機能を付加したりすることができるので、免疫応答の分子学的解明に寄与する生物材料を提供できるだけでなく、免疫疾患や癌の診断・治療等の医療分野で有益な生物材料を提供することもできる。 According to the present invention, it is possible to enhance a function already provided or add a new function to a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line. In addition to providing biological materials that contribute to the disease, it is also possible to provide biological materials that are useful in the medical field such as diagnosis and treatment of immune diseases and cancer.
また、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に対して、共刺激因子又は共刺激に関連する因子をコードする遺伝子を導入することによって、当該細胞の抗原提示能を顕著に増強させることができるので、細胞傷害性Ｔ細胞を用いた悪性腫瘍や感染症に対する細胞免疫療法の開発に貢献することもできる。 In addition, by introducing a gene encoding a costimulatory factor or a factor related to costimulation into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, the antigen presenting ability of the cell can be remarkably enhanced. Therefore, it can also contribute to the development of cellular immunotherapy for malignant tumors and infectious diseases using cytotoxic T cells.
１．形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の形質転換体
本発明の形質転換体は、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、機能調節タンパク質をコードする遺伝子が導入されてなることを特徴とする。以下、本発明について、詳細に説明する。
1. Transformant of plasmacytoid dendritic leukemia cell line The transformant of the present invention is characterized in that a gene encoding a functional regulatory protein is introduced into a plasmacytoid dendritic leukemia cell line. To do. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明において、「形質細胞様樹状細胞性白血病細胞」とは、形質細胞に形態が類似しウィルス感染により大量のＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）を産生する形質細胞様樹状細胞の悪性カウンターパートである白血病細胞である。 In the present invention, “plasmacytoid dendritic leukemia cell” is a malignant counterpart of a plasmacytoid dendritic cell that is similar in shape to the plasma cell and produces a large amount of type I interferon (IFN) by viral infection. A leukemia cell.
形質細胞様樹状細胞性白血病細胞の形態上の特徴としては、骨髄系樹状細胞と同様、樹状又は樹枝状の突起を有していることが挙げられる。 The morphological characteristics of plasmacytoid dendritic leukemia cells include dendritic or dendritic processes similar to myeloid dendritic cells.
形質細胞様樹状細胞性白血病細胞の表現型として、具体的には、ヘルパーＴリンパ球及びＮＫ細胞の表面マーカーであるＣＤ４及びＣＤ５６が共に陽性であり；形質細胞様樹状細胞の表面マーカーであるＣＤ１２３が陽性であり；抗原提示細胞の表面マーカーであるＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲが陽性であり；且つ分化マーカーであるＣＤ３、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６及びＣＤ１９が陰性であるものが例示される。また、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞のその他の表面マーカーとして、例えば、：ＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ４０、及びＣＤ５７が陰性であり、ＣＤ７、ＣＤ３３、ＣＤ５４、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＢＤＣＡ４が陽性であるものが挙げられる。 As a phenotype of plasmacytoid dendritic leukemia cells, specifically, CD4 and CD56, which are surface markers of helper T lymphocytes and NK cells, are both positive; Examples are those in which CD123 is positive; antigen-presenting cell surface markers CD86 and HLA-DR are positive; and differentiation markers CD3, CD11c, CD13, CD14, CD16, and CD19 are negative . Further, as other surface markers of plasmacytoid dendritic leukemia cells, for example: CD2, CD8, CD20, CD40, and CD57 are negative, and CD7, CD33, CD54, HLA-ABC, and BDCA4 are positive. The thing which is is mentioned.
また、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞の特徴の一つとして、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）７及び９を発現していることが挙げられる。 In addition, one of the characteristics of plasmacytoid dendritic cell leukemia cells is that TLR (Toll like receptor) 7 and 9 are expressed.
更に、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞の他の特徴として、単独で抗原提示能を有していることが挙げられる。形質細胞様樹状細胞性白血病細胞の抗原提示能は、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、ＣｐＧ ＤＮＡ、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）等によって更に増強することもある。 Furthermore, another feature of plasmacytoid dendritic cell leukemia cells is that they have the ability to present antigen alone. The antigen-presenting ability of plasmacytoid dendritic cell leukemia cells may be further enhanced by interleukin-3 (IL-3), CpG DNA, lipopolysaccharide (LPS) and the like.
また、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株として、簡便には、細胞寄託機関から入手することもできる。例えば、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株として、ＣＡＬ−１（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにてＦＥＲＭ Ｐ−２０５９５として寄託）が公知である。また、本出願人は、ｐＤＣＬ患者（ヒト）から樹立した形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株として、ＰＭＤＣ０５株を所有しており、本細胞株は自己寄託とし、申請により分譲を認めることとする。ＰＭＤＣ０５株の分譲を求める者は、国立大学法人新潟大学医学部保健学科検査技術科学専攻基礎生体情報学 高橋益廣教授（電話番号０２５−２２７−２３８７）から、必要に応じてＰＭＤＣ０５株の分譲を受けることができる。 Moreover, as a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, it can be conveniently obtained from a cell depository. For example, as a plasmacytoid dendritic leukemia cell line, CAL-1 (deposited as FERM P-20595 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center) is known. In addition, the applicant owns the PMDC05 strain as a plasmacytoid dendritic leukemia cell line established from a pDCL patient (human), and this cell line is self-deposited and can be distributed upon application. To do. Those who want to sell PMDC05 shares will receive PMDC05 shares as needed from Prof. Masashi Takahashi (Telephone No .: 025-227-2387), Department of Health Sciences, Niigata University School of Health Sciences be able to.
ＰＭＤＣ０５株は、正常な形質細胞様樹状細胞において認められる表面形質、Ｔｏｌｌ様受容体発現、抗原提示能、サイトカイン産生能等を有していることに加え、維持培養の際に支持細胞やサイトカインを必要としないという利点があり、本発明において、形質細胞様樹状細胞の性状や機能の研究および細胞免疫療法における抗原提示細胞として好適に使用される。また、ＰＭＤＣ０５株は、本発明によって、機能の増強や新たな機能の付加を行い易いという点でも、利点がある。 The PMDC05 strain has surface traits observed in normal plasmacytoid dendritic cells, Toll-like receptor expression, antigen presenting ability, cytokine production ability, etc., and also supports cells and cytokines during maintenance culture. In the present invention, it is preferably used as an antigen-presenting cell in the study of the properties and functions of plasmacytoid dendritic cells and in cell immunotherapy. The PMDC05 strain also has an advantage in that it is easy to enhance functions or add new functions according to the present invention.
本発明において、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に導入される遺伝子としては、機能調節タンパク質をコードしているものであれば、特に制限されない。 In the present invention, the gene introduced into the plasmacytoid dendritic leukemia cell line is not particularly limited as long as it encodes a function-regulating protein.
機能調節タンパク質とは、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株が既に有している機能に関連するタンパク質だけでなく、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株が有していない機能に関連するタンパク質が含まれる。 Function-regulated proteins are not only proteins related to functions already possessed by plasmacytoid dendritic leukemia cell lines but also functions not possessed by plasmacytoid dendritic leukemia cell lines Contains protein.
形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株が既に有している機能に関連するタンパク質としては、例えば、共刺激因子、共刺激シグナルに関連する因子、サイトカイン、Ｔｏｌｌ様受容体等が挙げられる。より具体的には、共刺激因子として、ＣＤ８０、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ８６等が挙げられる。共刺激シグナルに関連する因子としては、ＣＤ８３、ＣＤ１a等が挙げられる。サイトカインとしては、ＩＬ−１，−２、−４、−６、−１０、−１２、−１７、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、−β、−γ、ＴＮＦ−α等が挙げられる。 Examples of proteins related to the functions already possessed by the plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line include costimulatory factors, factors related to costimulatory signals, cytokines, Toll-like receptors, and the like. More specifically, the costimulatory factors include CD80, CD28, CD40, CD154, CD86 and the like. CD83, CD1a etc. are mentioned as a factor relevant to a costimulatory signal. Examples of cytokines include IL-1, -2, -4, -6, -10, -12, -17, M-CSF, IFN-α, -β, -γ, TNF-α and the like.
また、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株が有していない機能に関連するタンパク質としては、具体的には、ＣＤ40Ｌ等が挙げられる。 Specific examples of the protein related to the function that the plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line does not have include CD40L.
これらの機能調節タンパク質は公知であり、そのアミノ酸配列や、それをコードする遺伝子の塩基配列も公知である。 These function-regulating proteins are known, and their amino acid sequences and the base sequences of the genes encoding them are also known.
本発明において、導入する遺伝子がコードしている機能調節タンパク質の種類については、特に制限されず、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に備えさせる所望の特性に応じて適宜設定することができる。例えば、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の抗原提示能を増強させる場合であれば、導入する遺伝子がコードしている機能調節タンパク質として、共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子が好ましく、ＣＤ８０が特に好ましい。 In the present invention, the type of function-regulating protein encoded by the gene to be introduced is not particularly limited, and can be appropriately set according to desired characteristics to be provided for the plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line. . For example, in the case of enhancing the antigen presenting ability of a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, as a function regulatory protein encoded by the gene to be introduced, a factor related to a costimulatory factor and / or a costimulatory signal Is preferable, and CD80 is particularly preferable.
また、導入する機能調節タンパク質をコードしている遺伝子は、野生型遺伝子以外に、その遺伝子産物のアミノ酸配列における数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個）のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されており、且つ、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する変異遺伝子産物をコードしている変異遺伝子であってもよい。 In addition to the wild-type gene, there are several genes (for example, 1 to 10, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4) in the amino acid sequence of the gene product in addition to the wild type gene. Mutant, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2, amino acid substitutions, deletions and / or insertions, and having a function equivalent to that of the wild-type gene product It may be a mutated gene coding for.
また、本発明において、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に導入される機能調節タンパク質は、１種であっても、また２種以上であってもよい。 In the present invention, the function-regulating protein introduced into the plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line may be one kind or two or more kinds.
機能調節タンパク質をコードしている遺伝子を形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に導入するには、当該遺伝子が発現可能な状態で導入されることを限度として特に制限されず、動物細胞のトランスフェクションにおいて通常使用される形質転換法で行うことができる。具体的には、機能調節タンパク質をコードしている遺伝子を形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株へ導入する方法として、ベクターを使用する方法；リン酸カルシウム法；リポフェクション法；エレクトロポレーション法；マイクロインジェクション法等が例示される。これらの中でも、導入効率の点から、ベクターを使用する方法が好ましい。ベクターを使用する場合には、ベクターとして、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、人工ウイルス等を用いることができるが、レンチウィルス、アデノウイルス及びレトロウイルス等のウイルスベクターが、安全性の観点から好ましい。 Introducing a gene encoding a functional regulatory protein into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line is not particularly limited as long as the gene is introduced in a state where it can be expressed. The transformation can be performed by a commonly used transformation method. Specifically, as a method for introducing a gene encoding a functional regulatory protein into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, a method using a vector; a calcium phosphate method; a lipofection method; an electroporation method; a microinjection method Laws are exemplified. Among these, the method using a vector is preferable from the viewpoint of introduction efficiency. When a vector is used, a viral vector, a non-viral vector, an artificial virus, or the like can be used as the vector, but a viral vector such as a lentivirus, an adenovirus, or a retrovirus is preferable from the viewpoint of safety.
斯して形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に機能調節タンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体は、導入された機能調節タンパク質の種類に応じて、当該細胞の機能が増強されたり、新たな機能が付加されている。機能調節タンパク質をコードする遺伝子が形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に導入されていることの確認は、導入された機能調節タンパク質が発現しているか否か、或いは導入された機能調節タンパク質の種類に応じた機能増強や機能付加が認められるか否かを指標として行うことができる。また、機能調節タンパク質をコードする遺伝子と共に緑色蛍光蛋白や薬剤耐性遺伝子を導入しておいた場合には、緑色色素や薬剤存在下での生育を指標として、機能調節タンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体を選択することもできる。 Thus, a transformant in which a gene encoding a functional regulatory protein has been introduced into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line has an enhanced function of the cell depending on the type of the functional regulatory protein introduced. New functions have been added. Confirmation that the gene encoding the functional regulatory protein has been introduced into the plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line is whether the introduced functional regulatory protein is expressed or whether the introduced functional regulatory protein is Whether or not function enhancement or function addition according to the type is permitted can be performed as an index. In addition, when a green fluorescent protein or a drug resistance gene has been introduced together with a gene encoding a functional regulatory protein, the gene encoding the functional regulatory protein is introduced using growth in the presence of a green pigment or drug as an index. Transformants can also be selected.
斯してえられた形質転換体は、野生株である形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株と同じ条件で培養することができる。当該形質転換体の培養条件としては、具体的には、１０容量％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培地で、３７℃、５％ＣＯ２の条件が例示される。 The transformant thus obtained can be cultured under the same conditions as the wild-type plasmacytoid dendritic leukemia cell line. As the culture conditions for the transformant, specifically, an IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium) medium containing 10% by volume FBS (fetal bovine serum) and conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 are used. Illustrated.
斯して得られる形質転換体は、野生株である形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の機能が増強されていたり、新たな機能が付加されているので、免疫疾患や癌の診断・治療等の医療分野や、免疫応答の基礎研究およびがんや重症感染症に対する細胞免疫療法等において利用可能である。 The transformant thus obtained has an enhanced function or a new function of a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, which is a wild type, so that it can diagnose and treat immune diseases and cancers. It can be used in medical fields such as basic research on immune responses and cellular immunotherapy for cancer and severe infections.
２．形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の抗原提示能の増強方法
前述する機能調節タンパク質として、共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子を使用する場合、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株が有する抗原提示能を増強させることができる。従って、本発明は、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子をコードする遺伝子を導入する工程を含む、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の抗原提示能の増強方法をも提供する。
2. Method for enhancing antigen-presenting ability of plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line When using a costimulatory factor and / or a factor related to a costimulatory signal as the function-regulating protein described above, plasmacytoid dendritic cell leukemia The antigen presenting ability of the cell line can be enhanced. Accordingly, the present invention provides a plasmacytoid dendritic cell leukemia comprising the step of introducing into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line a gene encoding a costimulatory factor and / or a factor associated with a costimulatory signal. Also provided is a method for enhancing the antigen presentation capacity of a cell line.
当該増強方法において、使用される形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の種類、共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子の種類、遺伝子の導入方法等については、前記「１．形質転換体」の欄の記載の通りである。当該増強方法において、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株として、好適にはＰＭＤＣ０５株が使用される。 In the enhancement method, the type of plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line used, the type of co-stimulatory factor and / or the factor related to the costimulatory signal, the method of gene introduction, etc. are described in “1. It is as described in the column of “Conversion”. In the enhancement method, the PMDC05 strain is preferably used as the plasmacytoid dendritic leukemia cell line.
３．細胞障害性Ｔリンパ球の調製方法
前述するように、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体は、抗原提示能が向上しており、細胞障害性Ｔリンパ球を誘導し易いという特性を備えている。従って、本発明は、下記(1)及び(2)工程を含む、細胞障害性Ｔリンパ球の調製方法をも提供する。
(1)形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体に抗原を接触させる、又は当該形質転換において抗原をコードしている遺伝子を発現させることにより、抗原提示細胞を調製する工程、並びに
(2)上記工程で得られた抗原提示細胞と、細胞障害性Ｔ細胞前駆細胞とを接触させ、細胞障害性Ｔ細胞を誘導する工程。
3. Method for Preparing Cytotoxic T Lymphocytes As described above, transformation in which a gene encoding a costimulatory factor and / or a factor related to a costimulatory signal is introduced into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line The body has the characteristics that antigen-presenting ability is improved and cytotoxic T lymphocytes are easily induced. Therefore, the present invention also provides a method for preparing cytotoxic T lymphocytes comprising the following steps (1) and (2).
(1) An antigen is brought into contact with a transformant obtained by introducing a gene encoding a costimulatory factor and / or a factor related to a costimulatory signal into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, or the transformation is performed. A step of preparing an antigen-presenting cell by expressing a gene encoding the antigen in
(2) A step of inducing a cytotoxic T cell by bringing the antigen-presenting cell obtained in the above step into contact with a cytotoxic T cell progenitor cell.
上記工程(1)において使用される形質転換体としては、好ましくはＰＭＤＣ０５株に共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体が挙げられ、更に好ましくはＰＭＤＣ０５株にＣＤ８０をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体が挙げられる。 The transformant used in the above step (1) is preferably a transformant obtained by introducing a gene encoding a costimulatory factor and / or a factor related to a costimulatory signal into the PMDC05 strain, Preferably, a transformant obtained by introducing a gene encoding CD80 into the PMDC05 strain can be mentioned.
また、上記工程(1)において、使用される抗原としては、特に制限されず、例えば、癌細胞（白血病細胞を含む）や感染症の病原菌に特異的に発現しているタンパク質が例示される。上記工程(1)において、抗原提示細胞を調製するための具体的条件については、特に制限されず、例えば、従来採用されている抗原提示細胞の調製条件を採用することができる。 In the step (1), the antigen used is not particularly limited, and examples thereof include proteins that are specifically expressed in cancer cells (including leukemia cells) and infectious pathogens. In the above step (1), specific conditions for preparing antigen-presenting cells are not particularly limited, and for example, conventionally-prepared conditions for preparing antigen-presenting cells can be employed.
上記工程(2)において、使用される細胞障害性Ｔ細胞前駆細胞については、特に制限されないが、最終的に得られる細胞障害性Ｔ細胞を投与するする患者の末梢血から得られるものが好適である。また、上記工程(2)において、細胞障害性Ｔ細胞を誘導するための具体的条件については、特に制限されず、従来採用されている細胞障害性Ｔ細胞の誘導条件を採用することができる。 In the above step (2), the cytotoxic T cell progenitor cells to be used are not particularly limited, but those obtained from the peripheral blood of a patient who administers the finally obtained cytotoxic T cells are suitable. is there. In the above step (2), the specific conditions for inducing cytotoxic T cells are not particularly limited, and conventionally used conditions for inducing cytotoxic T cells can be employed.
また、上記工程(1)及び(2)は、各々の工程を順次行ってもよいが、両工程を同時に行ってもよい。上記工程(1)及び(2)を同時に行うには、例えば、上記形質転換体と、抗原と、細胞障害性Ｔ細胞前駆細胞とを混合培養する方法が挙げられる。 In the steps (1) and (2), each step may be performed sequentially, but both steps may be performed simultaneously. In order to simultaneously perform the above steps (1) and (2), for example, a method of culturing the above transformant, antigen, and cytotoxic T cell progenitor cells in a mixed manner can be mentioned.
斯して調製された細胞障害性Ｔリンパ球は、癌（白血病を含む）や感染症の治療に使用することができる。 The cytotoxic T lymphocytes thus prepared can be used for the treatment of cancer (including leukemia) and infectious diseases.
４．免疫応答に関与する物質のスクリーニング方法
前述するように、形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、機能調節タンパク質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体は、当該細胞の機能が増強されたり、新たな機能が付加されているので、免疫応答における形質細胞様樹状細胞のメカニズムに関する研究や、免疫応答に関与する物質のスクリーニングに利用することができる。従って、本発明は、下記(I)〜(III)工程を含む、免疫応答に関与する物質のスクリーニング方法をも提供する。
(I)形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、機能調節タンパク質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体と、被検物質とを接触させる工程、
(II)被験物質を接触させた形質転換体の特性と、被験物質を接触させていない形質転換体の特性とを分析して比較する工程、
(III)前記工程(II)を比較結果に基づいて、前記形質転換体の特性を変化させる被験物質を選択する工程。
4). As a screening method aforementioned substance related to the immune response, the plasmacytoid dendritic cell leukemia cell lines, the transformant in which the gene encoding a functional regulatory protein is introduced, the function of the cell is enhanced Or added a new function, it can be used for research on the mechanism of plasmacytoid dendritic cells in immune responses and screening for substances involved in immune responses. Therefore, the present invention also provides a screening method for a substance involved in an immune response, comprising the following steps (I) to (III).
(I) a step of bringing a transformant into which a gene encoding a function-regulating protein is introduced into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, and a test substance;
(II) analyzing and comparing the characteristics of the transformant contacted with the test substance and the characteristics of the transformant not contacted with the test substance,
(III) A step of selecting a test substance that changes the characteristics of the transformant based on the comparison result of the step (II).
上記工程(I)において使用される形質転換体としては、好ましくはＰＭＤＣ０５株に共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体が挙げられ、更に好ましくはＰＭＤＣ０５株にＣＤ８０をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体が挙げられる。 The transformant used in the step (I) is preferably a transformant obtained by introducing a gene encoding a costimulatory factor and / or a factor related to a costimulatory signal into the PMDC05 strain, Preferably, a transformant obtained by introducing a gene encoding CD80 into the PMDC05 strain can be mentioned.
前記工程(I)において、被験物質としては、公知物質又は新規物質のいずれであってもよく、タンパク質、ペプチド、低分子有機化合物、核酸、糖類等のいずれであってもよい。また、被験物質は、天然由来であっても、合成されたものであってもよい。前記工程(I)において、前記形質転換体と被検物質とを接触させる方法については、特に制限されず、例えば、前記形質転換体が生育可能な培地中に、前記形質転換体と被検物質とを共存させて３７℃で５％ＣＯ２の条件下でインキュベートすればよい。 In the step (I), the test substance may be a known substance or a novel substance, and may be any of protein, peptide, low molecular organic compound, nucleic acid, saccharide and the like. In addition, the test substance may be naturally derived or synthesized. In the step (I), the method for bringing the transformant into contact with the test substance is not particularly limited. For example, in the medium in which the transformant can grow, the transformant and the test substance are used. In the presence of 5% CO 2 at 37 ° C.
前記工程(II)において、被験物質を接触させた形質転換体の特性と、被験物質を接触させていない形質転換体の特性との比較は、例えば、形態変化の有無、タンパク質の発現量の差、ｍＲＮＡの発現量の差等に基づいて行うことができる。 In the step (II), the characteristics of the transformant contacted with the test substance and the characteristics of the transformant not contacted with the test substance are, for example, the presence or absence of morphological change and the difference in the expression level of the protein. , Based on the difference in the expression level of mRNA.
前記工程(III)では、前記工程(II)の結果を踏まえて、前記形質転換体の特性を変化させる被験物質が選択される。斯して選択される被験物質は、免疫応答に関与する候補物質である。当該スクリーニング方法で選択された被験物質は、癌（白血病）や免疫疾患の治療薬の候補物質となり得る。例えば、前記(II)において、前記形質転換体の抗原提示能の差が認められ、前記工程(III)で当該抗原提示能の差に基づいて候補物質を選択した場合には、選択された被験物質は、樹状細胞の抗原提示機能に関与する薬剤の候補にもなり得る。 In the step (III), a test substance that changes the characteristics of the transformant is selected based on the result of the step (II). The test substance thus selected is a candidate substance involved in the immune response. The test substance selected by the screening method can be a candidate substance for a therapeutic drug for cancer (leukemia) or immune disease. For example, in (II), when a difference in antigen presenting ability of the transformant is recognized and a candidate substance is selected based on the difference in antigen presenting ability in the step (III), the selected test Substances can also be candidates for drugs involved in the antigen-presenting function of dendritic cells.
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples and the like, but the present invention is not limited thereto.
実施例１： 形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株の形質転換体の作製
白血病性形質細胞様樹状細胞株ＰＭＤＣ０５（国立大学法人新潟大学医学部保健学科検査技術科学専攻基礎生体情報学にて保存）に対して、ヒトＣＤ８０をコードする遺伝子を導入した形質転換体を以下の手順に従って作製した。第3世代ＲＲＬレンチウィルスベクターに組み込んだＣＤ８０遺伝子をＰＭＤＣ０５に導入することにより形質転換体を作製した。ＰＭＤＣ０５への遺伝子導入は、５ｘ１０５個の細胞ペレットに組換えレンチウィルス浮遊液２００μｌと硫酸プロタミン（５μｇ／ｍｌ）を加え８００ｇ，３０分間遠心した後、１０容量％のＦＢＳを含むＩＭＤＭ培養液（ＧｌｕｔａＭＡＸ ３１９８００３０， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を８００μｌ加えた。細胞浮遊液を12ウェルプレートに移し再度８００ｇ，３０分間遠心したのち１晩培養した。翌日培養液を替えて２〜３日培養し、抗ＣＤ８０モノクローナル抗体で染色した後セルソーティングを行い、ＣＤ８０導入細胞を選択した。細胞が増殖した後、再度ＣＤ８０モノクローナル抗体で染色し、蛍光強度が強い細胞のソーティングを行いＰＭＤＣ１１とした。
Example 1: Preparation of a transformant of a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line Leukemia plasmacytoid dendritic cell line PMDC05 (Niigata University School of Medicine, Department of Health Sciences, Department of Health Sciences, Basic Bioinformatics) ), A transformant introduced with a gene encoding human CD80 was prepared according to the following procedure. A transformant was prepared by introducing the CD80 gene incorporated into the third generation RRL lentiviral vector into PMDC05. Gene transfer to PMDC05 was carried out by adding 200 μl of recombinant lentivirus suspension and 5 μg / ml of protamine sulfate (5 μg / ml) to 5 × 10 5 cell pellets, followed by centrifugation at 800 g for 30 minutes, and IMDM culture solution containing 10% by volume of FBS ( 800 μl of GlutaMAX 31980030, Invitrogen) was added. The cell suspension was transferred to a 12-well plate, centrifuged again at 800 g for 30 minutes, and cultured overnight. On the next day, the culture solution was changed and cultured for 2 to 3 days. After staining with anti-CD80 monoclonal antibody, cell sorting was performed to select CD80-introduced cells. After the cells proliferated, the cells were stained again with CD80 monoclonal antibody, and cells with strong fluorescence intensity were sorted to obtain PMDC11.
得られた形質転換体（ＰＭＤＣ１１株）におけるＣＤ８０の発現を確認するために、蛍光色素で標識した抗ＣＤ８０抗体による染色を行った。抗ＣＤ８０抗体による染色には、形質転換をした後に３ヵ月間、１０容量％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ ３１９８００３０， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)で継代培養を行った細胞を用いた。また、比較のために、白血病性形質細胞様樹状細胞ＰＭＤＣ０５株についても、同様に染色を行った。 In order to confirm the expression of CD80 in the obtained transformant (PMDC11 strain), staining with an anti-CD80 antibody labeled with a fluorescent dye was performed. For staining with anti-CD80 antibody, cells subcultured in IMDM medium (GlutaMAX 31980030, Invitrogen) containing 10% by volume of FCS for 3 months after transformation were used. For comparison, the leukemia plasmacytoid dendritic cell line PMDC05 was also stained in the same manner.
抗ＣＤ８０抗体によって細胞を染色した後に、フローサイトメトリーで分析を行った。結果を図１に示す。この結果から、白血病性形質細胞様樹状細胞PMDC05株では、ＣＤ８０が発現していないものの、ＣＤ８０を用いて形質転換した形質転換体ＰＭＤＣ１１株ではＣＤ８０が発現していることが確認された。 After staining cells with anti-CD80 antibody, analysis was performed by flow cytometry. The results are shown in FIG. From this result, it was confirmed that although CD80 was not expressed in the leukemic plasmacytoid dendritic cell PMDC05 strain, CD80 was expressed in the transformant PMDC11 strain transformed with CD80.
実施例２： 形質転換体ＰＭＤＣ１１株の抗原提示能の評価
上記実施例１で作製した形質転換体ＰＭＤＣ１１株の抗原提示能を評価するために以下の試験を行った。具体的には、種々の細胞数のＰＭＤＣ１１を刺激細胞とし、1ウェルあたり１×１０５個のアロリンパ球を反応細胞とした混合白血球培養（ＭＬＣ）を行った。刺激細胞を６０Ｇｙの放射線照射を行い、分裂を阻止した後に反応細胞に添加した。混合リンパ球培養を５日間行った後、３Ｈ-ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを培養に加え、その取り込みをシンチレーションカウンターで測定することにより、ＰＭＤＣ１１の抗原提示能を評価した。コントロールとしてＣＤ８０遺伝子を導入していないＰＭＤＣ０５を用いた。
Example 2: Evaluation of antigen-presenting ability of transformant PMDC11 strain In order to evaluate the antigen-presenting ability of the transformant PMDC11 strain prepared in Example 1 above, the following test was performed. Specifically, mixed leukocyte culture (MLC) was performed using PMDC11 having various numbers of cells as stimulating cells and 1 × 10 5 allolymphocytes per well as reaction cells. Stimulatory cells were irradiated with 60 Gy to prevent division and then added to the reaction cells. After 5 days of mixed lymphocyte culture, 3 H-thymidine was added to the culture, and its uptake was measured with a scintillation counter to evaluate the antigen presenting ability of PMDC11. PMDC05 into which CD80 gene was not introduced was used as a control.
得られた結果を図２に示す。図１の縦軸は、１細胞当たりの３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取り込み量（ｃｐｍ）であり、抗原刺激に反応して分裂したリンパ球のDNAに取り込まれた３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの値、即ち抗原提示能を反映している。この結果から、白血病性形質細胞様樹状細胞ＰＭＤＣ０５株でも、抗原提示能が認められたが、形質転換体ＰＭＤＣ１１株では、ＰＭＤＣ０５株を上回る顕著に高い抗原提示能があることが明らかとなった。 The obtained results are shown in FIG. The vertical axis in FIG. 1 represents the amount of 3 H-thymidine taken up per cell (cpm), and the value of 3 H-thymidine incorporated into the DNA of lymphocytes divided in response to antigen stimulation, ie, antigen presentation Reflects the ability. From these results, it was found that the antigen presenting ability was also observed in the leukemic plasmacytoid dendritic cell PMDC05 strain, but the transformant PMDC11 strain had a significantly higher antigen presenting ability than the PMDC05 strain. .
以上の結果から、白血病性形質細胞様樹状細胞にＣＤ８０等の機能調節遺伝子を導入して作成された形質転換体は、白血病性形質細胞様樹状細胞自体の機能が増強されており、より有用性が高い生物材料になり得ることが確認された。
From the above results, the transformant prepared by introducing a functional regulatory gene such as CD80 into leukemic plasmacytoid dendritic cells has enhanced functions of leukemic plasmacytoid dendritic cells themselves, It has been confirmed that it can be a highly useful biological material.
Claims (12)
(1)形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、共刺激因子及び／又は共刺激シグナルに関連する因子をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体に抗原を接触させる、又は当該形質転換において抗原をコードしている遺伝子を発現させることにより、抗原提示細胞を調製する工程、並びに
(2)上記工程で得られた抗原提示細胞と、細胞障害性Ｔ細胞前駆細胞とを接触させ、細胞障害性Ｔ細胞を誘導する工程。 A method for preparing cytotoxic T lymphocytes comprising the following steps (1) and (2):
(1) An antigen is brought into contact with a transformant obtained by introducing a gene encoding a costimulatory factor and / or a factor related to a costimulatory signal into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, or the transformation is performed. A step of preparing an antigen-presenting cell by expressing a gene encoding the antigen in
(2) A step of inducing a cytotoxic T cell by bringing the antigen-presenting cell obtained in the above step into contact with a cytotoxic T cell progenitor cell.
(I)形質細胞様樹状細胞性白血病細胞株に、機能調節タンパク質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換体と、被検物質とを接触させる工程、
(II)被験物質を接触させた形質転換体の特性と、被験物質を接触させていない形質転換体の特性とを分析して比較する工程、及び
(III)前記工程(II)を比較結果に基づいて、前記形質転換体の特性を変化させる被験物質を選択する工程。 A screening method for a substance involved in immune response, comprising the following steps (I) to (III):
(I) a step of bringing a transformant into which a gene encoding a function-regulating protein is introduced into a plasmacytoid dendritic cell leukemia cell line, and a test substance;
(II) analyzing and comparing the characteristics of the transformant contacted with the test substance and the characteristics of the transformant not contacted with the test substance; and
(III) A step of selecting a test substance that changes the characteristics of the transformant based on the comparison result of the step (II).
12. The screening method according to claim 11, wherein the plasmacytoid dendritic leukemia cell line is PMDC05.
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