JP2013001686A - Eye-drop vaccine for avian influenza - Google Patents

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To develop a method for preventing avian influenza in poultry using an inactivated vaccine, whereby potent immunity can be imparted without combined use of any oil adjuvant (which is essential for the vaccination of conventional inactivated vaccines for avian influenza) and rapid administration to a large number of poultry can be carried out without using any injection needle.SOLUTION: The method for preventing avian influenza in poultry includes a process of administering an inactivated vaccine that contains an inactivated avian influenza virus as an antigen and does not contain any oil adjuvant to the poultry by means of the instillation into eyes of the poultry.

Description

本発明は、家禽における鳥インフルエンザの予防方法に関する。   The present invention relates to a method for preventing avian influenza in poultry.

ワクチンは、投与する抗原によって生ワクチンと不活化ワクチンに大別される。
‘生ワクチン’は、弱毒化した病原体をワクチン抗原とするもので、免疫原性が高く、強力で長期にわたる免疫を付与できる。しかし、生きている病原体を抗原として用いるため、安全性の点で問題を生じる可能性がある。
一方、‘不活化ワクチン’は、不活化した病原体やその構成成分（タンパク質等）を抗原とするもので、安全性は高いが免疫原性が低い。 Vaccines are roughly classified into live vaccines and inactivated vaccines depending on the antigen to be administered.
A 'live vaccine' uses a attenuated pathogen as a vaccine antigen, is highly immunogenic, and can provide strong and long-term immunity. However, since a living pathogen is used as an antigen, there is a possibility of causing a problem in terms of safety.
On the other hand, an “inactivated vaccine” uses an inactivated pathogen or a component (protein, etc.) thereof as an antigen, and has high safety but low immunogenicity.

ワクチンにより付与される免疫の強さは、投与方法によって大きく左右される。一般的に、皮下又は筋肉内への投与では、付与される免疫が強い。一方、粘膜（経口、総排泄腔、経鼻、点眼）への投与では付与される免疫が弱い。
そのため、従来では、不活化ワクチンを用いる場合、アジュバント（免疫増強剤）を併用し、皮下又は筋肉内に注射する方法が採用されている（例えば、特許文献1 参照）。 The strength of immunity conferred by the vaccine depends greatly on the administration method. Generally, when administered subcutaneously or intramuscularly, the immunity imparted is strong. On the other hand, when given to mucous membranes (oral, total excretory cavity, nasal, eye drops), the immunity imparted is weak.
Therefore, conventionally, when an inactivated vaccine is used, a method of using an adjuvant (immunity enhancing agent) in combination and injecting subcutaneously or intramuscularly has been employed (see, for example, Patent Document 1).

近年、高病原性の鳥インフルエンザウイルスが、家禽において世界的に流行しており、一部の国では常在化している。当該ウイルスによる家禽の死亡率は極めて高い。さらに、国内で当該ウイルスの感染が確認された場合、防疫のためにその周辺の家禽は全て殺処分される。よって、当該ウイルスによる家禽産業の経済的被害は甚大である。
また、当該ウイルスは、ヒトに致死的な感染を引き起こす場合がある。当該ウイルスは、現在の段階では、家禽からヒトに直接伝播するもののみである。
しかし、将来、ヒトからヒトへの高い伝播能を有する系統が生じた場合、極めて深刻なパンデミックが起こる可能性がある。
よって、家禽における鳥インフルエンザの発生を抑えることは、家畜衛生及び公衆衛生上、世界的に重要な課題となっている。 In recent years, highly pathogenic avian influenza viruses have been prevalent worldwide in poultry and have become permanent in some countries. Poultry mortality from the virus is extremely high. Furthermore, if the virus is confirmed in the country, all the surrounding poultry will be killed for prevention of epidemics. Therefore, the economic damage to the poultry industry due to the virus is enormous.
In addition, the virus may cause a lethal infection in humans. The virus is currently only transmitted directly from poultry to humans.
However, in the future, if a strain with a high ability to transmit from person to person arises, a very serious pandemic may occur.
Therefore, suppressing the occurrence of avian influenza in poultry has become a globally important issue in terms of animal health and public health.

家禽において鳥インフルエンザに対するワクチン接種を行う場合、生ワクチンを用いるとウイルスが宿主体内で変異またはリアソータント（遺伝子再集合体）を生じ、家禽に対して強毒性のウイルスが発生する可能性がある。また、食品安全性の点からも家禽に生ワクチンを用いることには問題がある。さらに、家禽に接種された生ワクチンが、何らかの経路でパンデミックを起こすインフルエンザウイルスの出現に関わる可能性が否定できない。
従って、現行の家禽に対する鳥インフルエンザワクチンとしては、当該ウイルスの不活化ワクチンをオイルアジュバントと併用し、皮下又は筋肉内に注射する方法が採用されている。 When vaccination against avian influenza is carried out in poultry, if live vaccine is used, the virus may cause mutation or reassortant (gene reassortant) in the host, and a virus that is highly toxic to poultry may be generated. Also, there is a problem in using live vaccines for poultry from the viewpoint of food safety. Furthermore, the possibility that live vaccines inoculated into poultry may be involved in the emergence of influenza viruses that cause pandemics by some route.
Therefore, as an avian influenza vaccine for current poultry, a method in which the inactivated vaccine of the virus is used in combination with an oil adjuvant and injected subcutaneously or intramuscularly is employed.

ところが、このような方法でワクチン接種した家禽は、オイルアジュバントが体内に長期間残留するため、食品安全性の点から一定期間出荷ができない。
また、皮下又は筋肉に注射するには、一羽ずつ個別に接種するため多くの労力が必要であり、多頭羽に迅速に接種することが難しい。さらに、接種を行う者（獣医療従事者等）の針刺し事故の危険性や、使用済み注射針の廃棄が問題となっている。 However, poultry vaccinated by such a method cannot be shipped for a certain period of time from the viewpoint of food safety because the oil adjuvant remains in the body for a long time.
Moreover, in order to inject subcutaneously or intramuscularly, it takes a lot of labor to inoculate each bird individually, and it is difficult to inoculate many wings quickly. Furthermore, the danger of needle stick accidents for those who inoculate (veterinary workers, etc.) and the disposal of used syringe needles are a problem.

そのため、従来、鳥インフルエンザの防疫において、ワクチン接種は緊急時以外には原則的に用いられず、発生農場における家禽を全て処分する方法（殺処分）が採られている。   Therefore, conventionally, in the prevention of avian influenza, vaccination is not used in principle except in an emergency, and a method of disposing all poultry on the outbreak farm (killing) has been adopted.

特開2008-231123号公報（〔背景技術〕の段落）JP 2008-231123 A (paragraph of [Background Art])

本発明は、上記課題を解決し、家禽における不活化ワクチンを用いた鳥インフルエンザの予防方法において、；オイルアジュバントを併用しなくても高い免疫を付与することができ、且つ、注射針を用いた投与法でなく、且つ、多頭羽に迅速に投与が可能となる方法、を開発することを目的とする。   The present invention solves the above-mentioned problems, and in a method for preventing avian influenza using an inactivated vaccine in poultry; high immunity can be imparted without using an oil adjuvant, and an injection needle is used. It is an object of the present invention to develop a method that enables rapid administration to multiple wings, not an administration method.

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、「不活化した鳥インフルエンザウイルス」を抗原とするワクチンを、「点眼」によって投与することによって、；従来の皮下又は筋肉内に注射するワクチンでは必須であったオイルアジュバントを全く併用しなくても、家禽に強い免疫を付与できることを見出した。   As a result of intensive studies, the present inventors have administered a vaccine using “inactivated avian influenza virus” as an antigen by “instillation”; it is essential for conventional vaccines injected subcutaneously or intramuscularly. It was found that strong immunity can be imparted to poultry without using any oil adjuvant.

本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
即ち、〔請求項1〕に係る本発明は、家禽に対して、以下(A)に記載の不活化ワクチンを点眼投与することを特徴とする、家禽における鳥インフルエンザの予防方法に関するものである。
(A)：不活化した鳥インフルエンザウイルスを抗原として含み、且つ、オイルアジュバントを含まない不活化ワクチン。
また、〔請求項2〕に係る本発明は、前記不活化した鳥インフルエンザウイルスが、ウイルス粒子の構造が保持されたまま不活化されたものである、請求項1に記載の鳥インフルエンザの予防方法に関するものである。
また、〔請求項3〕に係る本発明は、前記点眼投与が、スプレー散布によって行うものである、請求項1又は2のいずれかに記載の鳥インフルエンザの予防方法に関するものである。
また、〔請求項4〕に係る本発明は、前記点眼投与が、間隔を空けて2回以上行うものである、請求項1〜3のいずれかに記載の鳥インフルエンザの予防方法に関するものである。 The present invention has been made based on these findings.
That is, the present invention according to [Claim 1] relates to a method for preventing avian influenza in poultry, characterized by administering the inactivated vaccine described in (A) below to poultry.
(A): An inactivated vaccine containing an inactivated avian influenza virus as an antigen and no oil adjuvant.
Further, the present invention according to [Claim 2] is the method for preventing avian influenza according to claim 1, wherein the inactivated avian influenza virus is inactivated while maintaining the structure of the virus particles. It is about.
The present invention according to [Claim 3] relates to the method for preventing avian influenza according to claim 1 or 2, wherein the eye drop administration is performed by spraying.
Further, the present invention according to [Claim 4] relates to the method for preventing avian influenza according to any one of Claims 1 to 3, wherein the ophthalmic administration is performed twice or more at intervals. .

本発明により、以下の効果が奏されるものと認められる。
i ）本発明では、オイルアジュバントの使用が全く不要となるため、オイルアジュバントを接種した家禽と比較して、より早期に食品安全上問題なく出荷することが可能となる。
ii）スプレー等での散布による点眼投与が可能となるため、一度に多頭羽の家禽へのワクチン投与が可能となる。
これにより、ワクチン投与における労力を大幅に削減できると同時に、注射針の針刺し事故、使用済み注射針の廃棄の問題等も発生しなくなる。
iii）生ワクチンを用いないため、接種個体内で強毒性のウイルスが発生する可能性がなく、安全性が高いものとなる。 According to the present invention, the following effects are recognized.
i) In the present invention, since it is not necessary to use an oil adjuvant at all, it can be shipped at an earlier stage without food safety problems as compared with poultry inoculated with an oil adjuvant.
ii) Because it is possible to administer eye drops by spraying, etc., it is possible to administer vaccine to multi-fowl poultry at once.
As a result, labor for vaccine administration can be greatly reduced, and at the same time, a needle stick accident, a problem of disposal of used syringe needles and the like do not occur.
iii) Since a live vaccine is not used, there is no possibility that a virulent virus is generated in the inoculated individual, and the safety is high.

以上により、本発明では、ワクチンを鳥インフルエンザに対する有効な防疫手段とすることが可能となり、従来行われてきた大規模な殺処分を回避することが可能となる。
As described above, according to the present invention, the vaccine can be used as an effective prevention means against avian influenza, and the large-scale killing that has been conventionally performed can be avoided.

実施例1において、各処置群の鶏の抗体価の測定結果を示す図である。In Example 1, it is a figure which shows the measurement result of the antibody titer of the chicken of each treatment group.

実施例2において、各処置群の鶏の抗体価の測定結果を示す図である。In Example 2, it is a figure which shows the measurement result of the antibody titer of the chicken of each treatment group.

本発明は、家禽に対して鳥インフルエンザの不活化ワクチンを点眼投与することを特徴とする、家禽における鳥インフルエンザの予防方法に関する。   The present invention relates to a method for preventing avian influenza in poultry, characterized by administering an inactivated vaccine for avian influenza to poultry.

〔不活化ワクチン〕
本発明における鳥インフルエンザの不活化ワクチンとしては、不活化された鳥インフルエンザウイルスを抗原として用いることを要する。
ここで不活化とは、ウイルスとしての機能（感染や増殖する機能等）を失っている状態を指す。
なお、本発明におけるワクチンとしては、安全性の点で、ウイルスとしての機能を有する弱毒ウイルスを抗原とする生ワクチンは含まれない。 [Inactivated vaccine]
As an inactivated vaccine of avian influenza in the present invention, it is necessary to use an inactivated avian influenza virus as an antigen.
Here, inactivation refers to a state in which a function as a virus (function of infection or proliferation) is lost.
The vaccine in the present invention does not include a live vaccine using an attenuated virus having a function as a virus as an antigen from the viewpoint of safety.

抗原として用いられる不活化ウイルスの種類としては、ウイルス粒子の構造が保持されたまま不活化された不活化全粒子ウイルス、；ウイルス粒子を破壊して不活化された不活化スプリットウイルス、；を挙げることができる。
不活化全粒子ウイルスは、β-プロピオラクトン、ホルマリン等の化学処理、加温処理、紫外線照射などにより得ることができる。また、不活化スプリットウイルスは、エーテル等の化学処理などにより得ることができる。
本発明では、十分な免疫原性を得るために、不活化全粒子ウイルスを用いることが好ましい。 Examples of types of inactivated viruses used as antigens include inactivated whole-particle viruses inactivated while retaining the structure of virus particles; inactivated split viruses inactivated by destroying virus particles; be able to.
The inactivated whole particle virus can be obtained by chemical treatment such as β-propiolactone and formalin, heating treatment, ultraviolet irradiation and the like. Inactivated split virus can be obtained by chemical treatment with ether or the like.
In the present invention, it is preferable to use an inactivated whole particle virus in order to obtain sufficient immunogenicity.

なお、本発明における不活化ワクチンとしては、ウイルス由来タンパク質（例えば、ウイルスから精製または遺伝子組み換え技術により作製されたヘマグルチニン等）のみを抗原とするものは含まれない。
抗原性を有するタンパク質のみでは、十分な免疫原性を持たないことが示唆されているためである。 In addition, the inactivated vaccine in the present invention does not include a vaccine using only a virus-derived protein (for example, hemagglutinin purified from a virus or produced by a gene recombination technique) as an antigen.
This is because it has been suggested that a protein having antigenicity alone does not have sufficient immunogenicity.

本発明においては、鳥インフルエンザウイルスとしては、鳥類に感染するA型インフルエンザウイルスを対象とする。
インフルエンザウイルスは、表面にヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)がスパイク状に配列した構造であり、H1N1型〜H16N9型からなる144種類の亜型に分類される。
特には、家禽に感染した際に、高い病原性を示す高病原性鳥インフルエンザウイルスを対象とする。 In the present invention, the avian influenza virus is a type A influenza virus that infects birds.
Influenza viruses have a structure in which hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are arranged in a spike shape on the surface, and are classified into 144 subtypes consisting of H1N1 to H16N9 types.
In particular, it targets highly pathogenic avian influenza viruses that exhibit high pathogenicity when infected with poultry.

〔点眼投与〕
本発明では、前記不活化ワクチンを、家禽に対して「点眼投与」することを必須とする。
本発明では、目の粘膜から不活化ウイルスを接種した場合に、強い免疫を付与することができる。
ここで点眼投与とは、眼窩に前記不活化ワクチンを投与し、目の粘膜を介して不活化ウイルスを導入する投与方法である。
なお、従来、家禽において、粘膜から投与できる不活化ワクチンはほとんど存在しない。一般的に、不活化ワクチンを粘膜から投与した場合、ほとんど免疫応答を起こさない、または、弱い免疫応答を起こすだけだからである。
鳥インフルエンザに対する不活化ワクチンについても、アジュバントなしで、点眼投与によって強い免疫を付与できることは全く想定されていなかった [Ophthalmic administration]
In the present invention, it is essential that the inactivated vaccine is “instilled” to poultry.
In the present invention, strong immunity can be imparted when an inactivated virus is inoculated from the eye mucosa.
Here, the ophthalmic administration is an administration method in which the inactivated vaccine is administered to the orbit and the inactivated virus is introduced through the mucous membrane of the eye.
Conventionally, there are few inactivated vaccines that can be administered from mucous membranes in poultry. In general, when an inactivated vaccine is administered from the mucosa, it causes little or only a weak immune response.
For inactivated vaccines against avian influenza, it was never assumed that strong immunity could be conferred by instillation without an adjuvant

点眼投与の具体的な態様としては、点眼器等を用いて、通常の目薬をさすように、不活化ワクチンの雫を上方から落下させる方法をとることができる。
例えば、片方の目（好ましくは両方の目）に一滴ずつ投与する方法で行うことができる。
また、シリンジ、水鉄砲状の容器等を用いて、前記液体を目に噴射する方法をとることもできる。
また、本発明において好ましくは、不活化ワクチンを噴霧させる「スプレー散布」の態様をとることによって一度に多頭羽の家禽に対して点眼投与することが可能となる。
ここで、スプレー散布としては、スプレー、噴霧器、霧吹き器等を用いて行うことができる。 As a specific aspect of the ophthalmic administration, a method of dropping an inactivated vaccine sputum from above so as to point to a normal eye drop using an eye dropper or the like can be used.
For example, it can be performed by a method in which one drop is administered to one eye (preferably both eyes).
Moreover, the method of injecting the said liquid into eyes using a syringe, a water gun-like container, etc. can also be taken.
Further, in the present invention, preferably, by adopting a “spray spraying” mode in which an inactivated vaccine is sprayed, it is possible to administer eye drops to multi-fowled poultry at once.
Here, spraying can be performed using a spray, a sprayer, a sprayer, or the like.

ワクチンの投与量としては、不活化ウイルス量に換算して103 HAU以上、好ましくは103〜105 HAU、さらに好ましくは104 HAU程度の量を、1度の点眼で投与することが望ましい。なお、HAUとは、赤血球凝集価（hemagglutination unit）を示す単位である。
また、本発明では、十分な免疫を付与するために、間隔を空けて2回以上の投与を行うことが望ましい。投与間隔としては、3週間〜2ヶ月が好ましい。 The dose of the vaccine is preferably 10 3 HAU or more, preferably 10 3 to 10 5 HAU, more preferably about 10 4 HAU in terms of the amount of inactivated virus. . HAU is a unit indicating hemagglutination unit.
In the present invention, it is desirable to administer two or more doses at intervals in order to confer sufficient immunity. The administration interval is preferably 3 weeks to 2 months.

〔ワクチンの形態〕
本発明におけるワクチンは、点眼に適した形態（使用時に液体の状態）であれば如何なる形態のものも含む。例えば、目薬様の液体アンプル、濃縮液等の形状とすることができる。
また、粉末、顆粒、カプセル状であっても、使用の際に液体であれば問題なく用いることができる。また、必要に応じて、pH調製剤、抗生物質等を混合したものでも良い。
また、本発明のワクチンとしては、他の病原菌やウイルスの抗原を混合した混合ワクチンの形態とすることもできる。 [Vaccine form]
The vaccine in the present invention includes any form as long as it is in a form suitable for eye drops (in a liquid state at the time of use). For example, it can be in the form of an eye drop-like liquid ampule, concentrated liquid, or the like.
Moreover, even if it is a powder, a granule, and a capsule form, if it is a liquid at the time of use, it can be used without a problem. Moreover, what mixed pH adjuster, antibiotics, etc. may be used as needed.
In addition, the vaccine of the present invention can be in the form of a mixed vaccine in which antigens of other pathogenic bacteria and viruses are mixed.

〔アジュバント〕
本発明においては、アジュバント（免疫増強剤）の併用を全く必要とすることなく、十分な免疫を付与することができる。
ここで、アジュバントの併用とは、(i)原則的にはワクチンにアジュバントを含有させて投与する態様を指すものであるが、(ii)ワクチンとアジュバントをそれぞれ別途に投与する態様も含むものである。 [Adjuvant]
In the present invention, sufficient immunity can be imparted without the need for any combined use of an adjuvant (immunity enhancing agent).
Here, the combined use of an adjuvant refers to (i) a mode in which an adjuvant is contained in a vaccine in principle, and (ii) includes a mode in which a vaccine and an adjuvant are separately administered.

これにより、本発明では、従来、鳥インフルエンザの不活化ワクチンを皮下又は筋肉内に注射する際には必須であったオイルアジュバント、を全く使用しなくても、鳥インフルエンザに対する免疫を付与することが可能となる。
なお、オイルアジュバントは、皮下や筋肉注射には適しているものの、粘性が高いことから粘膜投与全般（経口、総排泄腔、経鼻、点眼）には適さない。さらに、オイルアジュバントは体内に長期間残留するため、食品安全性の点から、接種家禽は一定期間出荷できなくなる。 Thereby, in the present invention, it is possible to confer immunity against avian influenza without using any oil adjuvant, which has been indispensable when subcutaneously or intramuscularly injecting an inactivated vaccine for avian influenza. It becomes possible.
Although oil adjuvants are suitable for subcutaneous and intramuscular injection, they are not suitable for general mucosal administration (oral, total excretory cavity, nasal, instillation) because of their high viscosity. Furthermore, since the oil adjuvant remains in the body for a long time, the inoculated poultry cannot be shipped for a certain period from the viewpoint of food safety.

なお、本発明においては、ワクチン投与においてアジュバントの使用を全く排除するものではなく、安全性が高く粘性が低いなど、点眼に適した性質を持つものであれば、その使用は可能である。   In the present invention, the use of an adjuvant is not completely excluded in vaccine administration, and any vaccine can be used as long as it has properties suitable for eye drops such as high safety and low viscosity.

〔対象となる家禽〕
本発明は、鳥類全般に対して適用が可能な技術であるが、具体的に対象となるのは家禽である。
ここで、家禽としては、鶏、あひる、うずら、きじ、だちょう、ほろほろ鳥、七面鳥などを挙げることができる。特には、養鶏産業への応用の観点から、鶏に対して有効に用いることができる。 [Target poultry]
Although the present invention is a technique that can be applied to birds in general, a specific target is poultry.
Examples of poultry include chickens, ducklings, quails, pheasants, ostriches, cheeks and turkeys. In particular, it can be effectively used for chickens from the viewpoint of application to the poultry industry.

また、本発明の点眼による不活化ワクチン投与は、鳥インフルエンザウイルスが感染する前の個体であれば、成鳥であっても雛に対しても免疫を付与することができる。
但し、ウイルスに感染した後の個体については、ワクチンの効果を得ることができない。
Moreover, the inactivated vaccine administration by the eye drop of this invention can confer immunity to a chick even if it is an adult bird if it is an individual before the avian influenza virus is infected.
However, the effect of the vaccine cannot be obtained for individuals after being infected with the virus.

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, the scope of the present invention is not limited by these.

〔調製例1〕 不活化ウイルスの調製
10日齢の発育鶏卵に、高病原性鳥インフルエンザウイルス（A/chichen/Yamaguchi/07/2004, H5N1型）を接種し、2日後に尿漿膜腔液を回収した。
尿漿膜腔液にβ-プロピオラクトンを最終濃度0.1％となるように添加し、室温で4時間放置し、ウイルスを不活化させ、30,000rpm 2hrの遠心分離を行って沈査を回収した。 [Preparation Example 1] Preparation of inactivated virus
Ten-day-old chicken eggs were inoculated with highly pathogenic avian influenza virus (A / chichen / Yamaguchi / 07/2004, type H5N1), and urinary serous fluid was collected two days later.
Β-propiolactone was added to the urinary serous fluid to a final concentration of 0.1%, and allowed to stand at room temperature for 4 hours to inactivate the virus, and the precipitate was collected by centrifugation at 30,000 rpm for 2 hours.

得られた沈査から、ショ糖密度勾配遠心法により不活化全粒子ウイルスを精製した。
70％及び25％ショ糖溶液とともに、27,000rpm 2hrの遠心を行い、両ショ糖溶液の間に濃縮される不活化ウイルスを回収した。
得られた不活化全粒子ウイルスは、鶏赤血球を用いて、赤血球凝集価（HAU）を測定し、ワクチン抗原とした。
The inactivated whole particle virus was purified from the obtained precipitate by sucrose density gradient centrifugation.
Centrifugation was performed at 27,000 rpm for 2 hours together with 70% and 25% sucrose solutions, and the inactivated virus concentrated between the two sucrose solutions was recovered.
The obtained inactivated whole particle virus was used as a vaccine antigen by measuring the hemagglutination value (HAU) using chicken erythrocytes.

〔実施例1〕 不活化ウイルスの鶏への点眼投与
・「ワクチン投与」
成鳥である鶏群に、上記調製した不活化ウイルス（104 HAU）を眼窩に点眼投与した。なお、投与は4週間隔で2回行った。
その後、2回目の投与から4週間後に血清を採取し、抗体価（赤血球凝集阻止価：HIU)を測定した（試験群1）。
また、陽性対象として、前記不活化ウイルスの点眼投与に加えて、アジュバント（CpG ODNまたはコレラトキシン）を同時に点眼投与した鶏群の抗体価を測定した（試験群2,3）。
なお、陰性対照として、ワクチンを投与しない鶏群の抗体価も測定した（試験群4）。測定結果を、表1および図1に示す。 [Example 1] Instillation of inactivated virus to chickens ・ "Vaccine administration"
The inactivated virus (10 4 HAU) prepared above was instilled into the orbit of an adult chicken group. Administration was performed twice at 4-week intervals.
Thereafter, serum was collected 4 weeks after the second administration, and the antibody titer (hemagglutination inhibition titer: HIU) was measured (Test Group 1).
In addition to the ophthalmic administration of the inactivated virus as a positive subject, the antibody titers of chicken groups that were simultaneously instilled with an adjuvant (CpG ODN or cholera toxin) were measured (test groups 2 and 3).
As a negative control, the antibody titer of the chicken group not administered with the vaccine was also measured (test group 4). The measurement results are shown in Table 1 and FIG.

なお、以下の表中において、抗体価の値が「N.D.」と記載されている箇所は、検出限界である10 HIU以下であったことを示す。また、以下の図中において、測定値が検出限界の10 HIU以下（N.D.）の鶏個体は、便宜的に1 HIUにプロットして示した。   In the following table, the part where the value of the antibody titer is described as “N.D.” indicates that the detection limit was 10 HIU or less. In the following figure, chickens whose measured values were 10 HIU or less (N.D.), the detection limit, were plotted for convenience as 1 HIU.

この結果、不活化鳥インフルエンザウイルス全粒子を単独で点眼投与（試験群1：本発明）することによって、当該ウイルスに対する抗体の産生を誘導できることが示された。
また、その抗体価は、アジュバントを併用した場合（試験群2,3：陽性対照）と比べて、同程度であることが示された。 As a result, it was shown that the production of antibodies against the virus can be induced by instilling all the inactivated avian influenza virus particles alone (Test Group 1: the present invention).
In addition, the antibody titer was shown to be comparable to that when adjuvant was used together (test groups 2, 3: positive control).

・「防御効果の検証」
上記各試験群1〜4の各鶏について、致死量の高病原性鳥インフルエンザウイルス（A/chichen/Yamaguchi/07/2004, H5N1型）の攻撃に晒し（感染させて）、2週間経過を観察した。結果を表1に示す。 ・ "Verification of defense effect"
Each chicken in each of the above test groups 1 to 4 was exposed to (infected with) a lethal dose of highly pathogenic avian influenza virus (A / chichen / Yamaguchi / 07/2004, H5N1) and observed for 2 weeks. did. The results are shown in Table 1.

この結果、ワクチンを投与していない群（陰性対照）では、2日後に全ての鶏が死亡した。
それに対して、不活化ウイルスのみを点眼投与した群（試験群1）では、2週間が経過した後においても、ほとんどの鶏で発病が起こらなかった。また、発病した1例についても、感染から6日後と、発病が大きく遅延した。
また、その防御効果は、アジュバントを併用した群（試験群2,3）と比べて、同程度であることが示された。 As a result, in the group not receiving the vaccine (negative control), all chickens died after 2 days.
In contrast, in the group administered with inactivated virus alone (Study Group 1), most chickens did not develop disease even after 2 weeks. In addition, in one patient who became ill, the onset was greatly delayed, 6 days after infection.
Moreover, it was shown that the protective effect is comparable compared with the group (test group 2, 3) which used the adjuvant together.

Figure 2013001686
Figure 2013001686

〔実施例2〕 点眼投与と経鼻投与との対比
・「ワクチン投与」
実施例1と同様にして、成鳥である鶏群に、上記調製した不活化ウイルス（103 HAU）を眼窩に点眼投与した。投与は4週間隔で2回行い、2回目の投与から4週間後に、血清を採取し、抗体価を測定した（試験群5）。
一方、比較対象として、成鳥である鶏群に、上記調製した不活化ウイルス（103 HAU）を、鶏の鼻腔に投与（経鼻投与：粘膜投与の一種）した。投与は4週間隔で2回行い、2回目の投与から4週間後に、血清を採取し、抗体価を測定した（試験群6）。
結果を表2および図2に示す。 [Example 2] Contrast between ophthalmic administration and nasal administration "Vaccine administration"
In the same manner as in Example 1, the inactivated virus (10 3 HAU) prepared above was instilled into the orbit of an adult chicken group. Administration was performed twice at 4-week intervals, and after 4 weeks from the second administration, serum was collected and the antibody titer was measured (Test Group 5).
On the other hand, as a comparative object, the inactivated virus (10 3 HAU) prepared above was administered to chicken nasal cavity (nasal administration: a type of mucosal administration) to adult chicken groups. Administration was performed twice at 4-week intervals, and serum was collected and antibody titer was measured 4 weeks after the second administration (Test Group 6).
The results are shown in Table 2 and FIG.

その結果、当該不活化ウイルスを単独で経鼻投与（試験群6：比較対照）した場合では、当該ウイルスに対する抗体の産生を誘導できないことが示唆された。   As a result, it was suggested that when the inactivated virus was administered nasally alone (Test Group 6: comparative control), production of antibodies against the virus could not be induced.

Figure 2013001686
Figure 2013001686

〔考察〕
以上の結果から、「鳥インフルエンザウイルスの不活化ウイルス」を抗原として用い、投与方法として「点眼投与」にて行うことによって、従来は必須であるアジュバント（免疫増強剤）を併用することなく、強い免疫を鶏に付与できることが明らかになった。
なお、粘膜投与の一種である経鼻投与では抗体の産生を誘導することはできないことから、当該免疫は、眼の粘膜からの投与によって効率よく付与されることが示唆された。
[Discussion]
From the above results, it is possible to use “avian influenza virus inactivated virus” as an antigen, and to perform “instillation administration” as an administration method. It became clear that immunity could be given to chickens.
In addition, nasal administration, which is a type of mucosal administration, cannot induce antibody production, suggesting that the immunity is efficiently imparted by administration from the ocular mucosa.

本発明は、家禽における鳥インフルエンザに対して、極めて有効な防疫技術となることが期待される。
これにより、本発明を家禽産業において使用することにより、鳥インフルエンザ発生時の大規模な殺処分を回避することが可能となり、家禽産業における経済的被害の軽減に大きく寄与することが期待される。
また、本発明に基づいて、家禽に対する鳥インフルエンザの予防及び緊急接種ワクチンとして、商品化が期待される。 The present invention is expected to be a very effective prevention technology against avian influenza in poultry.
As a result, by using the present invention in the poultry industry, it is possible to avoid a large-scale killing at the time of occurrence of avian influenza, and it is expected to greatly contribute to the reduction of economic damage in the poultry industry.
Moreover, based on this invention, commercialization is anticipated as prevention of avian influenza with respect to poultry, and an emergency inoculation vaccine.

Claims (4)

家禽に対して、以下(A)に記載の不活化ワクチンを点眼投与することを特徴とする、家禽における鳥インフルエンザの予防方法。
(A)：不活化した鳥インフルエンザウイルスを抗原として含み、且つ、オイルアジュバントを含まない不活化ワクチン。 A method for preventing avian influenza in poultry, comprising administering the inactivated vaccine described in (A) below to poultry.
(A): An inactivated vaccine containing an inactivated avian influenza virus as an antigen and no oil adjuvant. 前記不活化した鳥インフルエンザウイルスが、ウイルス粒子の構造が保持されたまま不活化されたものである、請求項1に記載の鳥インフルエンザの予防方法。   2. The method for preventing avian influenza according to claim 1, wherein the inactivated avian influenza virus is inactivated while maintaining the structure of virus particles. 前記点眼投与が、スプレー散布によって行うものである、請求項1又は2のいずれかに記載の鳥インフルエンザの予防方法。   3. The method for preventing avian influenza according to claim 1, wherein the ophthalmic administration is performed by spraying. 前記点眼投与が、間隔を空けて2回以上行うものである、請求項1〜3のいずれかに記載の鳥インフルエンザの予防方法。   The method for preventing avian influenza according to any one of claims 1 to 3, wherein the ophthalmic administration is performed twice or more at intervals.
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