JP2012528133A - Functional amphiphilic molecules or macromolecular formulations with multiple compartments - Google Patents
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Abstract
本発明は、少なくとも一つの治療薬、特に抗癌剤を送達する又は標的化するための、複数区画を有する新規機能性両親媒性分子、又は巨大分子製剤、並びにそのような製剤を調製するための方法、及びその使用に関する。 The present invention relates to novel functional amphiphilic molecules or macromolecular formulations having multiple compartments for delivering or targeting at least one therapeutic agent, in particular anticancer agents, and methods for preparing such formulations. And its use.
Description
本発明は、少なくとも一つの治療薬、特に抗新生物剤を送達又は標的化するための、複数区画を有する新規の機能性両親媒性分子又は巨大分子製剤、並びにそのような製剤を調製するための方法、及びその使用に関する。 The present invention relates to novel functional amphiphilic molecule or macromolecular formulations with multiple compartments for the delivery or targeting of at least one therapeutic agent, particularly antineoplastic agents, and to prepare such formulations. And the use thereof.
抗新生物剤の間で、シスプラチンは、特に固形腫瘍の治療のために、広く用いられる抗新生物剤である。しかしながら、その使用は、その毒性及び獲得耐性の出現により、限られている。 Among the anti-neoplastic agents, cisplatin is a widely used anti-neoplastic agent, particularly for the treatment of solid tumors. However, its use is limited by its emergence of toxicity and acquired resistance.
これらの欠点を改善するために、異なる製剤は先行技術において提案されている：例えば、米国特許5,178,876は、リポソームでのカプセル化を目的とした疎水性複合体の形態での白金誘導体を記載している。 To remedy these drawbacks, different formulations have been proposed in the prior art: For example, US Pat. No. 5,178,876 describes platinum derivatives in the form of hydrophobic complexes intended for encapsulation in liposomes. Yes.
米国特許6,001,817は、シスプラチン、及び少なくとも一つのヌクレオシド又はデオキシヌクレオシドを含む担体を含む組成物を記載している。
米国特許7,908,160は、リガンドと結合するシスプラチン誘導体に関し、その活性はリガンドとの結合によって可逆的である。
US Pat. No. 6,001,817 describes a composition comprising cisplatin and a carrier comprising at least one nucleoside or deoxynucleoside.
US Pat. No. 7,908,160 relates to cisplatin derivatives that bind to a ligand whose activity is reversible upon binding to the ligand.
特許出願WO01/32139は、負に荷電した天然の脂質、特にジオレオイルホスファチジルセリン(dioleylphosphatidylserine)に基づいて、凍結及び解凍のサイクルを繰り返すことにより得られる脂質ナノ粒子にカプセル化されたシスプラチン組成物を記載している。この適用では、これは、シスプラチンが、水中で、非荷電の種よりも高い溶解性を有する正に荷電した凝集体を形成することを示し、それは、負に荷電した脂質膜とのそれらの相互作用、及びシスプラチン凝集体の周りの脂質膜の再編成を許容する。 Patent application WO01 / 32139 describes a cisplatin composition encapsulated in lipid nanoparticles obtained by repeating freezing and thawing cycles based on negatively charged natural lipids, in particular dioleoylphosphatidylserine. Is described. In this application, this indicates that cisplatin forms positively charged aggregates that are more soluble in water than uncharged species, which is their mutual interaction with negatively charged lipid membranes. Allows action and reorganization of lipid membranes around cisplatin aggregates.
しかしながら、治療薬、特に抗新生物剤の標的化と関連する問題を解決するための要求も存在している。 However, there is also a need to solve the problems associated with targeting therapeutic agents, particularly anti-neoplastic agents.
特に、健康な細胞を保護しながら、すなわち神経の、腎臓の、聴覚の、消化の毒性などを減少させることにより、この治療薬に対する耐性の出現の現象を同時に制限することにより、高い医薬的活性を伴って、腫瘍細胞の内部に迅速に送達されるための治療薬(特にシスプラチン及び/又はその誘導体)を許容するための、手法が探索されている。 High pharmacological activity, in particular by simultaneously limiting the phenomenon of emergence of resistance to this therapeutic agent while protecting healthy cells, i.e. reducing neurological, renal, auditory, digestive toxicity etc. As a result, approaches are being explored to allow therapeutic agents (especially cisplatin and / or its derivatives) to be rapidly delivered to the interior of tumor cells.
特に活性の損失及び毒性の観点から、治療薬の早期放出、及び生物学的媒体中での遊離の治療薬の存在に関連する欠点を避けるために、長期に亘り、十分な安定性を有する担体を提供することが試みられている。 A carrier that has sufficient stability over time to avoid the disadvantages associated with the early release of therapeutic agents and the presence of free therapeutic agents in biological media, especially in terms of loss of activity and toxicity Has been tried to provide.
さらに、同じ製剤中の異なる区画に、同じ製剤中の一つ又はそれ以上の治療薬をカプセル化する可能性は、これ(これら)の薬剤(複数)の、同じ標的への、同時の又は互い違いの送達を許容する利益を有し、それぞれの区画は、容器として働くことができる。 Furthermore, the possibility of encapsulating one or more therapeutic agents in the same formulation in different compartments in the same formulation is the simultaneous or staggering of these (several) agents to the same target. Each compartment can serve as a container.
機能性両親媒性分子又は巨大分子から形成された、複数区画を有する製剤は、特に37℃で、改良された安定性の特性を示し、このことは長期に亘って前記治療薬を持続した標的化を可能とし、治療薬の効率的で迅速な細胞内送達を許容すること、が今回発見された。 Multi-compartment formulations formed from functional amphiphilic molecules or macromolecules, especially at 37 ° C., show improved stability properties, which are targets that have sustained the therapeutic agent over time It has now been discovered that it can be made to allow for efficient and rapid intracellular delivery of therapeutic agents.
それ故、本発明の対象は第一の態様によれば、機能性両親媒性分子又は巨大分子から形成された異なる極性の少なくとも二つの脂質層により取り囲まれた、治療薬を含む硬い核により構成されるナノ粒子の形態での、複数区画を有する製剤である。 The subject of the present invention is therefore, according to the first aspect, constituted by a hard nucleus containing a therapeutic agent surrounded by at least two lipid layers of different polarity formed from functional amphiphilic molecules or macromolecules. Is a formulation with multiple compartments in the form of nanoparticles.
（原文記載無し） (No original text)
「ナノ粒子」は、約1〜200 nM、好ましくは25〜150 nMの平均直径を有する粒子を意味する。 "Nanoparticle" means a particle having an average diameter of about 1 to 200 nM, preferably 25 to 150 nM.
本記述を換気すると、「本発明によるナノ粒子」又は「複数区画を有するナノ粒子」は、機能性両親媒性分子又は巨大分子から形成された異なる極性の少なくとも二つの脂質層によって取り囲まれた、治療薬を含む硬い核により構成されるナノ粒子の形態での複数区画を有する製剤を意味する。 Ventilating this description, the “nanoparticles according to the invention” or “nanoparticles with multiple compartments” are surrounded by at least two lipid layers of different polarity formed from functional amphiphilic molecules or macromolecules, It refers to a formulation having multiple compartments in the form of nanoparticles composed of hard nuclei containing therapeutic agents.
有利なことに、それぞれの脂質層は、核に存在するそれと同一又は異なる治療薬を含む区画を構成する。 Advantageously, each lipid layer constitutes a compartment containing the same or different therapeutic agent as that present in the nucleus.
有利な態様によれば、本発明による複数区画を有する製剤は、前もって形成された粒子から形成されるのではなく、治療薬(複数)の存在下で、異なる極性の前記脂質層から形成され、これは、所望の活性に応じて、所望の区画(複数)の中で活性成分の「カスタマイズされた」カプセル化を許容する。 According to an advantageous embodiment, the formulation with multiple compartments according to the invention is not formed from preformed particles, but is formed from said lipid layer of different polarity in the presence of the therapeutic agent (s), This allows for “customized” encapsulation of the active ingredient in the desired compartment (s) depending on the desired activity.
この特定の構造は、治療薬の送達に適合する本発明の安定性(存続期間)による複数区画を有するナノ粒子を与え、そして、この治療薬の放出後、それらの分解を許容する。 This particular structure provides nanoparticles with multiple compartments according to the stability (lifetime) of the present invention that is compatible with the delivery of therapeutic agents and allows their degradation after release of the therapeutic agent.
好ましくは、第一の脂質層は、一つ又はそれ以上の陰イオン性の脂質(複数)により構成され、第二の脂質層は、一つ又はそれ以上の陽イオン性の脂質(複数)により構成される。 Preferably, the first lipid layer is composed of one or more anionic lipids and the second lipid layer is composed of one or more cationic lipids. Composed.
「異なる極性の」は、核を取り囲んでいるそれぞれの連続する脂質層が、前のものと異なる脂質によって構成され、それぞれの層が負(陰イオン性脂質によって構成される)、又は正(陽イオン性脂質によって構成される)、又は中性(中性脂質によって構成される)の全体表面電荷を有することを意味する。例えば、第一の脂質層は、陰イオン性脂質によって形成され、負の表面電荷を帯びるのに対し、第二の脂質層は、陽イオン性脂質によって形成され、正の表面電荷を帯びる。 `` Different polar '' means that each successive lipid layer surrounding the nucleus is composed of a different lipid than the previous one, and each layer is negative (constituted by anionic lipid) or positive (positive It means having an overall surface charge of (constituted by ionic lipids) or neutral (composed of neutral lipids). For example, the first lipid layer is formed by an anionic lipid and has a negative surface charge, while the second lipid layer is formed by a cationic lipid and has a positive surface charge.
それぞれの層の表面電荷は、それらのゼータ電位により測定され、例えば、Andrea Mayer らによる Toxicology, 2009, 258, 139-147 、又は K. Furusawa 及び K. Uchiyama, 1988, 140, 217-226 に記述された技術による。 The surface charge of each layer is measured by their zeta potential and is described, for example, by Andrea Mayer et al. In Toxicology, 2009, 258, 139-147, or K. Furusawa and K. Uchiyama, 1988, 140, 217-226. Depending on the technology used.
有利な態様によれば、本発明による複数区画を有するナノ粒子は、交互する陰イオン性及び陽イオン性脂質層、及び一つ又はそれ以上の中性脂質(複数)により構成されるさらなる層を含む。 According to an advantageous embodiment, the nanoparticles with multiple compartments according to the present invention comprise alternating anionic and cationic lipid layers and a further layer composed of one or more neutral lipid (s). Including.
好ましい態様によれば、それぞれの脂質層は、式(I)： According to a preferred embodiment, each lipid layer has the formula (I):
の少なくとも一つの機能性両親媒性化合物により構成され、ここで、
−Xは、酸素、又は硫黄原子、又はメチレン基を表し、
−Bは、プリン、又はピリミジン塩基、例えば、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン、又はそれらの誘導体、又は非天然の単-又は二環式の、それぞれのその環が、随意的に置換された4〜7のメンバーを含むヘテロ環式の塩基を表し；
−L1及びL2は、同一又は異なって、水素、オキシカルボニル -O-C(O)-基、チオカルバメート -O-C(S)-NH-基、カルボナート-O-C(O)-O-基、カルバメート -O-C(O)-NH-基、酸素原子、リン酸基、ホスホネート基、又は直鎖若しくは分枝鎖の、飽和若しくは不飽和のC2〜C30の炭化水素鎖によって、置換されていない若しくは置換されている1〜4の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、
又は、L1及びL2はまた、共に式のケタール基を形成し、
Of at least one functional amphiphilic compound, wherein
-X represents an oxygen, sulfur atom, or methylene group;
-B is a purine or pyrimidine base such as uracil, adenine, guanine, cytosine, thymine, hypoxanthine, or derivatives thereof, or a non-natural mono- or bicyclic, each of its rings optionally Represents a heterocyclic base containing from 4 to 7 members substituted on
-L 1 and L 2 are the same or different and represent hydrogen, oxycarbonyl -OC (O)-group, thiocarbamate -OC (S) -NH- group, carbonate-OC (O) -O- group, carbamate- OC (O) -NH- group, an oxygen atom, a phosphate group, phosphonate group, or a linear or branched, saturated or by a hydrocarbon chain of C 2 -C 30 unsaturated, or substituted not substituted Represents a heteroaryl group containing 1-4 nitrogen atoms,
Or L 1 and L 2 also together form a ketal group of the formula
又は、L1若しくはL2は水素を表し、他方はヒドロキシ基又は直鎖若しくは分枝鎖のC2〜C30のアルキル鎖により置換されていない若しくは置換された1〜4の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し； Or, L 1 or L 2 represents hydrogen, and the other is a hetero group containing 1 to 4 nitrogen atoms not substituted or substituted by a hydroxy group or a linear or branched C 2 -C 30 alkyl chain. Represents an aryl group;
−R1及びR2は、同一又は異なって、
−フッ素原子により、又はベンジル又はナフチルエステル又はエーテルにより、鎖の末端で炭素が、置換されていない又は置換された、随意的に完全に又は部分的にフッ素化された、飽和又は部分的に不飽和の、直鎖又は分枝鎖のC2〜C30、好ましくは、C6〜C25、特にC8〜C25の炭化水素鎖を表し、又は
−それぞれのアシル鎖がC2〜C30であるジアシル鎖、又は
−ジアシルグリセロール、スフィンゴシン、又はセラミド基、又は
−L1又はL2が、水素を表し、他方がヒドロキシ基又は1〜4の窒素原子を含むヘテロアリール基を表すとき、R1及びR2は存在せず；
-R 1 and R 2 are the same or different,
The carbon at the end of the chain is unsubstituted or substituted, optionally fully or partially fluorinated, saturated or partially unsaturated by fluorine atoms or by benzyl or naphthyl esters or ethers. saturated, C 2 -C 30 linear or branched chain, preferably, C 6 -C 25, in particular a hydrocarbon chain of C 8 -C 25, or - each acyl chain is C 2 -C 30 A diacyl chain, or -diacylglycerol, sphingosine, or ceramide group, or -L 1 or L 2 represents hydrogen and the other represents a hydroxy group or a heteroaryl group containing 1 to 4 nitrogen atoms, R 1 and R 2 are not present;
−R3は、以下：
−ヒドロキシ、アミノ、リン酸、ホスホネート、ホスファチジルコリン、O-アルキルホスファチジルコリン、チオホスフェート、ホスホニウム、NH2-R4、NHR4R5、又はNR4R5R6基、ここで、R4、R5、及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は直鎖若しくは分枝鎖のC1〜C5アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖のC1〜C5ヒドロキシルアルキル鎖、又は
−ヒドロキシル基により随意的に置換された直鎖又は分枝鎖のC2〜C30アルキル鎖又は
−シクロデキストリンラジカル、又は
-R 3 is:
- hydroxy, amino, phosphate, phosphonate, phosphatidylcholine, O- alkyl phosphatidylcholines, thiophosphate, phosphonium, NH 2 -R 4, NHR 4
ここでVは、-O-、-S-、又は-NH-結合を表し、R7は、H又はCH3を、及びn=1〜500を表すラジカル、又は
−-(CH2)n-V-R8基、ここで、R8は、C2〜C30アルキル、及びn=1〜500を表す、又は、
−C2〜C30アルキルにより、又は-(CH2)m-O-(CH2)p-R9基により、置換されない、又は置換される、1〜4の窒素原子を含むヘテロアリール基、ここで、m＝1〜6、及びp＝0〜10、及びR9は、少なくとも一つの直鎖又は分枝鎖のC2〜C30アルキルにより、又はステロールラジカルにより、置換されていない、又は置換された、5〜7の炭素原子を含む、環状ケタール基を表す、
を表し、又は
−R3は、二量体の形態で式(I)の化合物を形成するために、同一の又は異なる式(I)の他の化合物の、同一又は異なる他の置換基R3との共有結合により、連結され、
それぞれの脂質層は、前のもののそれと異なる極性を有する。
Where V represents an —O—, —S—, or —NH— bond, R 7 represents H or CH 3 , and a radical representing n = 1 to 500, or —— (CH 2 ) n — VR 8 group, wherein, R 8 represents a C 2 -C 30 alkyl, and n = 1 to 500, or,
The -C 2 -C 30 alkyl, or - (CH 2) m -O- by (CH 2) p -R 9 radical, unsubstituted or substituted, heteroaryl groups containing 1 to 4 nitrogen atoms, Wherein m = 1-6 and p = 0-10, and R 9 is not substituted by at least one linear or branched C 2 -C 30 alkyl, or by a sterol radical, or Represents a substituted, cyclic ketal group containing 5 to 7 carbon atoms,
Or -R 3 represents other substituents R 3 that are the same or different from other compounds of the same or different formula (I) to form a compound of formula (I) in the form of a dimer. Linked by a covalent bond with
Each lipid layer has a different polarity than that of the previous one.
式(I)の化合物の電荷は、当該化合物が含む極性基により決定され、それらは置換基L1、L2、及び/又はR3に本質的に存在するか、又はそれらにより構成される。 The charge of the compound of formula (I) is determined by the polar group contained in the compound, which is essentially present in or constituted by the substituents L 1 , L 2 and / or R 3 .
第一の脂質層を調製するために用いられる式(I)の陰イオン性化合物は、例えば、陰イオン性核脂質、例えば、L1、L2、及び/又はR3が、随意的に置換された、負の荷電基、例えば、リン酸、ホスホネート、カルボキシレート、硫酸基などを表す式(I)の化合物などから選択される。 The anionic compound of formula (I) used to prepare the first lipid layer is, for example, optionally substituted by an anionic nuclear lipid, such as L 1 , L 2 , and / or R 3. Selected from the compounds of formula (I) representing negatively charged groups such as phosphoric acid, phosphonates, carboxylates, sulfate groups and the like.
第一の脂質層を調製するために用いられる式(I)の陽イオン性化合物は、例えば、陽イオン性核脂質、例えば、L1、L2、及び/又はR3が、随意的に置換された、正の荷電基、例えば、アンモニウム、ホスホニウム、イミダゾリウム基などを表す式(I)の化合物など選択される。 The cationic compound of formula (I) used to prepare the first lipid layer is, for example, optionally substituted by a cationic nuclear lipid, such as L 1 , L 2 , and / or R 3. Selected compounds of the formula (I) representing positively charged groups such as ammonium, phosphonium, imidazolium groups, etc. are selected.
これらの極性基の電荷はまた、これらの基、例えば、それがアミン、イミダゾール、リン酸基などである場合のpKaによって変化する。 The charge of these polar groups also varies with these groups, for example, the pKa when it is an amine, imidazole, phosphate group, and the like.
「治療薬」は、特に、ヒトを含む動物において、又は核酸又はそれらの断片の例外を含む、単離された細胞において、例えば、インビトロ、又はインビボで、病理学又は生物学的機能の回復の予防又は治療のために用いられる、例えば、天然の、又は合成の分子を意味する。 A “therapeutic agent” refers to the restoration of pathological or biological function, particularly in animals, including humans, or in isolated cells, including exceptions to nucleic acids or fragments thereof, eg, in vitro or in vivo . For example, natural or synthetic molecules used for prevention or treatment.
そのような分子は、例えば、医薬の活性成分から、特に抗新生物剤、例えば：
-白金錯体、その中でも特に、言及されたシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ロバプラチンなど、又は、
−白金錯体と結合するルテニウム、又は、
−ルテニウムII及び/又はIII、チタニウム、例えば、二塩化チタノセン、又はグリウム、例えば、ガリウム塩、例えば硝酸ガリウム、塩化ガリウム、KP46、に基づく、白金を含まない無機錯体、又は、
−鉄誘導体、例えば、フェロセニウム塩、鉄を含むヌクレオシドアナログ、ピリジル-五座配位子を含む鉄(II)錯体、又は、
−コバルト誘導体、例えば、ヘキサカルボニルジコバルト錯体、アルキンコバルト錯体、ナイトロジェンマスタードリガンドを含むCo(III)錯体、又は、
−金誘導体、例えば、アウラノフィン、金(I)、(III)、及び(III)錯体、アウロチオグルコースなど、
から選択される。
Such molecules are, for example, from pharmaceutical active ingredients, in particular anti-neoplastic agents such as
-Platinum complexes, among others mentioned cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, lobaplatin etc., or
-Ruthenium binding to the platinum complex, or
A platinum-free inorganic complex based on ruthenium II and / or III, titanium, for example titanocene dichloride, or gallium, for example a gallium salt, for example gallium nitrate, gallium chloride, KP46, or
An iron derivative, for example a ferrocenium salt, a nucleoside analogue containing iron, an iron (II) complex containing a pyridyl-pentadentate ligand, or
A cobalt derivative, for example a hexacarbonyldicobalt complex, an alkyne cobalt complex, a Co (III) complex comprising a nitrogen mustard ligand, or
-Gold derivatives such as auranofin, gold (I), (III) and (III) complexes, aurothioglucose, etc.
Selected from.
有利なことに、本発明による複数区画を有する製剤は、それらの分子をカプセル化すること、及びそれらの細胞内送達を確かにすることを可能にし、同時にこれらの化合物に対する獲得耐性の現象を制限する。 Advantageously, the multi-compartment formulation according to the invention makes it possible to encapsulate the molecules and to ensure their intracellular delivery, while at the same time limiting the phenomenon of acquired resistance to these compounds. To do.
白金錯体、特にシスプラチンは、本発明の目的のために好適な治療薬である。 Platinum complexes, particularly cisplatin, are preferred therapeutic agents for the purposes of the present invention.
ルテニウムII及び/又はIIIに基づく無機錯体は、例えば、NAMI-A、RAPTA-C、KP1019と呼ばれる錯体である。そのような非-白金錯体は、Ott I. 及び Gust R., Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2007, 340, 117-126 ; Reedijk J., Curr Opin Chem Biol., 1999, 3, 236-40 ; Haimei Chen らによる J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 173-186に記載されている。 Inorganic complexes based on ruthenium II and / or III are, for example, complexes called NAMI-A, RAPTA-C, KP1019. Such non-platinum complexes are described in Ott I. and Gust R., Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2007, 340 , 117-126; Reedijk J., Curr Opin Chem Biol., 1999, 3, 236- 40; J. Am. Chem. Soc., 2003, 125 , 173-186 by Haimei Chen et al.
鉄を含むヌクレオシドアナログは、 Schlawe D. らによる Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 1731-1734に記載されている。 Nucleoside analogs containing iron are described by Schlawe D. et al. In Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 1731-1734.
有利なことに、置換基Bで表される少なくとも一つの治療薬のリガンド (核酸塩基、ヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヘテロ環など)を含み、少なくとも一つの親水性部分(リン酸、カルボキシレートなど)、及び少なくとも一つの疎水性部分(一本鎖、二本鎖である疎水性部分、及び生物学的起源のシントン由来の極性部分など)の存在により両親媒特性を有する、式(I)の化合物を構成する分子及び/又は巨大分子構造は、治療薬を含む安定的なナノ粒子を形成することを可能にすることが発見された。 Advantageously, it comprises at least one therapeutic agent ligand (nucleobase, nucleoside, modified nucleoside, nucleotide, oligonucleotide, heterocycle, etc.) represented by substituent B, and at least one hydrophilic moiety (phosphorus). Acid, carboxylate, etc.), and amphiphilic properties due to the presence of at least one hydrophobic moiety (such as hydrophobic moieties that are single-stranded, double-stranded, and polar moieties derived from synthons of biological origin), It has been discovered that the molecules and / or macromolecular structures that make up the compounds of formula (I) make it possible to form stable nanoparticles containing therapeutic agents.
式(I)の化合物の両親媒性特性、これらの化合物の中の治療薬(活性成分)のリガンドの存在、及び治療薬とこれらの化合物の間の何らかの静電気的相互作用を組み合わせることにより、得られたナノ粒子は、それ故、カプセル化された活性成分、特に抗新生物剤、の効果的で迅速な細胞内送達を許容する構造を有する。 Obtained by combining the amphipathic properties of the compounds of formula (I), the presence of the ligand of the therapeutic agent (active ingredient) in these compounds, and any electrostatic interaction between the therapeutic agent and these compounds. The nanoparticle thus has a structure that allows for effective and rapid intracellular delivery of encapsulated active ingredients, in particular anti-neoplastic agents.
本発明を一つの説に限定するものではないが、式(I)の化合物の分子内相互作用は、使用の条件下で長期に亘る一層の安定性をもたらす、ナノ粒子の表面に及ぼす凝集力の増加を導くと仮定される。 While not limiting the present invention to a single theory, the intramolecular interaction of the compound of formula (I) exerts a cohesive force on the surface of the nanoparticle that provides more stability over time under the conditions of use. Is assumed to lead to an increase in
調節可能な極性を有する多重脂質層に基づく、本発明のナノ粒子の複数区画を有する構造は、それらに多数の利点、特に：
-特に生物学的媒体における、増大した安定性、
-想定される使用におけるそれらの有効性に応じた表面電荷(ゼータ電位)の調節、
−それらの機能化(機能性、標的化薬剤などの導入)、
−異なる治療薬の組み込み、
を与える。
Structures with multiple compartments of the nanoparticles of the present invention, based on multiple lipid layers with tunable polarity, have many advantages to them, in particular:
-Increased stability, especially in biological media,
-Adjustment of surface charge (zeta potential) according to their effectiveness in the envisaged use,
-Functionalization of them (introduction of functionality, targeted drugs, etc.),
-Incorporation of different therapeutic agents,
give.
有利なことに、前記ナノ粒子はまた、治療薬のための担体としてのそれらの使用と適合した存続期間を有する。 Advantageously, the nanoparticles also have a lifetime compatible with their use as a carrier for therapeutic agents.
上述の式(I)では、nは、有利に、1〜500の間に含まれ、好ましくは1〜100の間に含まれ、特に1〜50の間に含まれ、なお特に1〜10の間に含まれる。 In the above formula (I), n is advantageously comprised between 1 and 500, preferably comprised between 1 and 100, in particular comprised between 1 and 50, still more particularly between 1 and 10. Included in between.
「直線又は分枝のC1〜C5アルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、i-プロピル、n-ブチル、i-ブチル、3級-ブチルラジカル、好ましくはメチル又はエチルを意味する。 “Linear or branched C 1 -C 5 alkyl” means, for example, a methyl, ethyl, propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, tertiary-butyl radical, preferably methyl or ethyl.
また、上述の式(I)では、プリン又はピリミジン塩基、又は非天然へテロ環塩基は、例えば、ハロゲン、アミノ基、カルボキシ基、カルボニル基、カルボニルアミノ基、ヒドロキシ、アジド、シアノ、アルキル、シクロアルキル、ペルフルオロアルキル、アルキルオキシ(例えば、メトキシ)、オキシカルボニル、ビニル、エチニル、プロピニル、アシル基などから選択される、少なくとも一つの置換基により置換される。 In the above formula (I), the purine or pyrimidine base or the non-natural heterocyclic base is, for example, halogen, amino group, carboxy group, carbonyl group, carbonylamino group, hydroxy, azide, cyano, alkyl, cyclohexane. Substituted by at least one substituent selected from alkyl, perfluoroalkyl, alkyloxy (eg, methoxy), oxycarbonyl, vinyl, ethynyl, propynyl, acyl groups, and the like.
「非天然ヘテロ環塩基」は、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はヒポキサンチン以外の天然では存在しない塩基を意味する。 “Non-natural heterocyclic base” means a non-naturally occurring base other than uracil, adenine, guanine, cytosine, thymine, or hypoxanthine.
「1〜4の窒素原子を含むヘテロアリール基」は、単環の、又は二環の、芳香族の、又は部分的に不飽和の、5〜12の原子を含み、1〜4の窒素原子により遮られた、炭素環の基、特にピラゾール、トリアゾール、テトラゾール、またはイミダゾール基を意味する。 “Heteroaryl group containing 1 to 4 nitrogen atoms” means monocyclic or bicyclic, aromatic or partially unsaturated, 5 to 12 atoms, 1 to 4 nitrogen atoms Means a carbocyclic group interrupted by, especially a pyrazole, triazole, tetrazole or imidazole group.
式(I)の化合物の調製のために、この種類の化合物(特にpp.8〜17 及び実施例参照)への異なる到達経路を記述する、出願WO 2005/116043を参照することができる。 For the preparation of compounds of formula (I), reference may be made to application WO 2005/116043, which describes different routes of access to this class of compounds (see in particular pp. 8-17 and the examples).
後続の態様によれば、本発明はまた、それぞれの脂質層が、核の中に存在するそれと同一又は異なる治療薬を含む区画を構成する、機能性両親媒性分子又は巨大分子から形成される異なる極性の少なくとも二つの脂質層により取り囲まれる、治療剤を含む核により構成される固体ナノ粒子の形態で、複数区画を有する製剤を調製するための方法であって、以下のステップ：
a)少なくとも一つの機能性両親媒性分子又は巨大分子、特に上述の定義された式(I)の機能性両親媒性化合物、及び治療薬を調製し、
b)前記治療薬を含むナノ粒子を得るために、繰り返して加熱する及び凍結するサイクルに前記混合物を供し、及び
c)このようにして得られた前記治療薬を含むナノ粒子を再被覆し、
d)前記ナノ粒子を、ステップa)で用いられたそれと異なる極性を有する、少なくとも一つの機能性両親媒性分子又は巨体分子、特に、上記で定義された式(I)の機能性両親媒性化合物の存在の中に移し、
e) このようにして得られた複数区画ナノ粒子を再被覆すること、
を含む、方法に関する。
According to subsequent embodiments, the invention is also formed from functional amphiphilic molecules or macromolecules, each lipid layer constituting a compartment containing the same or different therapeutic agent as that present in the nucleus. A method for preparing a multi-compartment formulation in the form of solid nanoparticles composed of a nucleus containing a therapeutic agent surrounded by at least two lipid layers of different polarity, comprising the following steps:
a) preparing at least one functional amphiphilic molecule or macromolecule, in particular a functional amphiphilic compound of formula (I) as defined above, and a therapeutic agent;
b) subjecting the mixture to repeated heating and freezing cycles to obtain nanoparticles containing the therapeutic agent; and
c) re-coating the nanoparticles containing the therapeutic agent thus obtained,
d) at least one functional amphiphilic molecule or macromolecule with a polarity different from that used in step a), in particular the functional amphiphilic compound of formula (I) as defined above Move into the presence of compounds,
e) re-coating the multi-compartment nanoparticles obtained in this way,
Including a method.
好ましくは、治療薬は、抗新生物剤、特に、白金錯体、特にシスプラチンである。 Preferably, the therapeutic agent is an antineoplastic agent, in particular a platinum complex, in particular cisplatin.
有利なことに、本方法のステップは、所望の脂質層の数を得るために必要な回数繰り返される。 Advantageously, the steps of the method are repeated as many times as necessary to obtain the desired number of lipid layers.
随意的に、少なくとも一つの機能性両親媒性分子、又は巨大分子、特に上記で定義された式(I)の機能性両親媒性化合物、により構成される中性の脂質層の形成から成り、前記の式(I)の前記分子又は化合物は中性である、追加のステップは、ステップd)及びステップe)の間で行われる。 Optionally comprising the formation of a neutral lipid layer composed of at least one functional amphiphilic molecule, or macromolecule, in particular a functional amphiphilic compound of formula (I) as defined above, The molecule or compound of formula (I) is neutral, an additional step is performed between step d) and step e).
好ましい態様によれば、ステップa)及び/又はステップd)では、少なくとも一つの共脂質は、機能性両親媒性化合物に加えて用いられる。 According to a preferred embodiment, in step a) and / or step d), at least one colipid is used in addition to the functional amphiphilic compound.
「共脂質」は、ナノ粒子の脂質層(複数)の構造の製造に寄与する、式(I)の化合物と組み合わせて用いられる化合物を意味する。 “Colipid” means a compound used in combination with a compound of formula (I) that contributes to the production of the structure of the lipid layer (s) of nanoparticles.
好ましくは、両性イオン性共脂質が用いられる。 Preferably, zwitterionic colipids are used.
前記共脂質は、例えば、ジオレイルホスホファチジルコリン(DOPC)、ジオレイルホスファチジルウリジンホスファチジルコリン(DOUPC)、又はジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から選択される。 The colipid is selected from, for example, dioleyl phosphatidylcholine (DOPC), dioleyl phosphatidyluridine phosphatidylcholine (DOUPC), or dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE).
これらの化合物は、それらが式(I)の化合物との混合に用いられたときに、共脂質の役割を果たす。代わりに、それらは、式(I)、例えば、ジオレイルホスファチジルウリジンホスファチジルコリン(DOUPC)などに含まれる。この場合、それらは、式(I)の化合物の役割を果たす、又は式(I)の他の化合物と組み合わせで、共脂質の役割を果たす。 These compounds act as colipids when they are used in admixture with compounds of formula (I). Instead, they are included in formula (I), such as dioleyl phosphatidyluridine phosphatidylcholine (DOUPC) and the like. In this case, they act as compounds of formula (I) or in combination with other compounds of formula (I) as colipids.
他の有利な態様によれば、ステップa)に用いられるそれと同一又は異なる治療薬は、ステップd)に導入される。 According to another advantageous embodiment, the same or different therapeutic agent used in step a) is introduced in step d).
好ましくは、ステップa)に用いられる式(I)の機能性両親媒性化合物(複数)は、陰イオン性であり、ステップd)に用いられる式(I)の機能性両親媒性化合物(複数)は、陽イオン性である。 Preferably, the functional amphiphilic compound (s) of formula (I) used in step a) is anionic and the functional amphiphilic compound (s) of formula (I) used in step d) ) Is cationic.
有利なことに、式(I)の中性機能性両親媒性化合物は、ステップd)及びステップe)の間で製造される最外部の脂質層を構成するために用いられる。 Advantageously, the neutral functional amphiphilic compound of formula (I) is used to constitute the outermost lipid layer produced between step d) and step e).
より具体的には、複数区画を有する製剤を調製するための方法は、例えば、式(I)の化合物により形成された異なる極性の二つの脂質層により取り囲まれた、治療薬を含む硬い核により構成されるナノ粒子の形態の複数区画を有する製剤の製造、を説明する下記の一般的な条件の下で実施されるステップを含む。 More specifically, a method for preparing a multi-compartment formulation is, for example, by a hard nucleus containing a therapeutic agent surrounded by two lipid layers of different polarity formed by a compound of formula (I). Including the steps performed under the following general conditions describing the manufacture of a formulation having multiple compartments in the form of composed nanoparticles.
1) 治療薬を多く含む核、及び第一の脂質層を含む、本発明によるナノ粒子の形成
−式(I)の化合物は、脂質混合物を形成するために、有機溶媒に溶解され、その後、溶媒を、第一の脂質被膜を形成するために蒸発させた；
−平行して、治療薬、好ましくは抗新生物剤の所望の量は、蒸留水に溶解された；
−脂質被膜は、治療薬、好ましくは、抗新生物剤の溶液中で再水和された。透明な溶液が超音波処理及び加熱により得られた；
−溶液は、急速に、例えば、液体窒素への浸漬により、冷却された。この加熱/冷却のサイクルは、好ましくは、1〜10回、好ましくは5〜10回、好ましくは10回、行われた；
−得られた懸濁液の超音波処理、及び遠心分離後、上清は取り除かれ、ペレットは再懸濁された；
−遠心分離後、ペレットは取り除かれ、上清は回収された。
1) Formation of nanoparticles according to the invention comprising a nucleus rich in therapeutic agents and a first lipid layer- the compound of formula (I) is dissolved in an organic solvent to form a lipid mixture, and then The solvent was evaporated to form a first lipid film;
-In parallel, the desired amount of therapeutic agent, preferably an anti-neoplastic agent, was dissolved in distilled water;
The lipid coating was rehydrated in a solution of a therapeutic agent, preferably an antineoplastic agent. A clear solution was obtained by sonication and heating;
The solution was cooled rapidly, for example by immersion in liquid nitrogen. This heating / cooling cycle was preferably carried out 1 to 10 times, preferably 5 to 10 times, preferably 10 times;
-After sonication of the resulting suspension and centrifugation, the supernatant was removed and the pellet was resuspended;
-After centrifugation, the pellet was removed and the supernatant was recovered.
2) 治療薬を多く含む核、異なる極性の二つの脂質層を含む、本発明によるナノ粒子の形成
−第二の脂質被膜は、本方法の第一の部分で用いられる式(I)の化合物のそれと異なる極性の式(I)の化合物から調製された；
−第二の脂質被膜は、前に回収された上清で再水和され、
−得られた懸濁液の超音波処理、及び遠心分離後、上清は分離され、ペレットは再懸濁された；
−遠心分離後、ペレットは取り除かれ、異なる極性の二つの脂質層を含む複数区画を有するナノ粒子を含む、上清は回収された。
2) Formation of nanoparticles according to the invention comprising a nucleus rich in therapeutic agents, two lipid layers of different polarity- the second lipid coating is a compound of formula (I) used in the first part of the method Prepared from a compound of formula (I) of a polarity different from that of
The second lipid coating is rehydrated with the previously collected supernatant,
-After sonication of the resulting suspension and centrifugation, the supernatant was separated and the pellet was resuspended;
-After centrifugation, the pellet was removed and the supernatant containing nanoparticles with multiple compartments containing two lipid layers of different polarity was collected.
有利なことに、上記の方法のステップは、所望の脂質層の数を得るために必要な回数繰り返される。 Advantageously, the steps of the above method are repeated as many times as necessary to obtain the desired number of lipid layers.
好ましくは、脂質層の数は、2〜6の間で含まれる。 Preferably, the number of lipid layers is comprised between 2-6.
随意的に、上記で定義されたような、少なくとも一つの式(I)の機能性両親媒性化合物、前記の中性である式(I)の化合物、により構成される脂質層の形成から成る追加のステップ、は、本発明による複数区画を有するナノ粒子の回収を許容する最終ステップの前に、本方法の第二の部分の間に行われる。 Optionally comprising the formation of a lipid layer composed of at least one functional amphiphilic compound of formula (I) as defined above, said neutral compound of formula (I). An additional step is performed during the second part of the method before the final step that allows the recovery of nanoparticles with multiple compartments according to the present invention.
好ましい態様によれば、上述の調製の最初の部分において、又はその2番目の部分において、液体混合物の形成の間、少なくとも一つの上述のような共脂質は、式(I)の化合物に加えて用いられる。 According to a preferred embodiment, in the first part of the above preparation or in the second part thereof, during the formation of the liquid mixture, at least one colipid as described above is added Used.
本発明による好ましい製剤は、第一の脂質層が陰イオン性で、第二の脂質層が、陽イオン性であるそれらである。 Preferred formulations according to the invention are those in which the first lipid layer is anionic and the second lipid layer is cationic.
有機溶媒は、例えば、当該分野における通常の有機溶媒、例えば、クロロホルム、又はジクロロメタン、アルコール、例えば、メタノール又はエタノールなどから選択される。 The organic solvent is selected from, for example, common organic solvents in the art such as chloroform or dichloromethane, alcohols such as methanol or ethanol.
加熱は、好ましくは、20℃〜80℃の範囲の温度まで、冷却は-190℃(液体窒素)〜0℃(氷)の範囲の温度まで行われた。適切な加熱する/冷却するサイクルは、例えば、過熱について45℃、冷却について-78℃である。 Heating was preferably done to a temperature in the range of 20 ° C. to 80 ° C. and cooling was done to a temperature in the range of −190 ° C. (liquid nitrogen) to 0 ° C. (ice). Suitable heating / cooling cycles are, for example, 45 ° C for overheating and -78 ° C for cooling.
好ましくは、治療薬は、白金錯体(シスプラチン、カルボプラチンなど)、特に好ましいシスプラチン、又は白金錯体と結合するルテニウム、又は上述の、ルテニウムII、又はIII、チタン、ガリウム、コバルト、鉄、又は金に基づく白金を含まない無機錯体から選択される。 Preferably, the therapeutic agent is based on a platinum complex (cisplatin, carboplatin, etc.), particularly preferred cisplatin, or ruthenium that binds to a platinum complex, or ruthenium II or III, titanium, gallium, cobalt, iron, or gold as described above. It is selected from inorganic complexes not containing platinum.
式(I)の化合物/治療薬のモル比Rは、例えば、0.01〜50の間で、特にR=0.2で含まれる。 The compound / therapeutic agent molar ratio R of the formula (I) is for example comprised between 0.01 and 50, in particular R = 0.2.
得られたナノ粒子は、随意的に、例えば、100又は200 nmの範囲の細孔直径を有するポリカーボネートを通して押し出される。 The resulting nanoparticles are optionally extruded through a polycarbonate having a pore diameter in the range of 100 or 200 nm, for example.
複数区画を有するナノ粒子は、それ故得られる、それは、
共脂質を含む、または含まない上述のような式(I)の機能性両親媒性化合物により構成された異なる極性の少なくとも二つの脂質層により取り囲まれた治療薬(活性成分)を多く含む硬い核により構成される。
Nanoparticles with multiple compartments are therefore obtained, which
A hard nucleus rich in therapeutic agents (active ingredients) surrounded by at least two lipid layers of different polarity composed of functional amphiphilic compounds of formula (I) as described above with or without colipids Consists of.
本発明の態様によれば、前記脂質混合物は、少なくとも一つの式(I)の化合物だけを含み、共脂質を含まない。 According to an embodiment of the invention, the lipid mixture comprises only at least one compound of formula (I) and no colipids.
活性成分の細胞内送達が有意であるように、治療薬は、好ましくは、水相で0.1 ng/mL〜 10 mg/mLの範囲の濃度で用いられる。 The therapeutic agent is preferably used at concentrations ranging from 0.1 ng / mL to 10 mg / mL in the aqueous phase so that intracellular delivery of the active ingredient is significant.
脂質層を形成するために用いられる式(I)の好適な化合物は、Xが酸素を表すそれらである。 Preferred compounds of formula (I) used to form the lipid layer are those in which X represents oxygen.
Bがチミン又はアデニンを表す式(I)の化合物はまた、好適な化合物である。 Compounds of formula (I) in which B represents thymine or adenine are also suitable compounds.
L1、L2、及び/又はR3が、負に荷電した基、例えば、随意的に置換されている、リン酸、ホスホナート、カルボキシレート、硫酸基などは、陰イオン性脂質層を得るために好適な化合物である。 L 1 , L 2 , and / or R 3 are negatively charged groups such as phosphate, phosphonate, carboxylate, sulfate groups, etc., optionally substituted to obtain an anionic lipid layer Is a suitable compound.
L1、L2、及び/又はR3が、正に荷電した基、例えば、随意的に置換されている、アンモニウム、ホスホニウム、イミダゾリウム基など、は、陽イオン性脂質層を得るために好適な化合物である。 L 1 , L 2 , and / or R 3 is a positively charged group, such as an optionally substituted ammonium, phosphonium, imidazolium group, etc., suitable for obtaining a cationic lipid layer Compound.
好ましい態様によれば、本発明は、式(I)のこれらの化合物、及び治療薬、特に抗新生物剤、特に白金錯体(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ロバプラチンなど)、又は白金錯体と結合することのできるルテニウム、又はルテニウム、チタン、ガリウム、コバルト、鉄、又は金に基づく白金を含まない上述の無機錯体、を含む、上記で定義したような複数区画を有するナノ粒子に関する。シスプラチンは、本発明の目的のための好ましい抗新生物剤である。 According to a preferred embodiment, the present invention relates to these compounds of formula (I) and therapeutic agents, in particular anti-neoplastic agents, in particular platinum complexes (for example cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, lobaplatin etc.), or platinum The invention relates to nanoparticles having multiple compartments as defined above, comprising ruthenium that can bind to the complex, or the above-mentioned inorganic complexes that do not contain platinum based on ruthenium, titanium, gallium, cobalt, iron or gold. Cisplatin is a preferred antineoplastic agent for the purposes of the present invention.
式(I)の化合物はまた、抗新生物活性を有するプリン‐又はピリミジン−に基づく誘導体、例えば、アラシトシン(AraC)、5-フルオロウラシル(5-FU)、ロドデオキシウリジン(IdU)、2'-デオキシ-2'-メチリデンシチジン(DMDC)、又は 5-クロロ-6-アジド-5,6-ジヒドロ-2'-デオキシウリジンなどを含む。 Compounds of formula (I) are also purine- or pyrimidine-based derivatives having antineoplastic activity, such as aracytosine (AraC), 5-fluorouracil (5-FU), rhododeoxyuridine (IdU), 2'- Deoxy-2'-methylidene cytidine (DMDC), 5-chloro-6-azido-5,6-dihydro-2'-deoxyuridine and the like are included.
本発明の対象はまた、治療薬、特に抗新生物剤の送達又は標的化のための薬剤としての、上述の複数区画を有するナノ粒子の使用である。 The subject of the present invention is also the use of nanoparticles with multiple compartments as described above as agents for the delivery or targeting of therapeutic agents, in particular anti-neoplastic agents.
特に、本発明の対象はまた、治療薬、特に抗新生物剤の細胞内送達のための薬剤としての、上述の複数区画を有するナノ粒子の使用である。 In particular, the subject of the present invention is also the use of nanoparticles with multiple compartments as described above as agents for the intracellular delivery of therapeutic agents, in particular anti-neoplastic agents.
本発明はまた、抗新生物医薬の調製のための、上述の複数区画を有するナノ粒子の使用に関する。 The present invention also relates to the use of the above-mentioned multipartition nanoparticles for the preparation of antineoplastic medicaments.
本発明はまた、腫瘍疾患、特に癌、例えば、卵巣、睾丸、結腸、頸部、肺の癌、又は腺肉腫など、の治療のための、上述の複数区画を有するナノ粒子に関する。 The invention also relates to a nanoparticle having a plurality of compartments as described above for the treatment of tumor diseases, in particular cancers such as ovarian, testicular, colon, cervical, lung cancer or adenosarcoma.
前記の複数区画を有するナノ粒子は、上述の方法により、得られる。 The nanoparticles having a plurality of compartments can be obtained by the method described above.
本発明はまた、上述のように、機能性両親媒性分子又は巨大分子(又は複数区画を有するナノ粒子)から形成される異なる極性の少なくとも二つの脂質層により取り囲まれた、治療薬を含む硬い核により構成されるナノ粒子の形態で、複数区画を有する製剤を含む医薬組成物、及び医薬的に許容される媒体に関する。 The present invention also includes a therapeutic agent, as described above, comprising a therapeutic agent surrounded by at least two lipid layers of different polarity formed from functional amphiphilic molecules or macromolecules (or nanoparticles having multiple compartments). The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a preparation having a plurality of compartments in the form of nanoparticles composed of a nucleus, and a pharmaceutically acceptable medium.
本発明は、下記の実施例により非限定的に説明される。
全ての出発化合物は、化学製品の供給者(Aldrich、Alfa Aeser、及びAventi Polar Lipid)から入手し、続いて精製することなく用いられた。溶媒は、さらに蒸留することなく用いられた。合成された化合物は、例えば、NMR(300.13 MHzでの 1H、75.46 MHzでの13C、及び121.49 MHzでの31P)及び質量分析(特性)などの、標準的な分光分析方法を用いて特徴付けられた。NMRにおける化学シフト(δ)は、ppmで、及びTMSとの比較で表された。NMR 1Hにおけるカップリング定数 JはHzで表される。Merck RP-18 F254sプレートは、薄層クロマトグラフィー(TLC)に、用いられた。SEPHADEX LH-20(25〜100μm)シリカは、定量クロマトグラフィーによる精製に用いられた。
The invention is illustrated in a non-limiting manner by the following examples.
All starting compounds were obtained from chemical suppliers (Aldrich, Alfa Aeser, and Aventi Polar Lipid) and were subsequently used without purification. The solvent was used without further distillation. The synthesized compounds were prepared using standard spectroscopic methods such as NMR ( 1 H at 300.13 MHz, 13 C at 75.46 MHz, and 31 P at 121.49 MHz) and mass spectrometry (characteristics). Characterized. The chemical shift (δ) in NMR was expressed in ppm and compared to TMS. Coupling constant J in NMR 1 H is expressed in Hz. Merck RP-18 F254s plates were used for thin layer chromatography (TLC). SEPHADEX LH-20 (25-100 μm) silica was used for purification by quantitative chromatography.
「調製物」と題された以下の実施例は、式(I)の化合物を調製するために用いられる合成中間体の調製を記載する。式(I)の化合物の調製、及び本発明によるナノ粒子の試験は、下記の合成例及び「実施例」と題された試験に記載される。 The following examples entitled “Preparations” describe the preparation of synthetic intermediates used to prepare compounds of formula (I). The preparation of compounds of formula (I) and the testing of the nanoparticles according to the invention are described in the synthesis examples below and the tests entitled “Examples”.
調製物1
5'-パラトルエンスルホニルチミジン
5'-paratoluenesulfonylthymidine
0.1 M溶液中の2 gのチミジン(8.26 mmol)は、無水窒素雰囲気下で、二つ口フラスコ中の無水ピリジンに加えられた。溶液は、その後、0℃に冷却され、3.935 gのパラトルエンスルホン酸クロリド(2.5当量、20.6 mmol)が少量ずつ加えられた。反応溶媒は、周囲温度に戻すために放置され、その後10時間撹拌された。反応は、その後、10 mLのメタノールの添加により停止され、30 分間撹拌が続けられた。50 mLのCH2Cl2は、混合物に加えられ、その後、それは、20 mLのNaHCO3の5％溶液、20 mLのNaClの飽和溶液、及び20 mLのNaHCO3の5％溶液で連続的に洗浄された。溶媒は、減圧下で、除去された。予想された化合物は、メタノールからの再結晶化により、純粋な状態で得られた。
RF:0.47(酢酸エチル/メタノール 9/1)
収率：75％
2 g of thymidine (8.26 mmol) in 0.1 M solution was added to anhydrous pyridine in a two-necked flask under an anhydrous nitrogen atmosphere. The solution was then cooled to 0 ° C. and 3.935 g of paratoluenesulfonic acid chloride (2.5 eq, 20.6 mmol) was added in small portions. The reaction solvent was left to return to ambient temperature and then stirred for 10 hours. The reaction was then stopped by the addition of 10 mL of methanol and stirring was continued for 30 minutes. 50 mL of CH 2 Cl 2 is added to the mixture, which is then successively added with 20 mL of a 5% solution of NaHCO 3 , 20 mL of a saturated solution of NaCl, and 20 mL of a 5% solution of NaHCO 3. Washed. The solvent was removed under reduced pressure. The expected compound was obtained in pure form by recrystallization from methanol.
RF: 0.47 (ethyl acetate / methanol 9/1)
Yield: 75%
NMR 1H (300.13 MHz, DMSO d6) : δ 1.77 (s, 3H, CH3), δ 2.11 (m, 2H, CH2), δ 2.42 (s, 3H, CH3), δ 3.52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), δ 4.18 (m, 1H, CH), δ 4.25 (m, 3H, CH, CH2), δ 5.42 (s, 1H, OH), δ 6,15 (t, j = 6 Hz, H, CH), δ 7.38 (s, 1H, CH), δ 7.46 (s, 1H, CH), δ 7.49 (s, 1H, CH), δ 7.78 (s, 1H, CH), δ 7.81 (s, 1H, CH), δ 11.28 (s, 1H, NH)。
NMR 13C (75.47 MHz, DMSO d6) : δ 12.5 (CH3), δ 21.6 (CH3), δ 38.9 (CH2), δ 70.4 (CH2), δ 70.6 (CH), δ 83.7 (CH), δ 84.5 (CH), δ 110.3 (C), δ 128.1 (ar CH), δ 130.6 (ar 2 CH), δ 132.6 (ar C), δ 136.4 (ar C), δ 145.6 (C), δ 150.8 (C=O), δ 164.1 (C=0)。
高分解能MS[M+H]+：397.1
NMR 1 H (300.13 MHz, DMSO d 6 ): δ 1.77 (s, 3H, CH 3 ), δ 2.11 (m, 2H, CH 2 ), δ 2.42 (s, 3H, CH 3 ), δ 3.52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH 2 ), δ 4.18 (m, 1H, CH), δ 4.25 (m, 3H, CH, CH 2 ), δ 5.42 (s, 1H, OH), δ 6,15 (t , j = 6 Hz, H, CH), δ 7.38 (s, 1H, CH), δ 7.46 (s, 1H, CH), δ 7.49 (s, 1H, CH), δ 7.78 (s, 1H, CH) , δ 7.81 (s, 1H, CH), δ 11.28 (s, 1H, NH).
NMR 13 C (75.47 MHz, DMSO d 6 ): δ 12.5 (CH 3 ), δ 21.6 (CH 3 ), δ 38.9 (CH 2 ), δ 70.4 (CH 2 ), δ 70.6 (CH), δ 83.7 (CH ), δ 84.5 (CH), δ 110.3 (C), δ 128.1 (ar CH), δ 130.6 (
High resolution MS [M + H] + : 397.1
調製物2
2'-デオキシ-5'-トルエンスルホニルアデノシン
2'-deoxy-5'-toluenesulfonyladenosine
0.1 M溶液中の2 gの2'-デオキシアデノシン(8 mmol)は、無水窒素雰囲気下で、二つ口フラスコ中の無水ピリジンに加えられた。溶液は、その後、0℃に冷却され、3.793 gのパラトルエンスルホン酸クロリド(2.5当量、20 mmol)が少量ずつ加えられた。反応溶媒は、周囲温度に戻すために放置され、その後10時間撹拌された。反応は、その後、10 mLのメタノールの添加により停止され、30 分間撹拌が続けられた。50 mLのCH2Cl2は、混合物に加えられ、その後、それは、20 mLのNaHCO3の5％溶液、20 mLのNaClの飽和溶液、及び20 mLのNaHCO3の5％溶液で連続的に洗浄された。溶媒は、減圧下で、除去された。予想された化合物は、メタノールからの再結晶化により、純粋な状態で得られた。2.1 gの白色生成物がこの方法で単離された。
RF:0.37(酢酸エチル/メタノール 9/1)
収率：63％
2 g of 2′-deoxyadenosine (8 mmol) in 0.1 M solution was added to anhydrous pyridine in a two-necked flask under an anhydrous nitrogen atmosphere. The solution was then cooled to 0 ° C. and 3.793 g paratoluenesulfonic acid chloride (2.5 eq, 20 mmol) was added in small portions. The reaction solvent was left to return to ambient temperature and then stirred for 10 hours. The reaction was then stopped by the addition of 10 mL of methanol and stirring was continued for 30 minutes. 50 mL of CH 2 Cl 2 is added to the mixture, which is then successively added with 20 mL of a 5% solution of NaHCO 3 , 20 mL of a saturated solution of NaCl, and 20 mL of a 5% solution of NaHCO 3. Washed. The solvent was removed under reduced pressure. The expected compound was obtained in pure form by recrystallization from methanol. 2.1 g of white product was isolated in this way.
RF: 0.37 (ethyl acetate / methanol 9/1)
Yield: 63%
調製物3
5'-アジド‐5'‐デオキシチミジン
5'-azido-5'-deoxythymidine
DMFの0.1 M溶液中の2 gの調製物1に記載の通りの5'-パラトルエンスルホニルチミジン(5 mmol)は、無水窒素雰囲気下で、凝縮装置が備えられた二つ口フラスコ中に、加えられた。1.3 gのアジ化ナトリウム(4当量、20 mmol)が加えられた。溶液は、その後、撹拌され、110℃で10時間加熱された。混合物は周囲温度に冷却された。50 mLのCH2Cl2は、混合物に加えられ、その後、それは、15 mLの水で2回、その後15 mLのNaClの飽和水溶液で連続的に洗浄された。有機相は、硫酸ナトリウム上で乾燥され、その後溶媒は、減圧下で除去された。予想された化合物は、メタノールからの再結晶化により、純粋な状態で得られた。0.8 gの白色固形物がこの方法で得られた。
RF:0.47(酢酸エチル/メタノール 9/1)
収率：60％
MS[M+H]+：268.1
2 g of 5′-paratoluenesulfonylthymidine (5 mmol) as described in
RF: 0.47 (ethyl acetate / methanol 9/1)
Yield: 60%
MS [M + H] + : 268.1
調製物4
5'-アジド-2'-ジデオキシアデノシン
Preparation 4
5'-azido-2'-dideoxyadenosine
DMFの0.1 M溶液中の2 gの調製物2に記載の通りの2'-デオキシ-5'-パラトルエンスルホニルアデノシン(5 mmol)は、無水窒素雰囲気下で、凝縮装置が備えられた二つ口フラスコ中に、加えられた。1.3 gのアジ化ナトリウム(4当量、20 mmol)が加えられた。溶液は、その後、撹拌され、110℃で10時間加熱された。混合物は周囲温度に冷却された。50 mLのCH2Cl2は、混合物に加えられ、その後、それは、15 mLの水で2回、その後15 mLのNaClの飽和水溶液で連続的に洗浄された。有機相は、硫酸ナトリウム上で乾燥され、その後溶媒は、減圧下で除去された。予想された化合物は、メタノールからの再結晶化により、純粋な状態で得られた。0.8 gの白色固形物がこの方法で得られた。
RF:0.37(酢酸エチル/メタノール 9/1)
収率：60％
高分解能MS[M+H]+：計算質量：277.1161、測定質量：277.1157
2 g of 2′-deoxy-5′-paratoluenesulfonyladenosine (5 mmol) as described in
RF: 0.37 (ethyl acetate / methanol 9/1)
Yield: 60%
High resolution MS [M + H] + : Calculated mass: 277.1116, measured mass: 277.1157
調製物5
1-プロパルギルオキシオクタデカン
1-propargyloxyoctadecane
DMFの0.5 M溶液中の673 mgのプロパルギルアルコール(12 mmol)は、無水窒素雰囲気下で、清潔で乾燥したフラスコ中に、加えられた。溶液は、その後0℃に冷却され、180 mgの水素化ナトリウム(0.625当量、7.5 mmol)が少量ずつ加えられた。反応溶媒は、周囲温度に戻すために放置された。2 gの1-ブロモ-オクタデカン(0.5当量、6 mmol)が加えられた。撹拌は5時間続けられた。反応は、その後、10 mLのメタノールの添加により停止され、撹拌は30分続けられた。50 mLのCH2Cl2は、混合物に加えられ、その後、それは、20 mLの水で2回、及び20 mLのNaClの飽和水溶液で連続的に洗浄された。有機相は、その後、Na2SO4上で乾燥され、その後、溶媒は、減圧下で除去された。予想された化合物は、クロマトグラフィーカラム(ヘキサン)で分離後、純粋な状態で得られた。1.2 gの白色生成物がこの方法で得られた。
RF:0.82(ヘキサン)
収率：65％
673 mg of propargyl alcohol (12 mmol) in a 0.5 M solution of DMF was added into a clean and dry flask under an anhydrous nitrogen atmosphere. The solution was then cooled to 0 ° C. and 180 mg sodium hydride (0.625 eq, 7.5 mmol) was added in small portions. The reaction solvent was left to return to ambient temperature. 2 g of 1-bromo-octadecane (0.5 eq, 6 mmol) was added. Stirring was continued for 5 hours. The reaction was then stopped by the addition of 10 mL methanol and stirring was continued for 30 minutes. 50 mL of CH 2 Cl 2 was added to the mixture, after which it was washed successively with 20 mL of water twice and 20 mL of a saturated aqueous solution of NaCl. The organic phase was then dried over Na 2 SO 4 and then the solvent was removed under reduced pressure. The expected compound was obtained pure after separation on a chromatography column (hexane). 1.2 g of white product was obtained in this way.
RF: 0.82 (hexane)
Yield: 65%
NMR 1H (300.13 MHz, CDCl3) : δ0.90 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), δ1.28 (s, 30H, CH2), δ1.61 (m, 2H, CH2), δ2.43 (t, j = 3 Hz, 1H, CH), δ3.53 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), δ4.15 (d, j = 3 Hz, 2H, CH2)。 NMR 1 H (300.13 MHz, CDCl 3 ): δ0.90 (t, j = 6 Hz, 3H, CH 3 ), δ1.28 (s, 30H, CH 2 ), δ1.61 (m, 2H, CH 2 ), δ2.43 (t, j = 3 Hz, 1H, CH), δ3.53 (t, j = 6 Hz, 2H, CH 2 ), δ4.15 (d, j = 3 Hz, 2H, CH 2 ).
NMN 13C (75.47 MHz, CDCl3): δ 14.2 (CH2), δ22.7 (CH2), δ26.1 (CH2), δ29.4 (CH2), δ29.5 (CH2), δ29.6 (CH2), δ32.0 (CH2), δ58.0 (CH2), δ70,4 (CH2), δ74,1 (CH), δ80.1 (C)。 NMN 13 C (75.47 MHz, CDCl 3 ): δ 14.2 (CH 2 ), δ 22.7 (CH 2 ), δ 26.1 (CH 2 ), δ 29.4 (CH 2 ), δ 29.5 (CH 2 ), δ29.6 (CH 2 ), δ32.0 (CH 2 ), δ58.0 (CH 2 ), δ70,4 (CH 2 ), δ74,1 (CH), δ80.1 (C).
調製物6
1,12-プロパルギルオキシドデカン
12-プロパルギルオキシドデカン-1-オール
Preparation 6
1,12-propargyl oxide decane
12-propargyloxidedecan-1-ol
DMFの0.5 M溶液中の1 gのドデカン-1,12-ジオール(5 mmol)は、無水窒素雰囲気下で、清潔で乾燥したフラスコに、加えられた。溶液は、その後0℃に冷却され、360 mgの水素化水素(hydrogen hydride)(3当量、15 mmol)が少量ずつ加えられた。反応溶媒は、周囲温度に戻すために放置された。1.49 gのプロパルギルブロミド(2.5当量、12.5 mmol)が加えられた。撹拌は5時間続けられた。反応は、その後、10 mLのメタノールの添加により停止され、撹拌は30分続けられた。50 mLのCH2Cl2は、混合物に加えられ、その後、それは、20 mLの水で2回、及び20 mLのNaClの飽和水溶液で連続的に洗浄された。有機相は、その後、Na2SO4上で乾燥され、その後、溶媒は、減圧下で除去された。得られた生成物は、その後クロマトグラフィーカラム(ヘキサン/酢酸エチル 9/1)で分離された。二つの生成物、即ち、1,12-プロパルギルオキシドデカンに相当する370 mgの茶色オイル、及び12-プロパルギルオキシドデカン-1-オールに相当する430 mgの茶色固形物は単離された。 1 g of dodecane-1,12-diol (5 mmol) in a 0.5 M solution of DMF was added to a clean and dry flask under an anhydrous nitrogen atmosphere. The solution was then cooled to 0 ° C. and 360 mg of hydrogen hydride (3 eq, 15 mmol) was added in small portions. The reaction solvent was left to return to ambient temperature. 1.49 g propargyl bromide (2.5 eq, 12.5 mmol) was added. Stirring was continued for 5 hours. The reaction was then stopped by the addition of 10 mL methanol and stirring was continued for 30 minutes. 50 mL of CH 2 Cl 2 was added to the mixture, after which it was washed successively with 20 mL of water twice and 20 mL of a saturated aqueous solution of NaCl. The organic phase was then dried over Na 2 SO 4 and then the solvent was removed under reduced pressure. The resulting product was then separated on a chromatography column (hexane / ethyl acetate 9/1). Two products were isolated: 370 mg brown oil corresponding to 1,12-propargyl oxide decane and 430 mg brown solid corresponding to 12-propargyl oxide decan-1-ol.
1,12-プロパルギルオキシドデカン 1,12-propargyl oxide decane
RF:0.53(ヘキサン/酢酸エチル 9/1)
収率：27％
RF: 0.53 (hexane / ethyl acetate 9/1)
Yield: 27%
NMR 1H (300.13 MHz, CDCl3) : δ1.31 (m, 16H, CH2), δ1.61 (m, 4H, CH2), δ2.43 (t, j = 3 Hz, 1H, CH), δ3.52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), δ4.15 (d, j = 3 Hz, 4H, CH2)。 NMR 1 H (300.13 MHz, CDCl 3 ): δ1.31 (m, 16H, CH 2 ), δ1.61 (m, 4H, CH 2 ), δ2.43 (t, j = 3 Hz, 1H, CH) , δ3.52 (t, j = 6 Hz, 4H, CH 2 ), δ4.15 (d, j = 3 Hz, 4H, CH 2 ).
NMR 13C (75.47 MHz, CDCl3) : δ26.1 (CH2), δ29.4 (CH2), δ29.5 (CH2), δ29.6 (CH2), δ58.0 (CH2), δ70.3 (CH2), δ74.1 (CH), δ80.1 (C)。 NMR 13 C (75.47 MHz, CDCl 3 ): δ26.1 (CH 2 ), δ29.4 (CH 2 ), δ29.5 (CH 2 ), δ29.6 (CH 2 ), δ58.0 (CH 2 ) , δ70.3 (CH 2 ), δ74.1 (CH), δ80.1 (C).
12-プロパルギルオキシドデカン-1-オール 12-propargyloxidedecan-1-ol
RF:0.10(ヘキサン/酢酸エチル 9/1)
収率：36％
RF: 0.10 (hexane / ethyl acetate 9/1)
Yield: 36%
NMR 1H (300.13 MHz, CDCl3) : δ1.32 (m, 16H, CH2), δ1.59 (m, 4H, CH2), δ2.43 (t, j = 3 Hz, 2H, CH), δ3.52 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), δ3.65 (t, j = 15 6 Hz, 2H, CH2), δ4.15 (d, j = 3 Hz, 2H, CH2)。 NMR 1 H (300.13 MHz, CDCl 3 ): δ1.32 (m, 16H, CH 2 ), δ1.59 (m, 4H, CH 2 ), δ2.43 (t, j = 3 Hz, 2H, CH) , δ3.52 (t, j = 6 Hz, 2H, CH 2 ), δ3.65 (t, j = 15 6 Hz, 2H, CH 2 ), δ4.15 (d, j = 3 Hz, 2H, CH 2 ).
NMR 13C (75.47 MHz, CDCl3) : δ25.8 (CH2), δ26.0 (CH2), δ29.4 (2 CH2), δ29.5 (2 CH2), δ29.6 (CH2), δ32.7 (CH2), δ57.9 (CH2), δ62.7 (CH2), δ70.2 (CH2), δ74.2 (CH), δ79.9 (C)。 NMR 13 C (75.47 MHz, CDCl 3 ): δ25.8 (CH 2 ), δ26.0 (CH 2 ), δ29.4 (2 CH 2 ), δ29.5 (2 CH 2 ), δ29.6 (CH 2), δ32.7 (CH 2) , δ57.9 (CH 2), δ62.7 (CH 2), δ70.2 (CH 2), δ74.2 (CH), δ79.9 (C).
調製物7
o-プロパルギルコレステロール
Preparation 7
o-propargyl cholesterol
DMFの0.5 M溶液中の500 mgのコレステロール(1.3 mmol)は、無水窒素雰囲気下で、清潔で乾燥したフラスコ中に、加えられた。溶液は、その後0℃に冷却され、47 mgの水素化ナトリウム(1.5当量、2 mmol)が少量ずつ加えられた。反応溶媒は、周囲温度に戻すために放置された。238 mgのプロパルギルブロミド(1.5当量、2 mmol)が加えられた。撹拌は5時間続けられた。反応は、その後、10 mLのメタノールの添加により停止され、撹拌は30分続けられた。50 mLのCH2Cl2は、混合物に加えられ、その後、20 mLの水で2回、及び20 mLのNaClの飽和溶液で連続的に洗浄された。有機相は、その後、Na2SO4上で乾燥され、その後、溶媒は、減圧下で除去された。予想された化合物は、クロマトグラフィーカラム(ヘキサン/酢酸エチル 8/2)で精製後、得られた。215 mgの白色生成物がこの方法で単離された。
RF:0.83(ヘキサン/酢酸エチル8/2)
収率：39％
500 mg cholesterol (1.3 mmol) in a 0.5 M solution of DMF was added into a clean and dry flask under an anhydrous nitrogen atmosphere. The solution was then cooled to 0 ° C. and 47 mg of sodium hydride (1.5 eq, 2 mmol) was added in small portions. The reaction solvent was left to return to ambient temperature. 238 mg propargyl bromide (1.5 eq, 2 mmol) was added. Stirring was continued for 5 hours. The reaction was then stopped by the addition of 10 mL methanol and stirring was continued for 30 minutes. 50 mL of CH 2 Cl 2 was added to the mixture and then washed sequentially with 2 × 20 mL of water and 20 mL of saturated solution of NaCl. The organic phase was then dried over Na 2 SO 4 and then the solvent was removed under reduced pressure. The expected compound was obtained after purification on a chromatography column (hexane / ethyl acetate 8/2). 215 mg of white product was isolated in this way.
RF: 0.83 (hexane / ethyl acetate 8/2)
Yield: 39%
実施例1
チミジン 3'-(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-リン酸)(di c14dT)
Example 1
Thymidine 3 '-(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate) (di c14dT)
5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-デオキシチミジン,3'[(2-シアノ-エチル)-N,N-ジイソプロピル]ホスホラミダイト(0.500 g、1当量、0.67 mmol)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール(0.447 g、1.3当量、0.87 mmol)、及びアセトニトリル中のテトラゾールの0.45M溶液(2 mL、1.3当量、0.87 mmol)は、窒素雰囲気下で、4 mLの無水アセトニトリルに溶解された。反応溶媒は、24時間、周囲温度で磁気的に撹拌された。混合物は、その後、43 mLのTHF/Pyr/水中の0.02 M溶液のジヨードを添加することにより、酸化された。周囲温度で12時間後、溶媒は真空下で蒸発させた。残余物は、8 mLのジクロロメタンに溶解させた。その後、0.2 mLの1,5‐ジアゾビシクロ[5.4.0]ウンデク7-エン(DBU)(1.3当量、0.87 mmol)が5時間に亘り、反応溶媒に添加された。反応溶媒は、0.1 N溶液の塩酸で、その後Na2S2O7の飽和溶液で洗浄された。有機相は、真空下で濃縮された。化合物は、溶出勾配(メタノール/DCM 9：1から1：1)を用いたフラッシュクロマトグラフィーによる精製後、得られた(381 mg)。
収率：69％
Rf：0.34(DCM/メタノール 9：1)
5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-deoxythymidine, 3 ′ [(2-cyano-ethyl) -N, N-diisopropyl] phosphoramidite (0.500 g, 1 equivalent, 0.67 mmol), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol (0.447 g, 1.3 eq, 0.87 mmol) and a 0.45 M solution of tetrazole in acetonitrile (2 mL, 1.3 eq, 0.87 mmol) were added in 4 mL under a nitrogen atmosphere. Dissolved in anhydrous acetonitrile. The reaction solvent was magnetically stirred at ambient temperature for 24 hours. The mixture was then oxidized by adding 43 mL of a 0.02 M solution of diiodo in THF / Pyr / water. After 12 hours at ambient temperature, the solvent was evaporated under vacuum. The residue was dissolved in 8 mL of dichloromethane. Then 0.2 mL of 1,5-diazobicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU) (1.3 eq, 0.87 mmol) was added to the reaction solvent over 5 hours. The reaction solvent was washed with 0.1 N hydrochloric acid and then with a saturated solution of Na 2 S 2 O 7 . The organic phase was concentrated under vacuum. The compound was obtained after purification by flash chromatography using an elution gradient (methanol / DCM 9: 1 to 1: 1) (381 mg).
Yield: 69%
Rf: 0.34 (DCM / methanol 9: 1)
NMR 1H (300 MHz, CDCl3) : δ(ppmで) 0.84 (t, 6H, J=6.92 Hz, 2*CH3), 1.21 (m, 40H, 20*CH2), 1.42 (dd, 4H, J1=8.45 Hz, J2=15.68 Hz, 2*CH2), 1.89 (s, 3H, Me), 2.30 (dd, 4H, J1=7.43 Hz, J2=15.92 Hz, 2*CH2), 2.83 (t, 2H1, J=5.84, H2'), 3.84 (m, 1H, H3'), 4.09-4.35 (m, 7H, 2*CH2(グリセロール), H4', H5'), 5.27 (s, 1H, CHグリセロール), 6.22 (t, 1H, J=6.81 Hz, H1'), 7.61 (s, 1H, H塩基)。 NMR 1 H (300 MHz, CDCl 3 ): δ (in ppm) 0.84 (t, 6H, J = 6.92 Hz, 2 * CH 3 ), 1.21 (m, 40H, 20 * CH 2 ), 1.42 (dd, 4H , J1 = 8.45 Hz, J2 = 15.68 Hz, 2 * CH 2 ), 1.89 (s, 3H, Me), 2.30 (dd, 4H, J1 = 7.43 Hz, J2 = 15.92 Hz, 2 * CH 2 ), 2.83 ( t, 2H1, J = 5.84, H2 '), 3.84 (m, 1H, H 3 '), 4.09-4.35 (m, 7H, 2 * CH 2 (glycerol), H4 ', H5'), 5.27 (s, 1H, CH glycerol), 6.22 (t, 1H, J = 6.81 Hz, H1 ′), 7.61 (s, 1H, H base).
NMR 13C (75 MHz, CDCl3) : δ(ppmで) 19.29 (CH3), 23.71 (CH2), 26.57 (CH2), 28.73 (CH2), 32.76 (CH2), 37.85 (CH2), 48.90 (CH2), 166.15 (C=O)。
NMR 31P (121 MHz, CDCl3) : δ(ppmで) 0.61。
高分解能質量FAB − 理論値 m/z = 815.4823 観測値 m/z ＝ 815.4794。
NMR 13 C (75 MHz, CDCl 3 ): δ (in ppm) 19.29 (CH 3 ), 23.71 (CH 2 ), 26.57 (CH 2 ), 28.73 (CH 2 ), 32.76 (CH 2 ), 37.85 (CH 2 ), 48.90 (CH 2 ), 166.15 (C = O).
NMR 31 P (121 MHz, CDCl 3 ): δ (in ppm) 0.61.
High resolution mass FAB-Theoretical value m / z = 815.4823 Observed value m / z = 815.4794.
実施例2
チミジン 3'-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸)(di c16dT)
Example 2
Thymidine 3 '-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate) (di c16dT)
5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-2'-デオキシチミジン,3'[(2-シアノ-エチル)-N,N-ジイソプロピル]ホスホラミダイト(0.500 g、1当量、0.67 mmol)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロール(0.496 g、1.3当量、0.87 mmol/3 mLのTHFに可溶化)、及びアセトニトリル中のテトラゾールの0.45 M溶液(2 mL、1.3当量、0.87 mmol)は、窒素雰囲気下で、3 mLの無水アセトニトリルに溶解された。反応溶媒は、窒素雰囲気下で、周囲温度で、24時間磁気的に撹拌された。混合物は、その後43 mLのTHF/Pyr/水中の0.02 M溶液のジヨードを添加することにより、酸化された。周囲温度で12時間後、溶媒は、真空下で蒸発させ、ポンプを用いて、P2O5上で乾燥させた。残余物は、8mLのジクロロメタンに溶解させた。その後、0.2 mLの1,5-ジアゾビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エン(DBU)(1.3当量、0.87 mmol)が5時間に亘り、反応溶媒に添加された。反応溶媒は、0.1 N溶液の塩酸で、その後Na2S2O3の飽和溶液で洗浄された。有機相は、真空下で濃縮された。化合物は、溶出勾配(メタノール/DCM 98：2から1：1)を用いたフラッシュクロマトグラフィーによる精製後、得られた(180 mg)。
収率：24％
Rf：0.3(DCM/メタノール 8：2)
5′-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2′-deoxythymidine, 3 ′ [(2-cyano-ethyl) -N, N-diisopropyl] phosphoramidite (0.500 g, 1 equivalent, 0.67 mmol), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol (0.496 g, 1.3 eq, solubilized in 0.87 mmol / 3 mL THF), and a 0.45 M solution of tetrazole in acetonitrile (2 mL, 1.3 eq, 0.87 mmol) are Dissolved in 3 mL of anhydrous acetonitrile under a nitrogen atmosphere. The reaction solvent was magnetically stirred for 24 hours at ambient temperature under a nitrogen atmosphere. The mixture was then oxidized by adding a 0.02 M solution of diiodo in 43 mL of THF / Pyr / water. After 12 hours at ambient temperature, the solvent was evaporated under vacuum and dried over P 2 O 5 using a pump. The residue was dissolved in 8 mL dichloromethane. Then 0.2 mL of 1,5-diazobicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU) (1.3 eq, 0.87 mmol) was added to the reaction solvent over 5 hours. The reaction solvent was washed with 0.1 N hydrochloric acid and then with a saturated solution of Na 2 S 2 O 3 . The organic phase was concentrated under vacuum. The compound was obtained after purification by flash chromatography using an elution gradient (methanol / DCM 98: 2 to 1: 1) (180 mg).
Yield: 24%
Rf: 0.3 (DCM / methanol 8: 2)
NMR 1H (300 MHz, CDCl3) : δ(ppmで) 0.88 (t, 6H, J=6.9 Hz, 2*CH3), 1.25 (m, 48H, 24*CH2), 1.42 (dd, 4H, J1=8.4 Hz, J2=15.6 Hz, 2*CH2), 1.90 (s, 3H, Me), 2.33 (m, 4H, 2*CH2), 2.83 (t, 2H, J=5.6 Hz, H2'), 3.84 (m, 1H, H3'), 4.09-4.35 (m, 7H, 2*CH2(グリセロール), H4', H5'), 5.27 (s, 1H, CH グリセロール), 6.21 (t, 1H, J=6.7 Hz, HT), 7.54 (s, 1H, H 塩基)。 NMR 1 H (300 MHz, CDCl 3 ): δ (in ppm) 0.88 (t, 6H, J = 6.9 Hz, 2 * CH 3 ), 1.25 (m, 48H, 24 * CH 2 ), 1.42 (dd, 4H , J1 = 8.4 Hz, J2 = 15.6 Hz, 2 * CH 2 ), 1.90 (s, 3H, Me), 2.33 (m, 4H, 2 * CH 2 ), 2.83 (t, 2H, J = 5.6 Hz, H 2 '), 3.84 (m, 1H, H3'), 4.09-4.35 (m, 7H, 2 * CH 2 (glycerol), H 4 ', H 5 '), 5.27 (s, 1H, CH glycerol), 6.21 (t, 1H, J = 6.7 Hz, HT), 7.54 (s, 1H, H base).
NMR 13C (75 MHz, CDCl3) : δ(ppmで) 12.4 (CH3 塩基), 14.1 (CH3 鎖), 19.6 (CH2), 19.7 (CH2), 22.6 (CH2), 24.8 (CH2), 29.1-29.6 (CH2), 31.9 (CH2), 33.9 (CH2), 34.1 (CH2), 61.5 (CH2), 61.7 (CH2), 62.5 (CH2), 62.6 (CH2), 66.1 (CH2), 66.2 (CH2), 69.1 (CH), 78.8 (CH), 85.5 (CH), 86.1 (CH), 111.3 (C 塩基), 136.8 (CH 塩基), 150.5 (C=0 塩基), 164.1 (C=0 塩基), 173.0 (C=0 鎖), 173.5 (C=0 鎖)。 NMR 13 C (75 MHz, CDCl 3 ): δ (in ppm) 12.4 (CH 3 base), 14.1 (CH 3 chain), 19.6 (CH 2 ), 19.7 (CH 2 ), 22.6 (CH 2 ), 24.8 ( CH 2 ), 29.1-29.6 (CH 2 ), 31.9 (CH 2 ), 33.9 (CH 2 ), 34.1 (CH 2 ), 61.5 (CH 2 ), 61.7 (CH 2 ), 62.5 (CH 2 ), 62.6 ( CH 2 ), 66.1 (CH 2 ), 66.2 (CH 2 ), 69.1 (CH), 78.8 (CH), 85.5 (CH), 86.1 (CH), 111.3 (C base), 136.8 (CH base), 150.5 ( C = 0 base), 164.1 (C = 0 base), 173.0 (C = 0 chain), 173.5 (C = 0 chain).
NMR 31P (121 MHz, CDCl3) : δ(ppmで) 2.1。
質量 ESI- : 理論値 m/z = 872.5 観測値 m/z = 871.3。
NMR 31 P (121 MHz, CDCl 3 ): δ (in ppm) 2.1.
Mass ESI-: Theoretical value m / z = 872.5. Observed value m / z = 871.3.
実施例3
5'-(4-ヘキサデシルオキシメチル- [1,2,3]トリアゾール-1-イル)-5',2'ジデオキシチミジン
Example 3
5 '-(4-hexadecyloxymethyl- [1,2,3] triazol-1-yl) -5', 2 'dideoxythymidine
調製物3に記載した通りの200 mgの5'-アジド-5'-デオキシチミジン(0.75 mmol)、及び調製物5に記載した通りのTHFと水の混合物(1/1)中の0.1 M溶液中の231 mgの1-プロパルギルオキシオクタデカン(1当量)はフラスコに加えられた。その後、以下：30 mgのアスコルビン酸ナトリウム(0.2当量、0.15 mmol)、及び12 mgの硫酸銅(0.1当量、0.075 mmol)は、連続的に添加された。反応溶媒は、撹拌され、60℃で5時間加熱された。混合物は、その後周囲温度に冷却された。反応溶媒は、直ちにシリカに吸収され、溶媒は蒸発させた。180 mgの白色固形物が、シリカカラムでのクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール 8/2)後、得られた。
RF:0.72(酢酸エチル/メタノール 8/2)
収率：42％
高分解能MS[M+H]+：計算質量：576.4125、測定質量：576.4120
200 mg of 5′-azido-5′-deoxythymidine (0.75 mmol) as described in
RF: 0.72 (ethyl acetate / methanol 8/2)
Yield: 42%
High resolution MS [M + H] + : Calculated mass: 576.4125, measured mass: 576.4120
実施例4
5'-(4-ヘキサデシルオキシメチル-[1,2,3]トリアゾール-1-イル)-5',2'-ジデオキシアデノシン
Example 4
5 '-(4-Hexadecyloxymethyl- [1,2,3] triazol-1-yl) -5', 2'-dideoxyadenosine
調製物4に記載した通りの200 mgの5'-アジド-5',2'-ジデオキシアデノシン(0.72 mmol)、及び調製物5に記載した通りのTHFと水の混合物(1/1)中の0.1 M溶液中の223 mgの1-プロパルギルオキシオクタデカン(1当量)はフラスコに加えられた。その後、以下：30 mgのアスコルビン酸ナトリウム(0.2当量、0.15 mmol)、及び12 mgの硫酸銅(0.1当量、0.075 mmol)は、連続的に添加された。反応溶媒は、撹拌され、60℃で5時間加熱され、その後混合物は、周囲温度に冷却された。反応溶媒は、直ちにシリカに吸収され、溶媒は蒸発させた。150 mgの白色固形物が、カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール 8/2)後、得られた。
RF:0.65(酢酸エチル/メタノール 8/2)
収率：35％
In 200 mg of 5′-azido-5 ′, 2′-dideoxyadenosine (0.72 mmol) as described in Preparation 4 and a mixture of THF and water (1/1) as described in
RF: 0.65 (ethyl acetate / methanol 8/2)
Yield: 35%
NMR 1H (300.13 MHz, CDCl3) : δ0.89 (t, j = 6 Hz, 3H, CH3), δ1.26 (m, 3OH, CH2), δ 1.55 (m, 2H, CH2), δ2.54 (m, 1H, CH2), δ3.06 (m, 1H, CH2), δ3.45 (t, j = 6 Hz, 2H, CH2), δ4.50 (m, 4H, CH2, CH), δ4.89 (m, ???), δ5.88 (s, 2H, NH2), δ6.40 (t, j = 6 Hz, 1H, CH), δ7.42 (s, 1H, CH), δ7.81 (s, 1H, CH), δ8.35 (s, 1H, CH)。
高分解能 MS [M+H]+ : 計算質量： 585.4241、測定質量：585.4254
NMR 1 H (300.13 MHz, CDCl 3 ): δ0.89 (t, j = 6 Hz, 3H, CH 3 ), δ1.26 (m, 3OH, CH 2 ), δ 1.55 (m, 2H, CH 2 ) , δ2.54 (m, 1H, CH 2 ), δ3.06 (m, 1H, CH 2 ), δ3.45 (t, j = 6 Hz, 2H, CH 2 ), δ4.50 (m, 4H, CH 2 , CH), δ 4.89 (m, ???), δ 5.88 (s, 2H, NH 2 ), δ 6.40 (t, j = 6 Hz, 1H, CH), δ 7.42 (s , 1H, CH), δ7.81 (s, 1H, CH), δ8.35 (s, 1H, CH).
High resolution MS [M + H] + : Calculated mass: 585.4241, measured mass: 585.4254
実施例5
5'-(4-((O−コレステリル)-メチル)-[1,2,3]トリアゾール-1-イル)-5',2'ジデオキシチミジン
Example 5
5 '-(4-((O-cholesteryl) -methyl)-[1,2,3] triazol-1-yl) -5', 2 'dideoxythymidine
調製物3に記載した通りの170 mgの5'-アジド-5'-デオキシチミジン(0.63 mmol)、及び調製物7に記載した通りのTHFと水の混合物(1/1)中の0.1 M溶液中の270 mgのo-プロパルギルコレステロール(1当量)はフラスコに加えられた。以下：20 mgのアスコルビン酸ナトリウム(0.2当量、0.13 mmol)、及び10 mgの硫酸銅(0.1当量、0.063 mmol)は、連続的に添加された。反応溶媒は、撹拌され、60℃で5時間加熱された。混合物は、周囲温度に冷却された。反応溶媒は、直ちにシリカに吸収され、溶媒は蒸発させた。化合物は、カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール 8/2)により、純粋な状態で得られた。260 mgの白色固形物が得られた。
RF:0.57(酢酸エチル/メタノール 8/2)
収率：59％
MS [M+H]+ : 692.3
170 mg of 5′-azido-5′-deoxythymidine (0.63 mmol) as described in
RF: 0.57 (ethyl acetate / methanol 8/2)
Yield: 59%
MS [M + H] + : 692.3
実施例6
1,12-ビス-[5'-(4-(メチル)-[1,2,3]トリアゾール-1-イル)-5',2'ジデオキシチミジン]-オキシドデカン
Example 6
1,12-bis- [5 '-(4- (methyl)-[1,2,3] triazol-1-yl) -5', 2'dideoxythymidine] -oxide decane
調製物3に記載した通りの100 mgの5'-アジド-5'-デオキシチミジン(0.375 mmol)、及びTHF/水混合物(1/1)中の0.1 M溶液中の、調製物6に記載した通りの化合物から調製された52 mgの1,12-ジプロパルギルオキシドデカンはフラスコに加えられた。以下：15 mgのアスコルビン酸ナトリウム(0.2当量、0.075 mmol)、及び6 mgの硫酸銅(0.1当量、0.0375 mmol)は、連続的に添加された。反応溶媒は、撹拌され、60℃で5時間加熱された。混合物は、その後、周囲温度に冷却された。反応溶媒は、直ちにシリカに吸収され、溶媒は蒸発させた。化合物は、カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール 8/2)により、純粋な状態で得られた。90 mgの白色固形物が得られた。
収率：59％
100 mg of 5′-azido-5′-deoxythymidine (0.375 mmol) as described in
Yield: 59%
NMR 1H (300.13 MHz, メタノール d4) : δ 1.28 (m, 16H, CH2), δ0.83 (m, 4H, CH2), δ1.89 (s, 6H, CH3), δ2.17 (s, 2H, CH2), δ2.25 (m, 4H, CH2), δ3.51 (t, j = 6 Hz, 4H, CH2), δ4.18 (m, 2H, CH) δ4.42 (m, 2H, OH) δ4.58 (s, 4H, CH2), δ4.76 (qd, j = 6 Hz, 4H, CH2), δ6.21 (t, j = 6 Hz, 2H, CH), δ7.23 (s, 2H, CH), δ7,99 (s, 2H, CH)。 NMR 1 H (300.13 MHz, methanol d 4 ): δ 1.28 (m, 16H, CH 2 ), δ 0.83 (m, 4H, CH 2 ), δ 1.89 (s, 6H, CH 3 ), δ 2.17 (s, 2H, CH 2 ), δ 2.25 (m, 4H, CH 2 ), δ 3.51 (t, j = 6 Hz, 4H, CH 2 ), δ 4.18 (m, 2H, CH) δ 4. 42 (m, 2H, OH) δ4.58 (s, 4H, CH 2 ), δ4.76 (qd, j = 6 Hz, 4H, CH 2 ), δ6.21 (t, j = 6 Hz, 2H, CH), δ7.23 (s, 2H, CH), δ7,99 (s, 2H, CH).
実施例7
5'-(4-(1(R；-ヒドロキシ-ヘキシル)-[1,2,3]トリアゾール-1-イル)-5',2'ジデオキシチミジン
Example 7
5 '-(4- (1 (R; -hydroxy-hexyl)-[1,2,3] triazol-1-yl) -5', 2 'dideoxythymidine
調製物3に記載した通りの215 mgの5'-アジド-5'-デオキシチミジン(0.8 mmol)、及びTHF/水混合物(1/1)中の0.1 M溶液中の、101.5 mgの(R)オクト-1-イン-3-オール(1当量)はフラスコに加えられた。以下：31.5 mgのアスコルビン酸ナトリウム(0.2当量、0.15 mmol)、及び13 mgの硫酸銅(0.1当量、0.075 mmol)は、連続的に添加された。反応溶媒は、撹拌され、60℃で5時間加熱された。混合物は、その後、周囲温度に冷却された。反応溶媒は、その後、直ちにシリカに吸収され、溶媒は蒸発させた。化合物は、カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール 9/1)により、純粋な状態で得られた。240 mgの白色固形物が得られた。
RF:0.48(酢酸エチル/メタノール 9/1)
収率：76％
高分解能 MS [M+H]+ : 計算質量： 576.4125、測定質量：576.4120
215 mg of 5'-azido-5'-deoxythymidine (0.8 mmol) as described in
RF: 0.48 (ethyl acetate / methanol 9/1)
Yield: 76%
High resolution MS [M + H] + : Calculated mass: 576.4125, measured mass: 576.4120
実施例8
5'-(4-(1-(S)-ヒドロキシ-ヘキシル)-[1,2,3]トリアゾール-1-イル)-5',2'ジデオキシチミジン
Example 8
5 '-(4- (1- (S) -Hydroxy-hexyl)-[1,2,3] triazol-1-yl) -5', 2 'dideoxythymidine
調製物3に記載した通りの215 mgの5'-アジド-5'-デオキシチミジン(0.8 mmol)、及びTHF/水混合物(1/1)中の0.1 M溶液中の、101.5 mgの(S)オクト-1-イン-3-オール(1当量)はフラスコに加えられた。以下：31.5 mgのアスコルビン酸ナトリウム(0.2当量、0.15 mmol)、及び13 mgの硫酸銅(0.1当量、0.075 mmol)は、連続的に添加された。反応溶媒は、撹拌され、60℃で5時間加熱された。混合物は、その後、周囲温度に冷却された。反応溶媒は、その後直ちにシリカに吸収され、溶媒は蒸発させた。化合物は、カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール 85/15)により、純粋な状態で得られた。255 mgの白色固形物が得られた。
RF:0.48(酢酸エチル/メタノール 85/15)
収率：78％
高分解能 MS [M+H]+ : 計算質量： 576.4125、測定質量：576.4120
215 mg of 5′-azido-5′-deoxythymidine (0.8 mmol) as described in
RF: 0.48 (ethyl acetate / methanol 85/15)
Yield: 78%
High resolution MS [M + H] + : Calculated mass: 576.4125, measured mass: 576.4120
実施例9
5'-(4-(1-(S)-ヒドロキシ-ヘキシル)-[1,2,3]トリアゾール-1-イル)-5',2'ジデオキシアデノシン
Example 9
5 '-(4- (1- (S) -Hydroxy-hexyl)-[1,2,3] triazol-1-yl) -5', 2 'dideoxyadenosine
調製物3に記載した通りの200 mgの5'-アジド-5'-デオキシチミジン(0.75 mmol)、及びTHF/水混合物(1/1)中の0.1 M溶液中の、95 mgのオクト-1-イン-3-オールのラセミ混合物(1当量)はフラスコに加えられた。以下：30 mgのアスコルビン酸ナトリウム(0.2当量、0.15 mmol)、及び12 mgの硫酸銅(0.1当量、0.075 mmol)は、連続的に添加された。反応溶媒は、撹拌され、60℃で5時間加熱された。混合物は、その後、周囲温度に冷却された。反応溶媒は、直ちにシリカに吸収され、溶媒は蒸発させた。化合物は、カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール 8/2)により、純粋な状態で得られた。240 mgの白色固形物が得られた。
RF:0.47(酢酸エチル/メタノール 8/2)
収率：80％
高分解能 MS [M+H]+ : 計算質量： 576.4125、測定質量：576.4120
95 mg octo-1 in 0.1 M solution in 200 mg 5'-azido-5'-deoxythymidine (0.75 mmol) and THF / water mixture (1/1) as described in
RF: 0.47 (ethyl acetate / methanol 8/2)
Yield: 80%
High resolution MS [M + H] + : Calculated mass: 576.4125, measured mass: 576.4120
実施例10：複数区画を有するナノ粒子の調製
実施例2で調製された化合物、チミジン 3'-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸)(di C16 dT)は、式(I)の陰イオン性化合物として、ジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)は、共脂質として、Pauline Chabaud らによる Bioconjugate Chem., 2006, 17, 466-472に記載のように調製された化合物(N−[5'-(2',3'-ジオレオイル)ウリジン]-N', N', N'-トリメチルアンモニウムトシラート)(DOTAU)は、式(I)の陽イオン性化合物として用いられる。
Example 10: Preparation of nanoparticles with multiple compartments The compound prepared in Example 2, thymidine 3 '-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate) (di C16 dT) has the formula As an anionic compound of (I), dioleyl phosphatidylcholine (DOPC) is a compound prepared as described in Bioconjugate Chem., 2006, 17, 466-472 by Pauline Chabaud et al. (N- [ 5 ′-(2 ′, 3′-dioleoyl) uridine] -N ′, N ′, N′-trimethylammonium tosylate) (DOTAU) is used as the cationic compound of formula (I).
1)ストック溶液の調製
−a)シスプラチン溶液の調製：
15 mgのシスプラチンは、10 mLのミリ-Q水に溶解された(終濃度：5 mM)。この懸濁液は、1分間撹拌され(ボルテックス)、その後、37℃で24時間インキュベートされた。
−b)脂質溶液の調製：
溶液A：20 mgのdiC16dTは、2 mLのジクロロメタンに可溶化された(10 mg/mL)。このサンプルは-20℃で保管された。
溶液B：DOPC：-20℃で保管されたジクロロメタン中の20 mg/mLの溶液
溶液C：DOTAU：-20℃で保管されたジクロロメタン中の20 mg/mLの溶液
1) Preparation of stock solution- a) Preparation of cisplatin solution:
15 mg of cisplatin was dissolved in 10 mL of milli-Q water (final concentration: 5 mM). This suspension was agitated (vortex) for 1 minute and then incubated at 37 ° C. for 24 hours.
-B) Preparation of lipid solution:
Solution A: 20 mg diC16dT was solubilized in 2 mL dichloromethane (10 mg / mL). This sample was stored at -20 ° C.
Solution B: DOPC: 20 mg / mL solution in dichloromethane stored at -20 ° C Solution C: DOTAU: 20 mg / mL solution in dichloromethane stored at -20 ° C
2)第一層のための脂質製剤の調製
52.3μLの溶液Aは、47.2μLの溶液Bと、2 mLのエッペンドルフ（登録商標）チューブ中で、混合された。これらの容積は、1/1の二つの脂質のモル比に相当する。ジクロロメタンは、均質的な脂質被膜を得るために、窒素雰囲気下で、蒸発させた。
2) Preparation of lipid formulation for first layer
52.3 μL of Solution A was mixed with 47.2 μL of Solution B in a 2 mL Eppendorf® tube. These volumes correspond to a molar ratio of two lipids of 1/1. Dichloromethane was evaporated under a nitrogen atmosphere to obtain a homogeneous lipid coating.
3)ナノ粒子の調製(第一の陰イオン性脂質層)
37℃で事前にインキュベートされた1.2 mLのシスプラチン溶液は、事前に調製された脂質被膜を再水和するために用いられた。この混合物は、周囲温度で、一晩インキュベートされた。連続する10回の加熱する(55℃の水槽)及び凍結(ドライアイス/メタノール-72℃)するサイクルは行われた。
3) Preparation of nanoparticles (first anionic lipid layer)
1.2 mL of cisplatin solution preincubated at 37 ° C was used to rehydrate the previously prepared lipid coating. This mixture was incubated overnight at ambient temperature. 10 consecutive heating (55 ° C. water bath) and freezing (dry ice / methanol—72 ° C.) cycles were performed.
4)第一の陰イオン性脂質を含むナノ粒子の洗浄及び回収
連続した10回のサイクルが終了後すぐに、懸濁液は撹拌され、ガラスの溶血チューブに入れられた、その後、7分間の超音波処理を受けた。超音波処理後、懸濁液は、10,000 rpm/5分/20℃で遠心分離された。上清は、廃棄され、ナノ粒子ペレットは、1 mLのミリ-Q水に再懸濁された。このステップは2回繰り返された。
4) Washing and collecting nanoparticles containing the first anionic lipid Immediately after the end of 10 consecutive cycles, the suspension was stirred and placed in a glass hemolysis tube, then 7 minutes Sonicated. After sonication, the suspension was centrifuged at 10,000 rpm / 5 min / 20 ° C. The supernatant was discarded and the nanoparticle pellet was resuspended in 1 mL of milli-Q water. This step was repeated twice.
懸濁液は、1000 rpm/2.5分/20℃で遠心分離された。ペレットは、廃棄され、上清は陰イオン性ナノ粒子を含んだ。
Andrea Mayer らによるToxicology, 2009, 258, 139-147 又は K. Furusawa及び K. Uchiyama, 1988, 140, 217-226に記載の技術に従って測定されたゼータ電位は、-43.3±6 mVであった。
The suspension was centrifuged at 1000 rpm / 2.5 min / 20 ° C. The pellet was discarded and the supernatant contained anionic nanoparticles.
The zeta potential measured according to the technique described by Andrea Mayer et al. In Toxicology, 2009, 258, 139-147 or K. Furusawa and K. Uchiyama, 1988, 140, 217-226 was -43.3 ± 6 mV.
5)第一の陰イオン性脂質及び第二の陽イオン性脂質を含むナノ粒子の調製
180μLの溶液Cは、2 mLのエッペンドルフ（登録商標）チューブに入れられた。ジクロロメタンは均質な脂質被膜を得るために、圧縮窒素下で、蒸発させられた。
5) Preparation of nanoparticles containing the first anionic lipid and the second cationic lipid
180 μL of Solution C was placed in a 2 mL Eppendorf® tube. Dichloromethane was evaporated under compressed nitrogen to obtain a homogeneous lipid coating.
6)複数区画を有するナノ粒子(陽イオン性表面層)の洗浄及び回収
陽イオン性脂質被膜は、ステップ4)で調製された陰イオン性ナノ粒子の懸濁液で再水和された。
ボルテックス撹拌は、5分間行われ、続いて1分間の超音波処理がされた。
懸濁液は、ナノ粒子と結合していない脂質を取り除くため、10,000 rpmで、5分間、20℃で遠心分離された。上清は取り除かれ、その後ペレットは、1 mLのミリ-Q水で再水和された。
懸濁液は、1000 rpm/2.5分/20℃で遠心分離された。ペレットは廃棄され、上清は、陽イオン性表面層を有する複数区画ナノ粒子を含んだ。
前述の通りに測定されたゼータ電位は、-42.3±8 mVであった。
6) Cleaning and recovery of nanoparticles with multiple compartments (cationic surface layer) The cationic lipid coating was rehydrated with a suspension of anionic nanoparticles prepared in step 4).
Vortexing was performed for 5 minutes followed by 1 minute of sonication.
The suspension was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes at 20 ° C. to remove lipids not bound to the nanoparticles. The supernatant was removed and the pellet was then rehydrated with 1 mL of milli-Q water.
The suspension was centrifuged at 1000 rpm / 2.5 min / 20 ° C. The pellet was discarded and the supernatant contained multi-compartment nanoparticles with a cationic surface layer.
The zeta potential measured as described above was -42.3 ± 8 mV.
実施例11：安定性試験(放出されるシスプラチンの％)
実施例10の手順により調製されたナノ粒子は、ICP光学分光分析により分析された(測定値は、全濃度に相当する)。ナノ粒子の懸濁液は、5つのエッペンドルフ（登録商標）チューブ(150μL)に等分された。後者は、撹拌(300 rpm)下、37℃で、異なる期間(0、2.5、5、10及び24時間)、インキュベートされた。
一定の時間(x)で、チューブは14,000 rpm/10分/20℃で遠心分離され、50μLの上清(ペレットを再懸濁しないように、注意深く回収された)が分析された。
Example 11: Stability study (% cisplatin released)
Nanoparticles prepared by the procedure of Example 10 were analyzed by ICP optical spectroscopic analysis (measurements correspond to total concentrations). The nanoparticle suspension was aliquoted into five Eppendorf® tubes (150 μL). The latter was incubated at 37 ° C. under agitation (300 rpm) for different periods (0, 2.5, 5, 10 and 24 hours).
At constant time (x), the tubes were centrifuged at 14,000 rpm / 10 min / 20 ° C. and 50 μL of supernatant (collected carefully to avoid resuspending the pellet) was analyzed.
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-［ホスホ-L-セリン］(DOPS)に基づく、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホクロリン(DOPC)を共脂質として含む、ナノ粒子は、比較として同様の手順に従って調製された。これらのナノ粒子は、単一の陰イオン性脂質層を含む。 Nanoparticles containing 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphochlorin (DOPC) as a colipid based on 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [phospho-L-serine] (DOPS) Prepared according to a similar procedure for comparison. These nanoparticles contain a single anionic lipid layer.
シスプラチンの放出百分率は、下記の方程式に従って計算される：
放出されたシスプラチンの％＝Cx-C0/Ct-C0
Cx:一定の時間(x)での濃度
C0：インキュベーション前の上清での濃度
Ct：インキュベーション、及び遠心分離をしない場合の全濃度
The percent release of cisplatin is calculated according to the following equation:
% Of cisplatin released = Cx-C0 / Ct-C0
Cx: concentration at a fixed time (x)
C0: Concentration in the supernatant before incubation
Ct: total concentration without incubation and centrifugation
インキュベーション時間に応じたシスプラチンの放出の曲線は、図1に示される。
実施例10のステップ4の終わりで得られる単一の陰イオン性脂質層を含むナノ粒子(NP-で示される)は、記号-◆-で表され、実施例10のステップ6の終わりで得られる、第一の陰イオン性脂質層及び第二の陽イオン性脂質層を含む本発明によるナノ粒子(NP+で示される)は、記号-■-で表され、DOPC/DOPS(PSで示される)に基づくナノ粒子は、記号-▲-で表される。
The curve of cisplatin release as a function of incubation time is shown in FIG.
Nanoparticles (indicated by NP-) containing a single anionic lipid layer obtained at the end of Step 4 of Example 10 are represented by the symbol-♦-and obtained at the end of Step 6 of Example 10. A nanoparticle according to the present invention comprising a first anionic lipid layer and a second cationic lipid layer (indicated by NP +) is represented by the symbol-■-and is represented by DOPC / DOPS (indicated by PS) ) -Based nanoparticles are represented by the symbol-▲-.
結果は、半減期(シスプラチンの50％放出に必要なインキュベーション時間)は、本発明によるNP+ナノ粒子については、24時間超である一方で、DOPC/DOPSに基づくナノ粒子については、それは6.5時間程度であったことを示した。 The results show that the half-life (incubation time required for 50% release of cisplatin) is over 24 hours for the NP + nanoparticles according to the present invention, whereas for nanoparticles based on DOPC / DOPS it is around 6.5 hours It was shown.
さらに、同じインキュベーション時間(6.5時間)後、ナノ粒子NP-(単一層)は、それらのシスプラチン容量の30％超を放出していた一方、本発明によるNP+ナノ粒子は、それらのシスプラチンの20％未満を放出しており、それは、37℃におけるNP+ナノ粒子の顕著な安定特性を強調した。 Furthermore, after the same incubation time (6.5 hours), nanoparticles NP− (monolayer) released more than 30% of their cisplatin capacity, whereas NP + nanoparticles according to the present invention were 20% of their cisplatin. Released, which highlighted the remarkable stability properties of NP + nanoparticles at 37 ° C.
実施例12：ウシ胎仔血清の存在下での安定性試験(放出されたシスプラチンの％)
実施例10の手順により調製されたナノ粒子は、ICP光学分光分析により分析された(測定値は、全濃度に相当する)。ナノ粒子の懸濁液は、5つのエッペンドルフ（登録商標）チューブ(150μL)に等分された。後者は、10,000 rpmで5分間、20℃で遠心分離された。50μLの上清はICP光学分光分析により分析され、残った100μLは、分離された。ナノ粒子を含むペレットは、150μLのウシ胎仔血清(FCS、Invitrogen 10270-106参照)で再水和された。サンプルは、撹拌(300 rpm)下、37℃で、異なる期間(0、2.5、5、10、及び24時間)、インキュベートされた。
Example 12: Stability test in the presence of fetal calf serum (% of released cisplatin)
Nanoparticles prepared by the procedure of Example 10 were analyzed by ICP optical spectroscopic analysis (measurements correspond to total concentrations). The nanoparticle suspension was aliquoted into five Eppendorf® tubes (150 μL). The latter was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes at 20 ° C. 50 μL of the supernatant was analyzed by ICP optical spectroscopy, and the remaining 100 μL was separated. The pellet containing the nanoparticles was rehydrated with 150 μL of fetal calf serum (FCS, see Invitrogen 10270-106). Samples were incubated at 37 ° C. under agitation (300 rpm) for different periods (0, 2.5, 5, 10, and 24 hours).
一定の時間(x)で、チューブは14,000 rpm/10分/20℃で遠心分離され、50 μLの上清(ペレットを再懸濁しないように、注意深く回収された)が分析された。 At constant time (x), the tubes were centrifuged at 14,000 rpm / 10 min / 20 ° C. and 50 μL of supernatant (collected carefully to avoid resuspending the pellet) was analyzed.
1,2-ジオレオイル−sn−グリセロ-3-［ホスホ-L-セリン］(DOPS)に基づく、1,2-ジオレオイル−sn−グリセロ-3-ホスホクロリン(DOPC)を共脂質として含む、ナノ粒子は、比較として同様の手順に従って調製された。 Nanoparticles comprising 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphochlorin (DOPC) based on 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [phospho-L-serine] (DOPS) as a colipid Prepared according to a similar procedure for comparison.
シスプラチンの放出百分率は、下記の方程式に従って計算される。
放出されたシスプラチンの％＝Cx-C0/Ct-C0
Cx:一定の時間(x)での濃度
C0：インキュベーション前、及びFCSとの接触前の上清での濃度
Ct：インキュベーション、及び遠心分離をしない場合の全濃度
The percent release of cisplatin is calculated according to the following equation:
% Of cisplatin released = Cx-C0 / Ct-C0
Cx: concentration at a fixed time (x)
C0: Concentration in the supernatant before incubation and before contact with FCS
Ct: total concentration without incubation and centrifugation
インキュベーション時間に応じたシスプラチンの放出の曲線は、図2に示される。
実施例10で得られる、第一の陰イオン性脂質層及び第二の陽イオン性脂質層を含む本発明によるナノ粒子(NP+で示される)は、記号-■-で表され、DOPC/DOPS(PSで示される)に基づくナノ粒子は、記号-▲-で表される。
The curve of cisplatin release as a function of incubation time is shown in FIG.
A nanoparticle according to the present invention comprising a first anionic lipid layer and a second cationic lipid layer (indicated by NP +) obtained in Example 10 is represented by the symbol-■-and is represented by DOPC / DOPS. Nanoparticles based on (indicated by PS) are represented by the symbol-▲-.
結果は、シスプラチンの90％放出に必要なインキュベーション時間は、本発明によるNP+ナノ粒子については、24時間超である一方で、PSナノ粒子については、それは2時間未満であることを示した。 The results showed that the incubation time required for 90% release of cisplatin was more than 24 hours for NP + nanoparticles according to the present invention, whereas for PS nanoparticles it was less than 2 hours.
実施例13：細胞内のシスプラチンの評価
手順
80％の集密(直径で10 cmの皿)のIGROV1細胞(シスプラチン-感受性卵巣腺癌株)は、100μmの遊離のシスプラチン、又は実施例10のナノ粒子中にカプセル化されたシスプラチンで、2、4、又は6時間処理を行った。この処理の終了後、PBSで2回の洗浄が行われた。細胞は、トリプシンで処理され、PBSに再懸濁された。PBSでの細胞懸濁液の2回の洗浄が行われた(遠心分離 1000 rpm/1分)。この細胞は、1 mLのPBSで懸濁され、数えられた。
同じ手順は、SKV03細胞(シスプラチン-耐性卵巣腺癌株)でも行われた。
Example 13: Evaluation of intracellular cisplatin
procedure
80% confluent (10 cm diameter dishes) IGROV1 cells (cisplatin-sensitive ovarian adenocarcinoma line) are 100 μm free cisplatin or cisplatin encapsulated in nanoparticles of Example 2 , 4 or 6 hours treatment. After completion of this treatment, washing was performed twice with PBS. Cells were treated with trypsin and resuspended in PBS. Two washes of the cell suspension with PBS were performed (centrifugation 1000 rpm / 1 min). The cells were suspended and counted in 1 mL of PBS.
The same procedure was performed with SKV03 cells (cisplatin-resistant ovarian adenocarcinoma line).
IPC光学分析
106細胞は、500μLの細胞溶解溶液(SIGMA製の溶解バッファ)で溶解された。この容積は、1％のHNO3酸を含むミリ-Q水で、5 mLまで継ぎ足された。
IPC optical analysis
10 6 cells were lysed with 500 μL of cell lysis solution (SIGMA lysis buffer). This volume was supplemented to 5 mL with milli-Q water containing 1% HNO 3 acid.
結果
結果は、図3に表し、それは時間に応じた細胞溶解後に放出されたシスプラチンの濃度(ナノモル/106細胞/100μMの処理で表わされる)を示し、処理された細胞中に内在化するシスプラチンの濃度に対応する。
The results are shown in FIG. 3, which shows the concentration of cisplatin released after cell lysis as a function of time (expressed in nanomole / 10 6 cells / 100 μM treatment) and is internalized in the treated cells. Corresponds to the concentration of.
垂直の縞(左側)、水平の縞(中央)、及び格子縞(右側)の柱は、それぞれ2時間、4時間、及び6時間に亘る細胞の処理に対応する。 Vertical stripes (left side), horizontal stripes (center), and checkered (right side) columns correspond to treatment of cells for 2 hours, 4 hours, and 6 hours, respectively.
結果は、シスプラチンの内在化は、実施例10で得られる第一の陰イオン性脂質層及び第二の陽イオン性脂質層を含む本発明によるナノ粒子(NP+で示される)の存在下で、PSナノ粒子及び遊離のシスプラチンの場合においてよりも、オ明らかにより効果的であることを示した。 The results show that the internalization of cisplatin is in the presence of nanoparticles according to the invention (denoted NP +) comprising the first anionic lipid layer and the second cationic lipid layer obtained in Example 10, Evidently more effective than in the case of PS nanoparticles and free cisplatin.
例えば、同一の条件下(106 IGROV1細胞、100μM、2時間)で、遊離のシスプラチンの場合、0.5ナノモルのシスプラチンが内在化する一方で、本発明によるNP+ナノ粒子の場合、内在化は、40倍超(20ナノモル)であった(図3A)。 For example, under the same conditions (10 6 IGROV1 cells, 100 μM, 2 hours), in the case of free cisplatin, 0.5 nanomolar cisplatin is internalized, whereas in the case of NP + nanoparticles according to the invention internalization is 40 It was more than twice (20 nmole) (FIG. 3A).
シスプラチン耐性細胞株SKOV3に関しては、同一の条件下(106 細胞 SKOV3、100μM、2時間)で、本発明によるNP+ナノ粒子の場合、遊離のシスプラチンの場合(0.5ナノモル)よりも、内在化は、60倍超(30ナノモル)であった(図3B)。 For the cisplatin resistant cell line SKOV3, under the same conditions (10 6 cells SKOV3, 100 μM, 2 hours), internalization is greater for the NP + nanoparticles according to the invention than for free cisplatin (0.5 nmol). It was more than 60 times (30 nmol) (FIG. 3B).
実施例14：異なる腫瘍株における複数区画を有するナノ粒子の細胞毒性作用の試験
手順
a/ 細胞の調製及び処理：
試験は、腫瘍株のパネル、すなわち、
−シスプラチン-感受性A2780(ヒト卵巣癌上皮腫瘍)、及びシスプラチン-耐性A2780/CisPt(ヒト卵巣癌上皮腫瘍)、
−シスプラチン-感受性IGROV-1(ヒト卵巣癌)、及びシスプラチン-耐性IGROV-1/CisPt (ヒト卵巣癌)、
−シスプラチン-感受性L1210(マウスリンパ性白血病)、及びシスプラチン-耐性L1210/CisPt (マウスリンパ性白血病)、
−NIH：OVCAR3(卵巣癌)、及び
−P388(マウス白血病)、
に関して、細胞増殖の50％阻害濃度(IC50)を決定することから成る。
Example 14: Testing cytotoxic effects of nanoparticles with multiple compartments in different tumor lines
procedure
a / Cell preparation and processing:
The study consists of a panel of tumor lines, i.e.
Cisplatin-sensitive A2780 (human ovarian cancer epithelial tumor) and cisplatin-resistant A2780 / CisPt (human ovarian cancer epithelial tumor),
Cisplatin-sensitive IGROV-1 (human ovarian cancer) and cisplatin-resistant IGROV-1 / CisPt (human ovarian cancer),
Cisplatin-sensitive L1210 (mouse lymphocytic leukemia), and cisplatin-resistant L1210 / CisPt (mouse lymphocytic leukemia),
-NIH: OVCAR3 (ovarian cancer), and-P388 (mouse leukemia),
The determination of the 50% inhibitory concentration (IC 50 ) of cell proliferation.
96ウェルプレートにおいて、ウェルあたり2500細胞(卵巣腺癌株など)が、血清を含む100μLの培地中でインキュベートされた。24時間後、培地は吸引され、細胞は、血清を含まない100μLの培地中で、異なる濃度(500、100、10、1、0.1、0.01、0.001μM)で、遊離のシスプラチン、又は実施例10のナノ粒子でカプセル化されたシスプラチンで処理された。24時間の処理後、培地は取り除かれ、細胞は、100μLのPBSで2回洗浄され、その後、血清を含む100μLの培地中で、インキュベートされた。
b/ 毒性の顕色：
2回の洗浄の48時間後、細胞生存率は、20μLのMTSを添加することにより、明らかにされた。490 nmでの吸収は、37℃で2〜4時間のインキュベーション後、測定された。吸光度は、細胞生存率に比例する。
c/ 結果：
結果は図4に示され、それは、遊離のシスプラチン(左側の薄灰色柱)、又はシスプラチンを含む実施例10のステップ6の終わりで得られる第一の陰イオン性脂質層、及び第二の陽イオン性脂質層を含む本発明によるナノ粒子(NP+で示される)(右側の濃灰色柱)を用いて、50％細胞死亡(IC50)を得るために必要な濃度を示す。
In 96-well plates, 2500 cells per well (such as ovarian adenocarcinoma lines) were incubated in 100 μL medium containing serum. After 24 hours, the medium is aspirated and the cells are free cisplatin or Example 10 at different concentrations (500, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 μM) in 100 μL medium without serum. Treated with cisplatin encapsulated in nanoparticles. After 24 hours of treatment, the medium was removed and the cells were washed twice with 100 μL PBS and then incubated in 100 μL medium with serum.
b / Toxicity development:
After 48 hours of two washes, cell viability was revealed by adding 20 μL of MTS. Absorption at 490 nm was measured after 2-4 hours incubation at 37 ° C. Absorbance is proportional to cell viability.
c / Result:
The results are shown in FIG. 4, which includes free cisplatin (left light gray column), or first anionic lipid layer obtained at the end of step 6 of Example 10 containing cisplatin and a second positive lipid layer. Nanoparticles according to the invention comprising an ionic lipid layer (denoted NP +) (right gray column on the right) are used to show the concentration required to obtain 50% cell death (IC50).
結果は、本発明によるナノ粒子は、試験された全てのシスプラチン-感受性又は-耐性細胞株において、遊離のシスプラチンより、より効果的であることえお示した。 The results show that the nanoparticles according to the invention are more effective than free cisplatin in all cisplatin-sensitive or -resistant cell lines tested.
例えば、シスプラチン-感受性細胞株A2780の場合、50％細胞死亡が、0.23μMの本発明によるナノ粒子で得られた一方で、4.68μMの遊離のシスプラチンは、同じ死亡率を得るために用いられるに違い。 For example, in the case of the cisplatin-sensitive cell line A2780, 50% cell death was obtained with 0.23 μM nanoparticles according to the invention, while 4.68 μM free cisplatin was used to obtain the same mortality. the difference.
シスプラチン-耐性株A2780に関して、50％細胞死亡は、遊離のシスプラチンの29.21μMに対して、0.21μMの本発明によるナノ粒子で得られた。この場合、本発明によるナノ粒子は、感受性株A2780及び耐性株A2780に関して、遊離のシスプラチンより、それぞれ18及び140倍より効果的であった。 For cisplatin-resistant strain A2780, 50% cell death was obtained with 0.21 μM of the nanoparticles according to the invention, compared to 29.21 μM of free cisplatin. In this case, the nanoparticles according to the invention were 18 and 140 times more effective than free cisplatin, respectively, for the sensitive strain A2780 and the resistant strain A2780.
実施例15：腫瘍株IGROV-1及びSKOV3に関する複数区画を有するナノ粒子の細胞毒性作用の試験
手順
a/ 細胞の調製及び処理：
96ウェルプレートにおいて、ウェルあたり2500細胞(IGROV1、SKOV3、卵巣腺癌株)が、血清を含む100μLの培地中でインキュベートされた。24時間後、培地は吸引され、細胞は、血清を含まない100μLの培地中で、異なる濃度(500、100、10、1、0.1、0.01、0.001μM)で、遊離のシスプラチン又は、実施例10のナノ粒子でカプセル化されたシスプラチンで処理された。24時間の処理後、培地は取り除かれ、細胞は、100μLのPBSで2回洗浄され、その後、血清を含む100μLの培地中で、インキュベートされた。
b/ 毒性の顕色：
2回の洗浄の48時間後、細胞生存率は、20μLのMTSを添加することにより、明らかにされた。490 nmでの吸光度は、37℃で2〜4時間のインキュベーション後、測定された。吸光度は、細胞生存率に比例する。
c/ 結果：
結果は図5に表され、それは、遊離のシスプラチン(柱1、左側)、DOPC/DOPSに基づく対照ナノ粒子(PSで示される) (柱2、中央の左側)、実施例10のステップ4の終わりで得られる単一の陰イオン性脂質層を含むナノ粒子(NP-で示される) (柱3、中央の右側)、及び実施例10のステップ6の終わりで得られる第一の陰イオン性脂質層及び第二の陽イオン性脂質層を含む本発明によるナノ粒子(NP+で示される)(右側の柱)を用いて、50％細胞死亡(IC50)を得るために必要な濃度を示す。
Example 15: Testing cytotoxicity of nanoparticles with multiple compartments for tumor lines IGROV-1 and SKOV3
procedure
a / Cell preparation and processing:
In a 96-well plate, 2500 cells per well (IGROV1, SKOV3, ovarian adenocarcinoma line) were incubated in 100 μL medium with serum. After 24 hours, the medium is aspirated and the cells are free cisplatin or Example 10 at different concentrations (500, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 μM) in 100 μL medium without serum. Treated with cisplatin encapsulated in nanoparticles. After 24 hours of treatment, the medium was removed and the cells were washed twice with 100 μL PBS and then incubated in 100 μL medium with serum.
b / Toxicity development:
After 48 hours of two washes, cell viability was revealed by adding 20 μL of MTS. Absorbance at 490 nm was measured after 2-4 hours incubation at 37 ° C. Absorbance is proportional to cell viability.
c / Result:
The results are represented in FIG. 5, which is free cisplatin (
図5Aは、細胞株IGROV1に関し、図5Bは、細胞株SKOV3に関する。 FIG. 5A relates to cell line IGROV1, and FIG. 5B relates to cell line SKOV3.
結果は、本発明によるシスプラチンを含むNP+ナノ粒子が、二つの細胞株、IGROV1(シスプラチン-感受性)、及びSKOV3 (シスプラチン-耐性)において、遊離のシスプラチンより、より効果的であったことを示す。 The results show that NP + nanoparticles containing cisplatin according to the present invention were more effective than free cisplatin in two cell lines, IGROV1 (cisplatin-sensitive) and SKOV3 (cisplatin-resistant).
株IGROV1に関して、50％細胞死亡が、0.18μMのNP+シスプラチンを含むナノ粒子で得られた一方で、2.41μMの遊離のシスプラチンが、この結果を得るために、用いられるに違いない。株SKOV3に関して、50％細胞死亡が、遊離のシスプラチンの4.3μMに対して、0.29μMのシスプラチンを含むNP+ナノ粒子で得られた。 For strain IGROV1, 50% cell death was obtained with nanoparticles containing 0.18 μM NP + cisplatin, while 2.41 μM free cisplatin must be used to obtain this result. For strain SKOV3, 50% cell death was obtained with NP + nanoparticles containing 0.29 μM cisplatin versus 4.3 μM free cisplatin.
本発明によるシスプラチンを含むナノ粒子 (NP+)は、株IGROV1及びSKOV3それぞれに関して、遊離のシスプラチンより、それぞれ13及び14倍、より効果的であった。 Nanoparticles containing cisplatin (NP +) according to the present invention were 13 and 14 times more effective than free cisplatin, respectively, for strains IGROV1 and SKOV3.
実施例16：本発明によるナノ粒子の複数区画構造の実証Example 16: Demonstration of multi-compartment structure of nanoparticles according to the present invention
一方で、脂質層における標識の位置、及び他方で、それらが細胞中に入った後のナノ粒子の状態を調べるために、ナノ粒子の製剤は、異なる標識を用いて調製された。
親油性の蛍光プローブは、一方では標識として、他方では前駆薬剤を模倣する脂質化合物(例えば、抗癌ヌクレオシド、例えば5-FUなど、の脂質結合アナログ)として、製剤の中に挿入された。
On the one hand, nanoparticle formulations were prepared with different labels in order to investigate the position of the label in the lipid layer and, on the other hand, the state of the nanoparticles after they entered the cell.
The lipophilic fluorescent probe was inserted into the formulation on the one hand as a label and on the other hand as a lipid compound that mimics the precursor drug (eg, a lipid binding analog such as an anti-cancer nucleoside, such as 5-FU).
以下：
製剤A：diC16dT/DOPC 50/50
製剤B：DOTAU/DOPC 50/50
製剤C：diC16dT/DOPC/DOPE/フルオレセイン 49.25/49.25/0.5(λem＝483 nm、λex＝518 nm)
製剤D：DOTAU/DOPC/DOPE/ローダミン 49.25/49.25/0.5(λem＝550 nm、λex＝590 nm)
の異なる製剤が製造された。
Less than:
Formulation A: diC16dT /
Formulation B: DOTAU /
Formulation C: diC16dT / DOPC / DOPE / fluorescein 49.25 / 49.25 / 0.5 (λem = 483 nm, λex = 518 nm)
Formulation D: DOTAU / DOPC / DOPE / Rhodamine 49.25 / 49.25 / 0.5 (λem = 550 nm, λex = 590 nm)
Different formulations were produced.
本発明によるNP1、NP2、及びNP3ナノ粒子は、従って、以下： The NP1, NP2 and NP3 nanoparticles according to the invention are therefore:
に定義するように、異なる組成物で調製された。 Prepared with different compositions as defined above.
NP1、NP2、及びNP3ナノ粒子は、図6に示される。それぞれのナノ粒子では、白色層は、標識されていない脂質層を表し、灰色層は、フルオレセインで標識された層(製剤C)を表し、黒い層は、ローダミンで標識された層(製剤D)を表し、点々の中央は、組み込まれたシスプラチンを表す。 NP1, NP2, and NP3 nanoparticles are shown in FIG. In each nanoparticle, the white layer represents the unlabeled lipid layer, the gray layer represents the fluorescein labeled layer (Formulation C), and the black layer represents the rhodamine labeled layer (Formulation D). And the center of the dots represents the incorporated cisplatin.
FACS(フルオレセイン活性化細胞分類)測定は、以下：
−対照として、本発明によるナノ粒子の不在において(図7A)、
−第一の層が標識されたNP1ナノ粒子の存在において(図7B)、
−第二の層が標識されたNP2ナノ粒子の存在において(図7C)、及び
−二つの層が標識されたNP3ナノ粒子の存在において(図7D)、
インキュベートされたSKVO3細胞で行われた：
FACS (fluorescein activated cell classification) measurements are as follows:
As a control, in the absence of nanoparticles according to the invention (FIG. 7A),
In the presence of NP1 nanoparticles labeled with the first layer (FIG. 7B),
In the presence of NP2 nanoparticles labeled with a second layer (FIG. 7C), and in the presence of NP3 nanoparticles labeled with two layers (FIG. 7D),
Performed on incubated SKVO3 cells:
得られたFACSデータは、これらの標識を生じるNP3ナノ粒子の存在における、インキュベーション後のSKV03細胞における二つの蛍光標識(フルオレセイン、ローダミン)の存在を示す。これらの結果は、一方では、本発明によるナノ粒子が複数区画構造を有しており、及び他方では細胞に内在化後に無傷を維持していることを示す。 The FACS data obtained shows the presence of two fluorescent labels (fluorescein, rhodamine) in SKV03 cells after incubation in the presence of NP3 nanoparticles that produce these labels. These results show on the one hand that the nanoparticles according to the invention have a multi-compartment structure and on the other hand remain intact after internalization in the cells.
フルオレセイン顕微鏡法実験は、FACSにより得られた結果を裏付ける。このイメージは、標識されたNP1、NP2、及びNP3ナノ粒子が、SKVO3細胞において、無傷で内在化することを示す。 Fluorescein microscopy experiments confirm the results obtained by FACS. This image shows that labeled NP1, NP2, and NP3 nanoparticles are intact and internalized in SKVO3 cells.
Claims (20)
−Xは、酸素又は硫黄原子、又はメチレン基を表し、
−Bは、プリン、又はピリミジン塩基、例えば、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン、又はそれらの誘導体、又は非天然の単-又は二環式の、それぞれのその環が、随意的に置換された4〜7のメンバーを含むヘテロ環式の塩基を表し；
−L1及びL2は、同一又は異なって、水素、オキシカルボニル -O-C(O)- 基、チオカルバメート -O-C(S)-NH- 基、カルボナート-O-C(O)-O- 基、カルバメート -O-C(O)-NH- 基、酸素原子、リン酸基、ホスホネート基、又は直鎖若しくは分枝鎖の、飽和若しくは不飽和のC2〜C30の炭化水素鎖によって、置換されていない若しくは置換されている1〜4の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、
又は、L1及びL2はまた、共に式：
又は、L1若しくはL2は水素を表し、他方はヒドロキシ基、又は直鎖若しくは分枝鎖のC2〜C30のアルキル鎖により置換されていない若しくは置換された1〜4の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し；
−R1及びR2は、同一又は異なって、
−フッ素原子により、又はベンジル又はナフチルエステル又はエーテルにより、鎖の末端で炭素が、置換されていない又は置換された、随意的に完全に又は部分的にフッ素化された、飽和又は部分的に不飽和の、直鎖又は分枝鎖のC2〜C30、好ましくは、C6〜C25、特にC8〜C25の炭化水素鎖を表し、又は
−それぞれのアシル鎖がC2〜C30であるジアシル鎖、又は
−ジアシルグリセロール、スフィンゴシン、又はセラミド基、又は
−L1又はL2が、水素を表し、他方がヒドロキシ基、又は1〜4の窒素原子を含むヘテロアリール基を表すとき、R1及びR2は存在せず；
−R3は、以下：
−ヒドロキシ、アミノ、リン酸、ホスホネート、ホスファチジルコリン、O-アルキルホスファチジルコリン、チオホスフェート、ホスホニウム、NH2-R4、NHR4R5、又はNR4R5R6基、ここで、R4、R5、及びR6は、同一又は異なって、水素原子又は直鎖若しくは分枝鎖のC1〜C5アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖のC1〜C5ヒドロキシルアルキル鎖、又は
−ヒドロキシル基により随意的に置換された直鎖又は分枝鎖のC2〜C30アルキル鎖、又は
−シクロデキストリンラジカル、又は
-(CH2)n-V-R8基、ここで、R8は、C2〜C30アルキル、及びn=1〜500を表す、又は、
−C2〜C30アルキルにより、又は-(CH2)m-O-(CH2)p-R9基により、置換されない、又は置換される、1〜4の窒素原子を含むヘテロアリール基、ここで、m＝1〜6、及びp＝0〜10、及びR9は、少なくとも一つの直鎖又は分枝鎖のC2〜C30アルキルにより、又はステロールラジカルにより、置換されていない、又は置換された、5〜7の炭素原子を含む、環状ケタール基を表す、
を表し、又は
−R3は、二量体の形態で式(I)の化合物を形成するために、同一の又は異なる式(I)の他の化合物の、同一又は異なる他の置換基R3との共有結合により、連結される〕
の少なくとも一つの機能性両親媒性化合物により構成され、それぞれの脂質層は、前の脂質層の極性と異なる極性を有することを特徴とする、請求項1又は2に記載の製剤。 Each lipid layer has the formula (I):
-X represents an oxygen or sulfur atom, or a methylene group;
-B is a purine or pyrimidine base such as uracil, adenine, guanine, cytosine, thymine, hypoxanthine, or derivatives thereof, or a non-natural mono- or bicyclic, each of its rings optionally Represents a heterocyclic base containing from 4 to 7 members substituted on
-L 1 and L 2 are the same or different and represent hydrogen, oxycarbonyl-OC (O)-group, thiocarbamate-OC (S) -NH- group, carbonate-OC (O) -O- group, carbamate- OC (O) -NH- group, an oxygen atom, a phosphate group, phosphonate group, or a linear or branched, saturated or by a hydrocarbon chain of C 2 -C 30 unsaturated, or substituted not substituted Represents a heteroaryl group containing 1-4 nitrogen atoms,
Or, L 1 and L 2 are both of the formula:
Or L 1 or L 2 represents hydrogen and the other contains from 1 to 4 nitrogen atoms which are unsubstituted or substituted by a hydroxy group or a linear or branched C 2 -C 30 alkyl chain Represents a heteroaryl group;
-R 1 and R 2 are the same or different,
The carbon at the end of the chain is unsubstituted or substituted, optionally fully or partially fluorinated, saturated or partially unsaturated by fluorine atoms or by benzyl or naphthyl esters or ethers. saturated, C 2 -C 30 linear or branched chain, preferably, C 6 -C 25, in particular a hydrocarbon chain of C 8 -C 25, or - each acyl chain is C 2 -C 30 A diacyl chain, or -diacylglycerol, sphingosine, or ceramide group, or -L 1 or L 2 represents hydrogen and the other represents a hydroxy group or a heteroaryl group containing 1 to 4 nitrogen atoms, R 1 and R 2 are not present;
-R 3 is:
- hydroxy, amino, phosphate, phosphonate, phosphatidylcholine, O- alkyl phosphatidylcholines, thiophosphate, phosphonium, NH 2 -R 4, NHR 4 R 5, or NR 4 R 5 R 6 group, wherein, R 4, R 5 , And R 6 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a linear or branched C 1 to C 5 alkyl, or a linear or branched C 1 to C 5 hydroxylalkyl chain, or a -hydroxyl group C 2 -C 30 alkyl chain optionally substituted straight or branched chain, or - cyclodextrin radical, or
- (CH 2) n -VR 8 group, wherein, R 8 represents a C 2 -C 30 alkyl, and n = 1 to 500, or,
The -C 2 -C 30 alkyl, or - (CH 2) m -O- by (CH 2) p -R 9 radical, unsubstituted or substituted, heteroaryl groups containing 1 to 4 nitrogen atoms, Wherein m = 1-6 and p = 0-10, and R 9 is not substituted by at least one linear or branched C 2 -C 30 alkyl, or by a sterol radical, or Represents a substituted, cyclic ketal group containing 5 to 7 carbon atoms,
Or -R 3 represents other substituents R 3 that are the same or different from other compounds of the same or different formula (I) to form a compound of formula (I) in the form of a dimer. Linked by a covalent bond)
The preparation according to claim 1 or 2, wherein each lipid layer has a polarity different from the polarity of the previous lipid layer.
a)請求項3に記載の式(I)の少なくとも一つの機能性両親媒性化合物、及び治療薬の混合物を調製し、
b)前記治療薬を含むナノ粒子を得るために、繰り返して加熱する及び凍結するサイクルに前記混合物を供し、及び
c)このようにして得られた前記治療薬を含むナノ粒子を再被覆し、
d)前記ナノ粒子を、ステップa)で用いられた化合物の極性と異なる極性を有する、請求項3〜11のいずれか一項に定義された式(I)の少なくとも一つの機能性両親媒性分子の存在の中に移し、
e) このようにして得られた複数区画ナノ粒子を再被覆すること、
を含むことを特徴とする、請求項3〜11のいずれか一項に記載の製剤の調製の方法。 The following steps:
a) preparing a mixture of at least one functional amphiphilic compound of formula (I) according to claim 3 and a therapeutic agent;
b) subjecting the mixture to repeated heating and freezing cycles to obtain nanoparticles containing the therapeutic agent; and
c) re-coating the nanoparticles containing the therapeutic agent thus obtained,
d) at least one functional amphiphile of formula (I) as defined in any one of claims 3 to 11, wherein the nanoparticles have a polarity different from that of the compound used in step a) Move into the presence of molecules,
e) re-coating the multi-compartment nanoparticles obtained in this way,
A method for the preparation of a formulation according to any one of claims 3 to 11, characterized in that
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