JP2012235756A - Luciferase derived from firefly - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はホタル由来ルシフェラーゼに関する。 The present invention relates to a firefly-derived luciferase.
細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の機能を調べるためには、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する化学発光プローブが用いられている。特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光強度を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べることができる。具体的には、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで発光強度を定量し、その結果に基づいて発現量を特定する。この方法では、発光強度の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、測定に使用した全細胞の平均値として得られる。ルシフェラーゼ遺伝子等の発光遺伝子をレポーター遺伝子として導入する方法として、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクチン法またはエレクトロポレーション法等を使用でき、各方法は目的および細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流または下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぎ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することで、当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることが可能となる。また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子と目的の遺伝子とを共発現させることで、当該遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが可能となる。 In order to examine cell functions such as intracellular signal transduction and gene expression, fluorescent probes such as fluorescent dyes and fluorescent proteins, and chemiluminescent probes using luciferin-luciferase reaction are used. In particular, analysis of gene expression regulation uses luminescence measurement with excellent quantitativeness, which does not cause cell damage due to excitation light and does not cause a problem of self-luminescence. For example, when observing a cell into which a luciferase gene has been introduced, the intensity of luciferase gene expression (specifically, the expression level) can be examined by measuring the intensity of luminescence from the cell due to luciferase activity. . Specifically, cells are first lysed to prepare a cell lysate, and then luciferin, adenosine triphosphate (ATP), etc. are added to the cell lysate, and light is emitted by a luminometer using a photomultiplier tube. The intensity is quantified, and the expression level is specified based on the result. In this method, the luminescence intensity is measured after lysing cells. For this reason, the expression level of the luciferase gene at a certain point in time is obtained as an average value of all cells used for the measurement. As a method for introducing a luminescent gene such as a luciferase gene as a reporter gene, for example, a calcium phosphate method, a lipofectin method, an electroporation method, or the like can be used, and each method is properly used depending on the purpose and the type of cell. By connecting the target DNA fragment upstream or downstream of the luciferase gene to be introduced into the cell and measuring the expression level of the luciferase gene, it becomes possible to examine the influence of the DNA fragment on the transcription of the luciferase gene. In addition, by co-expressing a luciferase gene to be introduced into a cell and a target gene, it becomes possible to examine the influence of the gene product on the expression of the luciferase gene.
発光遺伝子発現量の時間変化を調べるには、生きた細胞からの発光強度を経時的に測定する必要がある。このような測定は、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、細胞集団全体からの発光強度を一定時間ごとに測定することで行われる。細胞集団全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることにより、一定の周期性をもった発現リズム等を分析することができる。 In order to examine temporal changes in the amount of luminescent gene expression, it is necessary to measure the luminescence intensity from living cells over time. Such measurement is performed by culturing cells in an incubator equipped with a luminometer, and measuring the luminescence intensity from the entire cell population at regular intervals. By capturing changes with time in the expression level of the luminescent gene in the entire cell population, it is possible to analyze an expression rhythm having a certain periodicity.
近年、生物学および医学の研究において、生命現象を分子レベルで動的に捉える必要性が高まってきている。蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子機能を動的に捉えるために、タイムラプスまたは動画撮像が行われている。従来技術では、蛍光試料を用いた経時的観察（例えば、蛍光分子を付したタンパク質１分子の動画観察）が行われている。 In recent years, in biological and medical research, there is an increasing need to dynamically capture life phenomena at the molecular level. In the research field using fluorescence observation, time lapse or moving image imaging is performed in order to dynamically grasp protein molecule functions in a sample. In the prior art, temporal observation using a fluorescent sample (for example, moving image observation of one protein molecule with a fluorescent molecule attached) is performed.
一方、経時的観察のために化学発光試料を用いる場合、化学発光試料の発光強度は極めて小さいため、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラを用いて観察する必要がある。また最近では、化学発光試料を観察するための光学系を有した顕微鏡も開発されている（特許文献１および２）。
On the other hand, when a chemiluminescent sample is used for temporal observation, since the luminescence intensity of the chemiluminescent sample is extremely small, it is necessary to observe using a CCD camera equipped with an image intensifier. Recently, a microscope having an optical system for observing a chemiluminescent sample has also been developed (
発光強度が小さい化学発光試料を顕微鏡により撮像する場合、鮮明な画像を撮影するために必要な露出時間は長くなる。このような化学発光試料は、使用できる研究用途が制限される。例えば、発光強度の小ささのために３０分間の露出時間が必要となる場合、３０分間隔での経時的撮影は可能であっても、より短い間隔での撮影、さらにはリアルタイムでの撮影は不可能である。また、画像の取得に当って、発光する細胞に焦点を合わせるために複数枚の画像を取得し比較する必要があるが、発光強度の小ささのために長い露出時間を必要とする場合、１枚の画像を取得するだけでも手間と時間を要することになる。 When a chemiluminescent sample with low emission intensity is imaged with a microscope, the exposure time required to capture a clear image becomes long. Such chemiluminescent samples limit the research applications that can be used. For example, if exposure time of 30 minutes is required due to low light emission intensity, even if shooting over time at 30-minute intervals is possible, shooting at shorter intervals or even real-time shooting Impossible. Further, when acquiring an image, it is necessary to acquire and compare a plurality of images in order to focus on the luminescent cells, but when a long exposure time is required due to the low emission intensity, 1 It takes time and effort to acquire only one image.
本発明の目的は、高い強度でルシフェリンを発光させるルシフェラーゼを提供することにある。 An object of the present invention is to provide a luciferase that emits luciferin with high intensity.
本発明の一態様に係る変異型ルシフェラーゼは、オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）に由来し、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる。 The mutant luciferase according to one embodiment of the present invention is derived from Pyrocoelia matsumurai and emits luciferin with higher intensity compared to the wild-type luciferase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
本発明によれば、高い発光強度を示すルシフェラーゼが提供されるため、発光像を撮像するために必要な露出時間を短縮することができ、且つ従来よりも時間分解能が高い経時的観察が可能となる。 According to the present invention, a luciferase exhibiting high luminescence intensity is provided, so that the exposure time required for capturing a luminescent image can be shortened and temporal observation with higher time resolution than before can be performed. Become.
本発明の実施形態は、オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）に由来するルシフェラーゼに関する。 An embodiment of the present invention relates to a luciferase derived from Pyrocoelia matsumurai.
「ルシフェラーゼ」とは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。実施形態に係るルシフェラーゼも、上述の通り定義されるルシフェラーゼと同義であるが、後述するホタルから初めて取得された新規のルシフェラーゼである。実施形態に関してルシフェリンとは、好ましくはホタルルシフェラーゼの基質となるホタルルシフェリンを意味する。より好ましくは、ホタルルシフェリンとはＤ−ルシフェリンである。 “Luciferase” generally refers to an enzyme that catalyzes a chemical reaction in which luminescence occurs. A substance that is a substrate for the enzyme is called luciferin. Luminescence occurs when luciferin undergoes a chemical change by the catalytic action of luciferase in the presence of ATP. Currently, luciferases derived from fireflies and bacteria are obtained. The luciferase according to the embodiment is also synonymous with the luciferase defined as described above, but is a novel luciferase obtained for the first time from fireflies described later. With respect to the embodiment, luciferin preferably means firefly luciferin which is a substrate for firefly luciferase. More preferably, the firefly luciferin is D-luciferin.
実施形態に係るルシフェラーゼは、オキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）に由来する。オキナワマドボタルとは節足動物門昆虫綱コウチュウ目ホタル科マドボタル属に属すホタルである。本発明の実施形態に関してオキナワマドボタルという場合、特に、主に沖縄本島に生息する基亜種ピロコエリア・マツムライ・マツムライ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）を意味する。なお、ここにいう「由来する」とは、オキナワマドボタルが有する野生型のルシフェラーゼに加えて、その変異体をも含むことを意味する。 The luciferase according to the embodiment is derived from Pyrocoelia matsumurai. The Okinawan firefly is a firefly that belongs to the genus Madbotal of the family Arthropoda elegans Coleoptera. When referring to the Okinawan firefly in relation to the embodiment of the present invention, it particularly means the subspecies Pyrocoelia matsumurai matsumurai that mainly inhabits the main island of Okinawa. Here, “derived from” means that, in addition to wild-type luciferase possessed by Okinawan firefly, a mutant thereof is also included.
実施形態に係るルシフェラーゼによれば、既知のルシフェラーゼと比較して格段に高い発光強度が得られる。従って、実施形態に係るルシフェラーゼは、タンパク質のイメージングのためのレポーターとして利用する場合に特に有利な効果を奏する。すなわち、実施形態に係るルシフェラーゼは、少量でも高い発光強度を提供できるため、発現量が低いタンパク質の良好な検出を可能とする。また、実施形態に係るルシフェラーゼは、得られる発光強度が高いことにより検出に必要な露出時間を短縮できる。このため、実施形態に係るルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影間隔を短くすることが可能となり、よりリアルタイムに近い観察が可能となる。すなわち、時間分解能が高い経時的観察が可能となる。 According to the luciferase according to the embodiment, remarkably high luminescence intensity can be obtained as compared with known luciferases. Therefore, the luciferase according to the embodiment has a particularly advantageous effect when used as a reporter for protein imaging. That is, since the luciferase according to the embodiment can provide high luminescence intensity even in a small amount, it enables favorable detection of proteins with low expression levels. Further, the luciferase according to the embodiment can shorten the exposure time required for detection due to the high emission intensity obtained. For this reason, if the luciferase according to the embodiment is used as a reporter for temporal observation, the imaging interval can be shortened, and observation near real time becomes possible. That is, observation over time with high time resolution becomes possible.
実施形態に係るルシフェラーゼの一例は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼである。当該ルシフェラーゼは、オキナワマドボタルから得られた野生型のルシフェラーゼである。この明細書および特許請求の範囲では、当該ルシフェラーゼを、野生型ルシフェラーゼ、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼまたは野生型オキナワマドボタル由来ルシフェラーゼ等と称する。 An example of the luciferase according to the embodiment is a luciferase comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The luciferase is a wild-type luciferase obtained from Okinawa firefly. In this specification and claims, the luciferase is referred to as wild-type luciferase, wild-type Okinawan firefly luciferase, wild-type Okinawan firefly-derived luciferase, or the like.
図１に、実施形態に係る野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られたルシフェリンの発光スペクトルを示す。この図に示されるとおり、実施形態に係る野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼは、ｐＨ８において、最大発光波長が５６０ｎｍ付近にある発光を生じさせる。ここで「最大発光波長」とは、ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光を測定することによって得られるスペクトルにおいて、発光強度が最大となる波長を意味する。 FIG. 1 shows an emission spectrum of luciferin obtained using the wild-type Okinawa firefly luciferase according to the embodiment. As shown in this figure, the wild-type Okinawan firefly luciferase according to the embodiment generates light having a maximum light emission wavelength near 560 nm at pH 8. Here, the “maximum emission wavelength” means a wavelength at which the emission intensity is maximum in a spectrum obtained by measuring luminescence of luciferin induced by luciferase.
また、図３に、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られたルシフェリンの発光強度、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）６Ｇによる発光強度およびＰ．ピラリスルシフェラーゼを用いた場合に得られたルシフェリンの発光強度を比較したグラフが示される。この図から、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼを使用した場合、ローダミン６Ｇによる発光強度の２４．４倍以上の発光強度を達成できることがわかる。この発光強度は、３００ｎｍから６５０ｎｍの波長の光を１０秒間取得して積算したものである。このように、実施形態に係るルシフェラーゼを用いた場合は、既知の発光物質および従来のホタルルシフェラーゼを用いた場合と比較して、より高い発光強度を達成できる。実施形態に係る野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼにより、好ましくはローダミン６Ｇによる発光強度の５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、２１倍以上、２２倍以上、２３倍以上または２４倍以上の発光強度が得られる。 FIG. 3 shows the luminescence intensity of luciferin obtained using wild type Okinawa firefly luciferase, the luminescence intensity by Rhodamine 6G, A graph comparing the luminescence intensities of luciferins obtained when using pyralis luciferase is shown. From this figure, it can be seen that when wild type Okinawa firefly luciferase is used, a light emission intensity of 24.4 times or more that of rhodamine 6G can be achieved. This emission intensity is obtained by accumulating light having a wavelength of 300 nm to 650 nm for 10 seconds. Thus, when the luciferase according to the embodiment is used, higher luminescence intensity can be achieved as compared with the case where a known luminescent substance and a conventional firefly luciferase are used. The wild-type Okinawa firefly luciferase according to the embodiment is preferably 5 times or more, 10 times or more, 15 times or more, 20 times or more, 21 times or more, 22 times or more, 23 times or more or 24 times or more of the luminescence intensity by rhodamine 6G. Is obtained.
実施形態に係るルシフェラーゼは、オキナワマドボタルから取得された野生型のルシフェラーゼだけでなく、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の一部に変異が生じた変異型のルシフェラーゼを含む。ここでは、このようなルシフェラーゼを、変異型ルシフェラーゼ、変異型オキナワマドボタルルシフェラーゼまたは変異型オキナワマドボタル由来ルシフェラーゼ等と称する。 The luciferase according to the embodiment includes not only a wild-type luciferase obtained from Okinawa butterfly but also a mutant luciferase in which a part of the amino acid sequence of the wild-type luciferase is mutated. Here, such a luciferase is referred to as a mutant luciferase, a mutant Okinawa firefly luciferase, a mutant Okinawa firefly-derived luciferase, or the like.
そのような変異は、ルシフェラーゼの酵素活性を向上させる変異であってよい。すなわち、そのような変異は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼよりも高い発光強度をもたらす変異であってよい。例えば、実施形態に係る変異型オキナワマドボタルルシフェラーゼを用いた場合に達成される発光強度は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼを用いた場合に達成される発光強度の２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、４倍以上または５倍以上であり得る。また、実施形態に係る変異型オキナワマドボタルルシフェラーゼを用いた場合に達成される発光強度は、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）６Ｇによる発光強度の５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、１００倍以上または１１０倍以上であり得る。 Such a mutation may be a mutation that improves the enzymatic activity of luciferase. That is, such a mutation may be a mutation that provides higher emission intensity than wild-type Okinawa firefly luciferase. For example, the luminescence intensity achieved when using the mutant Okinawa luciferase according to the embodiment is 2 times or more, 2.5 times or more of the luminescence intensity achieved when using the wild type Okinawa botany luciferase. It can be more than twice, more than 4 times, or more than 5 times. Further, the luminescence intensity achieved when the mutant Okinawa luciferase according to the embodiment is used is 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times the light emission intensity of Rhodamine 6G. As described above, it may be 100 times or more or 110 times or more.
発光強度の向上をもたらす変異の例は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）における４２４番目のイソロイシン（Ｉ）をロイシン（Ｌ）に置換する変異（Ｉ４２４Ｌ）である。別の例は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）における５３１番目のイソロイシン（Ｉ）をアルギニン（Ｒ）に置換する変異（Ｉ５３１Ｒ）である。別の例は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）における３５５番目のグルタミン酸（Ｅ）をアルギニン（Ｒ）に置換する変異（Ｅ３５５Ｒ）である。別の例は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）における３６７番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換する変異（Ｖ３６７Ａ）である。別の例は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）における４４６番目のリシン（Ｋ）をグルタミン（Ｑ）に置換する変異（Ｋ４４６Ｑ）である。これら計５種の変異は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）に対して、全て同時に、または任意の組合せで導入することができる。 An example of a mutation that leads to an improvement in luminescence intensity is a mutation (I424L) that substitutes leucine (L) for the 424th isoleucine (I) in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of wild-type Okinawan firefly luciferase. Another example is a mutation (I531R) that replaces the 531st isoleucine (I) with arginine (R) in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of wild-type Okinawan firefly luciferase. Another example is a mutation (E355R) that replaces the 355th glutamic acid (E) with arginine (R) in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of wild-type Okinawan firefly luciferase. Another example is a mutation (V367A) that replaces the 367th valine (V) with alanine (A) in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of wild-type Okinawan firefly luciferase. Another example is a mutation (K446Q) that replaces the 446th lysine (K) with glutamine (Q) in the amino acid sequence of wild-type Okinawan firefly luciferase (SEQ ID NO: 1). These five types of mutations can be introduced all at the same time or in any combination with respect to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of wild-type Okinawan firefly luciferase.
あるいは、上記５種の変異は、配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質に対しても導入することができる。例えば、そのようなタンパク質のアミノ酸配列と配列番号１との対応関係を考慮して変異を導入することができる。そのようなタンパク質にＩ４２４Ｌ変異を導入したい場合、配列番号１と導入の対象とするタンパク質の配列とを比較して、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４２４番目のＩに対応するアミノ酸残基を決定し、当該アミノ酸をＬに置換することでＩ４２４Ｌ変異を導入することができる。ここにおいて「対応するアミノ酸残基」は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。 Alternatively, the above five mutations can be introduced into a protein having an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 1. For example, a mutation can be introduced in consideration of the correspondence between the amino acid sequence of such a protein and SEQ ID NO: 1. When an I424L mutation is to be introduced into such a protein, the amino acid residue corresponding to the 424th I of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is compared by comparing SEQ ID NO: 1 with the sequence of the protein to be introduced. The I424L mutation can be introduced by determining and substituting the amino acid with L. Here, the “corresponding amino acid residue” can be determined using a known technique such as homology search.
実施形態に係る変異型オキナワマドボタルルシフェラーゼの一例は、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。ここでは、この変異型ルシフェラーゼを変異体１と称する。変異体１は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ（配列番号１）に対して、Ｉ４２４Ｌ、Ｅ３５５Ｒ、Ｖ３６７ＡおよびＫ４４６Ｑの変異を導入して得られた変異型ルシフェラーゼである。変異体１を用いた場合に達成され得る発光強度は、例えば、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ（配列番号１）を用いた場合に達成され得る発光強度の４．２倍以上である。また、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ（配列番号１）を用いた場合に達成され得る発光強度は、例えば、ローダミン６Ｇによる発光強度の２４．４倍以上である。以上から、変異体１を用いた場合に達成され得る発光強度は、例えば、ローダミン６Ｇによる発光強度の１０２．５倍（＝２４．４倍×４．２倍）以上であると算出される。
An example of the mutant Okinawa luciferase according to the embodiment is a luciferase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36. Here, this mutant luciferase is referred to as
また、実施形態は、変異体１に対して更なる変異を導入したものも含む。例えば、変異体１に対して、さらなる発光強度の向上を目的として、さらなる変異を導入したものを含む。あるいは、変異体１に対して、発光強度の向上とは別の目的、例えば、可溶性の向上、分解に対する耐性の向上等を目的として、さらなる変異を導入したものを含む。具体的には、実施形態は、変異体１のアミノ酸配列（配列番号３６）との間で一定の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる変異型ルシフェラーゼを含む。好ましくは、この変異型ルシフェラーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、４．２倍以上の強度でルシフェリンを発光させる。ここにおいて、アミノ酸配列における一定の相同性とは、例えば、７５％以上、８０％以上、８５%以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性である。また、好ましくは、変異体１に対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸が変異したものであり、１から１５のアミノ酸が変異したものであり、１から１０のアミノ酸が変異したものであり、１から５のアミノ酸が変異したものであり、１から４のアミノ酸が変異したものであり、１から３のアミノ酸が変異したものであり、１または２のアミノ酸が変異したものである。好ましくは、変異体１に対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼでは、Ｉ４２４Ｌ、Ｅ３５５Ｒ、Ｖ３６７ＡおよびＫ４４６Ｑの変異が維持されている。すなわち、変異体１に対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２４番目のアミノ酸（またはそれに対応するアミノ酸）がロイシンであり、３５５番目のアミノ酸（またはそれに対応するアミノ酸）がアルギニンであり、３６７番目のアミノ酸（またはそれに対応するアミノ酸）がアラニンであり、および４４６番目のアミノ酸（またはそれに対応するアミノ酸）がグルタミンである。ここにおいて「対応するアミノ酸」は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。
Embodiments also include those in which a further mutation is introduced into
実施形態に係る変異型オキナワマドボタルルシフェラーゼの別の例は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。ここでは、この変異型ルシフェラーゼを変異体２と称する。変異体２は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ（配列番号１）に対して、Ｉ４２４Ｌ、Ｉ５３１Ｒ、Ｅ３５５Ｒ、Ｖ３６７ＡおよびＫ４４６Ｑの変異を導入して得られた変異型ルシフェラーゼである。変異体２による発光強度は、例えば、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ（配列番号１）を用いた場合に達成され得る発光強度の２．４倍以上である。また、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ（配列番号１）を用いた場合に達成され得る発光強度は、例えば、ローダミン６Ｇによる発光強度の２４．４倍以上である。以上から、変異体２を用いた場合に達成され得る発光強度は、例えば、ローダミン６Ｇによる発光強度の５８．７倍（＝２４．４倍×２．４倍）以上であると算出される。
Another example of the mutant Okinawa luciferase according to the embodiment is a luciferase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37. Here, this mutant luciferase is referred to as
また、実施形態は、変異体２に対して更なる変異を導入したものも含む。例えば、変異体２に対して、さらなる発光強度の向上を目的として、さらなる変異を導入したものを含む。あるいは、変異体２に対して、発光強度の向上とは別の目的、例えば、可溶性の向上、分解に対する耐性の向上等を目的として、さらなる変異を導入したものを含む。具体的には、実施形態は、変異体２のアミノ酸配列（配列番号３７）との間で一定の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる変異型ルシフェラーゼを含む。好ましくは、この変異型ルシフェラーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼの２．４倍以上の強度でルシフェリンを発光させる。ここにおいて、アミノ酸配列における一定の相同性とは、例えば、７５％以上、８０％以上、８５%以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性である。また、好ましくは、変異体２に対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号３７に示されるアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸が変異したものであり、１から１５のアミノ酸が変異したものであり、１から１０のアミノ酸が変異したものであり、１から５のアミノ酸が変異したものであり、１から４のアミノ酸が変異したものであり、１から３のアミノ酸が変異したものであり、１または２のアミノ酸が変異したものである。好ましくは、変異体２に対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼでは、Ｉ４２４Ｌ、Ｉ５３１Ｒ、Ｅ３５５Ｒ、Ｖ３６７ＡおよびＫ４４６Ｑの変異が維持されている。すなわち、変異体１に対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２４番目のアミノ酸（またはそれに対応するアミノ酸）がロイシンであり、５３１番目のアミノ酸（またはそれに対応するアミノ酸）がアルギニンであり、３５５番目のアミノ酸（またはそれに対応するアミノ酸）がアルギニンであり、３６７番目のアミノ酸（またはそれに対応するアミノ酸）がアラニンであり、および４４６番目のアミノ酸（またはそれに対応するアミノ酸）がグルタミンである。ここにおいて「対応するアミノ酸」は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。
Embodiments also include those in which a further mutation is introduced into
実施形態に係る変異型ルシフェラーゼのその他の例は、実験的な操作性を向上させる変異が導入された変異型ルシフェラーゼである。たとえば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、その可溶性を高める変異が導入されたルシフェラーゼである。 Another example of the mutant luciferase according to the embodiment is a mutant luciferase into which a mutation that improves experimental operability is introduced. For example, when the wild-type luciferase exhibits low solubility in mammalian cells, the mutant luciferase according to the embodiment is a luciferase into which a mutation that increases its solubility is introduced.
変異型ルシフェラーゼとは、実施形態に係るルシフェラーゼの特徴、すなわち従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて、ルシフェラーゼのアミノ酸配列に変異、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加等が生じたルシフェラーゼであってよい。この変異とは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の１以上のアミノ酸の変異または１から数個のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸の変異、１から１５のアミノ酸の変異、１から１０のアミノ酸の変異、１から５のアミノ酸の変異、１から４のアミノ酸の変異、１から３のアミノ酸の変異、１または２のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で７５％以上、８０％以上、８５%以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有する。 The mutant luciferase is a characteristic of the luciferase according to the embodiment, that is, a mutation in the amino acid sequence of the luciferase, for example, amino acid substitution, deletion and / or addition, as long as high luminescence intensity is obtained as compared with the conventional luciferase. It may be a luciferase in which the This mutation is a mutation of one or more amino acids of the amino acid sequence of wild-type luciferase or a mutation of 1 to several amino acids, preferably a mutation of 1 to 20 amino acids of the amino acid sequence of wild-type luciferase, 15 amino acid mutations, 1 to 10 amino acid mutations, 1 to 5 amino acid mutations, 1 to 4 amino acid mutations, 1 to 3 amino acid mutations, 1 or 2 amino acid mutations. Preferably, the amino acid sequence of the mutant luciferase is 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more with respect to the amino acid sequence of the wild-type luciferase, It has 98% or more or 99% or more homology.
本発明の他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸に関する。すなわち、当該核酸は、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸である。実施形態において、核酸とは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを指す。また、実施形態において、ルシフェラーゼの「遺伝子」とは、主として、ｍＲＮＡに転写される領域、すなわち構造遺伝子を意味する。 Other embodiment of this invention is related with the nucleic acid containing the base sequence which codes the luciferase which concerns on the said embodiment. That is, the nucleic acid is a nucleic acid containing a luciferase gene derived from Okinawa firefly. In embodiments, nucleic acid refers to, for example, DNA or RNA. In the embodiments, the “gene” of luciferase mainly means a region transcribed into mRNA, that is, a structural gene.
実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の一例は、配列番号２に示される塩基配列を含む核酸である。この配列を有する遺伝子は、オキナワマドボタルからクローニングされており、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼをコードする。 An example of a nucleic acid containing a base sequence encoding luciferase according to an embodiment is a nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. A gene having this sequence has been cloned from Okinawan firefly and encodes wild-type Okinawan firefly luciferase.
実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の別の例は、配列番号３４または３５に示される塩基配列を含む核酸である。配列番号３４の配列を有する遺伝子は変異体１をコードする。配列番号３５の配列を有する遺伝子は変異体２をコードする。それぞれ、オキナワマドボタルからクローニングされた野生型の塩基配列に対し、哺乳細胞における発現のためのコドン最適化を行った後、特定のアミノ酸の置換に対応した変異を導入することで得られる配列である。
Another example of the nucleic acid containing the base sequence encoding the luciferase according to the embodiment is a nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 or 35. The gene having the sequence of SEQ ID NO: 34 encodes
実施形態に係る核酸は、野生型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸であっても、そこにおいて変異が生じた変異型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸であってもよい。ここにおいて、変異型ルシフェラーゼ遺伝子とは、コードされたルシフェラーゼが、実施形態に係るルシフェラーゼの特徴、すなわち従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて、塩基配列中の特定の塩基、たとえば数個の塩基の置換、欠失および／または付加等を受けた遺伝子であってよい。また、塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異が含まれる。すなわち、実施形態に係る核酸には、野生型ルシフェラーゼをコードする変異型ルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸が含まれる。 The nucleic acid according to the embodiment may be a nucleic acid including a base sequence of a wild type luciferase gene or a nucleic acid including a base sequence of a mutant luciferase gene in which a mutation has occurred. Here, the mutant luciferase gene means that the encoded luciferase has the characteristics of the luciferase according to the embodiment, that is, a specific base in the base sequence, for example, as long as high luminescence intensity is obtained as compared with the conventional luciferase. The gene may have undergone several base substitutions, deletions and / or additions. Moreover, the variation | mutation which a change does not produce in the encoded amino acid sequence is contained in the variation | mutation of a base sequence. That is, the nucleic acid according to the embodiment includes a nucleic acid containing a mutant luciferase gene encoding a wild type luciferase.
そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の一例は、遺伝子中に存在する特定の制限酵素の認識配列を無効にする変異である。この変異によって、遺伝子を含む核酸は当該制限酵素によって切断されなくなるものの、当該遺伝子は変異前と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードできる。このような変異は、制限酵素の認識配列を構成するコドンを、異なる塩基配列の同義コドンに変換することで達成できる。このような変異は、遺伝子組み換えに使用する制限酵素の認識配列が当該遺伝子中に存在する場合に有用である。この場合、予め遺伝子中の認識配列を無効にしておくことで、制限酵素で処理した場合に遺伝子を含む核酸が断片化することを防ぐことができ、結果として組み換えが容易になる。特定の制限酵素の認識配列を無効にした例は、配列番号３に示される塩基配列である。当該塩基配列は、オキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列からＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列を無効にしたものである。 An example of such a mutation that does not change the encoded amino acid sequence is a mutation that invalidates the recognition sequence of a specific restriction enzyme present in the gene. Although this mutation prevents the nucleic acid containing the gene from being cleaved by the restriction enzyme, the gene can encode a protein having the same amino acid sequence as before the mutation. Such mutation can be achieved by converting the codons constituting the recognition sequence of the restriction enzyme into synonymous codons of different base sequences. Such a mutation is useful when a restriction enzyme recognition sequence used for gene recombination is present in the gene. In this case, by invalidating the recognition sequence in the gene in advance, the nucleic acid containing the gene can be prevented from being fragmented when treated with a restriction enzyme, and as a result, recombination is facilitated. An example in which the recognition sequence of a specific restriction enzyme is invalidated is the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. The base sequence is obtained by invalidating the recognition sequence of BamHI and EcoRI from the base sequence of the Okinawad firefly luciferase gene.
そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の別の例は、遺伝子のコドンを特定の生物種における発現に最適化させる変異である。ここにいう「最適化」とは、核酸に含まれる遺伝子のコドンを、特定の生物種においてコドン出現頻度が高いコドンに代えることを意味する。最適化を行った場合、特定の生物種における遺伝子の発現は、最適化をしない場合に比べて高まる。実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子はホタルから取得されたものであるため、当該遺伝子を導入しようとする生物種が分類学的にホタルから遠い程、最適化の効果はより高いと考えられる。実施形態において特定の生物種とは、例えば細菌細胞、酵母細胞および哺乳細胞である。更に哺乳細胞は、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞である。 Another example of a mutation that does not change the encoded amino acid sequence is a mutation that optimizes the codons of the gene for expression in a particular species. The term “optimization” as used herein means that a codon of a gene contained in a nucleic acid is replaced with a codon having a high codon appearance frequency in a specific biological species. When optimization is performed, gene expression in a specific species is increased compared to when optimization is not performed. Since the luciferase gene according to the embodiment is obtained from a firefly, the effect of optimization is considered to be higher as the species to which the gene is introduced is taxonomically far from the firefly. In the embodiment, specific species are, for example, bacterial cells, yeast cells, and mammalian cells. Furthermore, mammalian cells are, for example, mouse cells, monkey cells and human cells.
実施形態に係るコドンが最適化されたルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の一例は、配列番号４に示される塩基配列を含む核酸である。当該核酸は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列が無効にされており、且つ哺乳細胞における発現にコドンが最適化されている。 An example of a nucleic acid containing a base sequence encoding a luciferase with optimized codons according to an embodiment is a nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. The nucleic acid has the BamHI and EcoRI recognition sequences disabled and codon optimized for expression in mammalian cells.
実施形態に係る核酸は、Ｋｏｚａｋ配列が付与されたルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸を含む。Ｋｏｚａｋ配列とは、開始コドンとその前後の複数の塩基配列から成る配列であり、Ｋｏｚａｋ配列が存在することで、その遺伝子の発現量が増大することがわかっている。Ｋｏｚａｋ配列は、生物種または生物群ごとに共通配列が見出されている。実施形態に係るＫｏｚａｋ配列を含む核酸は、それを導入する生物種に対応したＫｏｚａｋ配列を有する。例えば哺乳細胞に導入される場合、核酸は、Ｋｏｚａｋ配列としてｇｃｃｒｃｃａｔｇｇ（配列番号５）（ｒはグアニンまたはアデニンを意味する）の配列を含む。Ｋｏｚａｋ配列を付与するルシフェラーゼ遺伝子は、野生型遺伝子であってもよいが、上述のようなコドンの最適化を行った変異型遺伝子であってもよい。 The nucleic acid according to the embodiment includes a nucleic acid including a base sequence of a luciferase gene to which a Kozak sequence is added. The Kozak sequence is a sequence composed of a start codon and a plurality of base sequences before and after the start codon. It is known that the presence of the Kozak sequence increases the expression level of the gene. In the Kozak sequence, a common sequence is found for each species or group of organisms. The nucleic acid containing the Kozak sequence according to the embodiment has a Kozak sequence corresponding to the species into which it is introduced. For example, when introduced into a mammalian cell, the nucleic acid comprises the sequence of gccrccatgg (SEQ ID NO: 5) (r means guanine or adenine) as a Kozak sequence. The luciferase gene that imparts the Kozak sequence may be a wild-type gene, or may be a mutant gene that has been subjected to codon optimization as described above.
本発明のさらに他の実施形態はこれらの核酸を含むベクターに関する。当該ベクターには、ルシフェラーゼをコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。 Yet another embodiment of the invention relates to vectors comprising these nucleic acids. In addition to the nucleic acid encoding luciferase, the vector may include a nucleic acid containing a sequence for regulating expression or a marker gene sequence.
また、本発明のさらに他の実施形態は発光プローブに関する。当該発光プローブは、野生型のルシフェラーゼを含むものでもよいが、変異型ルシフェラーゼを含むものでもよい。特に、公知の技術によって、発光プローブとしての利用に適した改変を加えたものが好ましい。さらに実施形態は、上記発光プローブを用いた種々の試料（インビボ、インビトロ）に関する種々の使用（イメージング、測光等）に有効に適用できる。 Yet another embodiment of the present invention relates to a luminescent probe. The luminescent probe may contain wild-type luciferase or may contain mutant luciferase. In particular, those modified by a known technique and suitable for use as a luminescent probe are preferred. Furthermore, the embodiments can be effectively applied to various uses (imaging, photometry, etc.) related to various samples (in vivo, in vitro) using the luminescent probe.
本発明のさらに他の実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内の機能を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼを細胞内に導入する工程、および前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。例えば、ＤＮＡ中の特定の発現調節領域の下流に実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼの発現を、それが誘起するルシフェリンの発光の有無によって検出することで、発現調節領域の機能を調べることが可能である。 Yet another embodiment of the present invention relates to a method for analyzing intracellular functions using the luciferase according to the embodiment. The method includes a step of introducing the luciferase according to the embodiment into a cell, and a step of detecting luminescence of luciferin induced by the luciferase with an imaging device. For example, the function of the expression control region is examined by introducing the luciferase gene according to the embodiment downstream of a specific expression control region in DNA and detecting the expression of luciferase by the presence or absence of luciferin luminescence induced by the gene. It is possible.
本発明のさらに他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内タンパク質を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼと解析の対象とするタンパク質とから成る融合タンパク質を細胞内に導入する工程；および、前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。 Still another embodiment of the present invention relates to a method for analyzing an intracellular protein using the luciferase according to the above embodiment. The method includes a step of introducing a fusion protein comprising the luciferase according to the embodiment and a protein to be analyzed into a cell; and a step of detecting luminescence of luciferin induced by the luciferase with an imaging device.
当該方法は、解析の対象とするタンパク質の細胞内の局在の観察、および、その局在の時間変化の観察（タイムラプス）を含む。また、当該方法は、タンパク質の局在だけでなく、そのタンパク質が単に発現したか否かの確認をも含む。使用される細胞に特別な限定はなく、細胞のイメージングの分野において通常使用できる細胞であってよい。また、解析の対象とするタンパク質も特別に限定はなく、研究の目的に応じたタンパク質を選択することができる。当該タンパク質は、使用する細胞内に本来存在するタンパクであってよく、または細胞内に本来存在しない異種性のまたは改変したタンパク質であってよい。 This method includes observation of intracellular localization of a protein to be analyzed, and observation of temporal change in the localization (time lapse). The method also includes not only localization of the protein, but also confirmation of whether or not the protein is expressed. The cell used is not particularly limited, and may be a cell that can be usually used in the field of cell imaging. The protein to be analyzed is not particularly limited, and a protein can be selected according to the purpose of research. The protein may be a protein that is naturally present in the cell used or may be a heterologous or modified protein that is not inherently present in the cell.
融合タンパク質を細胞内に導入する場合、既知の導入方法を使用することができる。１つの方法は、細胞外で精製した融合タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって融合タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、融合タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって融合タンパク質を細胞に取り込ませることができる。また別の方法は、まず融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を導入し、その後細胞内で融合タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから融合タンパク質を発現させることができる。ここにおいて、融合タンパク質の遺伝子は、実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子と解析の対象とするタンパク質の遺伝子とを含む遺伝子であり、ここにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子とタンパク質遺伝子とは、それぞれ正常に翻訳されるよう連結されている。 When the fusion protein is introduced into the cell, a known introduction method can be used. One method is to introduce a fusion protein purified outside the cell directly into the cell. For example, the fusion protein can be directly injected into the cell by the microinjection method. Alternatively, cells can be incubated in a culture solution containing the fusion protein, and the fusion protein can be taken into the cell by endocytosis. Another method is a method in which a nucleic acid containing a base sequence encoding a fusion protein is first introduced, and then the fusion protein is expressed in cells. For example, an expression vector containing the nucleic acid can be introduced into cells by the calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method or the like, and the fusion protein can be expressed from the expression vector. Here, the gene of the fusion protein is a gene including the luciferase gene according to the embodiment and the gene of the protein to be analyzed. Here, the luciferase gene and the protein gene are linked so as to be normally translated. Has been.
ルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程は、既知の検出方法を使用することができる。例えば、ルシフェラーゼを含む融合タンパク質を発現する細胞に、ルシフェリン、ＡＴＰおよびＭｇ２＋イオン等を適宜与えてルシフェラーゼにルシフェリンの発光反応を誘起させ、発生した発光をイメージング装置により検出することができる。イメージング装置とは、例えば発光を捉えるためのフィルターを備えた顕微鏡である。顕微鏡を使用することで、細胞内における発光の位置を特定して、この情報をもとにタンパク質の局在を特定することが可能となる。また、イメージング装置として、経時的に撮像できる機能を備えた顕微鏡を使用することができ、この顕微鏡によって経時的観察も可能となる。 A known detection method can be used for the step of detecting luminescence of luciferin with an imaging device. For example, luciferin, ATP, Mg 2+ ions, and the like are appropriately given to cells expressing a fusion protein containing luciferase to induce a luciferin luminescence reaction, and the generated luminescence can be detected by an imaging device. An imaging apparatus is a microscope provided with a filter for capturing light emission, for example. By using a microscope, it is possible to specify the position of luminescence in the cell and specify the localization of the protein based on this information. In addition, a microscope having a function capable of imaging over time can be used as the imaging apparatus, and observation over time is also possible with this microscope.
［実施例１：オキナワマドボタル由来のルシフェラーゼ遺伝子のクローニング］
１．材料
材料として沖縄県沖縄本島で採集したオキナワマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍａｔｓｕｍｕｒａｉ）の幼虫を用いた。
[Example 1: Cloning of luciferase gene derived from Okinawan firefly]
1. Materials The larvae of Okinawad firefly (Pyrocoelia matsumurai) collected on the Okinawa main island of Okinawa were used as materials.
２．トータルＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
ホタルの幼虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄチューブ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に、採取した発光器および１ｍＬのトータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ ２４（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）またはＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１００Ａ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に装着し、振動速度６．５ｍ／ｓおよび振動時間４５秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、３０分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕を実施した。
2. Extraction of Total RNA and Synthesis of cDNA A light emitter was cut out from firefly larvae using scissors. The collected light emitter and 1 mL of total RNA extraction reagent TRIzol Reagent (Invitrogen) were placed in a Lysing Matrix D tube (MP-Biomedicals), which is a tube containing beads for tissue and cell homogenization. This tube was attached to a tissue cell disruption device FastPrep 24 (MP-Biomedicals) or FastPrep FP100A (MP-Biomedicals), and a firefly light emitter was used as a reagent under conditions of a vibration speed of 6.5 m / s and a vibration time of 45 seconds. It was crushed inside. After completion, the tube was removed from the crusher and placed on ice for 30 minutes. Thereafter, crushing was performed again under the same conditions.
次に、トータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔの説明書に従って、破砕した溶液からトータルＲＮＡの分離精製を行った。得られたｍＲＮＡ溶液１００μｌを、エタノール沈殿法によって沈殿濃縮した。次に、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）をマニュアルに従って使用して、沈殿濃縮したトータルＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ溶液２０μｌをホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーとして以下の遺伝子実験に用いた。 Next, according to the instructions of the total RNA extraction reagent TRIzol Reagent, the total RNA was separated and purified from the disrupted solution. 100 μl of the obtained mRNA solution was concentrated by precipitation by ethanol precipitation. Next, a full-length cDNA was synthesized from the precipitated and concentrated total RNA using a full-length cDNA synthesis reagent GeneRacer (Invitrogen) according to the manual. 20 μl of the obtained cDNA solution was used as a firefly full-length cDNA library for the following gene experiments.
３．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側の同定
３−１．Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ（ＲＡＣＥ）法に用いるプライマーの作製
オキナワマドボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によって行った。このＰＣＲに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。
3. 3. Identification of 5 ′ terminal side of firefly luciferase gene 3-1. Preparation of Primer for Rapid Amplification of cDNA End (RACE) Method The luciferase gene of Okinawan firefly was cloned by the Polymerase chain reaction (PCR) method. Primers used for this PCR were prepared as follows based on the amino acid sequence of a luciferase gene derived from a known related organism.
ホタルルシフェラーゼにおいてよく保存されているアミノ酸領域を確認するために、既に公開されている１０種類のホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列を、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）を用いて比較した。比較に用いた近縁生物は、ラムフィリス・ノクティルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）（登録番号ＣＡＡ６１６６８）、ルキオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）（登録番号Ｐ１３１２９）、ルキオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）（登録番号Ｑ０１１５８）、ルキオラ・ミングレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）（登録番号Ｑ２６３０４）、ホタリア・パルヴラ（Ｈｏｔａｒｉａ ｐａｒｖｕｌａ）（登録番号ＡＡＣ３７２５３）、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）（登録番号ＢＡＦ４８３９０）、フォトゥリス・ペンシルヴァニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）（登録番号Ｑ２７７５７）、ピロコエリア・ミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍｉｙａｋｏ）（登録番号ＡＡＣ３７２５４）、ピロコエリア・ルファ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｒｕｆａ）（登録番号ＡＡＧ４５４３９）およびラハゴフタルムス・オーバイ（Ｒｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｏｈｂａｉ）（登録番号ＢＡＦ３４３６０）である。 In order to confirm amino acid regions that are well conserved in firefly luciferase, the amino acid sequences of 10 types of firefly luciferases that have already been released were compared using sequence information analysis software DNASIS Pro (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.). The relative organisms used in the comparison were Rampyris noctiluca (registration number CAA61668), Luciola cruciata (registration number P13129), Luciola latero15 (Luciola laQal01)・ Mingrelica (registration number Q26304), Hotaria parvula (registration number AAC37253), Photinus pyralis (registration number BAF48390), Photouris pennsylva tyll vs. Q27757), Piroko area Miyako ( yrocoelia miyako) (registration number AAC37254), it is a Piroko area Alpha (Pyrocoelia rufa) (registration number AAG45439) and Rahagofutarumusu-Obai (Rhagophthalmus ohbai) (registration number BAF34360).
その結果、ホタルルシフェラーゼのＣ末端側４４０残基付近に位置するＬ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｋ−Ｇ−Ｙ−Ｑ−Ｖ（配列番号６）のアミノ酸配列がよく保存されていることがわかった。この９つのアミノ酸配列をコードするコドンから塩基配列を予測し、５’末端ＲＡＣＥ ＰＣＲに用いる１２種類のホタルルシフェラーゼ特異的混合プライマーを設計した。このプライマーの名称および配列は以下の通りである（プライマー配列中のＹ、ＲおよびＮは混合塩基を示す）：ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＴ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号７）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号８）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号９）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号１０）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号１１）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号１２）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号１３）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号１４）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号１５）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＣ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号１６）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＣ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号１７）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＣ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号１８）。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。 As a result, it was found that the amino acid sequence of LI-KY-K-G-Q-V (SEQ ID NO: 6) located near the C-terminal 440 residues of firefly luciferase is well conserved. It was. A nucleotide sequence was predicted from codons encoding these nine amino acid sequences, and 12 kinds of firefly luciferase-specific mixed primers used for 5 'terminal RACE PCR were designed. The name and sequence of this primer are as follows (Y, R and N in the primer sequence indicate mixed bases): flexLuc5-ATA (5′-ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTA AT-3 ′: SEQ ID NO: 7), flexLuc5-ATG (5′-ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTG AT-3 ′: SEQ ID NO: 8), flexLuc5-ATT (5′-ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTT AT-3 ′: SEQ ID NO: 9) , FlexLuc5-ACA (5'-ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTA AT-3 ': SEQ ID NO: 10), flexLuc5-ACG (5'-ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTG AT-3': SEQ ID NO: 11), flexLuc 5-ACT (5′-ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTT AT-3 ′: SEQ ID NO: 12), flexLuc5-GTA (5′-ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTA AT-3 ′: SEQ ID NO: 13), flexLuc5- GTG (5′-ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTG AT-3 ′: SEQ ID NO: 14), flexLuc5-GTT (5′-ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTT AT-3 ′: SEQ ID NO: 15), flexLuc5-G 5′-ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTA AT-3 ′: SEQ ID NO: 16), flexLuc5-GCG (5′-ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTG AT-3 ′: SEQ ID NO: 17), flexLu 5-GCT (5'-ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTT AT-3 ': SEQ ID NO: 18). The synthesis of these primers was outsourced to Life Technologies Japan.
３−２．５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによる、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側のクローニング
上述の通り作製したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーおよび５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ−３’：配列番号１９）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’：配列番号２０）を用いて５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
3-2.5′-RACE PCR cloning of the 5 ′ end of the firefly luciferase gene Using the firefly full-length cDNA library prepared as described above as a template, 12 kinds of specific mixed primers prepared as described above and
一度目のＰＣＲとして、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーのいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒとから成る１２通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％トリス酢酸緩衝液（ＴＡＥ）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。１２の反応溶液の全てにおいてわずかに遺伝子増幅が認められたため、これらのＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を次の通り実施した。 As the first PCR, the luciferase gene was amplified using 12 kinds of primer pairs consisting of any of the 12 kinds of specific mixed primers prepared as described above and GeneRacer 5 'Primer. Final concentration is 10 × Ex Taq Buffer (20 mM Mg2 + plus), final concentration is 0.2 mM dNTP Mixture (each 2.5 mM), final concentration is 0.05 U / μl TaKaRa Ex Taq (5 U / μl) A 10 μl PCR reaction solution containing one of 12 primers with a final concentration of 1.0 μM and GeneRacer 3 ′ Primer with a final concentration of 0.3 μM was prepared, and 0.2 μl of a firefly full-length cDNA library solution was added thereto. added. The concentration of the firefly full-length cDNA library solution was not quantified. In the PCR reaction, heat denaturation at 94 ° C. for 2 minutes was first performed, and then 94 ° C. for 30 seconds, 45 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 90 seconds were repeated for 30 cycles, and finally an extension reaction at 72 ° C. for 5 minutes was performed. After the PCR reaction, 1 μl of the PCR reaction solution was electrophoresed using a 1% Tris acetate buffer (TAE) agarose gel, and after ethidium bromide staining, the amplified gene band was observed under ultraviolet irradiation. Since gene amplification was slightly observed in all 12 reaction solutions, nested PCR reactions were performed as follows using these PCR reaction solutions as templates.
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、一度目のＰＣＲで使用した１２種類プライマーのうちの４つとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとから成る４通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．００５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせ条件を確認した。 As nested PCR, the luciferase gene was amplified using 4 types of primer pairs consisting of 4 out of 12 kinds of primers used in the first PCR and GeneRacer 3 ′ Nested Primer. Final concentration is 10 × Ex Taq Buffer (20 mM Mg 2+ plus), final concentration is 0.2 mM each dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration is 0.005 U / μl TaKaRa Ex Taq (5 U / μl), 10 μl of a PCR reaction solution containing one of 12 kinds of primers with a final concentration of 1.0 μM and GeneRacer 3 ′ Primer with a final concentration of 0.3 μM was prepared, and the first PCR reaction solution was used as a template there. 1.0 μl of a solution diluted 10-fold with sterilized water was added. In the PCR reaction, heat denaturation at 94 ° C. for 2 minutes was first performed, and then 94 ° C. for 30 seconds, 45 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 90 seconds were repeated for 30 cycles, and finally an extension reaction at 72 ° C. for 5 minutes was performed. After the PCR reaction, 1 μl of the PCR reaction solution was electrophoresed using a 1% TAE agarose gel. After ethidium bromide staining, the amplified gene band was observed under ultraviolet irradiation. The combination conditions of primers that efficiently amplified the gene in the vicinity of about 1.4 kbp were confirmed.
３−３．５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
Determination of the base sequence of the gene amplified by 3-3.5′-RACE In order to read the base sequence of the gene amplified by 5′-RACE, the PCR product was purified by gel extraction, subcloning and direct sequencing. Details are shown below.
約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９） Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ Ｃ−３’：配列番号２１）とＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＧＧ−３’：配列番号２２）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
PCR (
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。 For the PCR reaction solution in which amplification was confirmed, the base sequence of the gene was determined using the direct sequencing method. Excess dNTPs and primers contained in the PCR reaction solution were removed using a PCR product purification kit ExoSAP-IT (GE Healthcare Bioscience) to prepare a template for PCR direct sequencing. Using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), a sequencing reaction solution containing this template was prepared, and a sequencing reaction was performed using a thermal cycler. PCR product purification and sequencing were performed according to the respective manuals. After the sequencing reaction, the reaction product was purified as follows. 2.5 times volume of 100% ethanol was added to the reaction solution, and nucleic acid was precipitated using a centrifuge. Next, after removing the supernatant, 70% ethanol was added to wash the precipitate, and the nucleic acid was precipitated using a centrifuge. Finally, after removing the upper fine, the precipitate was dried. To the purified precipitate, 15 μl of Hi-Di Formatide (Applied Biosystems) was added and dissolved. This solution was heat-denatured at 94 ° C. for 2 minutes and further rapidly cooled on ice to prepare a sample for determining the base sequence. The base sequence of this sample was read using an Applied Biosystems 3130xl genetic analyzer (Applied Biosystems). The base sequence analysis method was performed according to the manual.
シークエンシングによって得られた遺伝子配列を、配列情報解析ソフトウェア ＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏの「シークエンス連結」機能を用いて解析した。この配列をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）が提供するｂｌａｓｔｘサーチを利用して相同性検索を実施し、既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側であると決定した。 The gene sequence obtained by sequencing was analyzed using the “sequence ligation” function of the sequence information analysis software DNASIS Pro. This sequence was subjected to a homology search using a blastx search provided by National Center for Biotechnology Information (NCBI), and confirmed to show high homology with the base sequence of known firefly luciferase. The base sequence obtained by the above experiment and analysis was determined to be on the 5 'end side of the novel firefly luciferase gene.
４．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’Ｒａｃｅ ＰＣＲおよび完全長ｃＤＮＡの取得
４−１．３’Ｒａｃｅ ＰＣＲに用いるプライマーの設計
５’Ｒａｃｅ ＰＣＲの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側非翻訳領域の配列を基にして、３’ＲＡＣＥに用いるプライマーおよびＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲに用いるプライマーを作成した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。
4). Obtaining 3 'Race PCR and full-length cDNA of firefly luciferase gene 4-1.3' Design of primers used for 'Race PCR' Sequence of 5 'terminal untranslated region of firefly luciferase gene obtained in 5' Race PCR experiment Based on the above, a primer used for 3′RACE and a primer used for Nested PCR were prepared. Primer synthesis was outsourced to Life Technologies Japan.
４−２．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ取得のための３’Ｒａｃｅ ＰＣＲ
上述の通り作成したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーＮｏ６（２／３）−Ｆｕｌｌ−Ｆ１（ＧＡＣＡＣＴＡＡＣＧＣＧＣＴＡＡＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＧＡ：配列番号２３）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’：配列番号２４）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’：配列番号２５）を用いて３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
4-2. 3 'Race PCR for obtaining full-length cDNA of firefly luciferase gene
Primer No6 (2/3) -Full-F1 (GACACTAACGCGCTAACATCATTGCAAGA: sequence) prepared from the base sequence of the 5′-terminal untranslated region of the target firefly luciferase using the firefly full-length cDNA library prepared as described above as a template No. 23) and GeneRacer 3 ′ Primer (5′-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G-3 ′: SEQ ID NO: 24) and GeneRacer 3 ′ Nested Primer (5′-CGC TAC GTA ACG GCA-3 TGA CAG No. 25) was used to perform 3′-RACE PCR. GeneRacer 3 ′ Primer and GeneRacer 3 ′ Nested Primer used were those included in the full-length cDNA synthesis reagent GeneRacer kit (Invitrogen). In order to efficiently amplify the luciferase gene by 3′-RACE PCR, a nested PCR was carried out in which the gene amplified once by PCR was used as a template and the gene was amplified more specifically by the inner primer pair. PCR was performed using polymerase Ex-Taq (Takara Bio Inc.) according to the manual.
一度目のＰＣＲとして、５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．４μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。わずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。 As the first PCR, the luciferase gene was amplified using a primer pair consisting of a primer prepared from the base sequence of the 5 ′ end side untranslated region and GeneRacer 3 ′ Primer. Final concentration of 10 × Ex Taq Buffer (20 mM Mg 2+ plus), final concentration of 0.2 mM each dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration 0.05 U / μl TaKaRa Ex Taq (5 U / μl) and 20 μl of a PCR reaction solution containing primers each having a final concentration of 0.3 μM were prepared, and 0.4 μl of a firefly full-length cDNA library solution was added thereto. The concentration of the firefly full-length cDNA library solution was not quantified. The PCR reaction was first heat-denatured at 94 ° C. for 2 minutes, then repeated 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes, and finally an extension reaction at 72 ° C. for 5 minutes. After the PCR reaction, 1 μl of the PCR reaction solution was electrophoresed using a 1% TAE agarose gel. After ethidium bromide staining, the amplified gene band was observed under ultraviolet irradiation. Since gene amplification was slightly observed, nested PCR reactions were performed using this PCR reaction solution as a template.
Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ用のプライマーＮｏ６（２／３）−Ｆｕｌｌ−Ｆ２（ＣＧＣＧＣＴＡＡＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＧＡ：配列番号２６）とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅していることを確認した。 As the nested PCR, a luciferase gene was amplified using a primer pair consisting of primer No. 6 (2/3) -Full-F2 (CGCGCTAATACATCATGCAAGAATGGGAAGA: SEQ ID NO: 26) and GeneRacer 3 ′ Nested Primer for Nested PCR. Final concentration of 10 × Ex Taq Buffer (20 mM Mg 2+ plus), final concentration of 0.2 mM each dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration 0.05 U / μl TaKaRa Ex Taq (5 U / μl) and 20 μl of a nested PCR reaction solution containing primers each having a final concentration of 0.3 μM were prepared, and 1.0 μl of a solution obtained by diluting the first PCR reaction solution 10-fold with sterile water was added thereto as a template. The PCR reaction was first heat-denatured at 94 ° C. for 2 minutes, then repeated 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes, and finally an extension reaction at 72 ° C. for 5 minutes. After the PCR reaction, 1 μl of the PCR reaction solution was electrophoresed using a 1% TAE agarose gel. After ethidium bromide staining, the amplified gene band was observed under ultraviolet irradiation. It was confirmed that the gene was efficiently amplified in the vicinity of about 2 kbp.
４−３．３’−Ｒａｃｅで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
Determination of the base sequence of the gene amplified with 4-3.3′-Race In order to read the base sequence of the gene amplified with 3′-RACE, purification of the PCR product by gel extraction, subcloning and direct sequencing were performed. Details are shown below.
約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９） Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ Ｃ−３’：配列番号２１）とＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＧＧ−３’：配列番号２２）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
PCR (
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスに用いたプライマーはベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。 For the PCR reaction solution in which amplification was confirmed, the base sequence of the gene was determined using the direct sequencing method. Excess dNTPs and primers contained in the PCR reaction solution were removed using a PCR product purification kit ExoSAP-IT (GE Healthcare Bioscience) to prepare a template for PCR direct sequencing. Using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), a sequencing reaction solution containing this template was prepared, and a sequencing reaction was performed using a thermal cycler. Primers used for sequencing were vector primers or gene-specific primers. PCR product purification and sequencing were performed according to the respective manuals. After the sequencing reaction, the reaction product was purified as follows. 2.5 times volume of 100% ethanol was added to the reaction solution, and nucleic acid was precipitated using a centrifuge. Next, after removing the supernatant, 70% ethanol was added to wash the precipitate, and the nucleic acid was precipitated using a centrifuge. Finally, after removing the upper fine, the precipitate was dried. To the purified precipitate, 15 μl of Hi-Di Formatide (Applied Biosystems) was added and dissolved. This solution was heat-denatured at 94 ° C. for 2 minutes and further rapidly cooled on ice to prepare a sample for determining the base sequence. The base sequence of this sample was read using an Applied Biosystems 3130xl genetic analyzer (Applied Biosystems). The base sequence analysis method was performed according to the manual.
シークエンシングによって完全長ホタルルシフェラーゼ遺伝子を獲得した。この塩基配列（配列番号２）もしくはアミノ酸（配列番号１）へ翻訳した配列について、ＮＣＢＩが提供するｂｌａｓｔｘまたはｂｌａｓｔｐサーチを利用して相同性検索を実施した。それぞれの検索で既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列であると決定した。 The full-length firefly luciferase gene was obtained by sequencing. The sequence translated into this base sequence (SEQ ID NO: 2) or amino acid (SEQ ID NO: 1) was subjected to homology search using blastx or blastp search provided by NCBI. Each search confirmed high homology with the base sequence of known firefly luciferase. The base sequence obtained by the above experiment and analysis was determined to be the full-length cDNA sequence of the novel firefly luciferase gene.
以下、この新規のルシフェラーゼを野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼと称する。 Hereinafter, this novel luciferase is referred to as wild type Okinawa firefly luciferase.
［実施例２：野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼの酵素学的なパラメータの測定］
１．野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現
野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（インビトロジェン）に導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。
[Example 2: Determination of enzymological parameters of wild-type Okinawa firefly luciferase]
1. Protein expression of wild type Okinawa firefly luciferase gene The wild type Okinawa firefly luciferase gene was introduced into pRSET-B vector (Invitrogen) for protein expression in E. coli. The gene expression vector was constructed according to a standard method as follows.
１−１．野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子の制限酵素認識部位の改変
上述の通り決定した塩基配列によれば、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」（羊土社、２００１年発行、ｐ．１７−２５）に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号３に示される塩基配列である。
1-1. Modification of restriction enzyme recognition site of wild-type Okinawa firefly luciferase gene According to the base sequence determined as described above, the wild-type Okinawa firefly luciferase gene contains BamHI and EcoRI restriction enzyme recognition sequences. While maintaining the amino acid sequence of luciferase, genetic modification was performed to remove these recognition sequences in these base sequences. This treatment was performed to facilitate the introduction of the luciferase gene described later into an expression vector. The introduction of gene mutation is shown in Taichi Yoshikazu's “Methods for Gene Function Inhibition—From Simple and Reliable Gene Function Analysis to Application to Gene Therapy” (Yodosha, 2001, p. 17-25) Followed the method. The sequence after mutagenesis is the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
１−２．野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入
ルシフェラーゼ遺伝子を、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクターの制限酵素サイトＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣを含むプライマー、並びに終始コドンおよびその後ろに制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列ＧＡＡＴＴＣを含むプライマーを作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｉｓ−（東洋紡績株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
1-2. Introduction of wild-type Okinawan firefly luciferase gene into gene expression vector In order to introduce the luciferase gene between the restriction enzyme sites BamHI and EcoRI of pRSET-B vector, a primer containing a restriction enzyme BamHI recognition sequence GGATCC in front of it, In addition, a primer containing a stop codon and a restriction enzyme EcoRI recognition sequence GAATTC behind it was prepared. Using this primer pair, a fragment containing the above-mentioned restriction enzyme recognition sites at both ends of the luciferase gene was amplified. PCR was performed using polymerase KOD-Plis- (Toyobo Co., Ltd.) according to the manual.
最終濃度が等倍の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が１．０ｍＭのＭｇＳＯ４、最終濃度が０．０２Ｕ／μｌのＴＯＹＯＢＯ ＫＯＤ−Ｐｌｉｓ−（１Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマー対を含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型としてＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ認識配列を持たないルシフェラーゼ遺伝子の溶液を０．４μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５５℃３０秒および６８℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に６８℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を通常のエタノール沈殿法により沈殿濃縮し、制限酵素処理用１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒを４μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡績株式会社）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績株式会社）を各２μｌならびに滅菌脱イオン水３２μｌを加えて溶解し、３７℃で２時間保温して制限酵素処理した。その後、この反応溶液をエタノール沈殿法により沈殿濃縮した後、滅菌脱イオン水に溶解した。この溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った。紫外線照射下において確認されるＤＮＡバンドを含むゲルを、ナイフを用いて切り出した。この切り出したゲルからＷｉｚａｒｄ（Ｒ） ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出した。これらの操作はマニュアルに従って実施した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｐａｃｋ（ニッポンジーン）をマニュアルに従って用いて、あらかじめ同様の方法で制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで処理したｐＲＳＥＴ−Ｂベクターに抽出したＤＮＡを導入した。このベクターＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換し、コロニーを形成させた。 10 × PCR Buffer with final concentration of 1 ×, final concentration of 0.2 mM dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration of 1.0 mM MgSO 4 , final concentration of 0.02 U / μl TOYOBO KOD− Prepare 20 μl of PCR reaction solution containing primer pair (1 U / μl) and final concentration of 0.3 μM respectively, and add 0.4 μl of luciferase gene solution without BamHI and EcoRI recognition sequence as template. It was. In the PCR reaction, after heat denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, 94 cycles of 30 ° C., 55 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 2 minutes were repeated 30 times, and finally, an extension reaction at 68 ° C. for 5 minutes was performed. After the PCR reaction, 1 μl of the PCR reaction solution was electrophoresed using a 1% TAE agarose gel. After ethidium bromide staining, the amplified gene band was observed under ultraviolet irradiation. Since gene amplification was confirmed, this PCR reaction solution was precipitated and concentrated by the usual ethanol precipitation method, 4 μl of 10 × H Buffer for restriction enzyme treatment, restriction enzyme BamHI (Toyobo Co., Ltd.) and restriction enzyme EcoRI (Toyobo Co., Ltd.) 2) each and 32 μl of sterilized deionized water were dissolved, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 2 hours for restriction enzyme treatment. Then, this reaction solution was precipitated and concentrated by an ethanol precipitation method and then dissolved in sterilized deionized water. This solution was electrophoresed using 1% TAE agarose gel and stained with ethidium bromide. A gel containing a DNA band confirmed under ultraviolet irradiation was cut out using a knife. DNA was extracted from this excised gel using Wizard (R) SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). These operations were performed according to the manual. Thereafter, using Ligation Pack (Nippon Gene) according to the manual, the extracted DNA was introduced into the pRSET-B vector previously treated with the restriction enzymes BamHI and EcoRI by the same method. This vector DNA was transformed into Escherichia coli JM109 (DE3) strain to form colonies.
得られたコロニーを鋳型としてダイレクトコロニーＰＣＲを実施し、ｐＲＳＥＴ−Ｂに導入したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。ダイレクトコロニーＰＣＲは、Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧ−３’：配列番号２７）およびＴ７ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＴＡ ＧＴＴ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＧＧ ＴＧＧ−３’：配列番号２８）のプライマー対を用いて行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマーを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。 Direct colony PCR was performed using the obtained colony as a template to amplify the luciferase gene introduced into pRSET-B. Direct colony PCR was performed using T7 promoter Primer (5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 ′: SEQ ID NO: 27) and T7 Reverse Primer (5′-CTA GTT ATT GCT CAG CGG TGG-3 ′: SEQ ID NO: 28). The primer pairs were used. Final concentration of 10 × Ex Taq Buffer (20 mM Mg 2+ plus), final concentration of 0.2 mM each dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration 0.05 U / μl TaKaRa Ex Taq (5 U / μl) and 10 μl of a PCR reaction solution containing primers each having a final concentration of 0.2 μM were prepared, and a small amount of E. coli colony was added thereto as a template. The PCR reaction was first heat-denatured at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 25 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes, and finally an extension reaction at 72 ° C. for 5 minutes. After the PCR reaction, 1 μl of the PCR reaction solution was electrophoresed using a 1% TAE agarose gel. After ethidium bromide staining, the amplified gene band was observed under ultraviolet irradiation.
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスには、ベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ ジェネティックアナライザを用いて塩基配列を読み取り、正常に遺伝子発現ベクターｐＲＳＥＴ−Ｂに導入されていることを確認した。 For the PCR reaction solution in which amplification was confirmed, the base sequence of the gene was determined using the direct sequencing method. Using PCR product purification kit ExoSAP-IT, excess dNTPs and primers contained in the PCR reaction solution were removed, and a template for PCR direct sequencing was prepared. Using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, a sequencing reaction solution containing this template was prepared, and a sequencing reaction was performed using a thermal cycler. For the sequencing, vector primers or gene-specific primers were used. PCR product purification and sequencing were performed according to the respective manuals. After the sequencing reaction, the reaction product was purified as follows. 2.5 times volume of 100% ethanol was added to the reaction solution, and nucleic acid was precipitated using a centrifuge. Next, after removing the supernatant, 70% ethanol was added to wash the precipitate, and the nucleic acid was precipitated using a centrifuge. Finally, after removing the upper fine, the precipitate was dried. To the purified precipitate, 15 μl of Hi-Di Formatide (Applied Biosystems) was added and dissolved. This solution was heat-denatured at 94 ° C. for 2 minutes and further rapidly cooled on ice to prepare a sample for determining the base sequence. The base sequence of this sample was read using an Applied Biosystems 3130xl genetic analyzer, and it was confirmed that the sample was normally introduced into the gene expression vector pRSET-B.
２．発光タンパク質の精製
ＪＭ１０９（ＤＥ３）を含む大腸菌溶液５０μｌにルシフェラーゼ発現ベクター０．５μｌを添加し、氷上で１０分、その後４２℃で１分、最後に氷上で２分インキュベートした。その後、大腸菌溶液５０μｌをＳＯＣ培地２００μｌに加えた。その大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル１００μｌをＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、５００ｍｌスケールのＬＢ培地で培養した。培養は３７℃で２４時間、１８℃で２４時間行った。合計４８時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム２ｍｌのカラムにＮｉ−Ａｇａｒ懸濁液５００μｌと０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ｍｌを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て４℃の条件で行った。２５ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液２ｍｌでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに５００ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２ｍｌ加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ６（ザルトリウス）で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、５０％グリセリン溶液とした。保存は−２０℃で行った。
2. Purification of photoprotein 0.5 μl of luciferase expression vector was added to 50 μl of E. coli solution containing JM109 (DE3), and incubated on ice for 10 minutes, then at 42 ° C. for 1 minute, and finally on ice for 2 minutes. Thereafter, 50 μl of E. coli solution was added to 200 μl of SOC medium. The E. coli / SOC medium mixed solution was incubated at 37 ° C. for 20 minutes with shaking. 100 μl of the incubated sample was streaked on an LB medium plate (containing 100 μg / ml ampicillin) and incubated overnight at 37 ° C. The colonies obtained the next day were picked up and cultured in a 500 ml scale LB medium. The culture was performed at 37 ° C. for 24 hours and at 18 ° C. for 24 hours. After a total of 48 hours of culture, the cells were collected by centrifugation, resuspended in a 0.1 M Tris-HCl solution (pH 8.0), and sonicated. The cell disruption solution was centrifuged (15000 rpm, 10 minutes), the sediment was removed, and the supernatant was recovered. To a column with a bed volume of 2 ml, 500 μl of Ni-Agar suspension and 2 ml of 0.1 M Tris-HCl were added to equilibrate the column. The collected supernatant was added to the column and allowed to fall naturally. All operations until the entire amount of the supernatant passed through the column were performed at 4 ° C. The column was washed with 2 ml of 25 mM imidazole / 0.1 M Tris-HCl solution. 2 ml of 500 mM imidazole / 0.1 M Tris-HCl solution was added to the washed column to elute luciferase. The eluted sample was filtered through a gel filtration column PD-10 (GE Healthcare) and desalted. The desalted sample was ultrafiltered with Vivaspin 6 (Sartorius), and glycerin was added to the concentrated sample to obtain a 50% glycerin solution. Storage was performed at -20 ° C.
３．発光スペクトルの測定
測定のための装置としてＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）を用い、０．１Ｍクエン酸／０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０−８．０）に１ｍＭ Ｄ−ルシフェリン、２ｍＭ ＡＴＰおよび４ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む溶液に、精製酵素を１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの間の最終濃度で添加し、酵素添加後１５秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図１に示す。
3. Measurement of emission spectrum LumiFl SpectroCapture (ATTO) was used as an apparatus for measurement, and 0.1 mM citric acid / 0.1 M Na 2 HPO 4 buffer (pH 6.0-8.0) was used with 1 mM D-luciferin, 2 mM ATP and 4 mM. The purified enzyme was added to the solution containing MgCl 2 at a final concentration between 1 μg / ml and 10 μg / ml, and the emission spectrum was measured when 15 seconds had elapsed after the addition of the enzyme. The measurement results are shown in FIG.
図１より、取得された野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼは、ｐＨ８．０の環境において、５６０ｎｍ付近に最大発光波長を示している。また、ｐＨ７．５において５６３ｎｍ付近、ｐＨ７．０において５７１ｎｍ付近（および６１０ｎｍ付近により小さなピーク）、ｐＨ６．５において６０８ｎｍ付近およびｐＨ６．０において６１２ｎｍ付近、ｐＨ５．５において６１３ｎｍ付近となった。 As shown in FIG. 1, the acquired wild-type Okinawa firefly luciferase has a maximum emission wavelength in the vicinity of 560 nm in an environment of pH 8.0. Further, it was around 563 nm at pH 7.5, around 571 nm at pH 7.0 (and a smaller peak near 610 nm), around 608 nm at pH 6.5, around 612 nm at pH 6.0, and around 613 nm at pH 5.5.
４．速度論的解析
４−１．Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰの濃度の決定
Ｄ−ルシフェリン溶液中のＤ−ルシフェリン濃度およびＡＴＰ溶液中のＡＴＰ濃度を以下の通りに決定した。
4). Kinetic analysis 4-1. Determination of D-luciferin and ATP concentrations The D-luciferin concentration in the D-luciferin solution and the ATP concentration in the ATP solution were determined as follows.
ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて、Ｄ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定し、この測定結果と以下のε値とから濃度を算出した。
Ｄ−ルシフェリン：λｍａｘ ３２８ｎｍ、ε１８２００、ｐＨ５．０
ＡＴＰ：λｍａｘ ２５９ｎｍ、ε１５４００、ｐＨ７．０。
Using a UV-Visible Spectrometer (Hitachi), the UV-visible absorption spectra of the D-luciferin solution and the ATP solution were measured, and the concentration was calculated from the measurement results and the following ε values.
D-luciferin: λ max 328 nm, ε18200, pH 5.0
ATP: λ max 259 nm, ε 15400, pH 7.0.
測定はそれぞれ１０回ずつ行い、吸光度の平均値を濃度算出に用いた。このように濃度を決定したＤ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液を用いて、以下のＫｍ値算出を行った。 Each measurement was performed 10 times, and the average value of absorbance was used for concentration calculation. The following Km value calculation was performed using the D-luciferin solution and the ATP solution thus determined.
４−２．Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍ値の測定
様々なＤ−ルシフェリン濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍ値を決定した。
4-2. Measurement of Km value for D-luciferin The intensity of luminescence by the obtained luciferase was measured under various D-luciferin concentrations. Based on the measurement results, the Km value for D-luciferin was determined.
Ｄ−ルシフェリンを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の１２種類のＤールシフェリン溶液を作製した。これらの溶液は、Ｄ−ルシフェリンの終濃度がそれぞれ０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、４８０および６４０μＭとなるようにＤ−ルシフェリンを含む。これらのＤ−ルシフェリン溶液を９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、４ｍＭ ＡＴＰおよび８ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を行った。測定にはＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を使用した。測定は各ルシフェリン濃度について３回ずつ行った。 D-luciferin was added to 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) to make 12 types of D-luciferin solutions with different concentrations. These solutions contain D-luciferin so that the final concentration of D-luciferin is 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 480 and 640 μM, respectively. Including. 50 μl of each of these D-luciferin solutions was dispensed into a 96-well microplate. A 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) solution containing various purified luciferases, 4 mM ATP and 8 mM MgSO 4 was connected to a standard pump of a luminometer, and 50 μl of the solution was added to the wells, and measurement was performed. Luminescence (ATTO) was used for the measurement. The measurement was performed three times for each luciferin concentration.
得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ルシフェリン濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。 The peak intensity of the photon count value obtained was plotted against the luciferin concentration S as the initial velocity V. This plot was subjected to Michaelis-Menten type curve fitting to calculate the Km value. Curve fitting was performed by a non-linear least square method, and Newton's method was used for parameter search.
４−３．ＡＴＰに対するＫｍ値の測定
様々なＡＴＰ濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ＡＴＰに対するＫｍ値を決定した。
4-3. Measurement of Km value for ATP The intensity of luminescence by the obtained luciferase was measured under various ATP concentration environments. Based on the measurement results, the Km value for ATP was determined.
ＡＴＰを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の１２種類のＡＴＰ溶液を作製した。これらの溶液は、ＡＴＰの終濃度がそれぞれ５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、４８０、６４０、８００、１２８０、１６００および１９２０μＭとなるようにＡＴＰを含む。これらのＡＴＰ溶液をそれぞれ９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、１ｍＭ Ｄ−ルシフェリン、８ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を行った。測定は各ＡＴＰ濃度について３回ずつ行った。 ATP was added to 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) to prepare 12 types of ATP solutions with different concentrations. These solutions contain ATP such that the final concentrations of ATP are 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 480, 640, 800, 1280, 1600 and 1920 μM, respectively. 50 μl of each ATP solution was dispensed into a 96-well microplate. A 0.1M Tris-HCl (pH 8.0) solution containing various purified luciferases, 1 mM D-luciferin, and 8 mM MgSO 4 was connected to a standard pump of a luminometer, and 50 μl of the solution was added to the wells for measurement. The measurement was performed three times for each ATP concentration.
得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ＡＴＰ濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。 The peak intensity of the obtained photon count value was plotted against the ATP concentration S as the initial velocity V. This plot was subjected to Michaelis-Menten type curve fitting to calculate the Km value. Curve fitting was performed by a non-linear least square method, and Newton's method was used for parameter search.
上記のようにして決定されたＤ−ルシフェリンに対するＫｍ値およびＡＴＰに対するＫｍ値を表１に示す。表１には、同様に測定した既知のルシフェラーゼの各Ｋｍ値も示される。ＧＬ３とは既知のホタル由来のルシフェラーゼである。また、ＥＬｕｃ、ＣＢＧおよびＣＢＲとは既知のコメツキムシ由来のルシフェラーゼである。これらの既知のルシフェラーゼは市販されるものを使用した。 Table 1 shows the Km value for D-luciferin and the Km value for ATP determined as described above. Table 1 also shows the Km values of known luciferases measured in the same manner. GL3 is a known firefly-derived luciferase. ELuc, CBG, and CBR are luciferases derived from known beetles. These known luciferases were used commercially.
さらに、これらの結果について、縦軸をＡＴＰに対するＫｍ値とし、横軸をＤ−ルシフェリンに対するＫｍ値としてプロットした図を、図２として示す。 Furthermore, about these results, the figure which plotted the vertical axis | shaft as Km value with respect to ATP and the horizontal axis | shaft as Km value with respect to D-luciferin is shown as FIG.
［実施例３：発光強度の測定］
野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼによる発光強度を、既知のルシフェラーゼおよびローダミン６Ｇによる発光強度と比較した。
[Example 3: Measurement of emission intensity]
The luminescence intensity by wild-type Okinawa firefly luciferase was compared with the luminescence intensity by known luciferase and rhodamine 6G.
１．ローダミン６Ｇによる化学発光の測定
ローダミン６Ｇを０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ４．０）溶液に溶解した。このローダミン６Ｇ溶液を１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液で１０００倍希釈し、希釈液の吸光度を測定した。測定はＮａｎｏＶｕｅ（ＧＥヘルスケア）で行った。測定は５３０ｎｍにおいて５回行い、その平均値として０．０４８の吸光度が得られた。ローダミン６Ｇのε値（１．１６ｘ１０５ｍｏｌ−１ｃｍ−１）を用いて元のローダミン６Ｇ溶液の濃度を算出した結果、４１４μＭであった。この溶液を０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ４．０）で希釈し、３０μＭの希釈液を作製した。
1. Measurement of chemiluminescence with rhodamine 6G Rhodamine 6G was dissolved in a 0.1 M citric acid / 0.2 M Na 2 HPO 4 (pH 4.0) solution. The rhodamine 6G solution was centrifuged at 15000 rpm for 1 minute, and the supernatant was recovered. The collected supernatant was diluted 1000 times with 0.1 M citric acid / 0.2 M Na 2 HPO 4 solution, and the absorbance of the diluted solution was measured. The measurement was performed with NanoVue (GE Healthcare). The measurement was performed 5 times at 530 nm, and an absorbance of 0.048 was obtained as an average value. As a result of calculating the concentration of the original rhodamine 6G solution using the ε value of rhodamine 6G (1.16 × 10 5 mol −1 cm −1 ), it was 414 μM. This solution was diluted with 0.1 M citric acid / 0.2 M Na 2 HPO 4 solution (pH 4.0) to prepare a 30 μM diluted solution.
この希釈液を使用して、以下の表２の通り溶液１を調製した。
Using this diluted solution,
また、ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキサレート（ＴＣＰＯ）をアセトニトリルに最終濃度３ｍＭとなるように溶解して溶液２を作製した。
Also, bis (2,4,6-trichlorophenyl) oxalate (TCPO) was dissolved in acetonitrile to a final concentration of 3 mM to prepare
溶液１を９６穴のマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。そこへ、ポンプを使用して溶液２を５０μｌ添加すると同時に測定を開始して、溶液２の添加から１０秒間のフォトンカウントの積算値を取得した。測定にはＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を使用し、３００ｎｍから６５０ｎｍの波長の光を取得した。同様の測定を１０回行った。
100 μl of
２．Ｐ．ピラリスルシフェラーゼおよび野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼによる化学発光の測定
ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を含む溶液５０μｌにルシフェラーゼ発現ベクターを含む溶液０．５μｌを添加し、氷上で１０分、４２℃で１分、氷上で２分インキュベートした。その後、この大腸菌溶液５０μｌをＳＯＣ培地２００μｌに加えた。大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル１００μｌをＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、できたコロニーをピックアップし、５００ｍｌスケールのＬＢ培地で培養した。培養は３７℃で２４時間、１８℃で２４時間行った。合計４８時間の培養の後、遠心分離によって菌体を回収し、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離し（１５０００ｒｐｍ、１０分間）、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム２ｍｌのカラムにＮｉ−Ａｇａｒ懸濁液５００μｌおよび０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液２ｍｌを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て４℃の条件で行った。２５ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液２ｍｌでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに５００ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２ｍｌ加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ６（ザルトリウス）で限界ろ過した。
2. P. Measurement of chemiluminescence by pyralis luciferase and wild-type Okinawan firefly luciferase 0.5 μl of a solution containing a luciferase expression vector was added to 50 μl of a solution containing JM109 (DE3) strain, and the mixture was added on ice for 10 minutes, at 42 ° C. for 1 minute, on ice Incubated for 2 minutes. Thereafter, 50 μl of this E. coli solution was added to 200 μl of SOC medium. The E. coli / SOC medium mixed solution was incubated at 37 ° C. for 20 minutes with shaking. 100 μl of the incubated sample was streaked on an LB medium plate (containing 100 μg / ml ampicillin) and incubated overnight at 37 ° C. On the next day, the resulting colonies were picked up and cultured in a 500 ml scale LB medium. The culture was performed at 37 ° C. for 24 hours and at 18 ° C. for 24 hours. After a total of 48 hours of culture, the cells were collected by centrifugation, resuspended in 0.1 M Tris-HCl solution (pH 8.0) and sonicated. The cell disruption solution was centrifuged (15000 rpm, 10 minutes), the sediment was removed, and the supernatant was collected. To the column with a bed volume of 2 ml, 500 μl of Ni-Agar suspension and 2 ml of 0.1 M Tris-HCl solution were added to equilibrate the column. The collected supernatant was added to the column and allowed to fall naturally. All operations until the entire amount of the supernatant passed through the column were performed at 4 ° C. The column was washed with 2 ml of 25 mM imidazole / 0.1 M Tris-HCl solution. 2 ml of 500 mM imidazole / 0.1 M Tris-HCl solution was added to the washed column to elute luciferase. The eluted sample was filtered through a gel filtration column PD-10 (GE Healthcare) and desalted. The sample after desalting was ultrafiltered with Vivaspin 6 (Sartorius).
得られたサンプルの濃度を比色法で測定し、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼおよび野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼの濃度を確認した。最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように上記ルシフェラーゼを０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）に希釈した。 The density of the obtained sample was measured by a colorimetric method. The concentrations of pyralis luciferase and wild-type Okinawa firefly luciferase were confirmed. The luciferase was diluted in 0.1 M citrate / 0.2 M Na 2 HPO 4 (pH 8.0) so that the final concentration was 1 μg / ml.
このルシフェラーゼ溶液を５０μｌずつ９６穴マイクロプレートに分注した。２ｍＭ Ｄ−ルシフェリン、４ｍＭ ＡＴＰおよび８ｍＭ ＭｇＳＯ４／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む溶液をルミノメーターの標準ポンプによって５０μｌ添加し、添加と同時に測定を行った。溶液の添加から１０秒間のフォトンカウントの積算値を取得した。測定にはＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を使用し、３００ｎｍから６５０ｎｍの波長の光を取得した。各測定は６回行った。 50 μl of this luciferase solution was dispensed into a 96-well microplate. 50 μl of a solution containing 2 mM D-luciferin, 4 mM ATP, and 8 mM MgSO 4 /0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) was added using a standard pump of a luminometer, and measurement was performed simultaneously with the addition. The integrated value of the photon count for 10 seconds from the addition of the solution was obtained. Luminescence (ATTO) was used for the measurement, and light having a wavelength of 300 nm to 650 nm was obtained. Each measurement was performed 6 times.
３．測定結果
以上のように測定したローダミン６Ｇ、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼおよび野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼによる化学発光の強度を図３に示す。
3. Measurement results Rhodamine 6G, P.I. FIG. 3 shows the intensity of chemiluminescence by pyralis luciferase and wild-type Okinawa firefly luciferase.
図３から、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼは、ローダミン６Ｇによる発光の２４．４倍の強度の発光を示すことがわかった。また、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼは、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光の５倍の強度の発光を示すことがわかった。 From FIG. 3, it was found that wild-type Okinawa firefly luciferase exhibits luminescence with an intensity 24.4 times that emitted by rhodamine 6G. Wild-type Okinawa firefly luciferase can It was found that the light emitted was five times stronger than that emitted by pyralis luciferase.
［実施例４：哺乳細胞における野生型オキナワマドボタルシフェラーゼの発現］
オキナワマドボタルをＨｅＬａ細胞に発現させて、細胞内での発光強度を測定した。
[Example 4: Expression of wild-type Okinawa firefly luciferase in mammalian cells]
Okinawa firefly was expressed in HeLa cells, and the luminescence intensity in the cells was measured.
オキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子の導入のために２種類の発現ベクターを作製した。オキナワマドボタルから取得したオリジナルのオキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子においてＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列を削除した遺伝子（配列番号３）、さらに哺乳細胞における発現に最適化した遺伝子（配列番号４）をそれぞれ含む核酸を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩのサイト間に挿入した。また、比較のために、既知であるＰ．ピラリスルシフェラーゼの遺伝子について哺乳細胞における発現に最適化させた遺伝子を含む核酸を、同様にｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに挿入した。 Two types of expression vectors were prepared for introduction of the Okinawa firefly luciferase gene. A nucleic acid containing the gene obtained by deleting the recognition sequence of BamHI and EcoRI (SEQ ID NO: 3) in the original Okinawa firefly luciferase gene obtained from Okinawad firefly, and the gene optimized for expression in mammalian cells (SEQ ID NO: 4), pcDNA3 Inserted between the BamHI and EcoRI sites of the multiple cloning site of the .1 (+) vector (Invitrogen). For comparison, the known P.I. A nucleic acid containing a gene optimized for expression in mammalian cells with respect to the gene for pyralis luciferase was similarly inserted into the pcDNA3.1 (+) vector.
このようにして得られた３種のプラスミドを、それぞれリポフェクション法によってＨｅＬａ細胞に遺伝子導入し、２４時間後Ｄ−ＭＥＭ培地を交換した。測定直前にＤ−ルシフェリンを最終濃度１ｍＭで添加し、Ｋｒｏｎｏｓ（ＡＴＴＯ）を用いて発光強度を測定した。その結果を図４に示す。なお、図４に示される発光強度は１０秒間の積算値を示している。 The three types of plasmids thus obtained were each transfected into HeLa cells by the lipofection method, and the D-MEM medium was replaced after 24 hours. Immediately before the measurement, D-luciferin was added at a final concentration of 1 mM, and the luminescence intensity was measured using Kronos (ATTO). The result is shown in FIG. In addition, the emitted light intensity shown in FIG. 4 has shown the integrated value for 10 seconds.
図４から、オキナワマドボタルルシフェラーゼのコドンの最適化によって、ＨｅＬａ細胞で発現させた場合の発光強度が２７倍増大することがわかる。また、コドン最適化後のオキナワマドボタルルシフェラーゼはコドン最適化後のＰ．ピラリスルシフェラーゼより３．４倍の発光強度を示した。 FIG. 4 shows that the emission intensity when expressed in HeLa cells is increased 27-fold by optimizing the codon of Okinawa firefly luciferase. Further, Okinawa codon luciferase after codon optimization is the same as P. pylori after codon optimization. The emission intensity was 3.4 times that of pyraris luciferase.
［実施例５：変異型オキナワマドボタルルシフェラーゼの作製］ [Example 5: Production of mutant Okinawa luciferase]
変異型オキナワマドボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。 A mutant gene expressing mutant Okinawa luciferase was prepared.
哺乳細胞における発現に最適化した遺伝子（配列番号４）に対し、次の５種の変異を任意の組合せで導入した。 The following five types of mutations were introduced in any combination to the gene (SEQ ID NO: 4) optimized for expression in mammalian cells.
アミノ酸配列上４２４番目のイソロイシンをロイシンに置換する変異（Ｉ４２４Ｌ）
アミノ酸配列上５３１番目のイソロイシンをアルギニンに置換する変異（Ｉ５３１Ｒ）
アミノ酸配列上３５５番目のグルタミン酸をアルギニンに置換する変異（Ｅ３５５Ｒ）
アミノ酸配列上３６７番目のバリンをアラニンに置換する変異（Ｖ３６７Ａ）
アミノ酸配列上４４６番目のリシンをグルタミンに置換する変異（Ｋ４４６Ｑ）
Mutation that replaces 424th isoleucine with leucine in the amino acid sequence (I424L)
Mutation that replaces the 531st isoleucine with arginine in the amino acid sequence (I531R)
Mutation that replaces the 355th glutamic acid in the amino acid sequence with arginine (E355R)
Mutation that replaces the 367th valine in the amino acid sequence with alanine (V367A)
Mutation that replaces 446th lysine with glutamine in the amino acid sequence (K446Q)
それぞれの変異の導入のために、以下の５種のプライマーを用いた。
Ｉ４２４Ｌ変異：ＯｋｉｎａｗａＭａｄｏ＿Ｉ４２４Ｌ（ＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＴＣＡＧＧＣＧＡＴｃＴｇＧＣＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＡＡＧＧＡＣＧＧＣ：配列番号２９）
Ｉ５３１Ｒ変異：ＯｋｉｎａｗａＭａｄｏ＿Ｉ５３１Ｒ（ＣＣＣＡＡＡＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＧＣＡＡＧＡｇａＧＡＣＴＣＴＣＧＡＡＡＡＡＴＴＣＧＡＧＡＡ：配列番号３０）
Ｅ３５５Ｒ変異：ＯｋｉｎａｗａＭａｄｏ＿Ｅ３５５Ｒ（ＡＧＴＧＣＡＧＴＡＡＴＣＡＴＴＡＣＴＣＣＡａｇＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣ：配列番号３１）
Ｖ３６７Ａ変異：ＯｋｉｎａｗａＭａｄｏ＿Ｖ３６７Ａ（ＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＣＡＡＧＧＴＣＧｃＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧ：配列番号３２）
Ｋ４４６Ｑ変異：ＯｋｉｎａｗａＭａｄｏ＿Ｋ４４６Ｑ（ＣＴＧＡＡＡＡＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＡＣｃＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡ：配列番号３３）
The following 5 types of primers were used for introduction of each mutation.
I424L mutation: OkinawaMado_I424L (GGCTGGCTGCATTCAGGCGATcTgGCTCACTACTGATAAGGACGGC: SEQ ID NO: 29)
I531R mutation: OkinawaMado_I531R (CCCAAAGGTCTCACAGGCAAGAgaGACTCTCGAAAAATCTCGAGAA: SEQ ID NO: 30)
E355R mutation: OkinawaMado_E355R (AGTGCAGTAATCATTACTCCAagGGGCGACGACAAACCAGGAGCCC: SEQ ID NO: 31)
V367A mutation: OkinawaMado_V367A (CCAGGAGCTCTGCGCAAGGTCGcCCCTTCTTTTCCGCCAAAATTGTTG: SEQ ID NO: 32)
K446Q mutation: OkinawaMado_K446Q (CTGAAAAGTCTGATCAAGTACcAGGGCTACCAGGTGCCCACCTGCA: SEQ ID NO: 33)
変異の導入は文献の記載に基づいて行った（Ａｓａｋｏ Ｓａｗａｎｏ ａｎｄ Ａｔｓｕｓｈｉ Ｍｉｙａｗａｋｉ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００， Ｖｏｌ．２８， Ｎｏ．１６）。変異導入後にシーケンサーを用いて配列を読み取り、目的とする変異がオキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子に導入されていることを確認した。 Mutation was introduced based on the description in the literature (Asako Sawano and Atsushi Miyawaki, Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 16). After introducing the mutation, the sequence was read using a sequencer, and it was confirmed that the target mutation was introduced into the Okinawad firefly luciferase gene.
作製した種々の変異型オキナワマドボタルルシフェラーゼのうち２種類（変異体１および変異体２と称する）に着目した。これらは、それぞれ以下の変異を有する。
Of the various mutant Okinawa firefly luciferases prepared, attention was paid to two types (referred to as
変異体１：Ｉ４２４Ｌ、Ｅ３５５Ｒ、Ｖ３６７ＡおよびＫ４４６Ｑ
変異体２：Ｉ４２４Ｌ、Ｉ５３１Ｒ、Ｅ３５５Ｒ、Ｖ３６７ＡおよびＫ４４６Ｑ
変異体１のアミノ酸配列は配列番号３６に記載され、変異体１をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号３４に記載される。また、変異体２のアミノ酸配列は配列番号３７に記載され、変異体２をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号３５に記載される。
Variant 1: I424L, E355R, V367A and K446Q
Variant 2: I424L, I531R, E355R, V367A and K446Q
The amino acid sequence of
次に、変異体１および２による発光強度について、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼと比較した。
Next, the luminescence intensity of
野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸（配列番号４）、変異体１の遺伝子を含む核酸（配列番号３４）および変異体２の遺伝子を含む核酸（配列番号３５）に対してＫｏｚａｋ配列を付与した。なお、３種の配列とも哺乳細胞における発現に対してコドン最適化されている。その後、ｐＦ９Ａ ＣＭＶ ｈＲＬｕｃ ｎｅｏ Ｆｌｅｘｉ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。ｐＦ９Ａベクターは内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲＬｕｃ）をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度との比として算出することが可能である。
A Kozak sequence is added to a nucleic acid (SEQ ID NO: 4) containing a wild-type Okinawan firefly luciferase gene, a nucleic acid containing a
得られた３種のプラスミドを、２４穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２４時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。２４穴プレートの各ウェルに２ｍＭ Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ２ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５００μｌずつ添加し、２５℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて１２０分間発光強度を測定した。９０分経過時点の発光強度を野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ、変異体１および変異体２の発光強度とした。各ウェル内の培養液を除去した後、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄した。次に各ウェルに１０μＭセレンテラジン／ＣＯ２ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍを５００μｌずつ添加し、２５℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて３０分間発光強度を測定した。セレンテラジン添加後、１０分経過時点の発光強度を内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度とした。野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ、変異体１および変異体２による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。
The obtained three types of plasmids were each transfected into HeLa cells seeded in a 24-well plate by the lipofection method, and after 24 hours, the cells were washed with PBS. 500 μl of 2 mM D-luciferin / CO 2 Independent Medium (Invitrogen) was added to each well of a 24-well plate, and the luminescence intensity was measured for 120 minutes using a Luminescence (ATTO) at 25 ° C. for 1 second per well. did. The luminescence intensity after 90 minutes was defined as the luminescence intensity of wild type Okinawa firefly luciferase,
図５には、Ｄ−ルシフェリン添加直後から１２０分経過時点までにおける、各細胞中のオキナワマドボタルルシフェラーゼによる発光強度の時間変化が示される。図６には、セレンテラジン添加直後から３０分経過時点までにおける、各細胞中のウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度の時間変化が示される。図７には、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ、変異体１および変異体２による９０分経過時点における発光強度を、内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる１０分経過時点における発光強度でそれぞれ除算して得られた発光強度比を示す。
FIG. 5 shows the time change of the luminescence intensity by Okinawa firefly luciferase in each cell from the time immediately after the addition of D-luciferin to 120 minutes. FIG. 6 shows the time change of the luminescence intensity by Renilla luciferase in each cell immediately after the addition of coelenterazine until 30 minutes have passed. FIG. 7 is obtained by dividing the luminescence intensity at 90 minutes by wild-type Okinawan firefly luciferase,
図７に示されるように、変異体１によって得られた発光強度は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼによる発光強度と比較して４．２倍高かった。変異体２によって得られた発光強度は、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼによる発光強度と比較して２．４倍高かった。変異の導入によってオキナワマドボタルルシフェラーゼの発光強度が増大することが示された。
As shown in FIG. 7, the luminescence intensity obtained by the
Claims (9)
配列番号１に記載されるアミノ酸配列の４２４番目のイソロイシンに対応するアミノ酸残基がロイシンであること、
配列番号１に記載されるアミノ酸配列の５３１番目のイソロイシンに対応するアミノ酸残基がアルギニンであること、
配列番号１に記載されるアミノ酸配列の３５５番目のグルタミン酸に対応するアミノ酸残基がアルギニンであること、
配列番号１に記載されるアミノ酸配列の３６７番目のバリンに対応するアミノ酸残基がアラニンであること、および
配列番号１に記載されるアミノ酸配列の４４６番目のリシンに対応するアミノ酸残基がグルタミンであること
の少なくとも１つを満足するアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼ。 The mutant luciferase according to any one of claims 1 to 4,
The amino acid residue corresponding to the 424th isoleucine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is leucine,
The amino acid residue corresponding to the 531st isoleucine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is arginine;
The amino acid residue corresponding to the 355th glutamic acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is arginine;
The amino acid residue corresponding to the 367th valine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is alanine, and the amino acid residue corresponding to the 446th lysine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is glutamine. A mutant luciferase having an amino acid sequence satisfying at least one of the above.
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