JP2012200204A - Flounder rhabdovirus connectivity aptamer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒラメラブドウイルス（HIRRV）に結合するHIRRV結合性核酸アプタマー、それを含むHIRRV病の治療・予防用医薬組成物及びラブドウイルス病検出方法に関する。 The present invention relates to a HIRRV-binding nucleic acid aptamer that binds to lamellabudovirus (HIRRV), a pharmaceutical composition for treatment / prevention of HIRRV disease containing the same, and a rhabdovirus disease detection method.
ヒラメラブドウイルス病は、1984年に日本の養殖ヒラメ（Paralichthys olivaceus）において最初に発生したウイルスによる感染症である。その原因ウイルスは、1本鎖RNAの棒状を呈するウイルスで、ラブドウイルス（Rhabdovirus）科ノビラブドウイルス（Novirhabdovirus）属に属する。サケ科魚類の伝染性造血器壊死症ウイルス(IHNV)や出血性敗血症ウイルス(VHSV：viral hemorrhagic septisemia virus)と同科同属に分類されるが、それらのウイルスとは遺伝子型が明確に異なり、ヒラメで発見された経緯からヒラメラブドウイルス（Hirame rhabdovirus: HIRRV又はHRV；本明細書では、以下、しばしば「HIRRV」とする）と呼ばれている。HIRRVは、15〜20℃でよく増殖し、熱には非常に弱いが、低温には強く、冷凍下(-20℃以下)でも生存している。それ故、比較的に低水温時期に発生しやすい。 The flounder virus disease is an infection caused by a virus that first occurred in Japanese cultured flounder (Paralichthys olivaceus) in 1984. The causative virus is a single-stranded RNA rod-shaped virus belonging to the genus Novirhabdovirus of the Rhabdovirus family. It is classified as the same family as salmonid infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) and hemorrhagic sepsis virus (VHSV), but the genotype is clearly different from these viruses, and flounder Is called the Hirame rhabdovirus (HIRRV or HRV; hereinafter, often referred to as “HIRRV”). HIRRV grows well at 15-20 ° C and is very sensitive to heat, but strong at low temperatures and survives under freezing (below -20 ° C). Therefore, it is likely to occur at a relatively low water temperature period.
HIRRVによる感染症は、外部所見では、稚魚において脊椎骨周辺、筋肉内及び鰭基部に点状出血又は脳の出血が見られ、育成魚においては体表や鰭の充出血、腹部膨満が見られる。また、内部所見では、腹水の貯留や生殖腺の著しい充出血、筋肉内の強い出血等が観察される。死亡率は、数パーセントから高い場合には90％を超える。HIRRVによる感染症は、これまでヒラメの他、アユ、ニジマス、メバル、クロダイ等においても報告されている（非特許文献１）。いずれも水産資源上重要な魚種であるが、さらなる重要な魚種にも感染が拡大する可能性があり、本ウイルスによるパンデミックな感染を防止するためにも早急な防除方法が求められている。 As for infections caused by HIRRV, external findings include punctate or cerebral hemorrhage around the vertebrae, in the muscles and at the base of the pupae in fry fish, and full bleeding and abdominal bloating in the growing fish. Internal findings include ascites accumulation, significant gonad bleeding, and strong intramuscular bleeding. Mortality rates range from a few percent to over 90%. Infectious diseases caused by HIRRV have been reported so far in flatfish, sweetfish, rainbow trout, rockfish, black sea bream and the like (Non-patent Document 1). Both are important fish species in terms of aquatic resources, but there is a possibility that infection will spread to even more important fish species, and an immediate control method is required to prevent pandemic infection caused by this virus. .
HIRRV病の予防策としては、現在までのところ、有機ヨード剤や紫外線による消毒と飼育水温を15℃以下に保つことが知られている（非特許文献２）。しかし、該方法は、十分な感染抑制効果があるとは言い難く、また、すでに感染した個体に対しては有効な治療・抑制法とは言えないため、感染個体を介して、その周辺水域の個体にさらに伝播する可能性がある。 As a preventive measure against HIRRV disease, it has been known so far to disinfect organic iodine or ultraviolet light and keep the breeding water temperature at 15 ° C. or lower (Non-patent Document 2). However, it is difficult to say that this method has a sufficient infection-suppressing effect, and it cannot be said that it is an effective treatment / suppression method for an already infected individual. There is a possibility of further transmission to the individual.
非特許文献３にはHIRRVに対するDNAワクチンの発明が開示されている。このDNAワクチンは、HIRRVの糖タンパク質をコードする遺伝子DNAからなるワクチンで、対象とする個体に投与することによって、その個体のHIRRVに対する防御免疫を刺激し、HIRRV防御能を個体に付与することができる点において優れている。また、DNAワクチンは、ペプチドワクチンよりも高温下においても比較的安定で、長期貯蔵が可能であり、遺伝学的手法により迅速な改良が容易にできることや、ワクチン開発に必要な時間を短縮できるという利点を有する。実際に、このような糖タンパク質をコードするDNAワクチンが高いワクチン効果を示すことが明らかにされている（非特許文献４）。しかし、DNAワクチンには即効性がなく、接種後約2週間以降でなければ防御効果が現れないという欠点がある。さらに、抗原をコードする遺伝子組換えプラスミドDNAを持つトランスジェニック魚は、食用魚として安全性の面でも問題があった。 Non-Patent Document 3 discloses an invention of a DNA vaccine against HIRRV. This DNA vaccine is a vaccine consisting of a genetic DNA encoding HIRRV glycoprotein. When administered to a target individual, it stimulates the individual's protective immunity against HIRRV and imparts HIRRV protective ability to the individual. It is excellent in that it can be done. In addition, DNA vaccines are relatively stable at higher temperatures than peptide vaccines and can be stored for a long period of time. They can be easily improved quickly by genetic methods, and the time required for vaccine development can be shortened. Have advantages. In fact, it has been clarified that a DNA vaccine encoding such a glycoprotein exhibits a high vaccine effect (Non-patent Document 4). However, DNA vaccines are not immediately effective and have the disadvantage that they do not show a protective effect until about 2 weeks after inoculation. Furthermore, the transgenic fish having the recombinant plasmid DNA encoding the antigen has a problem in terms of safety as an edible fish.
本発明の課題は、HIRRVの感染を予防及び治療することのできる医薬組成物及び方法、HIRRVを特定の水域から除去する装置及びそれを用いた除去方法、並びにHIRRVを簡便かつ高感度に検出するための方法及びキットを開発し、提供することである。 An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition and method capable of preventing and treating HIRRV infection, an apparatus for removing HIRRV from a specific water area, a removal method using the same, and detecting HIRRV simply and with high sensitivity. To develop and provide a method and kit for the purpose.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、HIRRVの感染を抑制できるHIRRV結合性核酸アプタマーの開発に成功した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have succeeded in developing a HIRRV-binding nucleic acid aptamer capable of suppressing HIRRV infection.
本発明は、前記核酸アプタマーに基づくものであり、以下を提供するものである。
（１）ヒラメラブドウイルス（HIRRV）及び／又は該ウイルスで発現するポリペプチドに結合し、HIRRVの宿主感染能を抑制する活性を有するHIRRV結合性核酸アプタマー。
（２）核酸がRNAである、（１）に記載のHIRRV結合性核酸アプタマー。
（３）配列番号１〜６のいずれかで示される塩基配列を含む、（１）又は（２）に記載のHIRRV結合性核酸アプタマー。
（４）前記（２）又は（３）に記載のHIRRV結合性核酸アプタマーをコードするDNA。
（５）前記（４）に記載のDNAを発現可能な状態で含む発現ベクター。
（６）前記（５）に記載の発現ベクターを発現宿主内に導入した形質転換体又はその後代。
（７）発現宿主が微生物又は魚類である、（６）に記載の形質転換体又はその後代。
（８）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のHIRRV結合性核酸アプタマー及び／又は前記（７）に記載の微生物形質転換体又はその後代並びに濾材を含む濾過槽を備えたHIRRV及び／又は該ウイルスで発現するポリペプチドの除去装置。
（９）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のHIRRV結合性核酸アプタマー及び／又は前記（７）に記載の微生物形質転換体又はその後代並びに濾材を含む濾過槽に特定の水域の水を通過させて、該特定の水域の水からHIRRV及び／又は該ウイルスで発現するポリペプチドを除去する方法。
（１０）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のHIRRV結合性核酸アプタマー又は（５）に記載の発現ベクター及び製薬上許容可能な担体を含むヒラメラブドウイルス病を治療又は予防するための医薬組成物。
（１１）前記（１０）に記載の医薬組成物を魚類に投与してHIRRV病を治療又は予防する方法。
（１２）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のHIRRV結合性核酸アプタマーを用いてHIRRV及び／又は該ウイルスで発現するポリペプチドを検出する方法。
（１３）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のHIRRV結合性核酸アプタマーを含む、HIRRV及び／又は該ウイルスで発現するポリペプチドを検出するためのHIRRV検出キット。
The present invention is based on the nucleic acid aptamer and provides the following.
(1) A HIRRV-binding nucleic acid aptamer that binds to lamellabudovirus (HIRRV) and / or a polypeptide expressed in the virus and has an activity of suppressing the host infectivity of HIRRV.
(2) The HIRRV-binding nucleic acid aptamer according to (1), wherein the nucleic acid is RNA.
(3) The HIRRV-binding nucleic acid aptamer according to (1) or (2), comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 6.
(4) DNA encoding the HIRRV-binding nucleic acid aptamer according to (2) or (3).
(5) An expression vector comprising the DNA according to (4) in a state capable of being expressed.
(6) A transformant or its progeny obtained by introducing the expression vector according to (5) above into an expression host.
(7) The transformant or its progeny according to (6), wherein the expression host is a microorganism or fish.
(8) HIRRV comprising a filtration tank containing the HIRRV-binding nucleic acid aptamer according to any one of (1) to (3) and / or the microbial transformant or progeny thereof according to (7) and a filter medium; An apparatus for removing polypeptides expressed in the virus.
(9) The HIRRV-binding nucleic acid aptamer according to any one of (1) to (3) and / or the microorganism transformant according to (7) or a progeny thereof, and a filtration tank containing a filter medium, A method of removing the polypeptide expressed by HIRRV and / or the virus from the water in the specific water region by passing water.
(10) In order to treat or prevent HIRRV-binding nucleic acid aptamers according to any one of (1) to (3) above or the lamellabudovirus disease comprising the expression vector according to (5) and a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical composition.
(11) A method for treating or preventing HIRRV disease by administering the pharmaceutical composition according to (10) to fish.
(12) A method for detecting HIRRV and / or a polypeptide expressed in the virus, using the HIRRV-binding nucleic acid aptamer according to any one of (1) to (3).
(13) A HIRRV detection kit for detecting HIRRV and / or a polypeptide expressed in the virus, comprising the HIRRV-binding nucleic acid aptamer according to any one of (1) to (3).
本発明のHIRRV結合性核酸アプタマーによれば、HIRRVの宿主感染能を抑制できる分子標的薬又はHIRRVを高感度に検出するための検出マーカーを提供することができる。 According to the HIRRV-binding nucleic acid aptamer of the present invention, a molecular target drug capable of suppressing the host infectivity of HIRRV or a detection marker for detecting HIRRV with high sensitivity can be provided.
本発明の医薬組成物によれば、魚類、特に水産資源として重要な魚種におけるHIRRVの感染予防又は治療を行うことができる。 According to the pharmaceutical composition of the present invention, it is possible to prevent or treat HIRRV infection in fish, particularly fish species important as marine resources.
本発明のHIRRV除去方法によれば、特定の水域からHIRRVを除去し、HIRRV感染のおそれの低い安全な水域を提供することができる。 According to the HIRRV removal method of the present invention, HIRRV can be removed from a specific water area, and a safe water area with a low risk of HIRRV infection can be provided.
本発明のHIRRV検出方法によれば、高感度にHIRRVを検出することができる。
本発明のHIRRV検出キットによれば、簡便かつ高感度にHIRRVを検出することができる。
According to the HIRRV detection method of the present invention, HIRRV can be detected with high sensitivity.
According to the HIRRV detection kit of the present invention, HIRRV can be detected simply and with high sensitivity.
１．HIRRV結合性核酸アプタマー
本発明の第１の実施形態は、HIRRV結合性核酸アプタマーである。本発明のHIRRV結合性核酸アプタマーは、ヒラメラブドウイルス（HIRRV）及び／又は該ウイルスで発現するポリペプチドに結合し、宿主感染能を抑制する活性を有することを特徴とする。
1. HIRRV-binding nucleic acid aptamer The first embodiment of the present invention is a HIRRV-binding nucleic acid aptamer. The HIRRV-binding nucleic acid aptamer of the present invention is characterized in that it has an activity of binding to Hiramerabud virus (HIRRV) and / or a polypeptide expressed in the virus and suppressing host infectivity.
「アプタマー」とは、標的物質と特異的に結合する能力を持ったリガンド分子であり、その分子の種類により、核酸アプタマーとペプチドアプタマーに大別することができる。いずれのアプタマーも、その分子が有する立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の機能を特異的に抑制する。標的物質と直接結合し、細胞外でも作用させることが可能という点においては、抗体と同様の作用効果を有するが、アプタマーは、通常、標的物質に対する特異性及び親和性が抗体よりも高く、また、結合に必要な標的のアミノ酸残基数が抗体のそれと比較して少なくてもよいことから、近縁の分子どうしを識別できる点で抗体よりも優れている。そのため、近縁のタンパク質又は微生物における亜型や株を識別する上で抗体よりも有用である。さらに、免疫原性や毒性が抗体よりも低い上に、3〜4週間程度の短期間で作製できる他、化学合成により大量に製造することもできるという利点をもつ。アプタマーは公知の技術であり、詳細に関しては、例えば、Sumedha D. Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45:1628-1650に記載の方法を参照すればよい。 An “aptamer” is a ligand molecule having the ability to specifically bind to a target substance, and can be roughly classified into a nucleic acid aptamer and a peptide aptamer depending on the type of the molecule. Any aptamer binds firmly and specifically to the target substance due to the three-dimensional structure of the molecule, and specifically inhibits the function of the target substance. Although it has the same effect as an antibody in that it can directly bind to a target substance and act outside the cell, aptamers usually have higher specificity and affinity for target substances than antibodies. Since the number of target amino acid residues necessary for binding may be smaller than that of an antibody, it is superior to an antibody in that it can distinguish closely related molecules. Therefore, it is more useful than antibodies in identifying closely related proteins or subtypes and strains in microorganisms. Furthermore, it has the advantages that it is less immunogenic and toxic than an antibody, and can be produced in a short period of about 3 to 4 weeks, and can be produced in large quantities by chemical synthesis. Aptamers are a known technique, and for details, for example, the method described in Sumedha D. Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45: 1628-1650 may be referred to.
本発明のHIRRV結合性核酸アプタマーは、核酸で構成される核酸アプタマーである。アプタマーを構成する核酸は、DNA、RNA又はそれらの組合せのいずれであってもよい。好ましくはRNAで構成されるRNAアプタマーである。一般に、RNAはDNAと比較して、より多くの立体構造を形成できるからである。また、本発明のHIRRV結合性核酸アプタマーは、必要に応じて、PNA(Peptide Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid;登録商標)／BNA（Bridge Nucleic Acid）、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等の化学修飾核酸や擬似核酸を含むこともできる。核酸アプタマーは、通常、1本鎖核酸が水素結合等を介した二次元構造、さらに三次元立体構造を形成し、その立体構造等に基づいて標的物質（例えば、ポリペプチド）と強固に、かつ特異的に結合することによって、標的物質の生理活性を抑制することができる。なお、本明細書では、RNAで構成されるHIRRV結合性核酸アプタマーを以降「HIRRV結合性RNAアプタマー」と呼ぶ。 The HIRRV-binding nucleic acid aptamer of the present invention is a nucleic acid aptamer composed of nucleic acids. The nucleic acid constituting the aptamer may be any of DNA, RNA, or a combination thereof. An RNA aptamer composed of RNA is preferable. This is because RNA generally can form more three-dimensional structures than DNA. Further, the HIRRV-binding nucleic acid aptamer of the present invention may contain, as necessary, PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid; registered trademark) / BNA (Bridge Nucleic Acid), methylphosphonate DNA, phosphorothioate DNA, Chemically modified nucleic acids such as 2′-O-methyl RNA and pseudo-nucleic acids can also be included. Nucleic acid aptamers generally have a single-stranded nucleic acid that forms a two-dimensional structure through hydrogen bonding or the like, and further a three-dimensional three-dimensional structure. Based on the three-dimensional structure and the like, By binding specifically, the physiological activity of the target substance can be suppressed. In the present specification, the HIRRV-binding nucleic acid aptamer composed of RNA is hereinafter referred to as “HIRRV-binding RNA aptamer”.
本発明のHIRRV結合性核酸アプタマーは、必要に応じて標識されていてもよい。標識は当該分野で公知のあらゆる核酸用標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。このような標識物質で標識されたHIRRV結合性核酸アプタマーは、後述するHIRRV検出方法において、HIRRVと結合した該アプタマーを検出する際に有用なツールとなり得る。 The HIRRV-binding nucleic acid aptamer of the present invention may be labeled as necessary. As the label, any nucleic acid labeling substance known in the art can be used. For example, radioisotopes (eg, 32 P, 3 H, 14 C), DIG, biotin, fluorescent dyes (eg, FITC, Texas, cy3, cy5, cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493 , NBD, TAMRA), or a luminescent substance (for example, acridinium ester). The HIRRV-binding nucleic acid aptamer labeled with such a labeling substance can be a useful tool for detecting the aptamer bound to HIRRV in the HIRRV detection method described later.
本発明のHIRRV結合性核酸アプタマーが結合する標的物質は、HIRRV及び／又は該ウイルスで発現するポリペプチドである。 The target substance to which the HIRRV-binding nucleic acid aptamer of the present invention binds is HIRRV and / or a polypeptide expressed in the virus.
本明細書において「HIRRVで発現するポリペプチド」とは、HIRRVのゲノム上にコードされるHIRRV特異的なタンパク質の全部又はその一部をいう。例えば、HIRRVの膜タンパク質又はその一部である。また、ここでいう「一部」とは、HIRRV特異的なタンパク質の断片であって、HIRRVが有する感染能を保持するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。 In the present specification, the “polypeptide expressed by HIRRV” refers to all or a part of a HIRRV-specific protein encoded on the HIRRV genome. For example, it is a membrane protein of HIRRV or a part thereof. The “part” herein is a fragment of a protein specific to HIRRV, and is a polypeptide having an amino acid sequence that retains the infectivity of HIRRV.
本態様において「宿主」とは、HIRRVの感染対象となる宿主生物であって、一般的には魚類、例えば、サケ科（Salmonidae）、アユ科、ヒラメ科（Paralichthyidae）、フサカサゴ科（Scorpaenidae）、スズキ科（Moronidae）、タラ科（Gadidae）、ニシン科（Clupeidae）、カレイ科（Pleuronectidae）、アジ科（Carangidae）、イカナゴ科（Ammodytidae）、タイ科（Sparidae）及びメバル科（Sebastidae）に属する魚種が該当する。より具体的には、例えば、ヒラメ（Paralichthys olivaceus）、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）、メバル（Sebastes inermis）、アユ（Plecoglossus altivelis）、イカナゴ（Ammodytes personatus）、マアジ（Trachurus japonicus）、シマアジ（Pseudocaranx dentex）、マダイ（Pagurus major）、イシダイ（Oplegnathus fasciatus）、キハダマグロ（Thunnus albacares）、クロダイ（Acanthopagrus schlegeli）である。 In this embodiment, the “host” is a host organism to be infected with HIRRV, and is generally a fish, for example, Salmonidae, Ayuaceae, Paralichthyidae, Scorpaenidae, Fish belonging to the perch family (Moronidae), cod family (Gadidae), herring family (Clupeidae), flounder family (Pleuronectidae), horse mackerel family (Carangidae), sandfish family (Ammodytidae), Thai family (Sparidae), and mabet family (Sebastidae) The species falls. More specifically, for example, flounder (Paralichthys olivaceus), rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), rockfish (Sebastes inermis), ayu (Plecoglossus altivelis), squid (Ammodytes personatus), mahji (Trachurus japonicus), shimaji (Pseudoan) Red sea bream (Pagurus major), Japanese sea bream (Oplegnathus fasciatus), yellowfin tuna (Thunnus albacares) and black sea bream (Acanthopagrus schlegeli).
本明細書において「感染」とは、HIRRVが宿主細胞内に侵入してから、宿主細胞内で増殖後、その細胞から多量のHIRRVが放出されるまでの過程をいう。本明細書において「宿主感染能」とは、HIRRVが宿主細胞に感染する能力をいう。また、本明細書において「宿主感染能を抑制する」とは、前記感染におけるいずれかの過程を阻害又は抑制することによって、HIRRVの有する感染能を阻害し、宿主細胞内でのHIRRVによる感染の拡大を抑制することをいう。 As used herein, “infection” refers to a process from the time when HIRRV enters a host cell to the time when the HIRRV is released from the cell after proliferation in the host cell. As used herein, “host infectivity” refers to the ability of HIRRV to infect host cells. Further, in the present specification, “suppressing host infectivity” means that the infectivity possessed by HIRRV is inhibited by inhibiting or suppressing any process in the infection, and the infection of HIRRV in the host cell is inhibited. Suppresses expansion.
HIRRV結合性核酸アプタマーは、HIRRV粒子又はHIRRVで発現するポリペプチドを標的分子として、当該分野で公知の方法により作製することができる。例えば、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法を用いて試験管内選別による作製が挙げられる。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両端にプライマー結合領域を有する多数のRNA分子によって構成されるRNAプールから標的分子に結合したRNA分子を選択し、回収後にRT-PCR反応によって増幅した後、得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、それを次のラウンドのRNAプールにするという一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対して、より結合力の強いRNAを選択する方法である。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。一般的にランダム配列領域は、20〜80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15〜40塩基の範囲である。標的分子への特異性を高めるためには、標的分子に類似する分子とRNAプールとを混合し、その分子と結合しなかったRNA分子からなるプールを用いればよい。以上の方法によって最終的に得られたRNA分子をHIRRV結合性RNAアプタマーとして利用する。なお、SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92: 11509-11513）に準じて行えばよい。 The HIRRV-binding nucleic acid aptamer can be prepared by a method known in the art using a HIRRV particle or a polypeptide expressed by HIRRV as a target molecule. For example, preparation by in-vitro sorting using SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method can be mentioned. The SELEX method is to select an RNA molecule bound to a target molecule from an RNA pool composed of a large number of RNA molecules having a random sequence region and primer binding regions at both ends thereof, and after recovery and amplification by RT-PCR reaction, Transcription using the obtained cDNA molecule as a template and making it into the next round of RNA pools is repeated several to several tens of rounds to select RNA with stronger binding to the target molecule Is the method. The base sequence lengths of the random sequence region and the primer binding region are not particularly limited. Generally, the random sequence region has a range of 20 to 80 bases, and the primer binding region has a range of 15 to 40 bases. In order to increase the specificity to a target molecule, a molecule composed of RNA molecules that have not been bound to the molecule may be used by mixing a molecule similar to the target molecule and an RNA pool. The RNA molecule finally obtained by the above method is used as a HIRRV-binding RNA aptamer. The SELEX method is a known method, and a specific method may be performed according to, for example, Pan et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92: 11509-11513).
HIRRV結合性核酸アプタマーは、HIRRV及び／又は該ウイルスで発現するポリペプチドに結合し、HIRRVの宿主、すなわち魚類への感染活性を抑制することのできる核酸アプタマーであれば、特にその塩基配列は、限定しない。一例として、本発明の配列番号１〜６のいずれかで示される塩基配列を含むHIRRV結合性RNAアプタマーが挙げられる。好ましくは配列番号１及び６のいずれかで表わされる塩基配列からなるHIRRV結合性RNAアプタマーである。 The HIRRV-binding nucleic acid aptamer is a nucleic acid aptamer that binds to HIRRV and / or a polypeptide expressed in the virus and can suppress the infectious activity of the HIRRV host, that is, fish, in particular, the base sequence thereof is: Not limited. As an example, a HIRRV-binding RNA aptamer comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 6 of the present invention can be mentioned. Preferably, it is a HIRRV-binding RNA aptamer consisting of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 and 6.
HIRRV結合性核酸アプタマーは、当該分野で公知のあらゆる方法によって調製することができる。例えば、配列番号１〜６で示される塩基配列に基づいて、化学的合成法によって調製できる。化学合成法は、同一のアプタマーを大量に調製できる点で好ましい。このような化学合成によるアプタマーの調製は、ライフサイエンス関連の各メーカーが受託合成サービスを行っている（例えば、インビトロジェン社）ので、それらを利用することもできる。また、HIRRV結合性RNAアプタマーは、後述のHIRRV結合性核酸アプタマーをコードするDNAを用いて、当該分野で公知のin vitroRNA転写法（例えば、Sambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）により製造してもよい。さらに、HIRRV結合性核酸アプタマーは、後述する形質転換体を用いて、当該分野で公知の技術によってHIRRV結合性核酸アプタマーの発現誘導処理を施し、その形質転換体から目的のHIRRV結合性核酸アプタマーを回収してもよい。 HIRRV-binding nucleic acid aptamers can be prepared by any method known in the art. For example, it can be prepared by a chemical synthesis method based on the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6. The chemical synthesis method is preferable in that the same aptamer can be prepared in large quantities. For the preparation of aptamers by such chemical synthesis, each manufacturer related to life science provides a contracted synthesis service (for example, Invitrogen), and they can also be used. Further, the HIRRV-binding RNA aptamer is a DNA encoding the HIRRV-binding nucleic acid aptamer described later, and an in vitro RNA transcription method known in the art (for example, Sambrook, J. et. Al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Furthermore, the HIRRV-binding nucleic acid aptamer is subjected to expression induction treatment of the HIRRV-binding nucleic acid aptamer by a technique known in the art using the transformant described later, and the target HIRRV-binding nucleic acid aptamer is obtained from the transformant. It may be recovered.
HIRRV結合性核酸アプタマーは、後述するHIRRV検出方法において、HIRRV及び／又は該ウイルスで発現するHIRRV特異的なポリペプチドを検出するためのマーカー分子とすることができる。HIRRV結合性核酸アプタマーは、HIRRVとの特異性及び親和性がHIRRV抗体よりも高いことから、抗体よりも高感度なHIRRV検出マーカーとなり得る。 The HIRRV-binding nucleic acid aptamer can be used as a marker molecule for detecting HIRRV and / or a HIRRV-specific polypeptide expressed in the virus in the HIRRV detection method described below. Since the HIRRV-binding nucleic acid aptamer has higher specificity and affinity for HIRRV than the HIRRV antibody, it can be a HIRRV detection marker with higher sensitivity than the antibody.
２．HIRRV結合性核酸アプタマーをコードするDNA
本発明の第２の実施形態は、HIRRV結合性RNAアプタマーをコードするDNAである。具体的には、例えば、配列番号１〜６で示される各塩基配列中のウラシル（U）をチミン（T）に置換した塩基配列からなるDNAである。各核酸は、必要に応じて、メチル基等で修飾されていてもよく、またPNA(Peptide Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid;登録商標)、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等の化学修飾核酸や擬似核酸を含むこともできる。
2. DNA encoding HIRRV-binding nucleic acid aptamer
The second embodiment of the present invention is DNA encoding a HIRRV binding RNA aptamer. Specifically, for example, DNA consisting of a base sequence in which uracil (U) in each base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 is replaced with thymine (T). Each nucleic acid may be modified with a methyl group or the like as necessary, and PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid; registered trademark), methylphosphonate-type DNA, phosphorothioate-type DNA, 2′- Chemically modified nucleic acids such as O-methyl RNA and pseudo-nucleic acids can also be included.
本発明のDNAは、HIRRV結合性RNAアプタマーを鋳型として、そのアプタマーの3’末端塩基配列に全部又は一部が相補するプラマーを用いて、逆転写反応を行うことによって調製することができる。逆転写反応は、当該分野で公知の技術を使用すればよい。例えば、上述のMolecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed.に記載の方法に準じて行うことができる。また、本発明のDNAは、例えば、配列番号１〜６で示されるRNAアプタマーの情報に基づいて、当技術分野で公知の化学合成法によって製造することもできる。化学合成による製造は、ライフサイエンス関連の各メーカーが受託合成サービスを行っている（例えば、インビトロジェン社）ので、それらを利用することができる。 The DNA of the present invention can be prepared by performing a reverse transcription reaction using a HIRRV-binding RNA aptamer as a template and a primer that is entirely or partially complementary to the 3 'terminal nucleotide sequence of the aptamer. For the reverse transcription reaction, a technique known in the art may be used. For example, it can be performed according to the method described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed. In addition, the DNA of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods known in the art based on information on RNA aptamers represented by SEQ ID NOs: 1 to 6, for example. Manufacturing by chemical synthesis can be used because each manufacturer related to life science provides a contracted synthesis service (for example, Invitrogen).
３．HIRRV結合性核酸アプタマー発現ベクター
本発明の第３の実施形態は、HIRRV結合性RNAアプタマーをコードするDNAを発現可能な状態で含む発現ベクターである。
3. HIRRV-binding nucleic acid aptamer expression vector A third embodiment of the present invention is an expression vector containing a DNA encoding a HIRRV-binding RNA aptamer in a state capable of being expressed.
「発現可能な状態で含む」とは、HIRRV結合性RNAアプタマーをコードするDNAを発現ベクター内のプロモーターの下流に発現可能なように連結することをいう。 “Contains in an expressible state” refers to ligating DNA encoding a HIRRV-binding RNA aptamer so that it can be expressed downstream of a promoter in an expression vector.
本発明の発現ベクターには、発現宿主内で自律的に増殖し得るプラスミド又はファージを使用することができる。「発現宿主」とは、発現ベクターにコードされたRNAアプタマーを細胞内で発現することのできる宿主である。例えば、発現ベクターがプラスミドであれば、発現宿主が大腸菌（Escherichia coli）の場合、pET、pGEX6p、pMAL、pREST等を、発現宿主が枯草菌（Bacillus subtilis）の場合、pUB110、pTP5等を、発現宿主が酵母の場合、YEp13、YEp24、YCp50等を、また発現宿主が魚類の場合、pEGFP-1（クロンテック社）等を使用できる。また、ファージであれば、λファージ（λgt11、λZAP等）を用いることができる。さらに、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターも用いてもよい。 As the expression vector of the present invention, a plasmid or phage that can autonomously grow in an expression host can be used. An “expression host” is a host capable of expressing an RNA aptamer encoded by an expression vector in a cell. For example, if the expression vector is a plasmid, pET, pGEX6p, pMAL, pREST, etc. are expressed when the expression host is Escherichia coli, and pUB110, pTP5, etc. are expressed when the expression host is Bacillus subtilis. When the host is yeast, YEp13, YEp24, YCp50 and the like can be used, and when the expression host is fish, pEGFP-1 (Clontech) and the like can be used. In the case of phage, λ phage (λgt11, λZAP, etc.) can be used. Furthermore, animal viruses such as vaccinia virus and insect virus vectors such as baculovirus may be used.
大腸菌や枯草菌のような細菌を発現宿主とする場合、本発明の発現ベクターは、HIRRV結合性RNAアプタマーをコードするDNA配列の他、細菌用複製起点、プロモーター配列、リボゾーム結合配列及び転写終結配列を含むことが好ましい。プロモーターは、発現宿主内で機能発揮できるものであればいずれを用いてもよい。また、そのようなプロモーターを制御する調節因子をコードする遺伝子を、本発明の発現ベクター内、又は本発明の発現ベクターとは別個のベクターではあるが同時に使用するヘルパーベクター内に含むことができる。 When a bacterium such as Escherichia coli or Bacillus subtilis is used as an expression host, the expression vector of the present invention includes a DNA replication sequence encoding a HIRRV-binding RNA aptamer, a bacterial replication origin, a promoter sequence, a ribosome binding sequence, and a transcription termination sequence. It is preferable to contain. Any promoter may be used as long as it can function in the expression host. In addition, a gene encoding a regulatory factor that controls such a promoter can be contained in the expression vector of the present invention or in a helper vector that is used separately from the expression vector of the present invention.
酵母、動物細胞、昆虫細胞等の真核細胞を発現宿主とする場合、本発明の発現ベクターは、HIRRV結合性RNAアプタマーをコードするDNA配列の他、プロモーター配列、必要に応じてエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル（ドナー部位、アクセプター部位、ブランチポイント等）、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー配列、リボソーム結合配列（SD配列）等を連結していてもよい。 When eukaryotic cells such as yeast, animal cells, and insect cells are used as expression hosts, the expression vector of the present invention includes a DNA sequence encoding a HIRRV-binding RNA aptamer, a promoter sequence, and a cis such as an enhancer as necessary. Elements, splicing signals (donor sites, acceptor sites, branch points, etc.), poly A addition signals, selectable marker sequences, ribosome binding sequences (SD sequences), etc. may be linked.
上記ベクターにHIRRV結合性RNAアプタマーをコードするDNAを挿入する方法は、当該分子遺伝学分野で公知の方法を用いることができる。例えば、精製した前記DNAを適当な制限酵素で切断し、それに対応する切断末端を生じる適当な制限酵素で切断したベクター内にDNAリガーゼ等を用いて連結する方法がある。当該方法の詳細については、上述のSambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed.に記載の方法を参照にすればよい。 As a method for inserting a DNA encoding a HIRRV-binding RNA aptamer into the vector, a method known in the field of molecular genetics can be used. For example, there is a method in which the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme and ligated into a vector cleaved with an appropriate restriction enzyme that generates a corresponding cleavage end using DNA ligase or the like. For details of the method, reference may be made to the method described in Sambrook, J. et. Al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed.
本発明の発現ベクターを目的の発現宿主細胞に導入した場合、それが細胞内で維持されている限りHIRRV結合性RNAアプタマーを発現することができる。 When the expression vector of the present invention is introduced into a target expression host cell, the HIRRV-binding RNA aptamer can be expressed as long as it is maintained in the cell.
４．形質転換体又はその後代
本発明の第４の実施形態は、前記第３実施形態の発現ベクターを発現宿主内に導入した形質転換体又はその後代である。
4). Transformant or its progeny The fourth embodiment of the present invention is a transformant or its progeny in which the expression vector of the third embodiment is introduced into an expression host.
本実施形態において「形質転換体」とは、HIRRV結合性RNAアプタマーをコードするDNAを含む発現ベクターの導入によって形質転換された発現宿主をいう。使用する発現宿主は、導入した発現ベクターにコードされたHIRRV結合性RNAアプタマーを発現できれば特に限定しない。通常、発現ベクターにより、その適用宿主は決まっており、それに従えばよい。発現宿主の具体例を挙げると、例えば、大腸菌、枯草菌、ロドブルム（Rhodovulum）菌のような細菌、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)又はメタノール資化性酵母(Pichia pastoris)のような酵母、sf9又はsf21のような昆虫細胞、BF-2細胞又はEPC細胞のような動物（特に、魚類）細胞、及び第一態様で例示したHIRRVに感染し得る魚種等が好適に用いられる。 In the present embodiment, the “transformant” refers to an expression host transformed by introducing an expression vector containing DNA encoding a HIRRV-binding RNA aptamer. The expression host to be used is not particularly limited as long as it can express the HIRRV-binding RNA aptamer encoded by the introduced expression vector. Usually, the applicable host is determined by the expression vector, and may be followed. Specific examples of the expression host include, for example, bacteria such as E. coli, Bacillus subtilis, Rhodovulum, budding yeast (Saccharomyces cerevisiae), fission yeast (Schizosaccharomyces pombe), and methanol-utilizing yeast (Pichia pastoris). Such yeast, insect cells such as sf9 or sf21, animal (especially fish) cells such as BF-2 cells or EPC cells, and fish species capable of infecting HIRRV exemplified in the first embodiment are preferably used. It is done.
本発明の発現ベクターは、発現宿主に導入後、その宿主のゲノム内に挿入されてもよく、またゲノムとは独立に細胞内に存在してもよい。 The expression vector of the present invention may be inserted into the genome of the host after being introduced into the expression host, or may be present in the cell independently of the genome.
前記発現ベクターを細菌に導入する方法は、公知の方法であれば特に限定しない。例えば、ヒートショック法、カルシウムイオン方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。これらの技術は、いずれも当該分野で公知であり、様々な文献に記載されている。例えば、上述のSambrook, J. et. al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed.に記載の方法を参照に行えばよい。また、動物細胞の形質転換には、リポフェクチン法（Malone R.W., et. al., 1989, PNAS, 86:6077-6081、Felgner P.L., et. al., 1987, PNAS, 84:7413-7417）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Graham F.L., and van der Eb A. J., 1973, Virology, 52:456−467）、DEAE−Dextran法等が好適に用いられる。 The method for introducing the expression vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a known method. Examples thereof include a heat shock method, a calcium ion method, and an electroporation method. These techniques are all known in the art and are described in various documents. For example, the method described in Sambrook, J. et. Al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Ed. Further, for transformation of animal cells, the lipofectin method (Malone RW, et. Al., 1989, PNAS, 86: 6077-6081, Felgner PL, et. Al., 1987, PNAS, 84: 7413-7417), The electroporation method, the calcium phosphate method (Graham FL, and van der Eb AJ, 1973, Virology, 52: 456-467), the DEAE-Dextran method and the like are preferably used.
本態様において前記形質転換体の「後代」とは、本発明の発現ベクターを導入した形質転換体第１世代の有性若しくは無性生殖を介した子孫であって、HIRRV結合性RNAアプタマーをコードするDNAを発現可能な状態で保持しているものをいう。例えば、形質転換体が大腸菌の場合には、その形質転換体が分裂した娘細胞が該当する。HIRRV結合性RNAアプタマーをコードするDNAを発現可能な状態で継代する限りにおいて後代の世代は問わない。 In this embodiment, the “progeny” of the transformant is a first-generation offspring of a transformant into which the expression vector of the present invention has been introduced, which is sexually or asexually mediated, and encodes a HIRRV-binding RNA aptamer. That holds the DNA to be expressed in an expressible state. For example, when the transformant is Escherichia coli, a daughter cell obtained by dividing the transformant is applicable. As long as the DNA encoding the HIRRV-binding RNA aptamer is passaged in a state where it can be expressed, the generation of the progeny is not limited.
５．HIRRV除去装置及びHIRRV除去方法
本発明の第５の実施形態は、HIRRV除去装置、及びHIRRV除去方法である。本実施形態で「HIRRV除去」とは、HIRRV及び該ウイルスで発現するポリペプチド(以下、「HIRRV等」とする)を除去すること及び／又はそれらの有する宿主感染性を失活させることをいう。以下、HIRRV除去装置及びHIRRV除去方法について、それぞれ説明をする。
5. HIRRV removal apparatus and HIRRV removal method The fifth embodiment of the present invention is an HIRRV removal apparatus and an HIRRV removal method. In the present embodiment, “HIRRV removal” refers to removal of HIRRV and a polypeptide expressed by the virus (hereinafter referred to as “HIRRV etc.”) and / or inactivation of host infectivity thereof. . Hereinafter, each of the HIRRV removal apparatus and the HIRRV removal method will be described.
５−１．HIRRV除去装置
本発明の「HIRRV除去装置」は、濾過槽を備える。その他に、濾過槽に特定の水域の水を送り込むためのポンプ、フィルター、及び／又は後述する実施形態８に記載のHIRRV検出方法を適用する検出装置を一以上備えていてもよい。
5-1. HIRRV removal apparatus The "HIRRV removal apparatus" of the present invention includes a filtration tank. In addition, one or more detection apparatuses that apply a pump, a filter, and / or a HIRRV detection method described in Embodiment 8 to be described later may be provided to feed water in a specific water area into the filtration tank.
「濾過槽」とは、前記第１実施形態に記載のHIRRV結合性アダプター、及び／又は第４実施形態に記載の形質転換体の微生物形質転換体又はその後代（以下、「微生物形質転換体等」とする）並びに濾材を含む容器又は用池であって、特定の水域の水を通過可能なように構成されている。 The “filtration tank” refers to the HIRRV binding adapter described in the first embodiment and / or the microbial transformant or its progenies of the transformant described in the fourth embodiment (hereinafter referred to as “microbe transformant etc.”). )) And a filter medium containing a filter medium, and configured to pass water in a specific water area.
「微生物形質転換体」とは、前記第４実施形態に記載の形質転換体において大腸菌等の微生物を発現宿主とする形質転換体をいう。好ましくは発現したHIRRV結合性RNAアプタマーを細胞外に分泌することのできる微生物種の前記形質転換体である。このような微生物主としては、例えば、ロドブルム・スルフィドフィルム（Rhodovulum sulfidophilum）が挙げられる。また、使用する微生物形質転換体は、濾過槽を海水に使用するのであれば海水で生存・増殖可能な微生物種を、また淡水に使用するのであれば淡水で生存・増殖可能な微生物種をそれぞれ発現宿主とする形質転換体を使用することが好ましい。 “Microbial transformant” refers to a transformant described in the fourth embodiment using a microorganism such as Escherichia coli as an expression host. Preferably, the transformant is a microbial species capable of secreting the expressed HIRRV-binding RNA aptamer outside the cell. Such microorganisms mainly include, for example, Rhodovulum sulfidophilum. In addition, if the filter tank is used for seawater, the microbial transformant to be used is a microbial species that can survive and grow in seawater, and if it is used for freshwater, a microbial species that can survive and grow in freshwater. It is preferable to use a transformant as an expression host.
「濾材」とは、HIRRV結合活性を保持した状態でHIRRV結合性RNAアプタマーを固定若しくは充填可能な、及び／又は微生物形質転換体等が定着可能な部材をいう。構成されていれば特に限定はしない。一定容積中に多数のHIRRV結合性RNAアプタマーを固定若しくは充填、及び／又は多数の微生物形質転換体等を定着させることができ、かつ流通性に富む表面積の大きい濾材が好ましい。濾材の具体的な例としては、プラスチック製若しくはガラス製のビーズやマイクロカプセル、グラスファイバ、カーボンファイバ又はフェルトのような繊維塊、又は活性炭、軽石、ゼオライト若しくはウレタンフォームのような多孔質材が挙げられる。 The “filter medium” refers to a member that can fix or fill a HIRRV-binding RNA aptamer while maintaining HIRRV-binding activity and / or can fix a microbial transformant or the like. There is no particular limitation as long as it is configured. A filter medium having a large surface area that is capable of fixing or filling a large number of HIRRV-binding RNA aptamers in a constant volume and / or fixing a large number of microbial transformants and the like and having high flowability is preferable. Specific examples of filter media include plastic or glass beads or microcapsules, fiber masses such as glass fibers, carbon fibers or felt, or porous materials such as activated carbon, pumice, zeolite or urethane foam. It is done.
濾材には、本発明のHIRRV結合性RNAアプタマーを固定させておくこと又は微生物形質転換体等を濾材に定着させておくことが好ましい。微生物形質転換体等は、濾過槽内にHIRRV結合性RNAアプタマーを分泌する。したがって、濾過槽内に、HIRRV結合性アダプターを固定若しくは充填する場合であっても、又は微生物形質転換体等を定着させる場合であっても、濾過槽内にはHIRRV結合性RNAアプタマーが存在することになる。ここに特定の水域の水を通すことによって、特定の水域の水にHIRRV等が存在した場合には、濾過槽内のHIRRV結合性RNAアプタマーが該HIRRVと結合し、宿主感染能を失活させることができる。その結果、排水口からは特定水域からHIRRV等を除去した水を排出することができる。 It is preferable to fix the HIRRV-binding RNA aptamer of the present invention on the filter medium, or to fix a microorganism transformant or the like on the filter medium. Microbial transformants and the like secrete HIRRV-binding RNA aptamers into the filtration tank. Therefore, even when the HIRRV-binding adapter is fixed or filled in the filtration tank, or when the microbial transformant is fixed, the HIRRV-binding RNA aptamer exists in the filtration tank. It will be. When HIRRV or the like is present in the water of a specific water area by passing water of a specific water area here, the HIRRV-binding RNA aptamer in the filtration tank binds to the HIRRV and deactivates the host infectivity. be able to. As a result, the water from which HIRRV and the like have been removed from the specific water area can be discharged from the drain outlet.
HIRRV結合性RNAアプタマーを濾材に固定する方法は、当該分野で公知の核酸結合方法を利用することができる。例えば、ビオチン修飾したHIRRV結合性RNAアプタマーを、当該ビオチンを介して濾材に固定した（ストレプト）アビジンと結合させる方法が挙げられる。 As a method for immobilizing the HIRRV-binding RNA aptamer on the filter medium, a nucleic acid binding method known in the art can be used. For example, a method of binding a biotin-modified HIRRV-binding RNA aptamer with (strept) avidin immobilized on a filter medium through the biotin is mentioned.
微生物形質転換体等を濾材に定着させる方法は、当該分野で公知の微生物定着方法を用いればよい。例えば、微生物形質転換体等を培養した培養液に濾材を数時間〜数日間浸漬する方法や、閉鎖区画内の特定の水域に微生物形質転換体等を投入し、数時間〜数日間濾過槽にその水を循環させることによって、自然定着させる方法が挙げられる。 As a method for fixing a microorganism transformant or the like on a filter medium, a microorganism fixing method known in the art may be used. For example, a method in which a filter medium is immersed for several hours to several days in a culture solution obtained by culturing microbial transformants or the like, or a microbial transformant or the like is introduced into a specific water area in a closed compartment, and is put in a filtration tank for several hours to several days There is a method of natural fixing by circulating the water.
本明細書で「特定の水域」とは、HIRRV等による汚染の可能性がある開放区画又は閉鎖区画内の水域をいう。淡水、汽水、海水を問わない。閉鎖若しくは一部開放された準閉鎖区画の例としては、水槽（プールを含む）、水田、池（調整池を含む）、沼又は湖が挙げられる。開放区画としては、例えば、沿岸海域等に設置する生簀が挙げられる。 In the present specification, the “specific water area” refers to a water area in an open compartment or a closed compartment that may be contaminated by HIRRV or the like. Regardless of fresh water, brackish water, seawater. Examples of quasi-closed compartments that are closed or partially open include water tanks (including pools), paddy fields, ponds (including regulated ponds), swamps, or lakes. As an open section, for example, ginger to be installed in a coastal sea area or the like can be mentioned.
濾過槽の具体例としては、濾過器又は濾過用水池等が挙げられる。
濾過器は、HIRRV結合性アダプター及び／又は微生物形質転換体等を内部に含む容器であって、取水口から取り入れた特定の水域の水を通過させ、HIRRV等が除去された水を排水口から排水するように構成されている。取水口付近に、取り込む水に混在する不要な固形物（ゴミ）等を除去するためのフィルターを配置していてもよい。フィルターの具体例としては、タンパク質、合成樹脂、ガラス又は金属製の繊維、網又はそれらの組合せが挙げられる。
Specific examples of the filtration tank include a filter or a filtration pond.
The filter is a container that contains a HIRRV binding adapter and / or a microbial transformant inside, and allows water in a specific water area taken from the water intake port to pass through. It is configured to drain. A filter for removing unnecessary solid matter (dust) or the like mixed in the water to be taken in may be disposed near the water intake. Specific examples of the filter include protein, synthetic resin, glass or metal fiber, mesh, or a combination thereof.
濾過用水池は、微生物形質転換体等を有する用水池で、取水口から取り入れた特定の水域の水を一定期間用水池に保持した後、HIRRV等が除去された水を排水口から排水するように構成されている。
濾過槽は、特定の水域の水を循環できるように構成されていてもよい。
The filtration basin is a reservoir with microbial transformants, etc., and after holding the water in a specific water area taken from the intake in the irrigation pond for a certain period of time, drain the water from which HIRLV etc. has been removed from the drain. It is configured.
The filtration tank may be configured to circulate water in a specific water area.
５−２．HIRRV除去方法
本発明の「HIRRV除去方法」は、前記除去装置と同様の構成を有する濾過槽を用いて特定の水域の水からHIRRV及び／又は該ウイルスで発現するポリペプチドを除去する方法である。
5-2. HIRRV removal method "HIRRV removal method" of the present invention is a method of removing HIRRV and / or polypeptide expressed by the virus from water in a specific water area using a filtration tank having the same configuration as the removal device. .
本発明の除去方法は、濾過槽の取水口から特定の水域の水を取り込む取水工程、取り込んだ水を該濾過槽に通して、排水口から排水する排水工程を含む。必要に応じて取水工程で取り込んだ水を濾過槽内に所定の期間保持する保持工程を含むこともできる。 The removal method of the present invention includes a water intake step of taking water in a specific water area from a water intake port of the filtration tank, and a drainage step of draining the taken water from the water discharge port through the filter tank. If necessary, a holding step of holding the water taken in the water intake step in the filtration tank for a predetermined period can be included.
取水工程において、取水口からの水の取り込みは、ポンプ等を用いた能動的作用による取り込みであってもよいし、又は自然の水流若しくは潮流による受動的作用による取り込みであってもよい。 In the water intake step, the water intake from the water intake may be an active action using a pump or the like, or a natural water current or a passive action due to a tidal current.
排水工程において、排水は、前記入水作用に基づく受動的作用によって行われてもよいし、排水ポンプ等を用いて能動的に排水してもよい。 In the drainage process, drainage may be performed by a passive action based on the water entry action, or may be actively drained using a drainage pump or the like.
保持工程では、取り込んだ水に含まれるHIRRV等を除去し得るだけの充分な期間、濾過槽内に取り込んだ水を保持し、その後、それを排水し、新たに取り込んだ水を再び保持することができる。必要に応じて、取り込んだ水に通気（エアレーション）を行ってもよい。 In the holding process, hold the water taken into the filtration tank for a period sufficient to remove HIRLV, etc. contained in the taken-in water, then drain it and hold the newly taken water again. Can do. If necessary, the taken-in water may be aerated.
本発明の除去装置及び／又は除去方法によれば、HIRRV等で汚染された特定の水域の水からHIRRV等を除去し、HIRRV感染のおそれのない、又は少ない水又は水域を提供できる。 According to the removal apparatus and / or the removal method of the present invention, it is possible to remove HIRRV and the like from water in a specific water area contaminated with HIRRV and the like, and provide water or a water area with little or no fear of HIRRV infection.
６．医薬組成物
本発明の第６の実施形態は、ヒラメラブドウイルス病を治療又は予防するため前記第１実施形態のHIRRV結合性核酸アプタマー又は第３実施形態の発現ベクター及び製薬上許容可能な担体を含むことを特徴とする医薬組成物である。
6). Pharmaceutical composition In the sixth embodiment of the present invention, the HIRRV-binding nucleic acid aptamer of the first embodiment or the expression vector of the third embodiment and a pharmaceutically acceptable carrier are used for the treatment or prevention of lamellabudovirus disease. It is a pharmaceutical composition characterized by including.
本発明の医薬組成物は、製薬上許容される範囲内において一以上のHIRRV結合性核酸アプタマーを含有することができる。例えば、医薬組成物が配列番号１〜６で示されるHIRRV結合性RNAアプタマーのいずれか二以上を組み合わせて含有していてもよい。それぞれのHIRRV結合性核酸アプタマーがHIRRVの異なる部分に結合する場合、異なるHIRRV結合性核酸アプタマーを組み合わせて使用することによりHIRRVの感染活性をより効率的に抑制することができる。 The pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more HIRRV-binding nucleic acid aptamers within a pharmaceutically acceptable range. For example, the pharmaceutical composition may contain any two or more of HIRRV-binding RNA aptamers represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 in combination. When each HIRRV-binding nucleic acid aptamer binds to a different part of HIRRV, the infectious activity of HIRRV can be more efficiently suppressed by using a combination of different HIRRV-binding nucleic acid aptamers.
「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用し得る溶媒及び／又は添加剤をいう。 “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to a solvent and / or an additive that can be generally used in the field of pharmaceutical technology.
溶媒には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。 Examples of the solvent include water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters and the like. These are preferably sterilized and preferably adjusted to be isotonic with blood as necessary.
また、添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、無痛化剤等が挙げられる。 Examples of the additive include excipients, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers, flow addition regulators, solubilizers, buffers, pH adjusters, and soothing agents.
本発明の医薬組成物の剤型は、投与方法によって異なり、また処方条件に応じて適宜選択される。投与方法については、次の態様で詳述するが、本態様においては、非経口投与が好ましい。経口投与の場合、HIRRV結合性RNAアプタマーは、通常、消化器官内で分解されてしまうからである。非経口投与においては、組織内投与又は粘膜投与が好ましい。非経口剤としての剤型も、その投与方法によって異なる。例えば、組織内投与の場合には注射剤が、粘膜投与の場合には、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、又は硬膏剤等が好適に使用される。前記各剤型の形状、大きさについては、いずれも当該分野で公知の剤型の範囲内にあればよく、特に限定はしない。 The dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the administration method and is appropriately selected depending on the prescription conditions. The administration method will be described in detail in the following embodiment. In this embodiment, parenteral administration is preferable. This is because in the case of oral administration, HIRRV-binding RNA aptamers are usually degraded in the digestive tract. For parenteral administration, intra-tissue administration or mucosal administration is preferred. The dosage form as a parenteral agent also varies depending on the administration method. For example, an injection is preferably used for intra-tissue administration, and a suspension, emulsion, cream, powder, paste, gel, ointment, or plaster is preferably used for mucosal administration. . The shape and size of each dosage form are not particularly limited as long as they are within the range of dosage forms known in the art.
本発明の医薬組成物を製剤化するには、当業者に公知の方法を利用することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載の方法を用いればよい。例えば、注射剤として調製する場合には、HIRRV結合性核酸アプタマーを製薬上許容可能な溶媒で溶解し、好ましくは血液と等張にした希釈剤を用いて当該分野で慣用されている方法により製造することができる。注射剤には、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコース又はグリセリン及び通常の溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、無痛化剤等も配合することができる。これら溶液、乳剤及び懸濁剤は、HIRRV結合性核酸アプタマー及び製薬上許容される塩の所定量を、前記水性や油性の非毒性の溶媒及び希釈剤に溶解又は懸濁し、さらに必要に応じて等張化剤等を加え、滅菌することにより調製すればよい。 Methods known to those skilled in the art can be used to formulate the pharmaceutical composition of the present invention. For example, the method described in Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.) May be used. For example, when preparing as an injection, the HIRRV-binding nucleic acid aptamer is dissolved in a pharmaceutically acceptable solvent, and preferably manufactured by a method commonly used in the art using a diluent that is made isotonic with blood. can do. A sufficient amount of sodium chloride, glucose or glycerin and a usual solubilizer, buffer, pH adjuster, soothing agent and the like can be added to the injection to prepare an isotonic solution. These solutions, emulsions and suspensions are prepared by dissolving or suspending predetermined amounts of HIRRV-binding nucleic acid aptamers and pharmaceutically acceptable salts in the above-mentioned aqueous or oily non-toxic solvents and diluents, and if necessary. What is necessary is just to prepare by adding a tonicity agent etc. and sterilizing.
本発明の医薬組成物によれば、HIRRVに感染した又は感染するおそれのある宿主、すなわち魚類のHIRRV病の治療薬又は予防薬を提供することができる。 According to the pharmaceutical composition of the present invention, it is possible to provide a therapeutic or prophylactic agent for HIRRV disease of a host infected with HIRRV, or a fish that may be infected, that is, fish.
７．HIRRV治療・予防方法
本発明の第７の実施形態は、前記第６実施形態の医薬組成物を魚類に投与してHIRRVを治療又は予防する方法である。本実施形態において、「魚類」とは、HIRRVに感染することが知られている又は感染するおそれのある魚であって、好ましくは第１の実施形態に記載の宿主として例示した魚科、より好ましくは魚種である。
7). HIRRV Treatment / Prevention Method The seventh embodiment of the present invention is a method for treating or preventing HIRRV by administering the pharmaceutical composition of the sixth embodiment to fish. In the present embodiment, the “fish” is a fish that is known or may be infected with HIRRV, and preferably from the fish family exemplified as the host described in the first embodiment. Preferably it is a fish species.
医薬組成物の投与方法は、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。好ましくは血液を介した全身投与である。一方、HIRRV病は、一般に腎臓、脾臓、生殖腺、消化管で細胞の壊死等の顕著な症状が観察されることから、これらの臓器又は器官に局所的に投与してもよい。 The administration method of the pharmaceutical composition may be either systemic administration or local administration. Systemic administration via blood is preferred. On the other hand, since HIRRV disease generally exhibits remarkable symptoms such as cell necrosis in the kidney, spleen, gonads, and gastrointestinal tract, it may be administered locally to these organs or organs.
前記医薬組成物の投与形態は、含有された有効成分であるHIRRV結合性核酸アプタマーが失活しないあらゆる適当な形態を包含する。例えば、前述の組織内投与又は粘膜投与のような非経口投与が挙げられる。組織内投与の場合、前述のように注射による投与が好ましい。注入する部位は特に限定しない。例えば、血管内（静脈内又は動脈内等）、皮下、皮内、筋肉内、骨髄内、髄腔内、心室内、腹腔内又は腸内等が挙げられる。好ましくは、静脈内又は動脈内等の血管内、筋肉内、又は腹腔内である（非特許文献１）。これらの方法は、侵襲性が比較的低く、被験体である魚に与える負担が小さいからである。 The administration form of the pharmaceutical composition includes any appropriate form in which the contained active ingredient HIRRV-binding nucleic acid aptamer is not inactivated. For example, parenteral administration such as intra-tissue administration or mucosal administration described above can be mentioned. In the case of intra-tissue administration, administration by injection is preferred as described above. The site to be injected is not particularly limited. For example, intravascular (intravenous or intraarterial), subcutaneous, intradermal, intramuscular, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intraperitoneal, or intestine, etc. Preferably, it is intravascular such as intravenous or intraarterial, intramuscular, or intraperitoneal (Non-patent Document 1). This is because these methods have relatively low invasiveness and a small burden on the fish as a subject.
前記態様の医薬組成物を投与する場合、一投与単位中には、HIRRV感染抑制活性が発揮され得る有効量が含有されていることが好ましい。本明細書で使用する場合、「有効量」とは、有効成分がその機能を発揮する上で必要な量、すなわち、本発明ではHIRRV結合性核酸アプタマーがHIRRVを治療又は改善できる用量、具体的にはHIRRVの細胞内への侵入、増殖及び／又は細胞外への放出を阻害又は抑制し、宿主のHIRRV感染に対する抵抗性を付与し、かつ投与する生体に対して有害な副作用がほとんどない又は全くない用量をいう。具体的な量は、被験体の情報、使用される剤形、及び投与経路によって変化し得る。「被験体の情報」には、HIRRVの進行度若しくは重症度、全身の健康状態、大きさ、重量、雌雄性別、薬剤感受性、及び治療に対する耐性等が含まれる。HIRRV感染治療・予防の効果を得る上で、本発明の医薬組成物の大量投与が必要な場合、魚類に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。 When administering the pharmaceutical composition of the said aspect, it is preferable that the effective dose which can exhibit HIRRV infection suppression activity is contained in one dosage unit. As used herein, an “effective amount” means an amount necessary for the active ingredient to perform its function, that is, a dose at which the HIRRV-binding nucleic acid aptamer can treat or improve HIRRV in the present invention, specifically Inhibits or suppresses HIRRV entry into cells, proliferation and / or extracellular release, imparts resistance to HIRRV infection in the host, and has almost no adverse side effects on the administered organism or Refers to a dose that is not present at all. The specific amount can vary depending on the subject's information, the dosage form used, and the route of administration. “Subject information” includes the degree or severity of HIRRV, general health, size, weight, sex, sex sensitivity, resistance to treatment, and the like. In order to obtain the effect of treatment / prevention of HIRRV infection, when it is necessary to administer a large amount of the pharmaceutical composition of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention can be divided into several times to reduce the burden on fish.
８．HIRRV検出方法
本発明の第８の実施形態は、HIRRV結合性核酸アプタマーを用いてHIRRV及び／又は該ウイルスで発現するHIRRV特異的なポリペプチドを検出するHIRRV検出方法である。HIRRVを検出可能な方法であれば、検出手段は特に限定はしない。例えば、表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス測定法、比濁法、比色法又は蛍光法を利用することができる。
8). HIRRV Detection Method The eighth embodiment of the present invention is a HIRRV detection method for detecting HIRRV and / or a HIRRV-specific polypeptide expressed in the virus using a HIRRV-binding nucleic acid aptamer. The detection means is not particularly limited as long as it can detect HIRRV. For example, a surface plasmon resonance measurement method, a quartz resonator microbalance measurement method, a turbidimetric method, a colorimetric method, or a fluorescence method can be used.
「表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：SPR）」とは、金属薄膜にレーザー光を照射すると特定の入射角度（共鳴角）において反射光強度が著しく減衰する現象をいう。「表面プラズモン共鳴法（SPR法）」は、この現象を利用した方法で、センサ部である金属薄膜表面上の吸着物を高感度に測定することができる。本発明においては、例えば、ビオチン／（ストレプト）アビジンのような公知の結合技術を用いて、予めHIRRV結合性核酸アプタマー又はHIRRV等を金属薄膜表面上に固定化しておく。その金属薄膜表面上に試料を通過させ、HIRRV結合性核酸アプタマーとHIRRV等との結合によって生じる試料通過前後の金属表面上の吸着物の差を検出することによりHIRRV又は該ウイルスで発現するポリペプチドを検出することができる。SPR法には、置換法、間接競合法等が知られるがいずれを用いてもよい。本技術は、当該分野において周知であり、例えば、永田和弘、及び半田宏, 生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法, シュプリンガー・フェアラーク東京, 東京, 2000に記載の方法を参照することができる。 “Surface Plasmon Resonance (SPR)” refers to a phenomenon in which the intensity of reflected light is significantly attenuated at a specific incident angle (resonance angle) when a metal thin film is irradiated with laser light. “Surface plasmon resonance method (SPR method)” is a method using this phenomenon, and can measure adsorbates on the surface of a metal thin film, which is a sensor part, with high sensitivity. In the present invention, for example, a known binding technique such as biotin / (strept) avidin is used to immobilize HIRRV-binding nucleic acid aptamer or HIRRV in advance on the metal thin film surface. A polypeptide expressed in HIRRV or the virus by passing the sample over the surface of the metal thin film and detecting the difference in adsorbate on the metal surface before and after passing through the sample caused by the binding of HIRRV-binding nucleic acid aptamer and HIRRV etc. Can be detected. As the SPR method, a substitution method, an indirect competition method, and the like are known, and any of them may be used. This technique is well known in the art, and for example, reference can be made to the method described in Kazuhiro Nagata and Hiroshi Handa, real-time analysis method of biological material interaction, Springer Fairlark Tokyo, Tokyo, 2000.
「水晶振動子マイクロバランス（Quartz Crystal Microbalance）測定法」は、水晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着すると、その質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用した方法である。この方法を用いたQCMセンサは、水共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえることができる。本発明においては、電極表面に、前記SPR法と同様に予めHIRRV結合性核酸アプタマー又はHIRRV等を固定化しておき、試料を電極表面に接触させることによって、HIRRV結合性核酸アプタマーとHIRRVとの結合により生じる水共振周波数の変化量からHIRRVの有無を定量的に検出することができる。本技術は、当該分野において周知である。例えば、J.Christopher Love,L.A.Estroff，J.K.Kriebel, R.G.Nuzzo, G.M.Whitesides (2005) Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review,105:1103-1169；森泉豊榮，中本高道，(1997) センサ工学，昭晃堂に記載の方法を参照されたい。 The “Quartz Crystal Microbalance measurement method” is a method that uses the phenomenon that when a substance is adsorbed on the surface of an electrode attached to a crystal unit, the resonance frequency of the crystal unit decreases according to its mass. is there. A QCM sensor using this method can quantitatively capture an extremely small amount of adsorbate based on the amount of change in the water resonance frequency. In the present invention, the HIRRV-binding nucleic acid aptamer or HIRRV or the like is immobilized on the electrode surface in advance in the same manner as in the SPR method, and the sample is brought into contact with the electrode surface, thereby binding the HIRRV-binding nucleic acid aptamer and HIRRV. It is possible to quantitatively detect the presence or absence of HIRRV from the amount of change in the water resonance frequency caused by. This technique is well known in the art. For example, J. Christopher Love, LAEstroff, JKKriebel, RGNuzzo, GMWhitesides (2005) Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review, 105: 1103-1169; Toyoi Morimori, Takamichi Nakamoto, (1997 ) Refer to the method described in Sensor Engineering, Shosodo.
「比濁法」とは、溶液に光を照射し、溶液中に浮遊する物質によって散乱する散乱光の減衰又はその溶液を通過した透過光を、比色計等を用いて光学的に計測することにより溶液中の物質量を測定する方法である。本発明においては、試料にHIRRV結合性核酸アプタマーを添加する前後の吸光度を計測することによって、試料中のHIRRV等を定量的に検出することができる。HIRRV結合性核酸アプタマーとHIRRV等との結合による凝集を高めるため、HIRRV結合性核酸アプタマーをラテックスのような担体に固定化しておくこともできる。 The “turbidimetric method” is a method in which a solution is irradiated with light, and the attenuation of scattered light scattered by a substance suspended in the solution or the transmitted light that has passed through the solution is optically measured using a colorimeter or the like. This is a method for measuring the amount of a substance in a solution. In the present invention, HIRRV and the like in a sample can be quantitatively detected by measuring the absorbance before and after adding the HIRRV-binding nucleic acid aptamer to the sample. In order to enhance the aggregation due to the binding between the HIRRV-binding nucleic acid aptamer and HIRRV or the like, the HIRRV-binding nucleic acid aptamer can be immobilized on a carrier such as latex.
また、HIRRV等に対する抗体と併用することによりHIRRV等を検出することもできる。例えば、ELISA法のサンドイッチ法を応用した方法を用いてもよい。この方法では、まず、固相担体にHIRRV結合性核酸アプタマーを固定しておき、次に試料を加えて、試料中に存在するHIRRVと該アプタマーとを結合させる。続いて、試料を洗い流した後、抗HIRRV抗体を加えてHIRRV等に結合させる。洗浄後、適当な標識をした二次抗体を用いて抗HIRRV抗体を検出することにより、試料中のHIRRV等を検出することができる。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。HIRRV結合性核酸アプタマー又はHIRRV等の前記固相担体への固定は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用する方法等、公知の方法に従って結合させることにより達成できる。 Moreover, HIRRV etc. can also be detected by using together with the antibody with respect to HIRRV etc. For example, a method using an ELISA sandwich method may be used. In this method, first, a HIRRV-binding nucleic acid aptamer is immobilized on a solid phase carrier, and then a sample is added to bind HIRRV present in the sample and the aptamer. Subsequently, after washing the sample, an anti-HIRRV antibody is added to bind to HIRRV or the like. After washing, HIRRV and the like in the sample can be detected by detecting an anti-HIRRV antibody using an appropriately labeled secondary antibody. As solid phase carriers, beads made of materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, latex, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics or magnetic materials Insoluble carriers in the form of microplates, test tubes, sticks or test pieces can be used. Immobilization of the HIRRV-binding nucleic acid aptamer or HIRRV or the like to the solid phase carrier can be achieved by binding according to a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination method thereof.
９．HIRRV検出キット
本発明の第９の実施形態は、HIRRV検出マーカーを含むHIRRV等を検出するためのキットである。本キットは、前記実施形態であるHIRRV検出方法を使用してHIRRV等を検出することが好ましい。
9. HIRRV detection kit The ninth embodiment of the present invention is a kit for detecting HIRRV and the like including a HIRRV detection marker. This kit preferably detects HIRRV and the like using the HIRRV detection method according to the embodiment.
本キットは、HIRRV結合性核酸アプタマーの他、必要に応じて標識二次抗体、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、又は試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を含むことができる。さらに、そのキットの使用説明書を包含することもできる。 In addition to the HIRRV-binding nucleic acid aptamer, this kit may contain a labeled secondary antibody, a substrate necessary for detection of the label, a positive control or negative control, or a buffer used for dilution or washing of the sample, if necessary. it can. In addition, instructions for using the kit can be included.
＜実施例１：HIRRV結合性核酸アプタマーの選択＞
（DNAライブラリー及びRNAプールの構築）
まず、DNAライブラリー（2.5mg）をオペロン・バイオテクノロジー社に委託合成し、調製した。このDNAライブラリーは、配列番号７で示す40塩基のランダムな塩基配列並びにその5’側及び3’側にそれぞれT7プロモーターのフォワードプライマーに相当する塩基配列及びM13リバースプライマーに相補的な塩基配列を有する全長75塩基のDNAを約5×1016クローン包含する(図１参照)。
<Example 1: Selection of HIRRV-binding nucleic acid aptamer>
(Construction of DNA library and RNA pool)
First, a DNA library (2.5 mg) was synthesized by commissioning to Operon Biotechnology. This DNA library comprises a 40 base random base sequence shown in SEQ ID NO: 7, a base sequence corresponding to the forward primer of the T7 promoter and a base sequence complementary to the M13 reverse primer on the 5 ′ side and 3 ′ side, respectively. It contains about 5 × 10 16 clones of DNA having a total length of 75 bases (see FIG. 1).
続いて、前記DNAライブラリーからRNAプールをT7 RibomaxTM Express Large Sclae RNA Production System（プロメガ社）を用いて構築した。具体的手順については、前記キット付属の使用説明書に従った。 Subsequently, an RNA pool was constructed from the DNA library using T7 Ribomax ™ Express Large Sclae RNA Production System (Promega). About the specific procedure, the instruction manual attached to the said kit was followed.
（SELEX法）
HIRRV結合性核酸アプタマーをSELEX法により分離した。SELEX法は、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995, 92: 11509-11513）の方法に若干の改変を加えた方法を用いた。具体的な方法を以下に示す。
(SELEX method)
HIRRV-binding nucleic acid aptamers were separated by the SELEX method. The SELEX method used was a method obtained by slightly modifying the method of Pan et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92: 11509-11513). A specific method is shown below.
（１）RNAとHIRRVの結合と結合したRNAの回収
1.5mLチューブに入った50μLのヌクレアーゼフリーの水に前記RNAプールを溶かした。RNAを直鎖状にするため、前記チューブを90℃で3分間、ヒートブロックを用いて加熱した後、直ちに氷上に5分間置いた。濾過滅菌した450μLの結合バッファ（20mM TRIS／100mM NaCl／2.5mM MgCl2(pH7.5)）を前記チューブに加えた。予め約500μLの結合バッファを通した孔サイズ0.1μmの湿潤フィルターに、前記RNAサンプルを通し、フィルターに結合するRNAを除去した。
(1) Recovery of RNA combined with binding of RNA and HIRRV
The RNA pool was dissolved in 50 μL of nuclease-free water in a 1.5 mL tube. In order to linearize RNA, the tube was heated at 90 ° C. for 3 minutes using a heat block and immediately placed on ice for 5 minutes. 450 μL of binding buffer (20 mM TRIS / 100 mM NaCl / 2.5 mM MgCl 2 (pH 7.5)) sterilized by filtration was added to the tube. The RNA sample was passed through a wet filter having a pore size of 0.1 μm through which about 500 μL of a binding buffer had been passed in advance to remove RNA bound to the filter.
得られた濾液を室温に置き、50μLのHIRRV(8601H株、北海道大学吉永守教授より分与)を加えた。RNAとHIRRVとを結合させるため37℃で30〜45分間振とうさせながらインキュベートした後、氷上に5分間置いた。その後、サンプルを結合バッファで予め湿らせた孔サイズ0.1μmの湿潤フィルターで濾過し、フィルター上に残ったHIRRVとRNAの複合体（以下、HIRRV−RNAとする）を約500μLの結合バッファで洗浄して回収した。ヒートブロックを用いてHIRRV−RNAを90℃で5分間加熱し、HIRRVとRNAを解離させた。解離したHIRRV粒子を除去するため、チューブに400μLのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(PCI)−DEPCを加え、１０秒間激しく混合した後、13,000rpmで10分間遠心した。上層を回収し、新たなチューブに移した。−20℃の99％エタノールを1mL加えた後、Etachinmate（ニッポンジーン社）と3M 酢酸ナトリウムを用いてエタノール沈殿処理を行った。回収したRNAを20μLのヌクレアーゼフリーの水に溶解し、−20℃に保存した。これをオリジナルHIRRV結合性核酸アプタマーとした。 The obtained filtrate was placed at room temperature, and 50 μL of HIRRV (8601H strain, distributed by Professor Mamoru Yoshinaga, Hokkaido University) was added. In order to bind RNA and HIRRV, the mixture was incubated at 37 ° C. with shaking for 30 to 45 minutes, and then placed on ice for 5 minutes. Then, the sample is filtered through a 0.1 μm pore size filter pre-wet with binding buffer, and the remaining HIRRV-RNA complex (hereinafter referred to as HIRRV-RNA) is washed with about 500 μL of binding buffer. And recovered. HIRRV-RNA was heated at 90 ° C. for 5 minutes using a heat block to dissociate HIRRV and RNA. In order to remove dissociated HIRRV particles, 400 μL of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (PCI) -DEPC was added to the tube, and the mixture was vigorously mixed for 10 seconds and then centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. The upper layer was collected and transferred to a new tube. After adding 1 mL of −20 ° C. 99% ethanol, ethanol precipitation was performed using Etachinmate (Nippon Gene) and 3M sodium acetate. The recovered RNA was dissolved in 20 μL of nuclease-free water and stored at −20 ° C. This was used as the original HIRRV-binding nucleic acid aptamer.
（２）逆転写反応によるcDNA合成
オリジナルHIRRV結合性核酸アプタマーから、さらにHIRRVと強固に結合するHIRRV結合性核酸アプタマーを選択するために、アプタマー増幅用鋳型となるcDNAを逆転写反応により合成した。逆転写には、M-MLV system（プロメガ社）を用いた。10μLの前記回収したRNA、アプタマー用フォワードプライマー（AptFw；T7 Fwプロモーター；配列番号８）及びアプタマー用リバースプライマー（AptRv；M13 Rvプライマー；配列番号９）各1μL、及び1μLのdNTPを0.2mLチューブ内で混合した。65℃で加熱混合し、5分後直ちに氷上に移し、5分間静置した。続いて、4μLの5× first strand buffer、2μLのDTT、0.25μLのRNase Out、0.5μLのMMLV及び1.25μLのRNaseフリーの水を加えて混合し（計22μL）、37℃に50分、次に70℃で15分間加熱した後、4℃で冷却した。得られた溶液をオリジナルのHIRRV結合性核酸アプタマーの鋳型cDNAとした。
(2) cDNA synthesis by reverse transcription reaction In order to select a HIRRV-binding nucleic acid aptamer that strongly binds to HIRRV from the original HIRRV-binding nucleic acid aptamer, cDNA as a template for aptamer amplification was synthesized by a reverse transcription reaction. M-MLV system (Promega) was used for reverse transcription. 10 μL of the recovered RNA, aptamer forward primer (AptFw; T7 Fw promoter; SEQ ID NO: 8) and aptamer reverse primer (AptRv; M13 Rv primer; SEQ ID NO: 9) each 1 μL and 1 μL of dNTP in 0.2 mL tube Mixed. The mixture was heated and mixed at 65 ° C., and immediately after 5 minutes, it was transferred to ice and allowed to stand for 5 minutes. Then add 4μL 5 × first strand buffer, 2μL DTT, 0.25μL RNase Out, 0.5μL MMLV and 1.25μL RNase-free water (total 22μL) and mix for 50 minutes at 37 ° C. The mixture was heated at 70 ° C. for 15 minutes and then cooled at 4 ° C. The obtained solution was used as an original HIRRV-binding nucleic acid aptamer template cDNA.
（３）cDNAの増幅
得られたcDNAをPCRにより増幅させた。36.1μLの水、5μLのEx Taq（タカラバイオ社）用10× バッファ、4μLのdNTP, AptFw及びAptRvを各1.9μL、0.6μLのEx Taq（タカラバイオ社）及び0.5μLのcDNAからなる50μLのPCR反応液を95℃１分間、続いて95℃で1分間、50℃で15秒及び72℃で3分間を1サイクルとして10サイクル反復した。PCR反応後、産物を水で500μLに充填し、等量のPCIで酵素等の除去処理、エタノール沈殿を行った後に、30μLのヌクレアーゼフリーの水に溶解してcDNA溶液を得た。
(3) Amplification of cDNA The obtained cDNA was amplified by PCR. 36.1 μL water, 5 μL Ex Taq 10 × buffer, 4 μL dNTP, AptFw and AptRv each 1.9 μL, 0.6 μL Ex Taq (Takara Bio) and 50 μL of 0.5 μL cDNA The PCR reaction was repeated 10 cycles at 95 ° C for 1 minute, followed by 95 ° C for 1 minute, 50 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 3 minutes. After the PCR reaction, the product was filled in 500 μL with water, and after removing enzyme and the like with ethanol in an equal amount and ethanol precipitation, the product was dissolved in 30 μL of nuclease-free water to obtain a cDNA solution.
（４）RNAの大量調製
HIRRV結合性RNAアプタマーのプールを調製するため、増幅した前記cDNAを鋳型として、T7 Ribomax system（プロメガ社）を用いて、RNAを大量に転写した。0.2mLチューブ２本のそれぞれに10μLの2× T7バッファ、5μLの前記cDNA溶液、3μLのヌクレアーゼフリーの水、及び2μLのEnzyme X mix（計20μL）を入れて、混合し、37℃で30分間インキュベートした。続いて、5μLのDNaseを添加した後、37℃で15分間加温した。最後に、2本のチューブ内のサンプルをまとめて、ヌクレアーゼフリーの水で400μLに充填し、等量のPCIでタンパク質除去、エタノール沈殿を行った後、50μLのヌクレアーゼフリーの水に溶解して、第２のHIRRV結合性核酸アプタマーとした。前記（１）〜当該（４）までを1ラウンドとした。
(4) Large-scale preparation of RNA
In order to prepare a pool of HIRRV-binding RNA aptamers, RNA was transcribed in large quantities using the T7 Ribomax system (Promega) using the amplified cDNA as a template. In each of two 0.2 mL tubes, add 10 μL of 2 × T7 buffer, 5 μL of the cDNA solution, 3 μL of nuclease-free water, and 2 μL of Enzyme X mix (20 μL in total), and mix at 37 ° C. for 30 minutes. Incubated. Subsequently, 5 μL of DNase was added, followed by warming at 37 ° C. for 15 minutes. Finally, collect the samples in the two tubes, fill 400 μL with nuclease-free water, remove protein with an equal amount of PCI, perform ethanol precipitation, dissolve in 50 μL of nuclease-free water, A second HIRRV-binding nucleic acid aptamer was used. The round from (1) to (4) was defined as one round.
（５）ラウンドの繰り返し
前記ラウンドを12回繰り返した。選択ストリンジェンシーを高めるために、ラウンドの回数を増加するごとに、使用するHIRRVの濃度を104nMから1nMに減じた。ラウンド4〜9においては、HIRRV−RNAと非結合RNAを高速遠心により分離した。
(5) Repeating the round The round was repeated 12 times. To increase the selection stringency, the concentration of HIRRV used was reduced from 10 4 nM to 1 nM for each round increase. In rounds 4 to 9, HIRRV-RNA and unbound RNA were separated by high-speed centrifugation.
（６）単離されたHIRRV結合性核酸アプタマーの塩基配列決定
上述のスクリーニングラウンドにより得られたHIRRV結合性核酸アプタマーに対して、RT-PCRを行った。プライマーには、各RNAアプタマーの両端に存在するプライマー結合領域に相補するT7 Fw及びM13 Rvプライマーを用いた。その後、T7プライマーを用いてシーケンサー（ABI社）により増幅PCR断片の塩基配列を決定した。
(6) Determination of nucleotide sequence of isolated HIRRV-binding nucleic acid aptamer RT-PCR was performed on the HIRRV-binding nucleic acid aptamer obtained by the above-described screening round. As the primers, T7 Fw and M13 Rv primers complementary to the primer binding regions existing at both ends of each RNA aptamer were used. Thereafter, the base sequence of the amplified PCR fragment was determined by a sequencer (ABI) using T7 primer.
（７）結果
本実施例によって得られたHIRRV結合性RNAアプタマーの塩基配列を図１に示す。SELEX法によって19個のRNAアプタマーが得られた。このうちの14クローンは、塩基配列が同一であったことから全部で6種(J9-2、J9-9、J9-16、J9-21、J9-25及びJ9-29)のRNAアプタマーが分離されたことになる。また、J9-2、J9-9、J9-16及びJ9-21の4クローンについては、J9-2の塩基配列が1塩基置換されたクローンであることから実質的に同じ群のクローンと考えられる。したがって、3群（J9-2、J9-25及びJ9-29)のHIRRV結合性核酸アプタマーが分離されたことになる。
(7) Results The base sequence of the HIRRV binding RNA aptamer obtained by this example is shown in FIG. 19 RNA aptamers were obtained by the SELEX method. 14 of these clones had the same nucleotide sequence, so a total of 6 RNA aptamers (J9-2, J9-9, J9-16, J9-21, J9-25 and J9-29) were isolated. It will be done. In addition, the four clones J9-2, J9-9, J9-16 and J9-21 are considered to be clones of substantially the same group because the J9-2 base sequence is a single base substitution. . Therefore, HIRRV-binding nucleic acid aptamers of 3 groups (J9-2, J9-25 and J9-29) were separated.
＜実施例２：HIRRV結合性核酸アプタマーによるHIRRV感染の抑制＞
実施例１で得られたHIRRV結合性核酸アプタマーのHIRRV感染活性抑制能について検証した。
<Example 2: Inhibition of HIRRV infection by HIRRV-binding nucleic acid aptamer>
The ability of the HIRRV-binding nucleic acid aptamer obtained in Example 1 to suppress HIRRV infection activity was verified.
（１）細胞培養
日本産ヒラメ（Paralichthys olivaceus）の胚細胞系列（HINAE）（北海道大学 吉永守教授より分与；Establishment of Two Japanese Flounder Embryo Cell Lines, Hisae Kasai and Mamoru Yoshimizu, Fish.Sci.Hokkaido Univ. 52:67-70）を10％FBS(JRH Bioscience社)／100 IU/mLのペニシリンG（Sigma）／100μg/mLのストレプトマイシン（Gibco-BRL社）で懸濁したLeibovitz’s L-15 培地（Gibco-BRL社）3mLに単層となるように播種し、15℃で3〜4日間培養した。詳細な培養方法については、（Lua et al., 2008, Antiviral Res. 80(3):316-323）に記載の方法に準じた。
(1) Cell culture Embryonic cell line (HINAE) of Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) (distributed by Professor Mamoru Yoshinaga, Hokkaido University; Establishment of Two Japanese Flounder Embryo Cell Lines, Hisae Kasai and Mamoru Yoshimizu, Fish. Sci. Hokkaido Univ. 52: 67-70) in 10% FBS (JRH Bioscience) / 100 IU / mL penicillin G (Sigma) / 100 μg / mL streptomycin (Gibco-BRL) in Leibovitz's L-15 medium (Gibco -BRL) 3 mL of seed was seeded and cultured at 15 ° C. for 3-4 days. The detailed culture method was the same as that described in (Lua et al., 2008, Antiviral Res. 80 (3): 316-323).
（２）HIRRV結合性核酸アプタマーによるHIRRV感染の阻害
実施例１で得られたRNAアプタマー3群（J9-2、J9-25及びJ9-29)について、HIRRV感染の阻害活性を検証した。
(2) Inhibition of HIRRV infection by HIRRV-binding nucleic acid aptamer Three groups of RNA aptamers (J9-2, J9-25 and J9-29) obtained in Example 1 were examined for the inhibitory activity of HIRRV infection.
結合バッファを用いて前記3群のRNAアプタマー溶液を1、2及び4mg/mLの濃度に調製し、フォールディング後、1mLの各RNAアプタマー溶液に105 TCID50のHIRRVを加えた。37℃で30分間インキュベート後、その溶液を、（１）で調製したHINAE細胞に加えてHIRRVの感染処理を行った。また、対照区にはL-15培地のみを、またバッファのみの試験区にはバッファのみを加え、HIRRV試験区と同様の方法で処理した。感染処理後のHINAE細胞を15℃にインキュベートし、4日後にHIRRVの感染における細胞変性効果（CPE）を顕微鏡下で観察し、RNAアプタマーによるHIRRV感染の阻害活性を調べた。 Using the binding buffer, the three groups of RNA aptamer solutions were prepared at concentrations of 1, 2 and 4 mg / mL, and after folding, 10 5 TCID 50 of HIRRV was added to 1 mL of each RNA aptamer solution. After incubating at 37 ° C. for 30 minutes, the solution was added to the HINAE cells prepared in (1) for HIRRV infection treatment. Further, only the L-15 medium was added to the control group, and only the buffer was added to the buffer-only test group, and the same treatment as in the HIRRV test group was performed. HINAE cells after the infection treatment were incubated at 15 ° C., and after 4 days, cytopathic effect (CPE) in the infection of HIRRV was observed under a microscope, and the inhibitory activity of HIRRV infection by RNA aptamer was examined.
（３）結果
図２に結果を示す。ｃのバッファ＋HIRRV添加試験区にJ9-2、J9-25又はJ9-29の各RNAアプタマーを添加した場合、3群のいずれを添加した場合にも濃度依存的にCPEが回復した。この結果から、本発明のHIRRV結合型RNAアプタマーは、宿主細胞のHIRRV感染抑制活性を有することが立証された。
(3) Results FIG. 2 shows the results. When J9-2, J9-25, or J9-29 RNA aptamers were added to the c buffer + HIRRV addition test group, CPE recovered in a concentration-dependent manner when any of the three groups was added. From this result, it was proved that the HIRRV-binding RNA aptamer of the present invention has a host cell HIRRV infection suppression activity.
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