JP2012189541A - Microchemical chip - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞を捕捉するために用いられるマイクロ化学チップに関する。 The present invention relates to a microchemical chip used for capturing cells.
がんの診断や研究、遺伝子の変異が関係するその他の様々な疾患の診断や研究等のために、個々の細胞を捕捉して検査することが提案されている。個々の細胞を捕捉することができれば、その細胞に対して例えばRCA法(in situ padlock probe rolling circle amplification)（非特許文献１）等を行うことにより、その細胞が、特定のがん遺伝子やSNPs等を有しているか否かを調べることができる。 It has been proposed to capture and examine individual cells for the diagnosis and research of cancer and the diagnosis and research of various other diseases related to gene mutation. If it is possible to capture individual cells, by performing the cell relative to example RCA method (in situ padlock probe r olling c ircle a mplification) ( Non-Patent Document 1), etc., its cells, certain cancer Whether or not it has genes, SNPs, etc. can be examined.
一方、マイクロ化学チップは、スライドガラス等の基板上に細い流路（マイクロ流路）を設けたチップであり、様々な化学分析や化学プロセスに用いることが近年、広く研究され、実用化もされている。個々の細胞を捕捉するために、マイクロ化学チップを用いることも提案されている。例えば、捕捉すべき細胞の表面上に発現する抗原に対する抗体を固定化した円柱状のピラーを、マイクロ流路内に分散して配置し、これらのピラーと衝突した目的の細胞を捕捉する方法が知られている（非特許文献２）。 On the other hand, a microchemical chip is a chip in which a thin channel (microchannel) is provided on a substrate such as a slide glass, and its use in various chemical analyzes and chemical processes has been widely studied and put into practical use in recent years. ing. It has also been proposed to use a microchemical chip to capture individual cells. For example, there is a method in which cylindrical pillars on which antibodies against antigens expressed on the surface of cells to be captured are immobilized are dispersed and arranged in microchannels, and target cells that collide with these pillars are captured. It is known (Non-Patent Document 2).
また、本願発明者らは先に、マイクロ流路中の一部の領域の深さを細胞のサイズよりも小さくして細胞を捕捉する方法を開示している（非特許文献３）。 The inventors of the present application have previously disclosed a method of capturing cells by making the depth of a partial region in the microchannel smaller than the size of the cells (Non-patent Document 3).
非特許文献２記載のマイクロ化学チップを用いて細胞を捕捉し、RCA法を行って蛍光を蛍光顕微鏡で観察しようとすると、目的の細胞がなかなか見つからず、視野を変えながら細胞を探す必要があり不便であることがわかった。これは、流れを妨害しないように分散して配置されている複数のピラーのどのピラーに目的の細胞が捕捉されるか不明であり、また、細胞表面上の抗原とピラーに固相化された抗体との抗原抗体反応では適格に細胞を捕捉しにくいことが原因と考えられる。一方、非特許文献３記載の方法では、被検試料中に種々の細胞が含まれる際に所望の細胞のみを捕捉することが困難であり、また、破壊される細胞もかなり発生する。 When capturing cells using the microchemical chip described in Non-Patent Document 2, performing the RCA method and observing fluorescence with a fluorescence microscope, it is difficult to find the target cells, and it is necessary to search for cells while changing the field of view. It turned out to be inconvenient. It is unclear which of the multiple pillars arranged in a distributed manner so as not to impede the flow, and the target cells are captured, and the antigens on the cell surface and the pillars are immobilized. It is thought that the cause is that it is difficult to capture cells properly in the antigen-antibody reaction with the antibody. On the other hand, according to the method described in Non-Patent Document 3, it is difficult to capture only desired cells when various cells are contained in the test sample, and a considerable number of cells are destroyed.
従って、本発明の目的は、所望の種類の細胞のみを、破壊することなく的確に捕捉することができ、捕捉された細胞の顕微鏡下での観察が容易である、マイクロ化学チップを提供することである。 Therefore, an object of the present invention is to provide a microchemical chip that can accurately capture only a desired type of cells without destroying them, and allows easy observation of the captured cells under a microscope. It is.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、マイクロ流路内に、深さ又は幅が、捕捉しようとする細胞のサイズよりも小さいが、細胞が流通しても破壊されない寸法を有する細胞捕捉領域を設けるとともに、この細胞捕捉領域の表面に、捕捉すべき細胞表面上に発現している抗原と抗原抗体反応する抗体を固定化することにより、目的の細胞のみを破壊することなく的確に捕捉することができ、かつ、細胞捕捉領域の寸法を、顕微鏡の一視野で観察できる程度の大きさにすることにより、捕捉した細胞を顕微鏡下で容易に観察できることを見出し、本発明を完成した。 As a result of diligent research, the inventors of the present application have found a cell trapping region having a dimension that is smaller in depth or width than the size of a cell to be trapped in a microchannel, but is not destroyed even when the cell flows. In addition to immobilizing the antigen that reacts with the antigen expressed on the surface of the cell to be captured on the surface of the cell capture region, the target cell can be captured accurately without destroying it. And the size of the cell trapping region is set to such a size that it can be observed with a single field of view of the microscope, and the trapped cells can be easily observed under the microscope, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、特定の細胞を捕捉するためのマイクロ化学チップであって、基板と、該基板内に設けられたマイクロ流路を具備し、該マイクロ流路は細胞捕捉領域を有し、該細胞捕捉領域は、その深さ又は幅が、捕捉すべき細胞のサイズよりも小さく、かつ、細胞を破壊することなく挟み込むことができる寸法を有し、該細胞捕捉領域の表面には、捕捉すべき細胞表面上に発現している抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が固定化されているマイクロ化学チップを提供する。 That is, the present invention is a microchemical chip for capturing specific cells, comprising a substrate and a microchannel provided in the substrate, the microchannel having a cell capturing region, The cell trapping region has a depth or width that is smaller than the size of the cell to be trapped and can be sandwiched without destroying the cell. Provided is a microchemical chip on which an antibody or antigen-binding fragment thereof which reacts with an antigen expressed on the surface of a cell to be immobilized is immobilized.
本発明により、所望の種類の細胞のみを、破壊することなく的確に捕捉することができるマイクロ化学チップが初めて提供された。また、本発明のマイクロ化学チップにおいて、細胞捕捉領域の寸法を、顕微鏡の一視野で観察できる程度の大きさとすることにより、捕捉した細胞にRCA法を行った場合等、個々の細胞を顕微鏡で観察する際、容易に顕微鏡観察を行うことができる。 The present invention provides for the first time a microchemical chip that can accurately capture only a desired type of cell without destroying it. Further, in the microchemical chip of the present invention, the size of the cell capture region is set to such a size that it can be observed with a single field of view of the microscope. Microscopic observation can be easily performed when observing.
１０ 基板
１２ マイクロ流路
１４ ダム部
１６ 細胞捕捉領域
１８ 細胞捕捉領域に捕捉された細胞
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Board | substrate 12 Microchannel 14 Dam part 16 Cell capture area 18 Cell captured by cell capture area
本願発明のマイクロ化学チップは、マイクロ流路中に後で詳細に説明する細胞捕捉領域を設けた点を特徴とし、その他の点では、公知のマイクロ化学チップと同様である。すなわち、本発明のマイクロ化学チップを構成する基板は、従来のマイクロ化学チップと同様、ガラスや、ポリジメチルシロキサンのようなシリコーンゴムで形成することができる。基板内にはマイクロ流路が設けられている。マイクロ流路の断面形状は、矩形や逆台形等、向かい合う辺が平行な多角形が好ましい。マイクロ流路の深さは、通常、30〜500μｍ程度、好ましくは30〜50μｍ程度である。また、マイクロ流路の幅は、通常、50〜1000μｍ程度、好ましくは100〜300μｍ程度である。マイクロ流路の長さは何ら限定されないが、通常、1cm〜6cm程度である。なお、マイクロ流路の上面は、通常のマイクロ化学チップと同様、透明なガラス板やプラスチック板で被覆されている。 The microchemical chip of the present invention is characterized in that a cell capture region, which will be described in detail later, is provided in the microchannel, and is otherwise the same as a known microchemical chip. That is, the substrate constituting the microchemical chip of the present invention can be formed of glass or silicone rubber such as polydimethylsiloxane as in the conventional microchemical chip. A microchannel is provided in the substrate. The cross-sectional shape of the microchannel is preferably a polygon having parallel sides such as a rectangle or an inverted trapezoid. The depth of the microchannel is usually about 30 to 500 μm, preferably about 30 to 50 μm. The width of the microchannel is usually about 50 to 1000 μm, preferably about 100 to 300 μm. The length of the microchannel is not limited at all, but is usually about 1 cm to 6 cm. Note that the upper surface of the microchannel is covered with a transparent glass plate or plastic plate as in the case of a normal microchemical chip.
上記の通り、本発明のマイクロ化学チップでは、マイクロ流路に細胞捕捉領域が設けられている。細胞捕捉領域は、その深さ又は幅が、捕捉すべき細胞のサイズよりも小さくなっており、細胞捕捉領域を通過する細胞を、上面と下面又は両側面の間に挟み込むことができる。捕捉した細胞を顕微鏡下で観察する場合の容易さの観点から、深さを捕捉すべき細胞のサイズよりも小さくすることが好ましい。また、細胞捕捉領域の深さ又は幅（以下、簡便のため、細胞捕捉領域は、深さを細胞のサイズよりも小さい場合について記述するので「細胞捕捉領域の深さ又は幅」は「細胞捕捉領域の深さ」と記述する）は、細胞を破壊することなく挟み込むことができるサイズであり、好ましくは、捕捉すべき細胞のサイズの７０％以上、１００％未満、さらに好ましくは、７０％以上９０％以下である。ここで、「捕捉すべき細胞のサイズ」は、細胞が球形の場合にはその直径であり、球形以外の場合には、平行な２辺で細胞を挟んだ際に２辺の間の距離が最小となるように細胞を挟んだ際の２辺間の距離を意味する。従って、例えば、赤血球のような扁平な細胞の場合には、「細胞のサイズ」は、扁平な面を下にして細胞を載置した際の細胞の高さになる。細胞捕捉領域の深さが、捕捉すべき細胞のサイズの７０％以上の場合には、多くの場合、細胞は破壊されずに変形して細胞捕捉領域内に進入することができる。もっとも、破壊ができるだけ起きないように、細胞の種類に応じて、７０％以上〜１００％未満の範囲内で適宜選択することができる。 As described above, in the microchemical chip of the present invention, the cell capture region is provided in the microchannel. The depth or width of the cell trapping region is smaller than the size of the cell to be trapped, and cells passing through the cell trapping region can be sandwiched between the upper surface and the lower surface or both side surfaces. From the viewpoint of ease of observing captured cells under a microscope, it is preferable to make the depth smaller than the size of the cells to be captured. In addition, since the depth or width of the cell trapping region (hereinafter, for the sake of simplicity, the cell trapping region is described as having a depth smaller than the cell size, the “depth or width of the cell trapping region” is “cell trapping”. Is the size that can be sandwiched without destroying the cells, preferably 70% or more, less than 100%, more preferably 70% or more of the size of the cells to be captured. 90% or less. Here, the “size of the cell to be captured” is the diameter when the cell is spherical, and when the cell is not spherical, the distance between the two sides when the cell is sandwiched between two parallel sides is It means the distance between two sides when the cell is sandwiched so as to be minimized. Therefore, for example, in the case of flat cells such as red blood cells, the “cell size” is the height of the cell when the cell is placed with the flat surface down. When the depth of the cell trapping region is 70% or more of the size of the cell to be trapped, in many cases, the cell can be deformed without being destroyed and enter the cell trapping region. But it can select suitably in the range of 70% or more and less than 100% according to the kind of cell so that destruction may not occur as much as possible.
細胞捕捉領域の、細胞と接触する表面、すなわち、細胞捕捉領域の上面と下面には、捕捉すべき細胞表面上に発現している抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が固定化されている。例えば、がん細胞を捕捉しようとする場合、そのがん細胞の表面抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片が固定化されている。このような細胞表面抗原の例として、転移性乳癌細胞（MCF-7株等）のEpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)、同じく転移性乳癌細胞SKBR3株等のHER2等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。また、抗体に代えて、抗体の抗原結合性断片、すなわち、抗体のFab断片やF(ab')2等を固定化してもよい。 On the surface of the cell capture region that comes into contact with the cells, that is, on the upper and lower surfaces of the cell capture region, an antibody or an antigen-binding fragment thereof that reacts with the antigen expressed on the cell surface to be captured is immobilized. Has been. For example, when a cancer cell is to be captured, an antibody or antigen-binding fragment thereof that undergoes an antigen-antibody reaction with a surface antigen of the cancer cell is immobilized. Examples of such cell surface antigens include EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule) of metastatic breast cancer cells (MCF-7 strain and the like), HER2 and the like of metastatic breast cancer cells SKBR3 strain and the like. It is not limited. Further, instead of the antibody, an antigen-binding fragment of the antibody, that is, an antibody Fab fragment, F (ab ′) 2 or the like may be immobilized.
抗体又はその抗原結合性断片（以下、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、単に「抗体」と呼ぶ）を固相に固定化する方法自体は、免疫測定の分野で常用されており、周知である。基板がプラスチックの場合には、抗体の固定化は物理吸着でもよいが、共有結合により抗体を結合することが好ましい。共有結合により抗体を固相に結合する方法も周知であり、固相にアミノ基又はカルボキシル基を付与し、抗体のカルボキシル基又はアミノ基とアミド結合等により共有結合させることができる。例えば、ガラス基板の場合には、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)を作用させてアミノ基を固相に付与し、これを、カップリング試薬を介して抗体のＣ末端のカルボキシル基と共有結合させることができる。 A method of immobilizing an antibody or an antigen-binding fragment thereof (hereinafter simply referred to as “antibody” unless otherwise apparent from the context) on a solid phase is commonly used in the field of immunoassay, It is well known. When the substrate is plastic, the antibody may be immobilized by physical adsorption, but it is preferable to bind the antibody by a covalent bond. A method of binding an antibody to a solid phase by a covalent bond is also well known. An amino group or a carboxyl group can be imparted to the solid phase, and the antibody can be covalently bound to the carboxyl group or amino group by an amide bond or the like. For example, in the case of a glass substrate, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is allowed to act to give an amino group to the solid phase, and this is shared with the carboxyl group at the C-terminal of the antibody via a coupling reagent. Can be combined.
なお、本発明における「細胞捕捉領域」は、上記した寸法の深さを有し、かつ、上記した抗体が固相化されている領域を意味し、抗体が固定化されていない部分は、深さが上記した寸法であっても細胞捕捉領域とは呼ばない。細胞捕捉領域の平面的な寸法は、顕微鏡での観察が容易になるように、縦横いずれも500μｍ以下であることが好ましく、縦横いずれも50μｍ以上、500μｍ以下であることが好ましい。なお、細胞捕捉領域は、深さが浅くなるので、液の流通をできるだけ妨げないように、幅は、マイクロ流路の他の部分よりも広くすることが望ましい（深さが他の部分よりも浅く、幅が広い領域を便宜的に「ダム部」と呼ぶ）。ダム部の全部に抗体を固定化して細胞捕捉領域とすることもできるし、ダム部の一部にのみ抗体を固定化して細胞捕捉領域とすることもできる。なお、抗体は、細胞捕捉領域のみに固定化することが好ましいが、マイクロ化学チップ作製上の簡便さから、ダム部以外の流路にも抗体が固定化されていてもよい。この場合、ダム部以外の部分は、マイクロ流路の寸法による挟み込みがないため、細胞はそれほど抗体に結合されないので、実用上の問題はない。 The “cell capture region” in the present invention means a region having the above-mentioned depth and the above-mentioned antibody is immobilized on a solid phase, and the portion where the antibody is not immobilized is a depth. Even if the size is as described above, it is not called a cell trapping region. The planar dimension of the cell trapping region is preferably 500 μm or less in both vertical and horizontal directions, and preferably 50 μm or more and 500 μm or less in both vertical and horizontal directions so that observation with a microscope becomes easy. In addition, since the depth of the cell trapping region is shallow, it is desirable that the width is wider than the other part of the microchannel so that the flow of the liquid is not hindered as much as possible. The shallow and wide area is called the “dam” for convenience.) An antibody can be immobilized on the entire dam portion to form a cell capture region, or an antibody can be immobilized only on a part of the dam portion to form a cell capture region. Although the antibody is preferably immobilized only in the cell capture region, the antibody may be immobilized in a flow path other than the dam portion for the convenience of manufacturing the microchemical chip. In this case, since the portion other than the dam portion is not sandwiched by the dimensions of the microchannel, the cell is not so much bound to the antibody, so there is no practical problem.
マイクロ化学チップを使用する際には、捕捉すべき細胞を含む被検試料液（細胞浮遊液）をマイクロ流路の一端からシリンジポンプ等により注入する。この際の流速は、できるだけ多くの細胞が破壊されることなく捕捉され、かつ、捕捉すべき細胞とサイズが同様な他の細胞も被検試料液中に含まれる場合には、できるだけ捕捉すべき細胞のみが捕捉されるように適宜設定する。流速は、通常、0.3〜6 mm/sec、好ましくは0.5〜4 mm/sec程度である。 When using a microchemical chip, a test sample solution (cell suspension) containing cells to be captured is injected from one end of the microchannel with a syringe pump or the like. In this case, the flow rate should be as much as possible when as many cells as possible are captured without being destroyed, and other cells of the same size as the cells to be captured are also included in the test sample solution. Set appropriately so that only cells are trapped. The flow rate is usually about 0.3 to 6 mm / sec, preferably about 0.5 to 4 mm / sec.
被検試料液が細胞捕捉領域に到達すると、目的の細胞は、細胞捕捉領域において、上面と下面の間に挟み込まれると共に、細胞表面の抗原が、細胞捕捉領域に固定化されている抗体と抗原抗体反応して細胞捕捉領域に捕捉される。一方、捕捉しようとしていない細胞は、そのサイズから細胞捕捉領域に入れないか、又は、入った場合でも抗体と結合しないために細胞捕捉領域を素通りする。これにより、所定の表面抗原を発現する目的の細胞だけが捕捉される。 When the test sample solution reaches the cell capture region, the target cell is sandwiched between the upper surface and the lower surface in the cell capture region, and the antigen on the cell surface is immobilized on the cell capture region. The antibody reacts and is captured in the cell capture region. On the other hand, cells that are not to be captured do not enter the cell capture region due to their size or pass through the cell capture region because they do not bind to the antibody even when they enter. Thereby, only the target cell expressing a predetermined surface antigen is captured.
捕捉した目的の細胞は、in situ RCA法やFISH法等の周知の方法で検査することができる。これにより、がんの診断や研究、各種遺伝病の診断や研究、感染症の診断や研究、各種治療薬（抗癌剤等）が有効か否かの事前予測等を行うことができる。特に、本発明によれば、単一の細胞を捕捉することができるので、単一の細胞について、上記の診断や研究を行うことができる。また、in situ RCA法等によれば、単一分子を検出できるので、本発明のマイクロ化学チップを用いることにより単一細胞中の単一分子を検出することができる。これらの検査を行う場合、検査に必要な試薬類も、マイクロ流路の一端から注入して供給することができる。例えば、in situ RCA法を行う場合、細胞を上記の通り捕捉した後、必要な試薬を順次マイクロ流路の一端からシリンジポンプ等により注入して供給することができる。in situ RCA法自体は周知であり、非特許文献３にも記載されており、下記参考例にも詳しく記載されている。 The captured target cells can be examined by a known method such as in situ RCA method or FISH method. Thereby, it is possible to perform cancer diagnosis and research, diagnosis and research of various genetic diseases, diagnosis and research of infectious diseases, prior prediction as to whether or not various therapeutic agents (such as anticancer agents) are effective. In particular, according to the present invention, since a single cell can be captured, the above diagnosis and research can be performed on a single cell. In addition, according to the in situ RCA method or the like, a single molecule can be detected, and therefore a single molecule in a single cell can be detected by using the microchemical chip of the present invention. When performing these inspections, reagents necessary for the inspection can also be supplied by being injected from one end of the microchannel. For example, when the in situ RCA method is performed, after the cells are captured as described above, necessary reagents can be sequentially injected from one end of the microchannel and supplied by a syringe pump or the like. The in situ RCA method itself is well known and is described in Non-Patent Document 3, and is also described in detail in the following reference example.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
１．マイクロ化学チップの作製
図１に模式的に示すマイクロ化学チップを作製した。図１中、１０はガラス基板、１２はマイクロ流路、１４がダム部、１６がダム部に設けられた細胞捕捉領域、１８は細胞捕捉領域に捕捉された細胞である。本実施例では、マイクロ流路の長さが60mm、幅が0.2mm、深さが30μｍであり、ダム部の長さが10mm、幅が500μｍ、深さが16μｍである。このマイクロ化学チップは具体的には次のようにして作製した。材料は3x7 cm ホウケイ酸ガラス(テンパックスまたはパイレックス（登録商標）)である。上板は厚さ0.7 mmで、フォトリソグラフィーによるパターン形成とフッ化水素酸によるウェットエッチングにより流路を加工し、さらに溶液導入用の孔をドリルで作製している。下板は厚さ0.2 mmのガラスを使用している。上板と下板をパイレックス（登録商標）は650℃、 テンパックスは 635℃で5時間程度熱融着している。
1. Production of Microchemical Chip A microchemical chip schematically shown in FIG. 1 was produced. In FIG. 1, 10 is a glass substrate, 12 is a microchannel, 14 is a dam portion, 16 is a cell trapping region provided in the dam portion, and 18 is a cell trapped in the cell trapping region. In this embodiment, the length of the microchannel is 60 mm, the width is 0.2 mm, the depth is 30 μm, the length of the dam portion is 10 mm, the width is 500 μm, and the depth is 16 μm. Specifically, this microchemical chip was produced as follows. The material is 3x7 cm borosilicate glass (Tempax or Pyrex (R)). The upper plate is 0.7 mm thick, and the flow path is processed by pattern formation by photolithography and wet etching with hydrofluoric acid, and a hole for introducing a solution is created by a drill. The lower plate is 0.2 mm thick glass. The upper and lower plates are heat-sealed at 650 ° C for Pyrex (registered trademark) and 635 ° C for Tempax for about 5 hours.
２．抗体の固定化
本実施例では、捕捉すべき細胞が転移性乳癌細胞株であるMCF-7細胞であるので、その表面に発現している抗原であるEpCAMに対する市販の抗体をダム部の一部の表面上に固定化した。
2. In this example, since the cells to be captured are MCF-7 cells, which are a metastatic breast cancer cell line, a commercially available antibody against EpCAM, which is an antigen expressed on the surface thereof, is part of the dam part. Immobilized on the surface.
まず、シランカップリング剤であるAPTESを結合させてマイクロ流路にアミノ基を付与した。この操作は具体的に次のようにして行った。まずマイクロ流路を1 M NaOH で洗浄してシラノール基を表出させた。その後、水洗浄、ホットプレートでの乾燥をさせ、70℃で40 分から1 時間真空引きをしながらAPTES の気相修飾を行った。次に120℃で2 時間ベイクした。この後に接触角を見て修飾されていることを確認した。APTES で修飾されていれば水の接触角約70°まで疎水化されていた。そして、毛管力によって抗体溶液100 μg/mL〜1 mg/mL を導入し室温で4時間から一晩静置した。抗体としてはCTC 細胞において発現が知られており、上皮細胞にみられるEpCAM（Epithelial cell adhesion molecule）をFITC で蛍光ラベルしたものを使用した（LifeSpan BioScience 製 EPCAM Mouse anti-HumanMonoclonal (FITC) Antibody）。なお、蛍光標識した抗体を用いたのは、抗体がマイクロ流路に固定化されたことを確認するためである。APTES を修飾したチャネルと未修飾チャネルを比較すると、修飾チャネルにのみ抗体をラベルしているFITC 由来の蛍光が観測されたことから、アミノ基を介した抗体の結合が行われたことを確認した。 First, APTES, which is a silane coupling agent, was bonded to give an amino group to the microchannel. This operation was specifically performed as follows. First, the microchannel was washed with 1 M NaOH to expose silanol groups. Thereafter, it was washed with water and dried on a hot plate, and APTES was subjected to gas phase modification while evacuating at 70 ° C. for 40 minutes to 1 hour. Next, it was baked at 120 ° C. for 2 hours. After that, it was confirmed that the surface was modified by looking at the contact angle. If modified with APTES, it was hydrophobized to a contact angle of about 70 ° with water. Then, 100 μg / mL to 1 mg / mL of the antibody solution was introduced by capillary force and left at room temperature for 4 hours to overnight. The antibody is known to be expressed in CTC cells, and EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule) found in epithelial cells is fluorescently labeled with FITC (EPCAM Mouse anti-HumanMonoclonal (FITC) Antibody manufactured by LifeSpan BioScience). The reason why the fluorescently labeled antibody was used was to confirm that the antibody was immobilized in the microchannel. When comparing the APTES-modified channel with the unmodified channel, FITC-derived fluorescence was observed, which labeled the antibody only on the modified channel, confirming that the antibody was bound via the amino group. .
３．細胞の選択的捕捉
捕捉すべき細胞であるMCF-7細胞と、EpCAMを表面に発現していない白血球細胞株RPMI1788（ともにヒューマンサイエンス研究資源バンクから分譲）を緩衝液中にそれぞれ106個/mL程度の濃度で含む細胞浮遊液を被検試料液とした。これを、マイクロ流路の一端から、シリンジポンプにより種々の流速で注入した。比較のため、抗体を固定化していない、同じ寸法のマイクロ流路（同じ寸法のダム部を有する）を用いて同じ実験を行った。
3. Selective capture of cells 10 6 cells / mL each of MCF-7 cells to be captured and white blood cell line RPMI1788 (both from Human Science Research Resource Bank) not expressing EpCAM in the buffer A cell suspension containing a moderate concentration was used as a test sample solution. This was injected from one end of the microchannel with a syringe pump at various flow rates. For comparison, the same experiment was performed using microchannels having the same dimensions (having dam portions having the same dimensions) to which antibodies were not immobilized.
結果を図２に示す。図２中、横軸は流速、縦軸は捕捉率を示す。「抗原抗体あり」は、抗体を固定化した細胞捕捉領域におけるMCF-7細胞についての結果を示し、「抗原なし」は、抗体を固定化した細胞捕捉領域におけるRPMI1788の捕捉率を示し、「抗体なし」は、抗体を固定化していないダム部におけるMCF-7細胞についての結果を示す。抗体を固定化した本発明のマイクロ流路を用い、流速を2mm/secとすることにより、MCF-7細胞のみを選択的に捕捉することができた。これにより、本発明のマイクロ化学チップを用いて、目的の種類の細胞を選択的に捕捉することができることがわかる。また、図１下部の顕微鏡写真に示す通り、100μm四方の視野を取れば、捕捉された複数の細胞を観察可能であった。 The results are shown in FIG. In FIG. 2, the horizontal axis indicates the flow velocity, and the vertical axis indicates the capture rate. “With antigen antibody” indicates the result for MCF-7 cells in the cell capture region where the antibody is immobilized, “No antigen” indicates the capture rate of RPMI1788 in the cell capture region where the antibody is immobilized, “None” shows the results for MCF-7 cells in a dam where antibodies were not immobilized. Only the MCF-7 cells could be selectively captured by using the microchannel of the present invention on which the antibody was immobilized and the flow rate of 2 mm / sec. Thus, it can be seen that the desired type of cells can be selectively captured using the microchemical chip of the present invention. In addition, as shown in the micrograph at the bottom of FIG. 1, a plurality of captured cells could be observed if a 100 μm square field was taken.
参考例
in situ RCA法
上記のようにして本発明のマイクロ化学チップにより細胞を捕捉すれば、その細胞についてin situ RCA法を行い、細胞に含まれる特定のDNAを特異的に検出することができる。以下、マイクロ流路のダム部（深さ８μm）に捕捉された白血病細胞(HL-60)について、そのミトコンドリアDNAを検出する方法を具体的に記載する。
Reference example
In situ RCA method When cells are captured by the microchemical chip of the present invention as described above, the cells can be subjected to the in situ RCA method to specifically detect specific DNA contained in the cells. Hereinafter, a method for detecting mitochondrial DNA of leukemia cells (HL-60) trapped in a dam part (depth 8 μm) of the microchannel will be specifically described.
(1) 固定
シリンジポンプによって流量を制御しながら細胞を導入した。細胞は4％パラホルムアルデヒド-リン酸緩衝液に懸濁してから導入し、捕捉後室温で30 分程度静置させた。その後、1xPBS で1μL/min、10分洗浄した。
(2) 細胞膜透過
0.1M塩酸を1μL/min で2 分間導入し、すぐに1xPBS で1 μL/min、10 分洗浄した。
(3) 制限酵素分解
反応溶液を1 μL/min で10 分間導入した。37℃で40 分間静置し、洗浄バッファー（0.1 M Tris-HCl pH7.5、0.15 M NaCl、0.05% Tween 20）で1 μL/min、10 分洗浄した。
(4) ライゲーション
反応溶液を1 μL/min で10 分間導入した。37℃で20 分間静置し、洗浄バッファーで1 μL/min、10 分洗浄した。
(5) RCA
反応溶液を1 μL/min で10 分間導入した。30℃で90 分間静置し、洗浄バッファーで1 μL/min、10 分洗浄した。
(6) 蛍光プローブハイブリダイゼーション
反応溶液を1 μL/min で10 分間導入した。37℃で20 分間静置し、洗浄バッファーで1 μL/min、10 分洗浄した。
(7) 核染色
1xPBS で2 μg/mL に希釈したDAPI を1 μL/min で1 分間導入し、すぐに1xPBS で洗浄し、観察した。また、反応中に流れを発生させると、反応し終わる前に流出してしまうことが考えられたので、流れを止めて反応させた。
(1) Cells were introduced while controlling the flow rate with a fixed syringe pump. The cells were introduced after being suspended in 4% paraformaldehyde-phosphate buffer, and allowed to stand at room temperature for about 30 minutes after capture. Thereafter, the plate was washed with 1 × PBS at 1 μL / min for 10 minutes.
(2) Cell membrane permeation
0.1 M hydrochloric acid was introduced at 1 μL / min for 2 minutes and immediately washed with 1 × PBS at 1 μL / min for 10 minutes.
(3) The restriction enzyme decomposition reaction solution was introduced at 1 μL / min for 10 minutes. The plate was allowed to stand at 37 ° C. for 40 minutes, and washed with a washing buffer (0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20) at 1 μL / min for 10 minutes.
(4) The ligation reaction solution was introduced at 1 μL / min for 10 minutes. The plate was allowed to stand at 37 ° C. for 20 minutes and washed with a washing buffer at 1 μL / min for 10 minutes.
(5) RCA
The reaction solution was introduced at 1 μL / min for 10 minutes. The plate was allowed to stand at 30 ° C. for 90 minutes, and washed with a washing buffer at 1 μL / min for 10 minutes.
(6) The fluorescent probe hybridization reaction solution was introduced at 1 μL / min for 10 minutes. The plate was allowed to stand at 37 ° C. for 20 minutes, and washed with a washing buffer at 1 μL / min for 10 minutes.
(7) Nuclear staining
DAPI diluted to 2 μg / mL with 1 × PBS was introduced at 1 μL / min for 1 minute, immediately washed with 1 × PBS, and observed. In addition, if a flow was generated during the reaction, it was thought that it would flow out before the reaction was completed, so the flow was stopped and the reaction was performed.
なお、用いたパッドロックプローブ及び検出プローブの塩基配列は次の通りであった。
パッドロックプローブ
5'-P-CTGCCATCTTAACAACCTTTCCTACGACCTCAATGCACATGTTTGGCTCCTCCTTCTGCGATTACCGGGCC（配列番号１）
検出プローブ
5'-FITC-CCTCAATGCACATGTTTGGCTCC（配列番号２）
The base sequences of the padlock probe and detection probe used were as follows.
Padlock probe
5'-P-CTGCCATCTTAACAACCTTTCCTACGACCTCAATGCACATGTTTGGCTCCTCCTTCTGCGATTACCGGGCC (SEQ ID NO: 1)
Detection probe
5'-FITC-CCTCAATGCACATGTTTGGCTCC (SEQ ID NO: 2)
プローブ濃度と、測定されたシグナル数との関係を図３に示す。理論値以上のシグナルを検出したことから、ターゲットが少量であっても一分子レベルで確実に検出することが可能であるといえる。またプローブ濃度の上昇に従ってシグナル数も上昇していることから、このシグナルは増幅産物由来のものであるといえるので、in situ RCA 法をマイクロ化学チップへ集積化することに成功したといえる。 The relationship between the probe concentration and the number of signals measured is shown in FIG. Since a signal exceeding the theoretical value was detected, it can be said that it can be reliably detected at a single molecule level even with a small amount of target. In addition, since the number of signals increases as the probe concentration increases, it can be said that this signal is derived from the amplification product. Therefore, it can be said that the in situ RCA method was successfully integrated on the microchemical chip.
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|---|---|---|---|---|
| JP2018059931A (en) * | 2016-09-30 | 2018-04-12 | アークレイ株式会社 | Method and device for magnetically labeling particles |
| CN109852544A (en) * | 2019-03-29 | 2019-06-07 | 欧阳东方 | Cell separation micro-fluidic chip and its application in tumour cell separation, cell isolation and identification method |
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2011
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|---|---|---|---|---|
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| CN109852544A (en) * | 2019-03-29 | 2019-06-07 | 欧阳东方 | Cell separation micro-fluidic chip and its application in tumour cell separation, cell isolation and identification method |
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