JP2012178997A - Method for improving oxidase activity - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素活性を高め、これらの酸化酵素反応の効率を向上させることができる技術、とりわけバイオ燃料電池における負極で電子を放出させる酵素反応系に好適に適用される技術に関する。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is suitably applied to a technology that can enhance the enzyme activity of glucose dehydrogenase and / or diaphorase and improve the efficiency of these oxidase reactions, particularly an enzyme reaction system that releases electrons at the negative electrode in a biofuel cell. Technology.
近年、負極又は正極の少なくとも一方の電極上に触媒として酸化還元酵素を固定したバイオ燃料電池が注目されている。このバイオ燃料電池は、グルコース等の燃料を酵素により分解してプロトン（Ｈ+）と電子とに分離することにより、燃料の持つ化学エネルギーを電気エネルギーに直接変換することが可能になっている。現在では、バイオ燃料電池は、大規模発電、自動車の駆動用電源、パソコンやモバイル機器等のポータブル電源等への幅広い応用が試みられている。 In recent years, biofuel cells in which an oxidoreductase is immobilized as a catalyst on at least one of a negative electrode and a positive electrode have attracted attention. In this biofuel cell, fuel such as glucose is decomposed by an enzyme and separated into protons (H + ) and electrons, whereby the chemical energy of the fuel can be directly converted into electric energy. At present, biofuel cells have been widely applied to large-scale power generation, power sources for driving automobiles, portable power sources such as personal computers and mobile devices.
グルコースを燃料として用いるバイオ燃料電池は、負極でグルコースの酸化反応が進行し、正極で大気中の酸素の還元反応が進行するように構成されている。当該バイオ燃料電池の代表的なものは、負極においては、グルコース、グルコースデヒドロゲナーゼ、補酵素、ジアホラーゼ、電子メディエーター、電極の順で、電子が受け渡されるように設計されている。 A biofuel cell using glucose as a fuel is configured such that an oxidation reaction of glucose proceeds at the negative electrode and a reduction reaction of oxygen in the air proceeds at the positive electrode. A typical biofuel cell is designed such that, in the negative electrode, electrons are delivered in the order of glucose, glucose dehydrogenase, coenzyme, diaphorase, electron mediator, and electrode.
一方、一般に、酵素反応は、生成物やエフェクター分子との結合によって反応過程で反応速度が頭打ちになる場合が多い。このような酵素反応が頭打ちとなる現象は、酵素反応を利用する技術分野で問題となっており、バイオ燃料電池の場合もその例外ではない。即ち、バイオ燃料電池の実用化への障壁の一つとして、電極における酵素反応が頭打ちになり、負極から正極に受け渡される電子量が少なく、他の燃料電池に比して出力が小さいという問題が挙げられる。そのため、バイオ燃料電池において、酸化酵素（特に、グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼ）の反応効率を向上させ得る技術を開発できれば、バイオ燃料電池の実用化に多大なる貢献をもたらすと考えられる。 On the other hand, in general, the reaction rate of an enzyme reaction often reaches its peak during the reaction process due to binding with a product or an effector molecule. Such a phenomenon that the enzyme reaction reaches its peak is a problem in the technical field using the enzyme reaction, and the case of a biofuel cell is no exception. That is, as one of the barriers to the practical application of biofuel cells, the enzyme reaction at the electrode has stopped, the amount of electrons transferred from the negative electrode to the positive electrode is small, and the output is small compared to other fuel cells. Is mentioned. Therefore, if a technology capable of improving the reaction efficiency of oxidase (especially glucose dehydrogenase and diaphorase) in a biofuel cell can be developed, it is considered that this will greatly contribute to the practical use of the biofuel cell.
従来、酵素反応において、酵素活性を高める技術は報告されている。例えば、非特許文献１には、アルコールを酵素反応溶液に添加することにより酵素活性を向上させる方法が開示されている。非特許文献２には、ポリエチレングリコールを酵素反応溶液に添加することによって、酵素活性を向上できることが開示されている。非特許文献３には、グリシンが酵素活性を向上させることも開示されている。特許文献１には、特定構造のベタイン誘導体が酵素活性を向上させることも開示されている。しかしながら、酵素の種類は多種多様であり、酵素活性を高める技術は、使用する酵素の種類に応じて検討しなければならず、非特許文献１〜３及び特許文献１に開示されている技術も、あらゆる酵素の活性向上に適用できる訳ではない。実際に、非特許文献１〜３及び特許文献１に開示されている技術を適用しても、酵素活性の向上が認められない酵素も多数存在することが確認されている。更に、非特許文献１〜３及び特許文献１には、酸化酵素の活性を向上させる技術的手段については一切開示されていない。 Conventionally, techniques for increasing enzyme activity in enzyme reactions have been reported. For example, Non-Patent Document 1 discloses a method for improving enzyme activity by adding alcohol to an enzyme reaction solution. Non-Patent Document 2 discloses that enzyme activity can be improved by adding polyethylene glycol to an enzyme reaction solution. Non-Patent Document 3 also discloses that glycine improves enzyme activity. Patent Document 1 also discloses that a betaine derivative having a specific structure improves enzyme activity. However, there are a wide variety of enzymes, and techniques for increasing enzyme activity must be examined according to the type of enzyme used, and techniques disclosed in Non-Patent Documents 1 to 3 and Patent Document 1 are also available. It cannot be applied to improve the activity of all enzymes. In fact, it has been confirmed that even if the techniques disclosed in Non-Patent Documents 1 to 3 and Patent Document 1 are applied, there are many enzymes that do not show an improvement in enzyme activity. Further, Non-Patent Documents 1 to 3 and Patent Document 1 do not disclose any technical means for improving the activity of oxidase.
従来、酸化酵素の酵素活性を高めて、反応効率を向上させるための具体的解決策は提言されていない。特に、バイオ燃料電池の出力増加をもたらし得る酸化酵素の活性を向上させる手法については、何ら知られていない。
そこで、本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素活性を高め、これらの酸化酵素反応の効率を向上させる技術、とりわけ、バイオ燃料電池の出力増加をもたらし得る酵素反応技術を提供することを目的とする。
Conventionally, no specific solution has been proposed for increasing the enzyme activity of oxidase and improving the reaction efficiency. In particular, there is no known technique for improving the activity of an oxidase that can increase the output of a biofuel cell.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a technique for enhancing the enzyme activity of glucose dehydrogenase and / or diaphorase and improving the efficiency of these oxidase reactions, particularly an enzyme reaction technique capable of increasing the output of a biofuel cell. And
本発明者等は、上記課題を解決すべき鋭意検討を行ったところ、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応において、特定構造のベタイン誘導体を添加することによって、酵素反応効率を著しく向上させることが可能になることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。 As a result of diligent studies to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention significantly improve the enzyme reaction efficiency by adding a betaine derivative having a specific structure in an enzyme reaction using glucose dehydrogenase and / or diaphorase. I found out that it would be possible. The present invention has been completed by further studies based on such knowledge.
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 下記一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応を行うことを特徴とする、酵素反応方法。
項２． グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼを組み合わせて同一反応系で酵素反応を行う、項１に記載の酵素反応方法。
項３． グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの少なくとも１つ及び下記一般式(1)に示すベタイン誘導体を含む負極を有する、バイオ燃料電池。
項４． 下記一般式(1)に示すベタイン誘導体からなる、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤。
項５． 項１又は２に記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼ、並びに一般式(1)に示すベタイン誘導体を含有する、前記キット。
Item 1. An enzyme reaction method comprising performing an enzyme reaction using glucose dehydrogenase and / or diaphorase in the presence of a betaine derivative represented by the following general formula (1).
Item 2. Item 2. The enzyme reaction method according to Item 1, wherein the enzyme reaction is performed in the same reaction system by combining glucose dehydrogenase and diaphorase.
Item 3. A biofuel cell comprising a negative electrode comprising at least one of glucose dehydrogenase and diaphorase and a betaine derivative represented by the following general formula (1).
Item 4. An agent for improving the enzymatic reaction efficiency of glucose dehydrogenase and / or diaphorase, comprising a betaine derivative represented by the following general formula (1).
本発明によれば、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応において、酵素反応効率を向上させることにより、グルコースからプロトンと電子の遊離、又は酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）とプロトンによる還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等）の生成を効率的に進行させることができる。特に、本発明は、グルコースを燃料として用いたバイオ燃料電池における電極反応系に好適に適用することができ、バイオ燃料電池の出力増加に寄与し得る。 According to the present invention, in the enzyme reaction using glucose dehydrogenase and / or diaphorase, the release of protons and electrons from glucose or the oxidized coenzyme (NAD + , NADP + etc.) is improved by improving the enzyme reaction efficiency. Production of reduced coenzymes (NADH, NADPH, etc.) by protons can be efficiently advanced. In particular, the present invention can be suitably applied to an electrode reaction system in a biofuel cell using glucose as a fuel, and can contribute to an increase in the output of the biofuel cell.
１．酵素反応方法
本発明の酵素反応方法は、一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応を行うことを特徴とする。
1. Enzyme Reaction Method The enzyme reaction method of the present invention is characterized in that an enzyme reaction using glucose dehydrogenase and / or diaphorase is performed in the presence of a betaine derivative represented by the general formula (1).
本発明で使用するベタイン誘導体は、以下の一般式(1)に示す構造である。
一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数１〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１〜４の直鎖状のアルキル基を示す。
また、一般式(1)中、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３ −を示す。
また、一般式(1)中、ｎは、１〜５、好ましくは１〜３、更に好ましくは１又は３の整数を示す。
In the general formula (1), R1 to R3 are the same or different and are linear or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, preferably linear or branched alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms, Preferably it shows a C1-C4 linear alkyl group.
Further, in the general formula (1), R4 is, COO - or SO 3 - shows the.
In general formula (1), n represents an integer of 1 to 5, preferably 1 to 3, and more preferably 1 or 3.
グルコースデヒドロゲナーゼの酵素反応に使用する場合には、一般式(1)に示すベタイン誘導体の中でも、好ましくは、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数２〜４の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数２又は４の直鎖状のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、更に好ましくは１であるもの；或いはR1〜R3が、炭素数１〜３の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数２の直鎖状のアルキル基、R4が、ＳＯ３ −、且つｎが２〜４の整数、更に好ましくは３であるものが例示される。 When used for the enzyme reaction of glucose dehydrogenase, among the betaine derivatives represented by the general formula (1), preferably, in the general formula (1), R1 to R3 are linear alkyl having 2 to 4 carbon atoms. A group, more preferably a linear alkyl group having 2 or 4 carbon atoms, R 4 is COO − , and n is an integer of 1 to 3, more preferably 1, or R 1 to R 3 are carbon atoms of 1 to 3 straight chain alkyl group, more preferably a linear alkyl group having 2 carbon atoms, R4 is, SO 3 -, and n is an integer of 2 to 4, is exemplified even more preferably 3 The
また、ジアホラーゼの酵素反応に使用する場合には、一般式(1)に示すベタイン誘導体の中でも、好ましくは、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数１〜４の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１〜３の直鎖状のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、更に好ましくは１であるもの；或いはR1〜R3が、炭素数１〜３の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１の直鎖状のアルキル基、R4が、ＳＯ３ −、且つｎが２〜４の整数、更に好ましくは３であるものが例示される。 In addition, when used for the enzyme reaction of diaphorase, among the betaine derivatives represented by the general formula (1), preferably, in the general formula (1), R1 to R3 are linear ones having 1 to 4 carbon atoms. An alkyl group, more preferably a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, R4 is COO − , and n is an integer of 1 to 3, more preferably 1, or R1 to R3 are carbon numbers A linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a linear alkyl group having 1 carbon atom, R 4 is SO 3 − , and n is an integer of 2 to 4, more preferably 3. Is done.
更に、グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼの双方を用いて同一の反応系内で双方の酸化酵素による酵素反応を行う場合には、一般式(1)に示すベタイン誘導体の中でも、好ましくは、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数２〜３の直鎖状のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、更に好ましくは１であるもの；或いはR1〜R3が、炭素数２〜３の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数２の直鎖状のアルキル基、R4が、ＳＯ３ −、且つｎが２〜４の整数、更に好ましくは３であるものが例示される。とりわけ、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数２のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、特に１であるものが、双方の酸化酵素の活性を顕著に向上させ得るので好適である。 Further, in the case of performing an enzyme reaction with both oxidases in the same reaction system using both glucose dehydrogenase and diaphorase, among the betaine derivatives represented by the general formula (1), preferably the general formula (1) R1 to R3 are linear alkyl groups having 2 to 3 carbon atoms, R4 is COO − , and n is an integer of 1 to 3, more preferably 1, or R1 to R3 is carbon. A linear alkyl group having 2 to 3 carbon atoms, more preferably a linear alkyl group having 2 carbon atoms, R 4 is an SO 3 − , and n is an integer of 2 to 4, more preferably 3. Illustrated. In particular, in the general formula (1), R1 to R3 are alkyl groups having 2 carbon atoms, R4 is COO − , and n is an integer of 1 to 3, particularly 1, and the activities of both oxidases are This is preferable because it can be remarkably improved.
一般式(1)に示すベタイン誘導体の製造方法については、例えば、特開2009-96766号公報等で公知であり、更に公知の有機合成法から導き出されるものである。 A method for producing a betaine derivative represented by the general formula (1) is known, for example, in JP-A-2009-96766 and is derived from a known organic synthesis method.
本発明の酵素反応方法では、酸化酵素として、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを使用する。 In the enzyme reaction method of the present invention, glucose dehydrogenase and / or diaphorase is used as the oxidase.
グルコースデヒドロゲナーゼは、酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）の存在下でグルコースを脱水素してグルコノ−δ−ラクトンとプロトンを生成させる。当該反応によって、酸化型補酵素は、還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等）に変換される。
本発明に使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、上記反応を行うことができる限り、その種類については、特に制限されないが、ＮＡＤ＋依存型のグルコースデヒドロゲナーゼが好ましい。また、本発明では、酵素反応効率を一層向上させるために、耐熱性のグルコースデヒドロゲナーゼを使用してもよい。
また、本発明に使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、微生物から単離したもの、その変異体、遺伝子組換技術により製造したもの等であってもよい。
Glucose dehydrogenase dehydrogenates glucose in the presence of oxidized coenzymes (NAD + , NADP +, etc.) to produce glucono-δ-lactone and protons. By this reaction, the oxidized coenzyme is converted into a reduced coenzyme (NADH, NADPH, etc.).
The type of glucose dehydrogenase used in the present invention is not particularly limited as long as the above reaction can be performed, but NAD + dependent glucose dehydrogenase is preferable. In the present invention, a thermostable glucose dehydrogenase may be used in order to further improve the enzyme reaction efficiency.
The glucose dehydrogenase used in the present invention may be isolated from microorganisms, mutants thereof, those produced by gene recombination techniques, and the like.
また、ジアホラーゼは、電子受容体の存在下で、還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）を酸化して、酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）とプロトンと電子を生成させる。当該反応によって、還元型補酵素１分子あたり、酸化型補酵素１分子と、プロトン１個と、電子２個が生成する。生成した電子は電子受容体の還元に使用され、電子受容体は電子供与体に変換される。
本発明に使用されるジアホラーゼは、上記反応を行うことができる限り、その種類については、特に制限されないが、ＮＡＤＨを還元できるものが好ましい。また、本発明では、酵素反応効率を一層向上させるために、耐熱性のジアホラーゼを使用してもよい。
また、本発明に使用されるジアホラーゼは、微生物から単離したもの、その変異体、遺伝子組換技術により製造したもの等であってもよい。
Diaphorase oxidizes reduced coenzymes (NADH, NADPH) in the presence of an electron acceptor to generate oxidized coenzymes (NAD + , NADP + etc.), protons and electrons. By the reaction, one oxidized coenzyme molecule, one proton, and two electrons are generated per reduced coenzyme molecule. The generated electrons are used for reduction of the electron acceptor, and the electron acceptor is converted into an electron donor.
The type of diaphorase used in the present invention is not particularly limited as long as the above reaction can be performed, but those capable of reducing NADH are preferable. In the present invention, thermostable diaphorase may be used in order to further improve the enzyme reaction efficiency.
The diaphorase used in the present invention may be isolated from microorganisms, mutants thereof, those produced by gene recombination techniques, and the like.
また、ジアホラーゼによる酵素反応で使用される電子受容体としては、バイオ燃料電池の電子メディエーターとして使用し得る物質、即ち酸化と還元を可逆的に行う物質であることが好ましく、このような電子受容体としては、２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン（Ｑ０）や、ナフトキノン骨格を有する化合物、例えば、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）、２−アミノ−３−メチル−１，４−ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２−メチル−１，４−ナフトキノン（ＶＫ３）、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、ビタミンＫ１等のナフトキノン誘導体；フェロセンメタノール等のフェロセン誘導体；フェリシアン化カリウム；オスミウム錯体；ルテニウム錯体；フェノチアジン誘導体；フェナジンメトサルフェート誘導体；ｐ−アミノフェノール；メルドーラブルー；２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等が挙げられる。これらの電子受容体は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。 The electron acceptor used in the enzyme reaction with diaphorase is preferably a substance that can be used as an electron mediator of a biofuel cell, that is, a substance that reversibly oxidizes and reduces, and such an electron acceptor. 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone (Q0) and compounds having a naphthoquinone skeleton, such as 2-amino-1,4-naphthoquinone (ANQ), 2-amino-3- Naphthoquinone derivatives such as methyl-1,4-naphthoquinone (AMNQ), 2-methyl-1,4-naphthoquinone (VK3), 2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone (ACNQ), vitamin K1, and the like; ferrocenemethanol Ferrocene derivatives; potassium ferricyanide; osmium complexes; ruthenium complexes; phenothiazine derivatives Body; phenazine methosulfate derivative; p-aminophenol; Mel Dora blue; 2,6-dichlorophenol indophenol, and the like. These electron acceptors may be used alone or in combination of two or more.
本発明の酵素反応では、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを使用する従来の酵素反応系に、上記一般式(1)に示すベタイン誘導体を添加することにより行われる。 The enzyme reaction of the present invention is performed by adding a betaine derivative represented by the above general formula (1) to a conventional enzyme reaction system using glucose dehydrogenase and / or diaphorase.
本発明の酵素反応において、酵素、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素、基質等の濃度については、特に制限されず、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼが使用される酵素反応での一般的な濃度範囲であればよい。 In the enzyme reaction of the present invention, the concentration of the enzyme, the betaine derivative represented by the general formula (1), the coenzyme, the substrate, etc. is not particularly limited, and is general in an enzyme reaction in which glucose dehydrogenase and / or diaphorase is used. Any concentration range may be used.
例えば、酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを使用する場合、反応開始時に、適量のグルコースデヒドロゲナーゼの存在下で、グルコース１モル当たり、酸化型補酵素を0.0001〜0.5モル、一般式(1)に示すベタイン誘導体を0.01〜3モルの比率で共存させればよい。 For example, when glucose dehydrogenase is used as the enzyme, 0.0001 to 0.5 mol of oxidized coenzyme and 0.01% of betaine derivative represented by the general formula (1) are added per mol of glucose in the presence of an appropriate amount of glucose dehydrogenase at the start of the reaction. What is necessary is just to coexist in the ratio of ~ 3 mol.
また、例えば、酵素としてジアホラーゼを使用する場合、反応開始時に、適量のジアホラーゼの存在下で、還元型補酵素を１モル当たり、電子受容体を0.0001〜0.5モル、一般式(1)に示すベタイン誘導体を0.01〜12.5モルの比率で共存させればよい。 Also, for example, when diaphorase is used as the enzyme, at the start of the reaction, 0.0019 to 0.5 mole of electron acceptor per mole of reduced coenzyme in the presence of an appropriate amount of diaphorase, betaine represented by the general formula (1) Derivatives may be present at a ratio of 0.01 to 12.5 moles.
更に、例えば、酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼを組み合わせて同一反応系で行う場合、反応開始時に、適量のグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの存在下で、グルコース１モル当たり、補酵素（酸化型補酵素と還元型補酵素の総量）を0.0001〜0.5モル、電子受容体を0.0001〜0.5モル、一般式(1)に示すベタイン誘導体を0.01〜12.5モルの比率で共存させればよい。 Further, for example, when glucose dehydrogenase and diaphorase are combined as enzymes in the same reaction system, a coenzyme (oxidized coenzyme and reduced form) per mol of glucose in the presence of appropriate amounts of glucose dehydrogenase and diaphorase at the start of the reaction. The total amount of coenzyme) may be 0.0001 to 0.5 mol, the electron acceptor may be 0.0001 to 0.5 mol, and the betaine derivative represented by the general formula (1) may be present at a ratio of 0.01 to 12.5 mol.
本発明の酵素反応における反応温度は、使用する酸化酵素の特性に応じて、適宜設定すればよく、使用する酸化酵素の至適温度であることが望ましいが、使用する酸化酵素が作用可能であることを限り、温度調整を行わず、酵素反応が行われる環境の温度であってもよい。 The reaction temperature in the enzyme reaction of the present invention may be appropriately set according to the characteristics of the oxidase used, and is preferably the optimum temperature of the oxidase used, but the oxidase used can act. As long as the temperature is not adjusted, the temperature of the environment in which the enzyme reaction is performed may be used.
本発明の酵素反応は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応を行うのに適した溶媒（例えば、緩衝液）中で行われる。 The enzyme reaction of the present invention is performed in a solvent (for example, a buffer solution) suitable for performing an enzyme reaction of glucose dehydrogenase and / or diaphorase.
２．バイオ燃料電池
本発明は、上記酵素反応を利用するバイオ燃料電池を提供する。
2. Biofuel cell The present invention provides a biofuel cell utilizing the enzyme reaction.
本発明のバイオ燃料電池では、負極において、グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの少なくとも１つ及び一般式(1)に示すベタイン誘導体を含むように構成される。 In the biofuel cell of the present invention, the negative electrode includes at least one of glucose dehydrogenase and diaphorase and a betaine derivative represented by the general formula (1).
例えば、バイオ燃料電池の負極において、酸化酵素として、グルコースデヒドロゲナーゼと、ジアホラーゼ以外の酸化酵素を使用する場合（実施態様１）、グルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素と、ジアホラーゼを使用する場合（実施態様２）、グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼを使用する場合（実施態様３）が包含される。 For example, in the negative electrode of a biofuel cell, when glucose oxidase and an oxidase other than diaphorase are used as oxidases (embodiment 1), an oxidase other than glucose dehydrogenase and diaphorase are used (embodiment 2). In the case of using glucose dehydrogenase and diaphorase (embodiment 3) is included.
実施態様１では、グルコースデヒドロゲナーゼと、ジアホラーゼ以外の酸化酵素とが負極に固定化される。当該実施態様１に使用されるジアホラーゼ以外の酸化酵素としては、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素反応により生成する還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等）を酸化して、酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）に変換できるものが使用される。当該実施態様１では、燃料化合物として使用されるグルコースが適当な溶媒（溶媒（例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の緩衝液）に溶解されて、燃料溶液として使用される。また、当該実施態様１において、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素及び電子メディエーターは、燃料溶液に含ませてもよいが、負極に固定化することが望ましい。当該実施態様１では、グルコースデヒドロゲナーゼによってグルコースが酸化されると共に還元型補酵素が生成し、ジアホラーゼ以外の酸化酵素により還元型補酵素が酸化型補酵素に戻されて、電子を生じさせる。当該実施態様１では、グルコース１分子あたり、２個の電子がと２個のプロトンが生成される。 In Embodiment 1, glucose dehydrogenase and an oxidase other than diaphorase are immobilized on the negative electrode. As an oxidase other than diaphorase used in Embodiment 1, oxidized coenzymes (NAD + , NADP + , etc.) are obtained by oxidizing reduced coenzymes (NADH, NADPH, etc.) generated by the enzymatic reaction of glucose dehydrogenase. ) Can be used. In the first embodiment, glucose used as a fuel compound is dissolved in a suitable solvent (a solvent (for example, a buffer solution such as a phosphate buffer or a Tris buffer)) and used as a fuel solution. In Embodiment 1, the betaine derivative, coenzyme, and electron mediator represented by the general formula (1) may be included in the fuel solution, but are preferably immobilized on the negative electrode, In Embodiment 1, glucose dehydrogenase is used. As glucose is oxidized, a reduced coenzyme is produced, and the reduced coenzyme is returned to the oxidized coenzyme by an oxidase other than diaphorase to generate electrons.In this embodiment 1, per molecule of glucose, Two electrons and two protons are generated.
実施態様２では、グルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素と、ジアホラーゼが負極に固定化される。当該実施態様２に使用されるグルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素としては、クエン酸回路に関与する各種の有機酸や、ペントースリン酸回路および解糖系に関与する糖又は有機酸を燃料化合物として、これらを酸化型補酵素の存在下で酸化し、酸化型補酵素を還元型補酵素に変換できるものが使用される。当該実施態様２では、燃料化合物として使用される有機酸や糖が適当な溶媒（溶媒（例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の緩衝液）に溶解されて、燃料溶液として使用される。また、当該実施態様２において、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素及び電子メディエーターは、燃料溶液に含ませてもよいが、負極に固定化することが望ましい。当該実施態様２では、グルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素によって燃料化合物が酸化されると共に還元型補酵素が生成し、ジアホラーゼにより還元型補酵素が酸化型補酵素に戻されて、電子を生じさせる。当該実施態様１では、燃料化合物から電子とプロトンが生成される。 In Embodiment 2, an oxidase other than glucose dehydrogenase and diaphorase are immobilized on the negative electrode. Examples of oxidases other than glucose dehydrogenase used in Embodiment 2 include various organic acids involved in the citrate cycle, sugars or organic acids involved in the pentose phosphate cycle and glycolysis, and these as fuel compounds. Those that can oxidize in the presence of an oxidized coenzyme and convert the oxidized coenzyme to a reduced coenzyme are used. In the second embodiment, the organic acid or sugar used as the fuel compound is dissolved in an appropriate solvent (for example, a buffer solution such as a phosphate buffer solution or a Tris buffer solution) and used as a fuel solution. In Embodiment 2, the betaine derivative, the coenzyme, and the electron mediator represented by the general formula (1) may be included in the fuel solution, but are preferably immobilized on the negative electrode. The fuel compound is oxidized by an oxidase other than glucose dehydrogenase and a reduced coenzyme is produced, and the reduced coenzyme is returned to the oxidized coenzyme by diaphorase to generate an electron. Electrons and protons are generated from the compound.
実施態様３では、グルコースデヒドロゲナーゼと、ジアホラーゼが負極に固定化される。当該実施態様３では、燃料として使用されるグルコースが適当な溶媒（溶媒（例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の緩衝液）に溶解されて、燃料溶液として使用される。また、当該実施態様３において、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素及び電子メディエーターは、燃料溶液に含ませてもよいが、負極に固定化することが望ましい。当該実施態様３では、グルコースデヒドロゲナーゼによってグルコースが酸化されると共に還元型補酵素が生成し、ジアホラーにより還元型補酵素が酸化型補酵素に戻されて、電子を生じさせる。当該実施態様３では、グルコース１分子あたり、２個の電子がと２個のプロトンが生成される。 In Embodiment 3, glucose dehydrogenase and diaphorase are immobilized on the negative electrode. In the embodiment 3, glucose used as a fuel is dissolved in an appropriate solvent (a solvent (for example, a buffer solution such as a phosphate buffer solution or a Tris buffer solution) and used as a fuel solution.) In the embodiment 3, the betaine derivative, the coenzyme and the electron mediator represented by the general formula (1) may be contained in the fuel solution, but are preferably immobilized on the negative electrode. Is reduced, and a reduced coenzyme is produced, and the reduced coenzyme is returned to the oxidized coenzyme by the diaphorer to generate an electron.In this Embodiment 3, two electrons are present per glucose molecule. And two protons are generated.
負極に使用される上記電子メディエーターとしては、補酵素に受け渡された電子を負極に移動させ得るものである限り、特に制限されないが、好適には、上記「１．酵素反応方法」の欄に記載した電子受容体が例示される。電子メディエーターを負極に固定化する場合、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2 以上となるように固定化することが望ましい。 The electron mediator used for the negative electrode is not particularly limited as long as it can move the electrons transferred to the coenzyme to the negative electrode. Preferably, the electron mediator used in the column of “1. Enzyme reaction method” is used. The described electron acceptor is exemplified. When immobilizing the electron mediator on the negative electrode, it is desirable to immobilize it so that the average value is 0.64 × 10 −6 mol / mm 2 or more.
上記負極において、燃料化合物、酸化酵素、補酵素の使用量については、上記「１．酵素反応方法」の欄に記載の比率を目安にして適宜設定すればよい。 In the negative electrode, the amount of the fuel compound, oxidase, and coenzyme used may be appropriately set based on the ratio described in the column “1. Enzyme reaction method”.
本発明のバイオ燃料電池は、負極で発生したプロトンがプロトン伝導体を通って正極まで移動するように構成される。また、負極で発生した電子は、外部回路を通って正極に送られる。正極では、負極から移動してきたプロトンと、外部から供給された酸素と、外部回路を通って正極に送られた電子とが反応して、水（Ｈ２Ｏ）が生じるように構成される。 The biofuel cell of the present invention is configured such that protons generated at the negative electrode move to the positive electrode through the proton conductor. Further, electrons generated at the negative electrode are sent to the positive electrode through an external circuit. The positive electrode is configured such that water that moves from the negative electrode, oxygen supplied from the outside, and electrons sent to the positive electrode through an external circuit react to generate water (H 2 O).
上記プロトン電素導体としては、電子伝導性を持たず、プロトンを伝導する性質を備えるものである限り、特に制限されず、通常の燃料電池にも使用されるものを用いることができる。 The proton element conductor is not particularly limited as long as it does not have electronic conductivity and has a property of conducting protons, and those used in ordinary fuel cells can be used.
正極は、プロトンと、酸素と、電子とが反応して、水が生じるように構成される限り、特に制限されないが、好ましくは、酸素還元酵素を利用するように構成されていることが望ましい。正極に使用される酸素還元酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。当該酸素還元酵素は、正極に固定化されて使用される。正極おける酸素還元酵素の使用量については、一般的なバイオ燃料電池の正極の場合と同様の範囲に設定すればよい。 The positive electrode is not particularly limited as long as it is configured so that water is generated by the reaction of protons, oxygen, and electrons, but preferably it is configured to utilize oxygen reductase. Examples of the oxygen reductase used for the positive electrode include bilirubin oxidase, laccase, and ascorbate oxidase. The oxygen reductase is used by being immobilized on the positive electrode. What is necessary is just to set the usage-amount of the oxygen reductase in a positive electrode in the same range as the case of the positive electrode of a general biofuel cell.
また、正極には、電子メディエーターが固定化されていることが好ましく、当該電子メディエーターとしては、例えば、オクタシアノタングステン酸カリウム、ヘキサシアノ鉄酸カリウム、フェリシアン化カリウム等が挙げられる。電子メディエーターを正極に固定化する場合、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2 以上となるように固定化することが望ましい。 Moreover, it is preferable that the electron mediator is fixed to the positive electrode, and examples of the electron mediator include potassium octacyanotungstate, potassium hexacyanoferrate, and potassium ferricyanide. When the electron mediator is immobilized on the positive electrode, it is desirable to immobilize it so that the average value is 0.64 × 10 −6 mol / mm 2 or more.
正極及び負極の電極における酵素、補酵素、一般式(1)に示すベタイン誘導体、電子メディエーター等の固定化は、当該技術分野で公知の方法で行うことができる。
正極及び負極の電極の材料としては、例えば、多孔質カーボン、カーボンペレット、カーボンフェルト、カーボンペーパー等のカーボン系材料を使用することができる。
Immobilization of an enzyme, a coenzyme, a betaine derivative represented by the general formula (1), an electron mediator, or the like in the positive electrode and the negative electrode can be performed by a method known in the art.
As a material for the positive electrode and the negative electrode, for example, carbon-based materials such as porous carbon, carbon pellets, carbon felt, and carbon paper can be used.
本発明のバイオ燃料電池は、コイン型、ボタン型等の各種形状にすることができる。 The biofuel cell of the present invention can have various shapes such as a coin type and a button type.
本発明のバイオ燃料電池は、例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船等）、動力装置等に用いることができる。 The biofuel cell of the present invention can be used in, for example, electronic devices, mobile objects (automobiles, motorcycles, aircraft, rockets, spacecrafts, etc.), power equipment, and the like.
３．グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤
また、本発明は、一般式(1)に示すベタイン誘導体からなる、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤を提供する。
当該剤は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを使用する酵素反応系で、反応効率を向上させるために使用されるものであり、その使用態様は、前記「１．酵素反応方法」の欄に記載の通りである。
3. Glucose dehydrogenase and / or diaphorase enzyme reaction efficiency improver The present invention also provides a glucose dehydrogenase and / or diaphorase enzyme reaction efficiency improver comprising a betaine derivative represented by the general formula (1).
The agent is an enzyme reaction system using glucose dehydrogenase and / or diaphorase, and is used for improving the reaction efficiency. The use mode is described in the column of “1. Enzyme reaction method” above. Street.
４．キット
更に、本発明は、上記酵素反応方法を行うためのキットをも提供する。
本発明のキットは、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼ、並びに一般式(1)に示すベタイン誘導体を含む。
本発明のキットは、必要に応じて、酵素反応に使用する補酵素を含んでいてもよく、また、ジアホラーゼの酵素反応方法を行うためのキットの場合には、電子受容体を含んでいてもよい。
また、本発明のキットは、前述する酵素反応についてのプロトコールを示した実験手順書が含まれていてもよい。
4). Kit The present invention further provides a kit for carrying out the above enzymatic reaction method.
The kit of the present invention includes glucose dehydrogenase and / or diaphorase, and a betaine derivative represented by the general formula (1).
The kit of the present invention may contain a coenzyme used for an enzyme reaction, if necessary, and may contain an electron acceptor in the case of a kit for performing a diaphorase enzyme reaction method. Good.
The kit of the present invention may include an experimental procedure manual showing a protocol for the enzyme reaction described above.
以下、実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, this invention is not limited to these Examples.
試験例１：グルコースデヒドロゲナーゼの反応効率の評価
グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性について、ベタイン誘導体の添加効果を評価した。基質としてはグルコース、酸化型補酵素としてＮＡＤ＋、ベタイン誘導体としては、下記のベタイン１〜５を用いた。
Test Example 1: Evaluation of reaction efficiency of glucose dehydrogenase The effect of adding a betaine derivative was evaluated for the enzyme activity of glucose dehydrogenase. Glucose was used as a substrate, NAD + was used as an oxidized coenzyme, and the following betaines 1 to 5 were used as betaine derivatives.
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、２Ｍのイミダゾール緩衝溶液（ｐＨ７．０）、グルコースデヒドロゲナーゼ0.875μｇ、0.015〜0.5Ｍのベタイン誘導体、0.4Ｍのグルコース、1.5 mＭのＮＡＤ＋を含む酵素反応液を調製し、２５℃で３分間インキュベートし酵素反応を行った。また、コントロールとして、ベタイン誘導体を添加しないこと以外は上記と同条件で、酵素反応を行った。
酵素反応によって生成するNADHの生成量を340 nmにおける吸光度を測定することにより、１分間に酸化されるグルコース量を測定した。NADHの分子吸光係数は6.22/mM/cmを用いた。コントロールにおける反応生成物の生成量を１００％として、各ベタイン誘導体を添加した場合の反応生成物の生成量を相対活性（％）として算出した。
The enzyme reaction was performed under the following conditions. First, an enzyme reaction solution containing 2M imidazole buffer solution (pH 7.0), glucose dehydrogenase 0.875 μg, 0.015-0.5 M betaine derivative, 0.4 M glucose, 1.5 mM NAD + was prepared, and the mixture was kept at 25 ° C. for 3 minutes. Incubation was performed for enzyme reaction. As a control, an enzyme reaction was carried out under the same conditions as above except that no betaine derivative was added.
The amount of glucose oxidized per minute was measured by measuring the absorbance at 340 nm of the amount of NADH produced by the enzyme reaction. The molecular extinction coefficient of NADH was 6.22 / mM / cm. The production amount of the reaction product in the control was taken as 100%, and the production amount of the reaction product when each betaine derivative was added was calculated as relative activity (%).
この結果を図１に示す。この結果から、ベタイン１〜５を添加した場合に、それらの添加濃度によってその挙動が異なるものの、コントロールに比して、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の向上が認められた。とりわけ、ベタイン１、３、及び５を添加した場合に、顕著なグルコースデヒドロゲナーゼ活性の向上が認められた。
以上の結果から、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体を選択し、これをグルコースデヒドロゲナーゼによる酵素反応系に添加することによって、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素反応効率を高め得ることが明らかとなった。
The result is shown in FIG. From these results, when betaines 1 to 5 were added, although their behaviors differed depending on their addition concentrations, an improvement in glucose dehydrogenase activity was recognized as compared with the control. In particular, when
From the above results, it is clear that the enzyme reaction efficiency of glucose dehydrogenase can be increased by selecting the betaine derivative represented by the general formula (1) defined in the present invention and adding it to the enzyme reaction system using glucose dehydrogenase. became.
試験例２：発色基質の発色効率の評価−２
ジアホラーゼの酵素活性について、ベタイン誘導体の添加効果を評価した。還元型補酵素としてはＮＡＤＨ、電子受容体としてＡＮＱ（2-amino-1,4-naphthoquinone）、ベタイン誘導体としては、実施例１で使用したベタイン１〜５を用いた。
Test Example 2: Evaluation of coloring efficiency of coloring substrate-2
The effect of adding betaine derivatives was evaluated on the enzyme activity of diaphorase. NADH was used as a reduced coenzyme, ANQ (2-amino-1,4-naphthoquinone) was used as an electron acceptor, and betaines 1 to 5 used in Example 1 were used as betaine derivatives.
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、２Ｍのイミダゾール緩衝溶液（ｐＨ７．０）、ジアホラーゼ０．１８μg、0.03〜0.5Ｍのベタイン誘導体、40mＭのＮＡＤＨ、0.3ｍＭのＡＮＱを含む酵素反応液を調製し、２５℃で３分間インキュベートし酵素反応を行った。また、コントロールとして、ベタイン誘導体を添加しないこと以外は上記と同条件で、酵素反応を行った。 The enzyme reaction was performed under the following conditions. First, an enzyme reaction solution containing 2M imidazole buffer solution (pH 7.0), diaphorase 0.18 μg, 0.03-0.5M betaine derivative, 40 mM NADH, 0.3 mM ANQ is prepared and incubated at 25 ° C. for 3 minutes. Enzymatic reaction was performed. As a control, an enzyme reaction was carried out under the same conditions as above except that no betaine derivative was added.
ANQの還元に伴って減少する４６５ｎｍにおける吸光度変化を測定することにより、酵素活性を測定した。ANQの分子吸光係数は12/mM/cmを用いた。コントロールにおける反応生成物の生成量を１００％として、各ベタイン誘導体を添加した場合の反応生成物の生成量を相対活性（％）として算出した。 Enzyme activity was measured by measuring the change in absorbance at 465 nm, which decreases with the reduction of ANQ. The molecular extinction coefficient of ANQ was 12 / mM / cm. The production amount of the reaction product in the control was taken as 100%, and the production amount of the reaction product when each betaine derivative was added was calculated as relative activity (%).
この結果を図２に示す。この結果から、ベタイン１〜５を添加した場合に、それらの添加濃度によってその挙動が異なるものの、コントロールに比して、ジアホラーゼ活性の向上が認められた。とりわけ、ベタイン１、２、４、及び５、特にベタイン1を添加した場合に、顕著なジアホラーゼ活性の向上が認められた。
以上の結果から、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体を選択し、これをジアホラーゼによる酵素反応系に添加することによって、ジアホラーゼの酵素反応効率を高め得ることが明らかとなった。
The result is shown in FIG. From these results, when betaines 1 to 5 were added, the diaphorase activity was improved as compared with the control, although the behavior was different depending on the addition concentration. In particular, when
From the above results, it was revealed that the enzyme reaction efficiency of diaphorase can be increased by selecting the betaine derivative represented by the general formula (1) defined in the present invention and adding it to the enzyme reaction system using diaphorase. .
Claims (5)
A kit for carrying out the enzymatic reaction method according to claim 1 or 2, comprising a glucose dehydrogenase and / or diaphorase, and a betaine derivative represented by the following general formula (1).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011043365A JP2012178997A (en) | 2011-02-28 | 2011-02-28 | Method for improving oxidase activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011043365A JP2012178997A (en) | 2011-02-28 | 2011-02-28 | Method for improving oxidase activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012178997A true JP2012178997A (en) | 2012-09-20 |
Family
ID=47010840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011043365A Withdrawn JP2012178997A (en) | 2011-02-28 | 2011-02-28 | Method for improving oxidase activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2012178997A (en) |
-
2011
- 2011-02-28 JP JP2011043365A patent/JP2012178997A/en not_active Withdrawn
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