JP2012147712A - Plant expressing volume of saccharifying enzyme, and method for saccharifying biomass using the same - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
Description
本発明は、植物体内に糖化酵素遺伝子が導入された形質転換植物を用いて、形質転換植物中のセルロースから高効率でグルコース等の還元糖を生成させる糖化方法に関する。また、本発明は、当該糖化方法に使用される形質転換植物に関する。 The present invention relates to a saccharification method for producing a reducing sugar such as glucose with high efficiency from cellulose in a transformed plant using a transformed plant into which a saccharifying enzyme gene is introduced into the plant body. Moreover, this invention relates to the transformed plant used for the said saccharification method.
地球温暖化は人類の生存基盤に関わる最も重要な環境問題であり、その原因である温室効果ガスの排出を抑制することは世界的に課題になっている。現代社会では、主要なエネルギー起源は化石資源であり、化石燃料の使用によって排出される二酸化炭素が温室効果ガスの多くを占めており、化石資源の代替となるエネルギー源の開発が急務になっている。 Global warming is the most important environmental problem related to the survival base of humankind, and it is a global issue to suppress the emission of greenhouse gases that cause it. In modern society, the main energy source is fossil resources, and carbon dioxide emitted by the use of fossil fuels occupies most of the greenhouse gases, so the development of energy sources to replace fossil resources has become an urgent task. Yes.
そこで、化石資源に代わるエネルギー源として、カーボンニュートラルなバイオマス資源の導入促進が期待されている。バイオマス資源をエネルギーとして有効に活用することは、温室効果ガスの低減のみならず、エネルギー源の多様化、エネルギー自給率の向上等も期待される。 Therefore, the promotion of introduction of carbon-neutral biomass resources is expected as an energy source to replace fossil resources. Effective use of biomass resources as energy is expected not only to reduce greenhouse gases, but also to diversify energy sources and improve the energy self-sufficiency rate.
従来、バイオマス資源のエネルギー化は、トウモロコシ等の穀物のデンプンを糖化させ、得られたグルコースをエタノールに変換する手法が主流である。しかしながら、エネルギー源として穀物を使用すると、却って食料や飼料との競合問題を生じさせるため、エネルギー源としての穀物の使用量の増大は、食料や飼料の安定供給を損なうことになる。そこで、食料や飼料と競合しないセルロース系バイオマスを原料としてエネルギーを創出する技術の実用化が望まれている。 Conventionally, the mainstream of energy conversion of biomass resources is a method of saccharifying starch of cereal grains such as corn and converting the obtained glucose into ethanol. However, if grain is used as an energy source, it causes a problem of competition with food and feed. Therefore, an increase in the amount of grain used as an energy source impairs the stable supply of food and feed. Therefore, it is desired to put into practical use a technology for creating energy using cellulosic biomass that does not compete with food and feed.
セルロース系バイオマスからのエネルギーの創出技術として、セルラーゼ等の糖化酵素をセルロース系バイオマスに添加して還元糖を生成させた後に、還元糖をエタノールに変換する手法が提案されている。従来、セルロース系バイオマスの糖化に使用される糖化酵素として、カビが細胞外に放出した複数の酵素を回収することにより製造された酵素製剤が知られている。しかしながら、カビ由来の酵素製剤を用いる手法は、効率の高い糖化反応を行うには大量の酵素が必要とされ、かかるコストの問題から実用化されていないのが現状である。また、セルロース系バイオマスの糖化には、大腸菌等を用いて作製した高い活性の組換え酵素を使用する方法も検討されている。しかしながら、セルロースの糖化反応には、少なくとも３種の糖化酵素、即ち、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びβ-グルコシダーゼが必要であるため、高活性の人工酵素セットを見出すことが困難である。さらに、必要酵素が複数種にまたがるため、必然的に酵素生産コストが嵩んでしまうという問題点もあり、実用化の障壁になっている。 As a technique for creating energy from cellulosic biomass, a method has been proposed in which saccharifying enzymes such as cellulase are added to cellulosic biomass to produce reducing sugar, and then the reducing sugar is converted to ethanol. Conventionally, as a saccharifying enzyme used for saccharification of cellulosic biomass, an enzyme preparation produced by collecting a plurality of enzymes released from the cell by a mold is known. However, a method using a mold-derived enzyme preparation requires a large amount of enzyme to perform a highly efficient saccharification reaction, and is currently not put into practical use due to such a cost problem. In addition, a method using a highly active recombinant enzyme prepared using Escherichia coli or the like has been studied for saccharification of cellulosic biomass. However, since at least three types of saccharifying enzymes, namely endoglucanase, cellobiohydrolase, and β-glucosidase, are required for the saccharification reaction of cellulose, it is difficult to find a highly active artificial enzyme set. Furthermore, since the necessary enzymes span multiple types, there is a problem that the enzyme production cost inevitably increases, which is a barrier to practical use.
そこで、近年、セルロース系バイオマスからエネルギーを創出する新たな手法として、植物体内に糖化酵素遺伝子が導入された形質転換植物を用いる技術が提案されている（例えば、特許文献１−２、非特許文献１等参照）。具体的には、当該形質転換植物を栽培することにより、当該形質転換植物内で糖化酵素を製造させ、当該糖化酵素を使用して当該形質転換植物中のセルロースを糖化させる技術である。これにより、セルロース系バイオマスの糖化に、別段に調製された糖化酵素を添加する必要がないため、糖化酵素生産過程にかかるコストの削減が見込まれる。さらに、植物が光合成によって生長するに伴って酵素が生産されるため、温室効果ガスの排出削減にも寄与することが期待される。 Therefore, in recent years, as a new technique for creating energy from cellulosic biomass, a technique using a transformed plant into which a saccharifying enzyme gene has been introduced has been proposed (for example, Patent Documents 1-2 and Non-Patent Documents). 1 etc.). Specifically, it is a technique for producing a saccharifying enzyme in the transformed plant by cultivating the transformed plant, and saccharifying cellulose in the transformed plant using the saccharifying enzyme. As a result, it is not necessary to add a separately prepared saccharifying enzyme to the saccharification of cellulosic biomass, so that the cost for the saccharifying enzyme production process is expected to be reduced. Furthermore, since enzymes are produced as plants grow through photosynthesis, it is expected to contribute to reducing greenhouse gas emissions.
しかしながら、前述の既存技術では、糖化効率の向上に寄与する酵素種の内、植物で発現可能な酵素種が限られており、生産可能な酵素種についても植物での発現量が少ない等の問題から、糖化反応を高収率で行うことができないのが現状である。 However, in the above-mentioned existing technology, among the enzyme species that contribute to the improvement of saccharification efficiency, there are limited enzyme species that can be expressed in plants, and there are problems such as low expression levels in plants even for enzyme species that can be produced. Therefore, the current situation is that the saccharification reaction cannot be performed in a high yield.
このような従来技術を背景として、効率的なセルロースの分解に寄与する複数の酵素種を個別の植物又は同一植物体内で高発現する形質転換植物を用いて、形質転換植物中のセルロースを高効率で還元糖を生成させる技術の開発が切望されている。 Against the background of such conventional technology, cellulose in transformed plants is highly efficient using individual plants or transformed plants that highly express multiple enzyme species that contribute to efficient cellulose degradation in the same plant. The development of technology to produce reducing sugars is desired.
本発明は、植物体内に糖化酵素遺伝子が導入された形質転換植物を用いて高収率に還元糖を生成させる技術、即ち、当該形質転換植物で発現した糖化酵素を利用して、当該形質転換植物中のセルロースを高収率に糖化させて還元糖を生成させる技術を提供することを目的とする。 The present invention relates to a technique for producing reducing sugar in a high yield using a transformed plant into which a saccharifying enzyme gene has been introduced, that is, utilizing the saccharifying enzyme expressed in the transformed plant. An object of the present invention is to provide a technique for producing reducing sugar by saccharifying cellulose in a plant with high yield.
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、意外にも、糖化酵素を植物の葉緑体DNAに組み込んだ形質転換植物を調製し、当該形質転換植物で発現された糖化酵素を用いて当該転換植物中のセルロースを糖化させることにより、効率的に還元糖が生成されることを見出した。また、グリコシドヒドロラーゼファミリー（Glycoside
Hydrolase Family; GHF）４８に属する、カルディセルロシルブター・サッカロリティカス由来のセロビオヒドロラーゼIは、大腸菌等の細菌に形質転換すると、活性を保持した状態で発現できないにも拘わらず、植物の葉緑体DNAに組み込むと、活性を保持した状態で高発現でき、当該酵素を葉緑体DNAに組み込んだ形質転換植物を利用することにより、一層効率的に還元糖の生成が可能になることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
The present inventors conducted extensive studies to solve the above problems, and surprisingly, a transformed plant in which saccharifying enzyme was incorporated into the chloroplast DNA of the plant was prepared and expressed in the transformed plant. It has been found that reducing sugar can be efficiently produced by saccharifying cellulose in the converted plant using a saccharifying enzyme. In addition, glycoside hydrolase family (Glycoside
Cellobiohydrolase I derived from Cardicellulosyl butter saccharolyticus belonging to Hydrolase Family (GHF) 48, when transformed into bacteria such as Escherichia coli, although it cannot be expressed in a state of maintaining its activity, When incorporated into chloroplast DNA, it can be highly expressed with its activity retained, and it will be possible to produce reducing sugars more efficiently by using transformed plants that incorporate the enzyme into chloroplast DNA. I found. The present invention has been completed by further studies based on these findings.
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．下記工程を含有することを特徴とする、植物系セルロースの糖化方法：
糖化酵素をコードする遺伝子が植物の葉緑体DNAに組み込まれている形質転換植物の少なくとも１種を抽出溶媒で抽出処理し、糖化酵素を含む液体画分と、セルロースを含む不溶性画分に分離する分離工程、及び
前記液体画分と前記不溶性画分を混合し、セルロースを糖化させて還元糖を生成させる糖化工程。
項２．前記分離工程に供される形質転換植物として、β1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、セロビオヒドロラーゼII、及びβグルコシダーゼをコードする遺伝子がそれぞれ導入されている形質転換植物４種を少なくとも含む、項１に記載の糖化方法。
項３．前記分離工程に供される形質転換植物として、更に、キシラナーゼ、及びキシロシダーゼをコードする遺伝子がそれぞれ導入されている形質転換植物２種を含む、項２に記載の糖化方法。
項４．前記セロビオヒドロラーゼIが、グリコシドヒドロラーゼファミリー４８に属する、カルディセルロシルブター・サッカロリティカス由来のセロビオヒドロラーゼIである、項２に記載の糖化方法。
項５．前記分離工程後且つ前記糖化工程前に、前記分離工程で得られた不溶性画分を軟化させる糖化前処理工程を含む、項１乃至４のいずれかに記載の糖化方法。
項６．前記糖化前処理において、不溶性画分の軟化が、アルカリ処理、酸処理、熱水処理、及び爆砕処理よりなる群から選択される少なくとも１種の処理により行われる、項５に記載の糖化方法。
項７．形質転換植物がタバコである、項１乃至６のいずれかに記載の糖化方法。
項８．糖化酵素をコードする遺伝子が植物の葉緑体DNAに組み込まれていることを特徴とする、形質転換植物。
項９．前記糖化酵素が、β1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、セロビオヒドロラーゼII、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、及びキシロシダーゼよりなる群から選択される少なくとも１種である、項８に記載の形質転換植物。
項１０．前記糖化酵素が、グリコシドヒドロラーゼファミリー４８に属する、カルディセルロシルブター・サッカロリティカス由来のセロビオヒドロラーゼIである、項８又は９に記載の形質転換植物。
項１１．植物がタバコである、項８乃至１０のいずれかに記載の形質転換植物。
That is, this invention provides the invention of the aspect hung up below.
Item 1. A method for saccharification of plant cellulose, comprising the following steps:
At least one transformed plant in which the gene encoding saccharifying enzyme is incorporated into the chloroplast DNA of the plant is extracted with an extraction solvent and separated into a liquid fraction containing saccharifying enzyme and an insoluble fraction containing cellulose. And a saccharification step of mixing the liquid fraction and the insoluble fraction and saccharifying cellulose to produce reducing sugar.
Item 2. The transformed plant to be subjected to the separation step includes at least four transformed plants into which genes encoding β1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II, and β-glucosidase are respectively introduced. The saccharification method according to Item 1.
Item 3. Item 3. The saccharification method according to Item 2, further comprising two transformed plants into which genes encoding xylanase and xylosidase have been introduced as transformed plants to be subjected to the separation step.
Item 4. Item 3. The saccharification method according to Item 2, wherein the cellobiohydrolase I is cellobiohydrolase I derived from cardicellulosyl butter saccharolyticus belonging to the glycoside hydrolase family 48.
Item 5. Item 5. The saccharification method according to any one of Items 1 to 4, further comprising a pre-saccharification treatment step of softening the insoluble fraction obtained in the separation step after the separation step and before the saccharification step.
Item 6. Item 6. The saccharification method according to Item 5, wherein in the saccharification pretreatment, the insoluble fraction is softened by at least one treatment selected from the group consisting of an alkali treatment, an acid treatment, a hot water treatment, and a blasting treatment.
Item 7. Item 7. The saccharification method according to any one of Items 1 to 6, wherein the transformed plant is tobacco.
Item 8. A transformed plant characterized in that a gene encoding a saccharifying enzyme is incorporated into chloroplast DNA of a plant.
Item 9. Item 9. The transformed plant according to Item 8, wherein the saccharifying enzyme is at least one selected from the group consisting of β1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II, β-glucosidase, xylanase, and xylosidase. .
Item 10. Item 10. The transformed plant according to Item 8 or 9, wherein the saccharifying enzyme is cellobiohydrolase I derived from cardicellulosyl butter saccharolyticus belonging to glycoside hydrolase family 48.
Item 11. Item 11. The transformed plant according to any one of Items 8 to 10, wherein the plant is tobacco.
本発明によれば、植物体内に糖化酵素遺伝子が導入された形質転換植物を利用することにより、当該形質転換植物中で発現した糖化酵素で、当該形質転換植物中のセルロースを効率的に糖化することができる。 According to the present invention, by using a transformed plant into which a saccharifying enzyme gene has been introduced into the plant body, the cellulose in the transformed plant is efficiently saccharified with the saccharifying enzyme expressed in the transformed plant. be able to.
また、本発明は、食料や飼料と競合しないセルロース系バイオマスを原料として使用することにより、バイオ燃料や化学製品製造時の原材料として使用されるグルコース等の還元糖を簡便且つ効率的に供給することができ、新たなグリーンビジネス創出技術として有用性が高い。 In addition, the present invention uses cellulose-based biomass that does not compete with food and feed as a raw material, thereby easily and efficiently supplying a reducing sugar such as glucose used as a raw material when producing biofuels or chemical products. It is highly useful as a new green business creation technology.
本発明の糖化方法は、下記の分離工程及び糖化工程を含むことを特徴とする：
糖化酵素をコードする遺伝子が植物の葉緑体DNAに組み込まれている形質転換植物の少なくとも１種を抽出溶媒で抽出処理し、糖化酵素を含む液体画分と、セルロースを含む不溶性画分に分離する分離工程、及び
前記液体画分と前記不溶性画分を混合し、セルロースを糖化させて還元糖を生成させる糖化工程。
The saccharification method of the present invention comprises the following separation step and saccharification step:
At least one transformed plant in which the gene encoding saccharifying enzyme is incorporated into the chloroplast DNA of the plant is extracted with an extraction solvent and separated into a liquid fraction containing saccharifying enzyme and an insoluble fraction containing cellulose. And a saccharification step of mixing the liquid fraction and the insoluble fraction and saccharifying cellulose to produce reducing sugar.
以下、本発明について詳述する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1)形質転換植物
本発明の糖化方法は、糖化酵素をコードする遺伝子が植物の葉緑体DNAに組み込まれている形質転換植物の少なくとも１種を利用して行われる。葉緑体形質転換技術の利点としては、圧倒的な葉緑体DNAのコピー数（１細胞当たり最大10,000コピー）を背景とした導入遺伝子の大量発現が挙げられる。これにより、糖化酵素の発現量が、既存の糖化酵素発現植物よりも飛躍的に向上することが期待される。また、葉緑体形質転換技術では、発現させた糖化酵素は葉緑体内に局在化され、葉緑体内に基質となるセルロースが存在しないため、形質転換植物の生育に悪影響を与えることなく、目的の糖化酵素の高発現が可能になる。更に、葉緑体DNAは母性遺伝するため、花粉を介した導入遺伝子の環境中への飛散（遺伝子汚染）のリスクがない、等の利点もある。当該形質転換植物は、外来遺伝子（糖化酵素をコードする遺伝子）が葉緑体DNAに導入されているため、花粉を通じた当該遺伝子の環境中へ飛散を抑制し、環境の遺伝子汚染を回避することができる。
(1) Transformed plant The saccharification method of the present invention is carried out using at least one transformed plant in which a gene encoding a saccharifying enzyme is incorporated into the chloroplast DNA of a plant. Advantages of the chloroplast transformation technique include large-scale expression of the transgene against the background of the overwhelming copy number of chloroplast DNA (up to 10,000 copies per cell). As a result, it is expected that the expression level of saccharifying enzyme will be dramatically improved as compared with existing saccharifying enzyme expressing plants. In the chloroplast transformation technique, the expressed saccharifying enzyme is localized in the chloroplast, and there is no cellulose as a substrate in the chloroplast, so that it does not adversely affect the growth of the transformed plant, High expression of the target saccharifying enzyme becomes possible. Furthermore, since the chloroplast DNA is maternally inherited, there is an advantage that there is no risk of scattering of the transgene into the environment (gene contamination) via pollen. In the transformed plant, a foreign gene (gene encoding saccharifying enzyme) is introduced into the chloroplast DNA, so that the gene can be prevented from scattering through the pollen into the environment and environmental genetic contamination can be avoided. Can do.
本発明で使用される糖化酵素としては、セルロースのD-グルコース間のβ-1,4-グリコシド結合を加水分解してグルコースやセロビオース等の還元糖を生成させ得るカルボヒドラーゼや、セルロース線維を取り囲むヘミセルロースやリグニン等の分解に関与する酵素が挙げられる。その種類については特に制限されないが、例えば、β1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、ラッカーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、ペクトリアーゼ、リパーゼ、エクスパンシン等が挙げられる。 Examples of the saccharifying enzyme used in the present invention include a carbohydrase that can hydrolyze a β-1,4-glycosidic bond between D-glucose of cellulose to produce a reducing sugar such as glucose and cellobiose, and hemicellulose surrounding cellulose fibers. And enzymes involved in the degradation of lignin and the like. The type is not particularly limited, and examples thereof include β1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase, xylanase, xylosidase, laccase, ferulic acid esterase, pectinase, lipase, and expansin.
これらの糖化酵素の中でも、本発明では、β1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びβグルコシダーゼの中の少なくとも１種、好ましくは、β1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、セロビオヒドロラーゼII、及びβグルコシダーゼの４種を必須とすることが望ましい。更に、これらの糖化酵素と共に、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、ラッカーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、ペクトリアーゼ、リパーゼ、及びエクスパンシンの中の少なくとも１種、好ましくは、キシラナーゼ及びキシロシダーゼの２種を併用することが望ましい。とりわけ、本発明において、糖化酵素として、β1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、セロビオヒドロラーゼII、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ及びキシロシダーゼの６種を併用することが、効率的な糖化を行う上で特に有効である。 Among these saccharifying enzymes, in the present invention, at least one of β1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase, and β-glucosidase, preferably β1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase, is used. It is desirable to make four types of II and β-glucosidase essential. Further, together with these saccharifying enzymes, it is desirable to use at least one of xylanase, xylosidase, laccase, ferulic acid esterase, pectinase, lipase, and expansin, preferably two of xylanase and xylosidase. In particular, in the present invention, the combination of six types of β1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II, β-glucosidase, xylanase and xylosidase as saccharifying enzymes is effective for efficient saccharification. It is particularly effective.
糖化酵素の中でも、耐熱性を示すものは、高温条件下で糖化反応を行うことができるため、セルロースの溶解度の増加、反応速度の向上、反応系への細菌混入のリスクの低下等の利点もあり、本発明において好適に使用できる。また、耐熱性の糖化酵素を使用する場合、後述する分離工程を、糖化酵素以外の酵素を失活させる高温条件で行うことができ、当該分離工程で得られる液体画分において、糖化酵素が活性を保持した状態で回収することが可能になる。耐熱性の糖化酵素の由来としては、例えば、カルディセルロシルブター属（Caldicellulosiruptor）、サーモトガ属（Thermotoga）、クロストリジウム属（Clostridium）、パイロコッカス属（Pyrococcus）、アエロパイラム属（Aeropyrum）、サーモプラズマ属（Thermoplasma）、サーモプロテイウス属（Thermoproteus）、アシドサーマス属(Acidothermus)、サーモコッカス属(Thermococcus)、バチルス属（Bacillus）、シネココッカス属（Synechococcus）、サーマス属（Thermus）等の好熱性細菌が挙げられるが、好ましくはカルディセルロシルブター属（Caldicellulosiruptor）、サーモトガ属（Thermotoga）、クロストリジウム属（Clostridium）、バチルス属（Bacillus）、更に好ましくはカルディセルロシルブター・サッカロリティカス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、特に好ましくはカルディセルロシルブター・サッカロリティカス（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）が挙げられる。 Among saccharifying enzymes, those that exhibit heat resistance can be subjected to a saccharification reaction under high temperature conditions, so there are also advantages such as increased solubility of cellulose, improved reaction rate, and reduced risk of bacterial contamination in the reaction system. And can be suitably used in the present invention. In addition, when using a heat-resistant saccharifying enzyme, the separation step described below can be performed under high temperature conditions that inactivate enzymes other than the saccharifying enzyme, and the saccharifying enzyme is active in the liquid fraction obtained in the separation step. It becomes possible to collect in a state of holding. Examples of the origin of the thermostable saccharifying enzyme include, for example, Caldicellulosiruptor, Thermotoga, Clostridium, Pyrococcus, Aeropyrum, and Thermoplasma ( Thermoplasma), Thermoproteus, Acidothermus, Thermococcus, Bacillus, Synechococcus, Thermus and other thermophilic bacteria Preferably Caldicellulosiruptor, Thermotoga, Clostridium, Bacillus, more preferably Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Clostridium thermosera (Clostridium thermocellum), Thermotoga maritima, Bacillus subtilis, particularly preferably Caldicellulosiruptor saccharolyticus.
本発明に使用される糖化酵素の内、グリコシドヒドロラーゼファミリー４８に属する、カルディセルロシルブター・サッカロリティカス由来のセロビオヒドロラーゼI及びクロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼIは、大腸菌等の細菌を宿主にして組み換え酵素として発現させると、その大部分は不溶性となり、活性を保持した状態で発現できないことが知られているが、これらの遺伝子を植物の葉緑体内のDNAに組み込んで形質転換すると、活性を保持した可溶性タンパク質として大量発現が可能である。それ故、本発明において、グリコシドヒドロラーゼファミリー４８に属する、カルディセルロシルブター・サッカロリティカス由来のセロビオヒドロラーゼI及びクロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼIを使用する場合、従来技術では実現できていなかった当該酵素の大量生産という観点からも利点がある。グリコシドヒドロラーゼファミリー４８に属するセロビオヒドロラーゼIは、（α／α）６バレルフォールド構造を有するものであり、グリコシドヒドロラーゼファミリーの分類はHenrissat, B., and A. Bairoch, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J., 316, 695-696 (1996).及びウェブサイト「Carbohydrate-Active Enzymes」（URL：http://www.cazy.org/）に従う。 Among the saccharifying enzymes used in the present invention, cellobiohydrolase I derived from cardicellulosyl butter saccharolyticus and cellobiohydrolase I derived from clostridium thermocellum belonging to glycoside hydrolase family 48 are bacteria such as Escherichia coli. When expressed as a recombinant enzyme in a host, most of them become insoluble, and it is known that they cannot be expressed in a state of maintaining activity. However, when these genes are transformed into the chloroplast DNA of plants, they are transformed. It can be expressed in large quantities as a soluble protein that retains its activity. Therefore, in the present invention, when cellobiohydrolase I derived from cardicellulosyl butter saccharolyticus belonging to glycoside hydrolase family 48 and cellobiohydrolase I derived from clostridium thermocellum are used, it has not been realized in the prior art. There is also an advantage from the viewpoint of mass production of the enzyme. Cellobiohydrolase I belonging to glycoside hydrolase family 48 has (α / α) 6 barrel fold structure, and the classification of glycoside hydrolase family is Henrissat, B., and A. Bairoch, Updating the sequence-based classification of Follow glycosyl hydrolases. Biochem. J., 316, 695-696 (1996). and the website “Carbohydrate-Active Enzymes” (URL: http://www.cazy.org/).
本発明に使用される糖化酵素の好適な具体例として、カルディセルロシルブター・サッカロリティカス由来のセロビオヒドロラーゼI、クロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼII、クロストリジウム・サーモセラム由来のβ1,4-エンドグルカナーゼ、クロストリジウム・サーモセラム由来のβグルコシダーゼ、クロストリジウム・サーモセラム由来のキシラナーゼ、サーモトガ・マリティマ由来のキシロシダーゼ、クロストリジウム・サーモセラム由来のフェルラ酸エステラーゼ、クロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼI、及びバチルス・ズブチリス由来のエクスパンシンが挙げられる。 Preferred specific examples of the saccharifying enzyme used in the present invention include cellobiohydrolase I derived from cardicellulosyl butter saccharolyticus, cellobiohydrolase II derived from clostridium thermocellum, and β1,4-derived from clostridium thermocellum. Endoglucanase, β-glucosidase from Clostridium thermocellum, xylanase from Clostridium thermocellum, xylosidase from Thermotoga maritima, ferulic acid esterase from Clostridium thermocellum, cellobiohydrolase I from Clostridium thermocellum, and Bacillus subtilis Expansin is mentioned.
本発明において、一層効率的な糖化を行うために、カルディセルロシルブター・サッカロリティカス由来のセロビオヒドロラーゼI、クロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼII、クロストリジウム・サーモセラム由来のβ1,4-エンドグルカナーゼ、及びクロストリジウム・サーモセラム由来のβグルコシダーゼの４種の酵素を組み合わせて使用することが好ましく；とりわけ、カルディセルロシルブター・サッカロリティカス由来のセロビオヒドロラーゼI、クロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼII、クロストリジウム・サーモセラム由来のβ1,4-エンドグルカナーゼ、クロストリジウム・サーモセラム由来のβグルコシダーゼ、クロストリジウム・サーモセラム由来のキシラナーゼ、サーモトガ・マリティマ由来のキシロシダーゼの６種の酵素を組み合わせて使用することが好ましい。 In the present invention, in order to perform more efficient saccharification, cellobiohydrolase I derived from cardicellulosyl butter saccharolyticus, cellobiohydrolase II derived from clostridium thermocellum, β1,4-endo derived from clostridium thermocellum It is preferable to use a combination of four kinds of enzymes, glucanase and β-glucosidase derived from clostridium thermocellum; in particular, cellobiohydrolase I derived from caldy cellulosyl butter saccharolyticus, cellobiohydrolase derived from clostridium thermocellum II, β1,4-endoglucanase from Clostridium thermocellum, β-glucosidase from Clostridium thermocellum, xylanase from Clostridium thermocellum, Thermotoga marite It is preferable to use a combination of six kinds of enzymes derived from ima xylosidase.
本発明に使用される糖化酵素の具体例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（カルディセルロシルブター・サッカロリティカス由来のセロビオヒドロラーゼI）、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（クロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼII）、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（クロストリジウム・サーモセラム由来のβ1,4-エンドグルカナーゼ）、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（クロストリジウム・サーモセラム由来のβグルコシダーゼ）、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（クロストリジウム・サーモセラム由来のキシラナーゼ）、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（サーモトガ・マリティマ由来のキシロシダーゼ）、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（クロストリジウム・サーモセラム由来のフェルラ酸エステラーゼ）、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（クロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼI）、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（バチルス・ズブチリス由来のエクスパンシンが例示される。 配列番号１−９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、糖化酵素活性（好ましくは天然型のポリペプチドと実質的に同等の糖化酵素活性）を保持していることを限度として、アミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されていてもよい。配列番号１−９で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換及び／又は付加の数としては、１又は数個、或いは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個が例示される。 As a specific example of the saccharifying enzyme used in the present invention, a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (cellobiohydrolase I derived from cardicellulosyl butter / saccharolyticus), amino acid represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising a sequence (cellobiohydrolase II derived from Clostridium thermocellum), a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (β1,4-endoglucanase derived from Clostridium thermocellum), an amino acid represented by SEQ ID NO: 4 A polypeptide comprising the sequence (β-glucosidase derived from clostridium thermocellum), a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (xylanase derived from clostridium thermocellum), a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (A xylosidase derived from Thermotoga maritima), a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (ferulic acid esterase derived from clostridium thermocellum), a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (derived from clostridium thermocellum) Cellobiohydrolase I) and a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (expansins derived from Bacillus subtilis are exemplified. A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1-9 is Amino acid residues may be deleted, substituted and / or added as long as the saccharifying enzyme activity (preferably saccharifying enzyme activity substantially equivalent to that of a naturally occurring polypeptide) is maintained. In the amino acid sequence represented by Nos. 1-9, amino acids The number of deletions, substitutions and / or additions of the nonacid residue is 1 or several, or 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3. Are illustrated.
また、上記糖化酵素は、他のタンパク質又はペプチドが融合した融合タンパクであってもよい。融合させる他のタンパク質又はペプチドについては、糖化酵素の葉緑体内での発現増強、糖化酵素の安定化等に寄与し得るものであれば特に制限されない。融合させる他のタンパク質又はペプチドの具体例として、黄色蛍光タンパク質(Venus)を葉緑体での発現に適した形に改変した改変黄色蛍光タンパク質（cpVnus）が挙げられる。当該改変黄色蛍光タンパク質（cpVnus）は、葉緑体内で糖化酵素の発現増強に有効であり、とりわけβ1,4-エンドグルカナーゼ（特にクロストリジウム・サーモセラム由来のβ1,4-エンドグルカナーゼ）のＮ末端に融合させることにより、当該酵素の葉緑体内での発現を増強に有効である。当該改変黄色蛍光タンパク質（cpVnus）の具体例としては、配列番号１０で示されるアミノ酸配列が例示される。また、改変黄色蛍光タンパク質（cpVnus）を融合させたクロストリジウム・サーモセラム由来のβ1,4-エンドグルカナーゼの具体例としては、配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが例示される。配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、β1,4-エンドグルカナーゼ活性（好ましくは配列番号１１のポリペプチドと実質的に同等の、β1,4-エンドグルカナーゼ活性）を保持していることを限度として、アミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加されていてもよい。アミノ酸残基の欠失、置換及び／又は付加の数としては、前記と同様である。 Further, the saccharifying enzyme may be a fusion protein in which another protein or peptide is fused. Other proteins or peptides to be fused are not particularly limited as long as they can contribute to expression enhancement in chloroplasts and stabilization of saccharifying enzymes. Specific examples of other proteins or peptides to be fused include a modified yellow fluorescent protein (cpVnus) obtained by modifying yellow fluorescent protein (Venus) into a form suitable for expression in chloroplasts. The modified yellow fluorescent protein (cpVnus) is effective in enhancing the expression of saccharifying enzymes in chloroplasts, and is especially fused to the N-terminus of β1,4-endoglucanase (especially β1,4-endoglucanase derived from Clostridium thermocellum). It is effective to enhance the expression of the enzyme in the chloroplast. As a specific example of the modified yellow fluorescent protein (cpVnus), an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is exemplified. A specific example of β1,4-endoglucanase derived from clostridium thermocellum fused with a modified yellow fluorescent protein (cpVnus) is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. The polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 retains β1,4-endoglucanase activity (preferably β1,4-endoglucanase activity substantially equivalent to the polypeptide of SEQ ID NO: 11). To the extent that is possible, amino acid residues may be deleted, substituted and / or added. The number of amino acid residue deletions, substitutions and / or additions is the same as described above.
糖化酵素をコードする遺伝子は、公知の手法により取得することができる。例えば、糖化酵素をコードする遺伝子は、当該遺伝子を保有している細菌のゲノムDNAを鋳型として、当該糖化酵素をコードする遺伝子の全長を増幅可能なように設計したプライマーを用いてPCR法により取得することができる。 A gene encoding a saccharifying enzyme can be obtained by a known method. For example, a gene encoding a saccharifying enzyme is obtained by PCR using primers designed so that the full length of the gene encoding the saccharifying enzyme can be amplified using the genomic DNA of the bacteria carrying the gene as a template. can do.
PCR法による糖化酵素をコードする遺伝子の増幅は、鋳型となるポリヌクレオチド、PCRバッファー、プライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）、dNTP
mixture（デオキシヌクレオシド三リン酸の混合物）、及びDNAポリメラーゼを含む反応液中で、温度の上下のサイクルを繰り返すことによって実施される。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、例えば、糖化酵素をコードする遺伝子の５’末端又はその周辺及び３’末端又はその周辺に位置する任意の約１０〜５０ｂｐのヌクレオチド配列に基づき設計され、常法に従って合成される。増幅させる配列が開始コドンを含んでいない場合、開始コドンをin-frameで含むようにフォワードプライマーを設計するか、後述の発現ベクターにin-frameで開始コドンを導入しておく。PCRバッファーは、使用するDNAポリメラーゼ等に応じて適宜選択され、市販品を用いることができる。dNTP mixture及びDNAポリメラーゼについても、市販品を用いることができる。PCRの反応は、慣用的な手順に従うか又はDNAポリメラーゼの指示書に従って行うことができ、必要に応じて反応温度、反応時間、反応サイクル、反応組成等を適宜変更して実施することもできる。
Amplification of the gene encoding saccharifying enzyme by PCR method includes template polynucleotide, PCR buffer, primer set (forward primer and reverse primer), dNTP
It is carried out by repeating the cycle of increasing and decreasing the temperature in a reaction solution containing a mixture (a mixture of deoxynucleoside triphosphates) and DNA polymerase. The forward primer and the reverse primer are designed based on any nucleotide sequence of about 10 to 50 bp located at or around the 5 ′ end and around the 3 ′ end of the gene encoding saccharifying enzyme, and synthesized according to a conventional method. Is done. When the sequence to be amplified does not contain a start codon, a forward primer is designed so as to contain the start codon in-frame, or the start codon is introduced in-frame into an expression vector described later. The PCR buffer is appropriately selected according to the DNA polymerase to be used, and commercially available products can be used. Commercially available products can also be used for the dNTP mixture and DNA polymerase. The PCR reaction can be carried out according to conventional procedures or according to the instructions of DNA polymerase, and can be carried out by appropriately changing the reaction temperature, reaction time, reaction cycle, reaction composition and the like as necessary.
糖化酵素をコードする遺伝子として、具体的には、配列番号１２で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号１で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコード）、配列番号１３で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号２で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコード）、配列番号１４で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号３で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコード）、配列番号１５で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号４で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコード）、配列番号１６で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号５で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコード）、配列番号１７で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号６で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコード）、配列番号１８で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号７で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコード）、配列番号１９で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号８で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコード）、及び配列番号２０で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号９で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコード）が例示される。また、改変黄色蛍光タンパク質（cpVnus）を融合させたクロストリジウム・サーモセラム由来のβ1,4-エンドグルカナーゼをコードする遺伝子として、具体的には、配列番号２１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号１１で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコード）が例示される。これらの遺伝子には、配列番号１２−２１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、糖化酵素活性（好ましくは天然型のポリペプチドと実質的に同等の糖化酵素活性）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用することもできる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、65℃で5×SSC溶液（１倍濃度のSSC溶液の組成は、150ｍＭ塩化ナトリウム、15ｍＭクエン酸ナトリウム）中でハイブリダイズさせ、更に0.1％のSDSを含有する0.5×SSC溶液で65℃で洗浄する条件を意味する。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの各操作は、「Molecular Cloning(Third
Edition)」(J. Sambrook & D. W.Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、通常、プローブとして使用するポリヌクレオチドの塩基配列と一定以上の相同性を有し、その相同性は、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上である。塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。具体的には、BLAST（J.Mol.Biol., 215, 403, 1990）やFASTA（Methods in Enzymology, 183, 63-69）等の解析ソフトを用いて計算される。
Specifically, as a gene encoding saccharification enzyme, a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 (encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1), and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 A polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 (encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3), SEQ ID NO: 15 A polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 (which encodes a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 (the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Code), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 (SEQ ID NO: 6), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 (encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7), and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19. And a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 (encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9). The Further, as a gene encoding β1,4-endoglucanase derived from clostridium thermocellum fused with a modified yellow fluorescent protein (cpVnus), specifically, a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 (SEQ ID NO: 11), which encodes a polypeptide having the amino acid sequence shown in FIG. These genes hybridize under stringent conditions to a polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 12-21, and have a saccharifying enzyme activity (preferably a natural type). It is also possible to use a polynucleotide encoding a polypeptide having substantially the same saccharifying enzyme activity as the above polypeptide. Here, stringent conditions are, for example, hybridization at 5 ° C. in a 5 × SSC solution (composition of a 1-fold concentration SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate), and further 0.1% SDS. The condition of washing at 65 ° C. with a 0.5 × SSC solution containing Each hybridization operation under stringent conditions is described in `` Molecular Cloning (Third
Edition) "(J. Sambrook & DWRussell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Generally, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency. A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions usually has a certain degree of homology with the base sequence of the polynucleotide used as a probe, and the homology is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, More preferably, it is 95% or more, and particularly preferably 97% or more. The homology of the base sequence can be calculated using an analysis tool that is commercially available or available through a telecommunication line (Internet). Specifically, it is calculated using analysis software such as BLAST (J. Mol. Biol., 215 , 403, 1990) and FASTA (Methods in Enzymology, 183, 63-69).
本発明で使用される形質転換植物は、糖化酵素をコードする遺伝子を植物の葉緑体DNAに組み込むことにより作製される。具体的には、糖化酵素をコードする遺伝子を増幅させ、これを植物の葉緑体内で発現可能なベクターに組み込んだ後に、植物の葉緑体に形質転換することにより、形質転換植物が作製される。糖化酵素をコードする遺伝子の葉緑体DNAへの導入は、相同組み換えによって行うことが望ましい。 The transformed plant used in the present invention is produced by incorporating a gene encoding a saccharifying enzyme into the chloroplast DNA of a plant. Specifically, a transformed plant is produced by amplifying a gene encoding a saccharifying enzyme, incorporating it into a vector that can be expressed in the chloroplast of the plant, and then transforming it into the chloroplast of the plant. The The introduction of a gene encoding a saccharifying enzyme into chloroplast DNA is preferably performed by homologous recombination.
形質転換に使用されるベクターは、葉緑体DNAに当該遺伝子を導入して、葉緑体内で糖化酵素を発現させ得る限り特に限定されない。 The vector used for transformation is not particularly limited as long as the gene can be introduced into chloroplast DNA to express a saccharifying enzyme in the chloroplast.
形質転換に使用されるベクターに糖化酵素をコードする遺伝子を挿入するには、糖化酵素をコードする遺伝子の5’末端側に葉緑体内で機能するプロモーターを連結すればよい。葉緑体内で機能するプロモーターとしては、例えば、葉緑体psbA遺伝子、rrn16-rrn23オペロン、rbcL遺伝子、psbEFLJオペロン、psbDCオペロン、psbB-Hオペロン、accD遺伝子、atpB遺伝子等の葉緑体遺伝子由来のプロモーター；lacプロモーターなどの細菌由来の原核生物型プロモーター等が挙げられる。 In order to insert a gene encoding a saccharifying enzyme into a vector used for transformation, a promoter that functions in the chloroplast may be linked to the 5 'end side of the gene encoding the saccharifying enzyme. Examples of promoters that function in the chloroplast include chloroplast psbA gene, rrn16-rrn23 operon, rbcL gene, psbEFLJ operon, psbDC operon, psbB-H operon, accD gene, and atpB gene-derived chloroplast genes. Promoter: Prokaryotic promoters derived from bacteria such as lac promoter, etc.
また、当該ベクターには、プロモーター及び糖化酵素をコードする遺伝子以外に、転写後調節に関わる塩基配列が含まれる。具体的には、翻訳開始制御に関わる配列として、psbA、rbcL、atpB、rps2、psbL、等の葉緑体遺伝子由来の5'-UTR や、T7 ファージ由来のgene10リーダー配列等が挙げられる。転写産物の安定化又は翻訳終結に関わる塩基配列としては、psbA、rbcL、petD、rps16等の葉緑体遺伝子由来の3'-UTRが挙げられる。また、葉緑体への遺伝子導入を確認するために、当該ベクターには、選択マーカー遺伝子の発現カセットが含まれていてもよい。選択マーカー遺伝子としては、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の抗生物質耐性を与える遺伝子；セト酪酸合成酵素遺伝子等の除草剤耐性を与える遺伝子；ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等のメソトレキセート（ＭＴＸ）耐性を与える遺伝子；GFP遺伝子等の蛍光を指標とした選択を可能にする遺伝子等が挙げられる。選択マーカー遺伝子の発現制御配列（プロモーター、転写後制御配列）としては、糖化酵素の発現に用いたものと同様のものが利用可能である。 In addition to the promoter and the gene encoding saccharifying enzyme, the vector includes a base sequence involved in post-transcriptional regulation. Specifically, examples of sequences involved in translation initiation control include 5′-UTR derived from chloroplast genes such as psbA, rbcL, atpB, rps2, and psbL, and a gene10 leader sequence derived from T7 phage. Examples of the base sequence involved in the transcription product stabilization or translation termination include 3′-UTR derived from chloroplast genes such as psbA, rbcL, petD, and rps16. In addition, in order to confirm gene introduction into chloroplasts, the vector may contain an expression cassette for a selectable marker gene. Selectable marker genes include spectinomycin resistance gene, kanamycin phosphotransferase gene, hygromycin phosphotransferase gene, chloramphenicol acetyltransferase and other genes that give antibiotic resistance; herbicide resistance such as cetobutyrate synthase gene A gene that gives resistance to methotrexate (MTX) such as a dihydrofolate reductase gene; a gene that enables selection using fluorescence as an index, such as a GFP gene. As the expression control sequence (promoter, post-transcriptional control sequence) of the selectable marker gene, the same one as that used for the expression of saccharifying enzyme can be used.
糖化酵素をコードする遺伝子を導入する葉緑体DNA中の領域は、葉緑体ゲノムに存在する遺伝子間領域であれば特に限定されるものではないが、好適な例として、trnIとtrnAの遺伝子間領域、trnVとrps12/7の遺伝子間領域、rbcLとaccDの遺伝子間領域、rps7とndhBの遺伝子間領域等が挙げられる。また、遺伝子導入領域に対する目的遺伝子の発現カセット及び選抜マーカーの方向は、発現効率等に応じて適宜設定すればよい。 The region in the chloroplast DNA into which the gene encoding the saccharifying enzyme is introduced is not particularly limited as long as it is an intergenic region present in the chloroplast genome, but preferred examples include the genes of trnI and trnA. Intergenic region, intergenic region of trnV and rps12 / 7, intergenic region of rbcL and accD, intergenic region of rps7 and ndhB, and the like. In addition, the direction of the expression cassette of the target gene and the selection marker with respect to the gene transfer region may be appropriately set according to the expression efficiency and the like.
糖化酵素をコードする遺伝子の葉緑体DNAへの導入は、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の公知の植物細胞の形質転換法により実施される。好適な形質転換法はパーティクルガン法である。 Introduction of a gene encoding a saccharifying enzyme into chloroplast DNA is performed by a known plant cell transformation method such as a particle gun method, an electroporation method, or a microinjection method. A suitable transformation method is the particle gun method.
パーティクルガンによる形質転換は、一定段階まで成長したこれらの植物の葉に対して行うことが望ましい。例えば、タバコに導入する場合は、播種後1ヶ月程度の葉（栄養生長期にある第5葉〜第9葉）に対して行うことが望ましい。 It is desirable to perform transformation by particle gun on the leaves of these plants grown to a certain stage. For example, when introduced into tobacco, it is desirable to carry out on the leaves (fifth to ninth leaves in the vegetative growth period) for about one month after sowing.
パーティクルガン法により糖化酵素をコードする遺伝子を導入した植物の葉を5mm × 5mm程度に切り分け、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に応じた適当な選抜用薬剤の存在下で、脱分化又はシュート再生が可能な培地で培養することで、形質転換体の選抜を行う。次いで、形質転換体の候補を、再分化用の培地に移すことによって発根を促し、植物体に再生することにより、形質転換植物が作製される。これらの形質転換植物の作製方法、脱分化、再分化は、公知の手法によって行うことができる。 Plant leaves into which a gene encoding saccharifying enzyme has been introduced by the particle gun method are cut into pieces of about 5 mm × 5 mm, and dedifferentiation or shoot regeneration is performed in the presence of an appropriate selection agent according to the type of the selection marker gene introduced. The transformant is selected by culturing in a medium capable of. Next, the transformed plant is produced by promoting the rooting by transferring the transformant candidate to a medium for regeneration and regenerating it into a plant body. The production method, dedifferentiation, and redifferentiation of these transformed plants can be performed by known methods.
作製された形質転換植物の葉緑体DNAに糖化酵素をコードする遺伝子が組み込まれていることは、再生した植物体の葉から細胞内の全DNAを調製し、その全DNAから、PCR法又はサザン分析法等により、導入した糖化酵素をコードする遺伝子を検出することにより確認できる。また、作製された形質転換植物の葉緑体DNAに糖化酵素をコードする遺伝子が組み込まれていることは、形質転換植物の葉から可溶性タンパク質を抽出し、当該抽出液に導入した糖化酵素が含まれているか否かを測定することにより確認することもできる。 The fact that the gene encoding the saccharifying enzyme is incorporated into the chloroplast DNA of the produced transformed plant is that the total DNA in the cell is prepared from the regenerated plant body leaves, and the PCR method or This can be confirmed by detecting a gene encoding the introduced saccharifying enzyme by Southern analysis or the like. In addition, the fact that the gene encoding saccharifying enzyme is incorporated into the chloroplast DNA of the produced transformed plant includes the saccharifying enzyme extracted from the leaves of the transformed plant and introduced into the extract. It can also be confirmed by measuring whether or not.
本発明で使用される形質転換植物の宿主植物種類については、特に制限されないが、例えば、タバコ（Nicotiana tabacum）；ジャガイモ（Solanum tuberosum）、トマト（Solanum lycopersicum）、ペチュニア（Petunia）等のナス科植物（Solanaceae）；イネ（Oryza sativa）等のイネ科植物（Poaceae）；ダイズ（Glycine max）等のマメ科植物（Fabaceae）；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、キャベツ（Brassica oleracea L.）等のアブラナ科植物（Brassicaceae）；レタス（Lactuca sativa）等のキク科植物（Asteraceae）；ニンジン（Daucus carota）等のセリ科植物（Apiaceae）；ワタ（Gossypium spp.）等のアオイ科植物（Malvaceae）；アオウキクサ（Spirodela perpusilla）等のウキクサ科植物（Lemnaceae）；ポプラ（Populus alba）等のヤナギ科植物（Salicaceae）；テンサイ（Beta vulgaris L.）等のアカザ科植物（Chenopodiaceae）；ゼニゴケ（Marchantia polymorpha L.）等のゼニゴケ科植物（Marchantiaceae）；ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）等のヒョウタンゴケ科植物（Funariaceae）等は、葉緑体形質転換が可能であり、世界的に作付面積の広い作物でもあることから、本発明において好適に使用される。 The host plant type of the transformed plant used in the present invention is not particularly limited. For example, solanaceous plants such as tobacco (Nicotiana tabacum); potato (Solanum tuberosum), tomato (Solanum lycopersicum), and petunia (Petunia). (Solanaceae); Gramineae plants (Poaceae) such as rice (Oryza sativa); Legumes (Fabaceae) such as soybean (Glycine max); Brassicaceae plants such as Arabidopsis thaliana and cabbage (Brassica oleracea L.) (Brassicaceae); Asteraceae such as lettuce (Lactuca sativa); Apiaceae such as carrot (Daucus carota); Mallowaceae (Malvaceae) such as cotton (Gossypium spp.); Spirodela duckweed plants (Lemnaceae) such as perpusilla; willow plants (Salicaceae) such as populus (Populus alba); red crustaceans such as sugar beet (Beta vulgaris L.) (Chenopodiaceae); Vermicellies (Marchantia polymorpha L.), etc. (Marchantiaceae); Leopards (Funariaceae), such as Physcomitrella patens; Since it is also a crop with a large cropping area, it is preferably used in the present invention.
(2)分離工程
本発明の糖化方法では、先ず、上記形質転換植物の少なくとも１種を抽出溶媒で抽出処理し、糖化酵素を含む液体画分と、セルロースを含む不溶性画分に分離する分離工程に供する。
(2) Separation step In the saccharification method of the present invention, first, at least one of the above transformed plants is extracted with an extraction solvent, and separated into a liquid fraction containing a saccharifying enzyme and an insoluble fraction containing cellulose. To serve.
優れた効率で糖化を行うために、複数種の糖化酵素を後述する糖化工程で使用することが望ましく、利用する糖化酵素の組み合わせに対応するように、複数種の形質転換植物を当該分離工程に供することが望ましい。即ち、糖化酵素毎に形質転換植物を選択し、選択された複数種の形質転換植物が当該分離工程に供される。例えば、β1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、セロビオヒドロラーゼII、及びβグルコシダーゼの４種の糖化酵素を使用する場合には、これらの糖化酵素をコードする遺伝子がそれぞれ導入されている形質転換植物４種が、当該分離工程に供される。また、例えば、β1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、セロビオヒドロラーゼII、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ及びキシロシダーゼの６種の糖化酵素を使用する場合には、これらの糖化酵素をコードする遺伝子がそれぞれ導入されている形質転換植物６種が、当該分離工程に供される。本発明において使用される糖化酵素の組み合わせについては、前述の通りである。 In order to perform saccharification with excellent efficiency, it is desirable to use a plurality of types of saccharifying enzymes in the saccharification step described later, and a plurality of types of transformed plants are used in the separation step so as to correspond to the combination of saccharifying enzymes to be used. It is desirable to provide. That is, a transformed plant is selected for each saccharifying enzyme, and a plurality of selected transformed plants are subjected to the separation step. For example, when four saccharifying enzymes, β1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II, and β-glucosidase are used, the genes into which the genes encoding these saccharifying enzymes have been introduced, respectively. Four kinds of converted plants are subjected to the separation step. For example, when six saccharifying enzymes such as β1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II, β-glucosidase, xylanase and xylosidase are used, the genes encoding these saccharifying enzymes are respectively Six transformed plants that have been introduced are subjected to the separation step. The combination of saccharifying enzymes used in the present invention is as described above.
当該分離工程では、使用する複数種の形質転換植物を混合した状態で一つの分離工程を行うことが好ましいが、形質転換植物の種類毎に各々別個に分離工程を行ってもよい。 In the separation step, it is preferable to perform one separation step in a state where a plurality of types of transformed plants to be used are mixed, but the separation step may be performed separately for each type of transformed plant.
当該分離工程に複数種の形質転換植物を供する場合、各形質転換植物の比率については、各形質転換植物が発現する糖化酵素の種類、糖化酵素の発現量等に応じて適宜設定される。例えば、当該分離工程において、β1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、セロビオヒドロラーゼII、及びβグルコシダーゼをコードする遺伝子がそれぞれ導入されている形質転換植物４種を使用する場合であれば、β1,4-エンドグルカナーゼ形質転換植物を１０〜３０重量％、セロビオヒドロラーゼI形質転換植物を２０〜６０重量％、セロビオヒドロラーゼII形質転換植物を１〜２０重量％、及びβグルコシダーゼ形質転換植物を１０〜３０重量％の割合で当該分離工程に供すればよい。また、例えば、β1,4-エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼI、セロビオヒドロラーゼII、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ及びキシロシダーゼをコードする遺伝子がそれぞれ導入されている形質転換植物６種を使用する場合であれば、β1,4-エンドグルカナーゼ形質転換植物を１０〜３０重量％、セロビオヒドロラーゼI形質転換植物を２０〜６０重量％、セロビオヒドロラーゼII形質転換植物を１〜２０重量％、βグルコシダーゼ形質転換植物を１０〜３０重量％、キシラナーゼ形質転換植物とキシロシダーゼ形質転換植物の合計量を１〜１０重量％の割合で当該分離工程に供すればよい。 When a plurality of types of transformed plants are used in the separation step, the ratio of each transformed plant is appropriately set according to the type of saccharifying enzyme expressed by each transformed plant, the expression level of the saccharifying enzyme, and the like. For example, in the separation step, if four transformed plants into which genes encoding β1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II, and β-glucosidase are respectively used are used, β1,4-endoglucanase transformed plant 10-30% by weight, cellobiohydrolase I transformed plant 20-60% by weight, cellobiohydrolase II transformed plant 1-20% by weight, and β-glucosidase transformed plant May be subjected to the separation step at a ratio of 10 to 30% by weight. In addition, for example, if six transformed plants into which genes encoding β1,4-endoglucanase, cellobiohydrolase I, cellobiohydrolase II, β-glucosidase, xylanase and xylosidase are respectively used are used, 10 to 30% by weight of β1,4-endoglucanase transformed plant, 20 to 60% by weight of cellobiohydrolase I transformed plant, 1 to 20% by weight of cellobiohydrolase II transformed plant, β glucosidase transformed plant What is necessary is just to use for the said isolation | separation process in the ratio of 10-10 weight% and the total amount of a xylanase transformed plant and a xylosidase transformed plant in the ratio of 1-10 weight%.
当該分離工程に供される形質転換植物は、乾燥状態及び非乾燥状態のいずれであってもよい。乾燥状態の形質転換植物は、減量されており、運搬や保管に要するコストを低減できるので、工業的実施の上で有利になる。 The transformed plant subjected to the separation step may be in a dry state or a non-dry state. The transformed plant in the dry state is reduced in weight, and the cost required for transportation and storage can be reduced, which is advantageous in industrial implementation.
また、当該分離工程に供される形質転換植物は、葉部を含むことを限度として、全草又は全木、地上部、葉部のいずれであってもよいが、好ましくは葉部が挙げられる。また、当該分離工程に供される形質転換植物は、糖化酵素を効率的に抽出して液体画分に含有させるために、細切化や粉末化処理したものを使用することが望ましい。 In addition, the transformed plant to be subjected to the separation step may be any of whole grass or whole tree, above-ground part, and leaf part as long as it contains a leaf part, preferably a leaf part. . In addition, it is desirable to use a plant that has been subjected to chopping or pulverization in order to efficiently extract the saccharifying enzyme and include it in the liquid fraction as the transformed plant to be subjected to the separation step.
当該分離工程で使用される抽出溶媒は、形質転換植物の葉部で発現している糖化酵素を抽出可能であることを限度として、その組成については制限されないが、例えば、水、各種緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。 The extraction solvent used in the separation step is not limited with respect to its composition, as long as it can extract the saccharifying enzyme expressed in the leaves of the transformed plant, for example, water, various buffers, Examples thereof include physiological saline.
また、抽出溶媒のｐＨについては、糖化酵素を失活させない範囲であることを限度として制限されるものではないが、例えば３〜１０、好ましくは４〜９、更に好ましくは５〜８が挙げられる。 Further, the pH of the extraction solvent is not limited as long as it is in a range that does not inactivate the saccharifying enzyme, but is, for example, 3 to 10, preferably 4 to 9, and more preferably 5 to 8. .
当該分離工程における抽出処理については、従来公知のタンパク質抽出手段により行うことができる。具体的には、当該抽出処理は、形質転換植物と抽出溶媒を混合し、通常１分以上、好ましくは２〜３０分間、更に好ましくは３〜１０分間、静置又は撹拌を行えばよい。また、抽出処理時の温度条件については、糖化酵素を失活させない範囲で適宜設定されるが、糖化酵素が耐熱性酵素である場合には、６０℃以上に設定することにより、糖化酵素の活性を維持しつつ、宿主植物由来の酵素を失活させることができるので、宿主植物由来のプロテアーゼ等の作用により、糖化酵素が失活するのを防止でき、ひいては最終的な糖化率を向上せしめることが可能になる。 About the extraction process in the said isolation | separation process, it can carry out by a conventionally well-known protein extraction means. Specifically, the extraction treatment may be performed by mixing the transformed plant and the extraction solvent, and standing or stirring for usually 1 minute or longer, preferably 2 to 30 minutes, more preferably 3 to 10 minutes. In addition, the temperature condition during the extraction treatment is appropriately set within a range that does not inactivate the saccharifying enzyme. When the saccharifying enzyme is a thermostable enzyme, the saccharifying enzyme activity is set by setting the temperature to 60 ° C. or higher. Since the enzyme derived from the host plant can be inactivated while maintaining the pH, it is possible to prevent the inactivation of the saccharifying enzyme by the action of the protease derived from the host plant, thereby improving the final saccharification rate. Is possible.
当該抽出処理で使用される形質転換植物と抽出溶媒の量比としては、例えば、抽出処理に供される形質転換植物１重量部当たり、抽出溶媒を０．５〜２００重量部、好ましくは１〜１００重量部、更に好ましくは１〜２０重量部となるように設定すればよい。 As a quantitative ratio of the transformed plant and the extraction solvent used in the extraction treatment, for example, the extraction solvent is 0.5 to 200 parts by weight, preferably 1 to 1 part by weight of the transformed plant to be subjected to the extraction treatment. What is necessary is just to set so that it may become 100 weight part, More preferably, it is 1-20 weight part.
斯くして抽出処理を行った後に、固液分離を行って液体画分と不溶性画分に分離する。液体画分には糖化酵素が含まれ、不溶性画分には形質転換植物に由来するセルロースが含まれる。固液分離は、ろ過や遠心分離等の公知の方法で行うことができる。 Thus, after performing an extraction process, solid-liquid separation is performed and it isolate | separates into a liquid fraction and an insoluble fraction. The liquid fraction contains saccharifying enzyme, and the insoluble fraction contains cellulose derived from the transformed plant. Solid-liquid separation can be performed by a known method such as filtration or centrifugation.
当該分離工程で得られた液体画分は、そのまま後述する糖化工程に使用してもよく、また必要に応じて濃縮した後に後述する糖化工程に使用してもよい。また、当該分離工程で得られた不溶性画分は、そのまま後述する糖化工程に使用してもよいが、後述する糖化前処理工程に供し、不溶性画分に含まれるセルロースが糖化酵素による反応を受け易くなるように軟化処理しておくことが望ましい。 The liquid fraction obtained in the separation step may be used as it is in the saccharification step described later, or may be used in the saccharification step described later after concentration as necessary. The insoluble fraction obtained in the separation step may be used as it is in the saccharification step described later. However, the insoluble fraction is subjected to a saccharification pretreatment step described later, and the cellulose contained in the insoluble fraction undergoes a reaction by a saccharifying enzyme. It is desirable to carry out a softening process so that it may become easy.
(3)糖化前処理工程
糖化前処理工程では、不溶性画分を軟化させることにより、不溶性画分に含まれるセルロース、ヘミセルロース、及びリグニンの交絡を解いて、セルロースが糖化酵素による反応を受け易くする。
(3) Saccharification pretreatment step In the saccharification pretreatment step, the insoluble fraction is softened, thereby untangling the cellulose, hemicellulose, and lignin contained in the insoluble fraction so that the cellulose is easily subjected to a reaction by a saccharifying enzyme. .
不溶性画分を軟化させる処理としては、セルロースを覆っているリグニンやヘミセルロースの一部を剥離させ、糖化酵素がセルロースに接触させる頻度を向上させ得る処理であればよく、具体的には、アルカリ処理、酸処理、熱水処理、爆砕処理等が挙げられる。これらの軟化処理は、１種の処理を単独で実施してもよく、２種以上の処理を組み合わせて実施してもよい。 The treatment for softening the insoluble fraction may be any treatment that can exfoliate part of the lignin and hemicellulose covering the cellulose and improve the frequency with which the saccharifying enzyme contacts the cellulose. , Acid treatment, hot water treatment, explosion treatment and the like. These softening treatments may be performed alone or in combination of two or more treatments.
アルカリ処理としては、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ性物質でｐＨを１２〜１４に調整した水溶液中に、上記不溶性画分を浸漬させて、１〜３０分間、８０〜１２１℃で処理する方法が例示される。 Specifically, the alkali treatment is performed by immersing the insoluble fraction in an aqueous solution adjusted to a pH of 12 to 14 with an alkaline substance such as sodium hydroxide or potassium hydroxide for 1 to 30 minutes, 80 to 80 minutes. The method of processing at 121 degreeC is illustrated.
酸処理としては、具体的には、硫酸等の酸性物質でｐＨを０．５〜２に調整した水溶液中に、上記不溶性画分を浸漬させて、５〜３０分間、１００〜２３０℃で処理する方法が例示される。 Specifically, the acid treatment is performed by immersing the insoluble fraction in an aqueous solution adjusted to pH 0.5 to 2 with an acidic substance such as sulfuric acid and treating at 100 to 230 ° C. for 5 to 30 minutes. The method of doing is illustrated.
熱水処理としては、具体的には、１００〜２５０℃の熱水中に、上記不溶性画分を浸漬させた状態で５〜３０分間処理する方法が例示される。熱水処理は、必要に応じて加圧条件で行うこともできる。 Specific examples of the hot water treatment include a method of treating for 5 to 30 minutes in a state where the insoluble fraction is immersed in hot water at 100 to 250 ° C. The hot water treatment can also be performed under pressurized conditions as necessary.
爆砕処理としては、具体的には、上記不溶性画分を、高温高圧処理後、瞬時に大気圧又はその付近の低温低圧条件下に放出する方法が例示される。 Specific examples of the explosion treatment include a method in which the insoluble fraction is instantaneously released under atmospheric pressure or a low temperature and low pressure condition in the vicinity thereof after the high temperature and high pressure treatment.
上記軟化処理の中でも、アルカリ処理は、簡便且つ効率的に不溶性画分の軟化が行えるため、好適である。 Among the softening treatments, alkali treatment is preferable because it can easily and efficiently soften the insoluble fraction.
斯くして糖化前処理工程に供された不溶性画分は、必要に応じて、ｐＨ調整、洗浄、乾燥を行った後に、後述する糖化工程に使用される。 Thus, the insoluble fraction subjected to the saccharification pretreatment step is used for the saccharification step described later after pH adjustment, washing, and drying as necessary.
(4)糖化工程
糖化工程では、上記液体画分と上記不溶性画分を混合し、セルロースを糖化させて還元糖を生成させる。即ち、糖化工程では、上記液体画分に含まれる糖化酵素を、上記不溶性画分に含まれるセルロースに作用させて、グルコース等の還元糖を生成させる。
(4) Saccharification step In the saccharification step, the liquid fraction and the insoluble fraction are mixed, and cellulose is saccharified to produce reducing sugar. That is, in the saccharification step, a saccharification enzyme contained in the liquid fraction is allowed to act on cellulose contained in the insoluble fraction to produce a reducing sugar such as glucose.
当該糖化工程は、具体的には、上記液体画分の全量又は一部と、上記液体画分の全量又は一部とを混合し、上記液体画分に含まれる糖化酵素が作用可能な条件でインキュベートすることにより行われる。上記液体画分と上記不溶性画分の混合比については、液体画分に含まれる糖化酵素の量や活性、不溶性画分に含まれるセルロースの量等に応じて適宜設定される。 Specifically, the saccharification step is performed by mixing the total amount or part of the liquid fraction and the total amount or part of the liquid fraction, and under conditions that allow the saccharifying enzyme contained in the liquid fraction to act. This is done by incubating. The mixing ratio of the liquid fraction and the insoluble fraction is appropriately set according to the amount and activity of the saccharifying enzyme contained in the liquid fraction, the amount of cellulose contained in the insoluble fraction, and the like.
上記分離工程で形質転換植物の葉部を使用した場合、当該糖化工程において、形質転換植物の葉部以外の部位（例えば、茎部、根部、枝部等）についても、上記液体画分及び不溶性画分と共に混合して、葉部以外の部位のセルロースを糖化させてもよい。この場合、当該糖化工程に供する葉部以外の部位については、前述する糖化前処理工程に供しておくことが望ましい。 When the leaves of the transformed plant are used in the separation step, the liquid fraction and insolubility are also obtained in parts other than the leaves of the transformed plant (for example, stems, roots, branches, etc.) in the saccharification step. You may mix with a fraction and saccharify the cellulose of parts other than a leaf part. In this case, it is desirable to use the saccharification step before the saccharification pretreatment step for the portions other than the leaves to be subjected to the saccharification step.
また、上記液体画分と上記不溶性画分以外に、必要に応じて、糖化酵素を別途添加し、糖化効率を高めることもできる。 In addition to the liquid fraction and the insoluble fraction, a saccharification enzyme can be added separately as necessary to increase the saccharification efficiency.
更に、上記液体画分と上記不溶性画分以外に、必要に応じて、緩衝液、水、ｐＨ調整剤等を添加して、糖化が効率的に進行するように条件を調整することができる。 Furthermore, in addition to the liquid fraction and the insoluble fraction, conditions can be adjusted so that saccharification proceeds efficiently by adding a buffer solution, water, a pH adjuster, or the like, if necessary.
当該糖化工程は、糖化酵素反応の開始時の上記不溶性画分の濃度が乾燥重量換算で０．１〜１５重量％程度、上記液体画分に含まれる糖化酵素の総量の濃度が０．００２〜１重量％程度に設定しておくことが望ましい。 In the saccharification step, the concentration of the insoluble fraction at the start of the saccharifying enzyme reaction is about 0.1 to 15% by weight in terms of dry weight, and the total amount of saccharifying enzyme contained in the liquid fraction is 0.002 to 0.002. It is desirable to set it to about 1% by weight.
当該糖化工程において、糖化酵素を作用させる際のｐＨ及び温度については、当該糖化酵素の作用可能なｐＨ範囲や温度範囲に基づいて適宜設定される。また、当該糖化工程において、糖化酵素を作用させる時間については、糖化酵素の活性や量、セルロースの量、セルロースの糖化の進行状況等に応じて適宜設定すればよい。 In the saccharification step, the pH and temperature when the saccharifying enzyme is allowed to act are appropriately set based on the pH range and temperature range in which the saccharifying enzyme can act. In the saccharification step, the time for which the saccharifying enzyme is allowed to act may be appropriately set according to the activity and amount of the saccharifying enzyme, the amount of cellulose, the progress of saccharification of cellulose, and the like.
斯くして糖化工程を行うことにより、グルコース等の還元糖が生成される。本発明の糖化方法によって生成した還元糖は、アルコール産生微生物を用いたバイオエタノールの製造のための基質として好適に使用される。 Thus, reducing sugars, such as glucose, are produced | generated by performing a saccharification process. The reducing sugar produced by the saccharification method of the present invention is suitably used as a substrate for the production of bioethanol using an alcohol-producing microorganism.
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples and the like, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１：形質転換植物の作製
１．葉緑体形質転換用ベクターの作製法
葉緑体形質転換基本ベクター
（p16S-23S-aadA）の作成
本実験で用いた葉緑体形質転換用ベクターは、Plant Biotechnol J. (2003) 71-79に記載されているpLDApsbAHSAに類する、公知のベクターを基に設計した。まず、相同組み換えに必要な領域として、葉緑体rrn16-rrn23オペロンに相当するDNA断片を取得した。具体的には、タバコ(Nicotiana tabacum cv. Xanthii)から抽出した全DNAを鋳型として、プライマーセット（ADLF: CACTCTGCTGGGCCGACACTGACAC（配列番号２２）、 ADLR: CACTAGCCGACCTTGACCCCTGTT（配列番号２３））を用いてPCRを行い、タバコ葉緑体DNA の103,441-107,302（Gene Bank accession number Z00044）に相当するDNA断片を増幅した。これを、制限酵素PvuIIで処理したpBluescript II KS+に挿入し、p16S-23Sを得た。
Example 1: Production of transformed plants
1. Method for preparing chloroplast transformation vector <br/> Construction of chloroplast transformation basic vector (p16S-23S-aadA) The chloroplast transformation vector used in this experiment was Plant Biotechnol J. (2003). ) Designed based on a known vector similar to pLDApsbAHSA described in 71-79. First, as a region necessary for homologous recombination, a DNA fragment corresponding to the chloroplast rrn16-rrn23 operon was obtained. Specifically, using the total DNA extracted from tobacco (Nicotiana tabacum cv. Xanthii) as a template, PCR was performed using a primer set (ADLF: CACTCTGCTGGGCCGACACTGACAC (SEQ ID NO: 22), ADLR: CACTAGCCGACCTTGACCCCTGTT (SEQ ID NO: 23)), A DNA fragment corresponding to tobacco chloroplast DNA 103,441-107,302 (Gene Bank accession number Z00044) was amplified. This was inserted into pBluescript II KS + treated with the restriction enzyme PvuII to obtain p16S-23S.
形質転換体の選抜に利用するスペクチノマイシン耐性遺伝子(aadA)の発現カセットは、pPrrn-G10L-Aから調整した。pPrrn-G10L-aadAでは、タバコ葉緑体rrn16-rrn23オペロンのプロモーター領域(102,553-102,728（GeneBank accession number Z00044）)とT7バクテリオファージ由来の翻訳調節配列（gene10 Leader）により、aadA遺伝子（葉緑体形質転換ベクターpKH3(Plant Cell Physiol (2003) 44, 334-341)より取得）の発現がコントロールされる遺伝子カセットが、pBluescript II KS-のSacI-PstI間領域にクローニングされている。 pPrrn-G10L-aadAをSacIおよびXhoIで切断し、(Takara)DNA blunting Kitにより平滑末端化した後、Prrn:G10L:aadA発現カセットに相当するDNA断片を回収して、PvuII処理したp16S-23Sにクローニングした（p16S-23S-aadA）。p16S-23S-aadAでは、Prrn:G10L:aadA発現カセットが、タバコ葉緑体rrn16-rrn23オペロン中のtrnIとtrnAの遺伝子間領域（105,332位（Gene Bank accession number Z00044））に挿入されている。 The expression cassette of the spectinomycin resistance gene (aadA) used for selection of transformants was prepared from pPrrn-G10L-A. In pPrrn-G10L-aadA, the promoter region of the tobacco chloroplast rrn16-rrn23 operon (102,553-102,728 (GeneBank accession number Z00044)) and the T7 bacteriophage-derived translational regulatory sequence (gene10 Leader), the aadA gene (chloroplast) A gene cassette that controls the expression of the transformation vector pKH3 (obtained from Plant Cell Physiol (2003) 44, 334-341) has been cloned into the SacI-PstI region of pBluescript II KS-. pPrrn-G10L-aadA was cleaved with SacI and XhoI, blunt-ended with (Takara) DNA blunting Kit, and then a DNA fragment corresponding to the Prrn: G10L: aadA expression cassette was recovered and converted to p16S-23S treated with PvuII. Cloned (p16S-23S-aadA). In p16S-23S-aadA, the Prrn: G10L: aadA expression cassette is inserted in the intergenic region of trnI and trnA (positions 105,332 (Gene Bank accession number Z00044)) in the tobacco chloroplast rrn16-rrn23 operon.
目的遺伝子発現のための基本カセット(pPA-TA(R))の作成
タバコ葉緑体psbA遺伝子の5’-非翻訳領域に相当するDNA断片(1811-1595（GeneBank accession number Z00044）)がクローニングされたpMIK1を鋳型として、プライマーセット（Pst-PpsbA-Fd： CTGCAGCTAGCATATCGAAATTCTAATTTT（配列番号２４）、Xba-PpsbA-Rv: TCTAGATGCATGCTCGAGCGGC（配列番号２５）)を用いてPCRを行い、psbA遺伝子の5’-非翻訳領域とそれに連なるマルチクローニングサイト（MCS）が含まれるDNA断片を増幅した。これを、pGEM-T vector(Promega)にクローニングし、pGEM-PpsbAを得た。また、タバコ葉緑体psbA遺伝子の3’-非翻訳領域に相当するDNA断片(535-142（GeneBank accession number Z00044）)を、タバコの全DNAを鋳型として、プライマーセット (Xba-TpsbA-Fd: TCTAGAGGATCCTGGCCTAGTCTATAGGAG（配列番号２６）、Sal-TpsbA-Rv: GTCGACCGAATATAGCTCTTCTTTCTTATT（配列番号２７）)を用いてPCRにより増幅し、得られたDNA断片をpGEM-T vectorにクローニングした(pGEM-TpsbA)。pGEM-TpsbAをNcoIで切断した後、klenow fragment(NEB)により平滑末端化して、ライゲーションした。これにより、pGEM-T上のNcoIサイトを欠損させた(pGEM-TpsbA-dNc)。 さらに、pGEM-PpsbAをPstIおよびXbaI処理することで、psbA遺伝子の5’-非翻訳領域及びそれに続くMCSを切り出し、同じ制限酵素の組み合わせで切断したpGEM-TpsbA-dNcに挿入した。これにより、psbA遺伝子の5’-非翻訳領域(PpsbA)、MCS、psbA遺伝子の3’-非翻訳領域（TpsbA）が連なる、発現用カセットが得られた(pPA-TA)。さらに、pPA-TAをSalIで切断し、得られた二本のDNA断片を再ライゲーションすることによって、pGEM-Tベクターに対するPpsbA-MCS-TpsbAの方向性が逆転した、pPA-TA(R)を得た。
Construction of basic cassette (pPA-TA (R)) for expression of target gene A DNA fragment (1811-1595 (GeneBank accession number Z00044)) corresponding to the 5'-untranslated region of tobacco chloroplast psbA gene was cloned Using pMIK1 as a template, PCR was performed using a primer set (Pst-PpsbA-Fd: CTGCAGCTAGCATATCGAAATTCTAATTTT (SEQ ID NO: 24), Xba-PpsbA-Rv: TCTAGATGCATGCTCGAGCGGC (SEQ ID NO: 25)), and psbA gene 5'-untranslated A DNA fragment containing the region and the multiple cloning site (MCS) connected to the region was amplified. This was cloned into pGEM-T vector (Promega) to obtain pGEM-PpsbA. In addition, a DNA fragment (535-142 (GeneBank accession number Z00044)) corresponding to the 3′-untranslated region of the tobacco chloroplast psbA gene was used as a primer set (Xba-TpsbA-Fd: TCTAGAGGATCCTGGCCTAGTCTATAGGAG (SEQ ID NO: 26), Sal-TpsbA-Rv: GTCGACCGAATATAGCTCTTCTTTCTTATT (SEQ ID NO: 27)) was amplified by PCR, and the resulting DNA fragment was cloned into the pGEM-T vector (pGEM-TpsbA). pGEM-TpsbA was cleaved with NcoI, blunt-ended with klenow fragment (NEB), and ligated. As a result, the NcoI site on pGEM-T was deleted (pGEM-TpsbA-dNc). Furthermore, pGEM-PpsbA was treated with PstI and XbaI, so that the 5′-untranslated region of the psbA gene and the subsequent MCS were excised and inserted into pGEM-TpsbA-dNc cleaved with the same combination of restriction enzymes. As a result, an expression cassette was obtained in which the 5′-untranslated region (PpsbA) of the psbA gene, the 3′-untranslated region (TpsbA) of the MCS and psbA gene were linked (pPA-TA). In addition, pPA-TA (R) was obtained by cleaving pPA-TA with SalI and religating the two obtained DNA fragments to reverse the direction of PpsbA-MCS-TpsbA with respect to the pGEM-T vector. Obtained.
耐熱性糖化酵素発現ベクターの作成
個々の目的遺伝子の取得法については、後述する。目的遺伝子をコードするDNAの両端をNcoIとXbaIで切断し、同じ組み合わせの制限酵素により処理したpPA-TA(R)にクローニングした（pPA-geneX）。さらに、pPA-geneXを特異的な制限酵素（SalI等）で処理し、得られた発現カセット（PpsbA-geneX-TpsbA）を同じ酵素の組み合わせで切断したp16S-23S-aadAに挿入することで、目的の耐熱性酵素を葉緑体DNAに導入するための葉緑体形質転換用ベクター(pKATシリーズ)を構築した。当該葉緑体形質転換用ベクターの構造を図１に示す。
Preparation of thermostable saccharifying enzyme expression vector The method for obtaining individual target genes will be described later. Both ends of the DNA encoding the target gene were cleaved with NcoI and XbaI and cloned into pPA-TA (R) treated with the same combination of restriction enzymes (pPA-geneX). Furthermore, by treating pPA-geneX with a specific restriction enzyme (SalI etc.) and inserting the resulting expression cassette (PpsbA-geneX-TpsbA) into p16S-23S-aadA cut with the same enzyme combination, A chloroplast transformation vector (pKAT series) was constructed to introduce the desired thermostable enzyme into chloroplast DNA. The structure of the chloroplast transformation vector is shown in FIG.
(4)目的酵素遺伝子の取得
＜改変黄色蛍光タンパク質（cpVnus）を融合させたクロストリジウム・サーモセラム由来のβ1,4-エンドグルカナーゼ（配列番号１１のアミノ酸配列のポリペプチド）＞
由来生物およびORF: Clostridium thermocellum ATCC27450 Cthe_2812
Clostridium thermocellum ATCC 27450のゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット（EGL-Fd1: CCATGGAATACAATTATGCAAAGGCGCTG（配列番号２８）、EGL-Rv1: TCTAGAATTATCCATATACAATTTGCGTATCAGG（配列番号２９））を用いてPCRを行い、得られたDNA断片を、pGEM-Tにクローニングした(pGEM-EGLI)。pGEM-EGLIをNcoI, XbaI切断して得られた目的遺伝子断片を、同様の制限酵素で切断したpPA-TA(R)に挿入し、pPA-EGL1を得た。さらに、pPA-EGL1をSalI処理することで得られる発現カセットPpsbA-EGL1-TpsbAを、同じくSalIで切断したp16S-23S-aadAとライゲーションすることで、葉緑体形質転換用ベクターpKAT1Aを作出した。
第一試行の結果、pKAT1Aを導入した形質転換タバコ(KAT1A)における、目的のエンドグルカナーゼ（EGL1）の発現量は低レベルであった。そこで、発現を増強するための工夫として、エンドグルカナーゼを、葉緑体での大量発現が可能な黄色蛍光タンパク質(Venus)との融合タンパク質として発現させることを試みた。Venusは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）の変異体の１種であるが、GFPよりも熱安定性が高いことが報告されている(Nature biotechnology (2002) 20, 87-90)。そこで、Venus遺伝子のコドンを葉緑体での発現に適した形に改変した人工遺伝子（cpVnus）を作成し、pGEM-Tベクターにクローニングした。これを、NcoIで処理することでcpVenus断片を回収し、同じくNcoIで切断したpPA-EGL1とライゲーションすることで、pPA-cpVenus-EGL1を得た。さらに、pPA-cpVenus-EGL1をSalI処理することで得られる発現カセットPpsbA-cpVenus-EGL1-TpsbAを、同じくSalIで切断したp16S-23S-aadAとライゲーションすることで、葉緑体形質転換用ベクターpKAT1Bを作出した。
(4) Acquisition of target enzyme gene <β1,4-endoglucanase derived from clostridium thermocellum fused with modified yellow fluorescent protein (cpVnus) (polypeptide of amino acid sequence of SEQ ID NO: 11)>
Origin and ORF: Clostridium thermocellum ATCC27450 Cthe_2812
Using the genomic DNA of Clostridium thermocellum ATCC 27450 as a template, PCR was performed using a primer set (EGL-Fd1: CCATGGAATACAATTATGCAAAGGCGCTG (SEQ ID NO: 28), EGL-Rv1: TCTAGAATTATCCATATACAATTTGCGTATCAGG (SEQ ID NO: 29)), and the resulting DNA fragment was It was cloned into pGEM-T (pGEM-EGLI). The target gene fragment obtained by cleaving pGEM-EGLI with NcoI and XbaI was inserted into pPA-TA (R) cleaved with the same restriction enzymes to obtain pPA-EGL1. Furthermore, the expression cassette PpsbA-EGL1-TpsbA obtained by SalI treatment of pPA-EGL1 was ligated with p16S-23S-aadA, which was also cut with SalI, to produce a chloroplast transformation vector pKAT1A.
As a result of the first trial, the expression level of the target endoglucanase (EGL1) in the transformed tobacco (KAT1A) introduced with pKAT1A was low. Thus, as a device for enhancing expression, an attempt was made to express endoglucanase as a fusion protein with a yellow fluorescent protein (Venus) that can be expressed in large amounts in chloroplasts. Venus is one of the mutants of green fluorescent protein (GFP) derived from Aequorea jellyfish, but has been reported to have higher thermal stability than GFP (Nature biotechnology (2002) 20, 87-90). Therefore, an artificial gene (cpVnus) in which the codon of Venus gene was modified into a form suitable for expression in chloroplasts was created and cloned into the pGEM-T vector. This was treated with NcoI to recover the cpVenus fragment and ligated with pPA-EGL1 that was also cleaved with NcoI to obtain pPA-cpVenus-EGL1. Furthermore, the expression cassette PpsbA-cpVenus-EGL1-TpsbA obtained by SalI treatment of pPA-cpVenus-EGL1 is ligated with p16S-23S-aadA, which has also been cut with SalI, so that the vector chloroplast transformation vector pKAT1B Made.
＜クロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼII（配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチド）＞
由来生物およびORF: Clostridium thermocellum ATCC 27450 Cthe_0412
Clostridium thermocellum ATCC 27450のゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット(Nco-CBHII-Fd1: CCATGGAAGACAAGTCTCCAAAGTTGCCGGATTA（配列番号３０）、CBHII-Rv1: GGCTAGTCTAGAATTAACCATAAATAACCTCCGGTTCTTCTGGG（配列番号３１）)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片を、pGEM-Tにクローニングした(pGEM-CBHII)。pGEM-CBHIIをNcoI, XbaI切断して得られた目的遺伝子断片を、同様の制限酵素で切断したpPA-TA(R)に挿入し、pPA-CBHIIを得た。さらに、pPA-CBHIIをSalI処理することで得られる発現カセットPpsbA-CBHII-TpsbAを、同じくSalIで切断したp16S-23S-aadAとライゲーションすることで、葉緑体形質転換用ベクターpKAT3を作出した。
<Cerobiohydrolase II derived from Clostridium thermocellum (polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2)>
Origin and ORF: Clostridium thermocellum ATCC 27450 Cthe_0412
Using the genomic DNA of Clostridium thermocellum ATCC 27450 as a template, PCR was performed using the primer sets (Nco-CBHII-Fd1: CCATGGAAGACAAGTCTCCAAAGTTGCCGGATTA (SEQ ID NO: 30), CBHII-Rv1: GGCTAGTCTAGAATTAACCATAAATAACCTCCGGTTCTTCTGGG (SEQ ID NO: 31)). Was cloned into pGEM-T (pGEM-CBHII). The target gene fragment obtained by cleaving pGEM-CBHII with NcoI and XbaI was inserted into pPA-TA (R) cleaved with the same restriction enzymes to obtain pPA-CBHII. Furthermore, the expression cassette PpsbA-CBHII-TpsbA obtained by SalI treatment of pPA-CBHII was ligated with p16S-23S-aadA, which was also cut with SalI, to produce a chloroplast transformation vector pKAT3.
＜クロストリジウム・サーモセラム由来のβグルコシダーゼ（配列番号４のアミノ酸配列のポリペプチド）＞
由来生物およびORF: Clostridium thermocellum ATCC 27450 Cthe_1256
Clostridium thermocellum ATCC 27450のゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット(BGL1-Fd1: CCATGGCGGTAGATATCAAGAAAATAATAA（配列番号３２）、BGL1-Rv1: TCTAGAATTATTCCACGTTGTTTATTTTGTCAACC（配列番号３３）)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片を、pGEM-Tにクローニングした(pGEM-BGL1)。pGEM-BGL1をNcoI, XbaI切断して得られた目的遺伝子断片を、同様の制限酵素で切断したpPA-TA(R)に挿入し、pPA-BGL1を得た。さらに、pPA-BGL1をSalI処理することで得られる発現カセットPpsbA-BGL1-TpsbAを、同じくSalIで切断したp16S-23S-aadAとライゲーションすることで、葉緑体形質転換用ベクターpKAT4を作出した。
<Β-glucosidase derived from clostridium thermocellum (polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4)>
Origin and ORF: Clostridium thermocellum ATCC 27450 Cthe_1256
Using the genomic DNA of Clostridium thermocellum ATCC 27450 as a template, PCR was performed using a primer set (BGL1-Fd1: CCATGGCGGTAGATATCAAGAAAATAATAA (SEQ ID NO: 32), BGL1-Rv1: TCTAGAATTATTCCACGTTGTTTATTTTGTCAACC (SEQ ID NO: 33)), and the resulting DNA fragment was It was cloned into pGEM-T (pGEM-BGL1). The target gene fragment obtained by cleaving pGEM-BGL1 with NcoI and XbaI was inserted into pPA-TA (R) cleaved with the same restriction enzymes to obtain pPA-BGL1. Furthermore, the expression cassette PpsbA-BGL1-TpsbA obtained by SalI treatment of pPA-BGL1 was ligated with p16S-23S-aadA, which was also cut with SalI, to produce a chloroplast transformation vector pKAT4.
＜クロストリジウム・サーモセラム由来のキシラナーゼ（配列番号５のアミノ酸配列のポリペプチド）＞
由来生物およびORF: Clostridium thermocellum ATCC 27450 Cthe_2972
Clostridium thermocellum ATCC 27450のゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット(Nco-XYN-Fd1: CCATGGTAGTAATTACGTCAAACCAGACGGGTACTCATG（配列番号３４）、XYN1-M1-Rv: CCGTCTTTGAGGACCATAGTTCCGTTTCCG（配列番号３５）)を用いてPCRを行い、目的遺伝子のN-末端側に相当するDNA断片(XYN1-N)を得た。更に、プライマーセット(XYN1-M1-Fd: CGGAAACGGAACTATGGTCCTCAAAGACGG（配列番号３６）XYN1-Rv1: GGCTAGTCTAGAATTAATTTACGCCATTCGAGTCGAATATGAAGTAGTCA（配列番号３７）)を用いてPCRを行い、目的遺伝子のC-末端側に相当するDNA断片(XYN1-C)を得た。
<Xylanase derived from Clostridium thermocellum (polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5)>
Origin and ORF: Clostridium thermocellum ATCC 27450 Cthe_2972
PCR using the genomic DNA of Clostridium thermocellum ATCC 27450 as a template and primer set (Nco-XYN-Fd1: CCATGGTAGTAATTACGTCAAACCAGACGGGTACTCATG (SEQ ID NO: 34), XYN1-M1-Rv: CCGTCTTTGAGGACCATAGTTCCGTTTCCG (SEQ ID NO: 35)) A DNA fragment (XYN1-N) corresponding to the N-terminal side was obtained. Furthermore, PCR was performed using a primer set (XYN1-M1-Fd: CGGAAACGGAACTATGGTCCTCAAAGACGG (SEQ ID NO: 36) XYN1-Rv1: GGCTAGTCTAGAATTAATTTACGCCATTCGAGTCGAATATGAAGTAGTCA (SEQ ID NO: 37)), and a DNA fragment corresponding to the C-terminal side of the target gene (XYN1- C) was obtained.
XYN1-N及びXYN1-Cを混合し、プライマーセット(Nco-XYN-Fd1: CCATGGTAGTAATTACGTCAAACCAGACGGGTACTCATG（配列番号３８）、XYN1-Rv1: GGCTAGTCTAGAATTAATTTACGCCATTCGAGTCGAATATGAAGTAGTCA（配列番号３９）)を用いてPCRを行い、目的遺伝子の全長に相当するDNA断片を増幅し、pGEM-Tにクローニングした(pGEM-XYN1)。２段階のPCRにより目的遺伝子の全長を取得したのは、後のクローニング作業にとって不都合な、コーディング領域内のNcoI認識サイトに変異を加えるためである。pGEM-XYN1をNcoI, XbaI切断して得られた目的遺伝子断片を、同様の制限酵素で切断したpPA-TA(R)に挿入し、pPA-XYN1を得た。さらに、pPA-XYN1をSalI処理することで得られる発現カセットPpsbA-XYN1-TpsbAを、同じくSalIで切断したp16S-23S-aadAとライゲーションすることで、葉緑体形質転換用ベクターpKAT５を作出した。 XYN1-N and XYN1-C were mixed and PCR was performed using the primer set (Nco-XYN-Fd1: CCATGGTAGTAATTACGTCAAACCAGACGGGTACTCATG (SEQ ID NO: 38), XYN1-Rv1: GGCTAGTCTAGAATTAATTTACGCCATTCGAGTCGAATATGAAGTAGTCA (SEQ ID NO: 39)) The corresponding DNA fragment was amplified and cloned into pGEM-T (pGEM-XYN1). The reason why the full length of the target gene was obtained by two-step PCR is to add mutations to the NcoI recognition site in the coding region, which is inconvenient for subsequent cloning work. The target gene fragment obtained by cleaving pGEM-XYN1 with NcoI and XbaI was inserted into pPA-TA (R) cleaved with the same restriction enzymes to obtain pPA-XYN1. Furthermore, the expression cassette PpsbA-XYN1-TpsbA obtained by SalI treatment of pPA-XYN1 was ligated with p16S-23S-aadA, which was also cut with SalI, to produce a chloroplast transformation vector pKAT5.
＜クロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼI (CelS)（配列番号８のアミノ酸配列のポリペプチド）＞
由来生物およびORF: Clostridium thermocellum ATCC 27450 Cthe_2089
Clostridium thermocellum ATCC27450のゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット(CelS-Fd1: CCATGGGTCCTACAAAGGCACCTACAAAAG（配列番号４０）、CelS-Rv1: TCTAGAATTAGTATAATTTAGTAGAAGGAGTACCAGGT（配列番号４１）)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片を、pGEM-Tにクローニングした(pGEM-CelS)。pGEM-CBHIIをNcoI, XbaI切断して得られた目的遺伝子断片を、同様の制限酵素で切断したpPA-TA(R)に挿入し、pPA-CelSを得た。さらに、pPA-CelSをSacI処理後平滑末端化し、さらにPstIで処理することによって得られる発現カセットPpsbA-CelS-TpsbAを、同じくSalIで切断後平滑末端化し、さらにPstIで切断したp16S-23S-aadAとライゲーションすることで、葉緑体形質転換用ベクターpKAT6を作出した。
<Cellobiohydrolase I (CelS) derived from Clostridium thermocellum (polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8)>
Origin and ORF: Clostridium thermocellum ATCC 27450 Cthe_2089
Using the genomic DNA of Clostridium thermocellum ATCC27450 as a template, PCR was performed using primer sets (CelS-Fd1: CCATGGGTCCTACAAAGGCACCTACAAAAG (SEQ ID NO: 40), CelS-Rv1: TCTAGAATTAGTATAATTTAGTAGAAGGAGTACCAGGT (SEQ ID NO: 41)), and the resulting DNA fragment was pGEM Cloned into -T (pGEM-CelS). The target gene fragment obtained by cleaving pGEM-CBHII with NcoI and XbaI was inserted into pPA-TA (R) cleaved with the same restriction enzymes to obtain pPA-CelS. In addition, pPA-CelS was treated with SacI and then blunt-ended, and the expression cassette PpsbA-CelS-TpsbA obtained by treating with PstI was similarly cut with SalI, blunt-ended, and then p16S-23S-aadA cut with PstI. Was ligated to produce a chloroplast transformation vector pKAT6.
＜クロストリジウム・サーモセラム由来のフェルラ酸エステラーゼ（配列番号７のアミノ酸配列のポリペプチド）＞
由来生物およびORF: Clostridium thermocellum ATCC27450 Cthe_1963
Clostridium thermocellum ATCC 27450のゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット(FAE1-Fd1: CCATGGTCACAATAAGCAGTACATCAGCGGCATC（配列番号４２）、FAE1-Rv1: TCTAGAATCAAACGCCAAAAGTGAACCAGTCTATG（配列番号４３）)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片を、pGEM-Tにクローニングした(pGEM-FAE1)。pGEM-FAE1をNcoI, XbaI切断して得られた目的遺伝子断片を、同様の制限酵素で切断したpPA-TA(R)に挿入し、pPA-FAE1を得た。さらに、pPA-FAE1をPstIおよびSalIで切断することで得られる発現カセットPpsbA-FAE1-TpsbAを、同じ組み合わせの制限酵素で処理したp16S-23S-aadAとライゲーションすることで、葉緑体形質転換用ベクターpKAT7を作出した。
<Ferulic acid esterase derived from clostridium thermocellum (polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7)>
Origin and ORF: Clostridium thermocellum ATCC27450 Cthe_1963
Using the genomic DNA of Clostridium thermocellum ATCC 27450 as a template, PCR was performed using the primer set (FAE1-Fd1: CCATGGTCACAATAAGCAGTACATCAGCGGCATC (SEQ ID NO: 42), FAE1-Rv1: TCTAGAATCAAACGCCAAAAGTGAACCAGTCTATG (SEQ ID NO: 43)), and the resulting DNA fragment was obtained. It was cloned into pGEM-T (pGEM-FAE1). The target gene fragment obtained by cleaving pGEM-FAE1 with NcoI and XbaI was inserted into pPA-TA (R) cleaved with the same restriction enzymes to obtain pPA-FAE1. Furthermore, ligation of the expression cassette PpsbA-FAE1-TpsbA obtained by cleaving pPA-FAE1 with PstI and SalI with p16S-23S-aadA treated with the same combination of restriction enzymes enables chloroplast transformation. The vector pKAT7 was created.
＜サーモトガ・マリティマ由来のキシロシダーゼ（配列番号６のアミノ酸配列のポリペプチド）＞
由来生物およびORF: Thermotoga maritime MSB8 TM_0076
Thermotoga maritima MSB8のゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット(TM76-Fd1: CCATGGAACTGTACAGGGATCCTTCGCAAC（配列番号４４）、TM76-Rv1: TCTAGAATTATTCCACGTTGTTTATTTTGTCAACC（配列番号４５）)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片を、pGEM-Tにクローニングした(pGEM-XYL1)。pGEM-XYL1をNcoI, XbaI切断して得られた目的遺伝子断片を、同様の制限酵素で切断したpPA-TA(R)に挿入し、pPA-XYL1を得た。さらに、pPA-XYL1をSacI処理後、平滑末端化し、さらにPstIで切断することで得られる発現カセットPpsbA-XYL1-TpsbAを、同じくSalI処理後平滑末端化し、さらに、PstIで切断したp16S-23S-aadAとライゲーションすることで、葉緑体形質転換用ベクターpKAT9を作出した。
<Xylosidase derived from Thermotoga maritima (polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6)>
Origin and ORF: Thermotoga maritime MSB8 TM_0076
PCR was performed using Thermotoga maritima MSB8 genomic DNA as a template and primer sets (TM76-Fd1: CCATGGAACTGTACAGGGATCCTTCGCAAC (SEQ ID NO: 44), TM76-Rv1: TCTAGAATTATTCCACGTTGTTTATTTTGTCAACC (SEQ ID NO: 45)), and the resulting DNA fragment was pGEM Cloned into -T (pGEM-XYL1). The target gene fragment obtained by cleaving pGEM-XYL1 with NcoI and XbaI was inserted into pPA-TA (R) cleaved with the same restriction enzymes to obtain pPA-XYL1. Furthermore, pPA-XYL1 was subjected to SacI treatment, blunt-ended, and further cleaved with PstI. The expression cassette PpsbA-XYL1-TpsbA obtained by the same SalI treatment, blunt-ended, and further cleaved with PstI p16S-23S- A chloroplast transformation vector pKAT9 was created by ligation with aadA.
＜バチルス・ズブチリス由来のエクスパンシン（配列番号９のアミノ酸配列のポリペプチド）＞
Bacillus subtilisのゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット(BsEXP-Fd1: CCATGGCTTATGACGACCTGCATGAAGG（配列番号４６）、BsEXP-Rv1: TCTAGAATTATTCAGGAAACTGAACATGGCCCGG（配列番号４７）を用いてPCRを行い、得られたDNA断片を、pGEM-Tにクローニングした(pGEM-EXP)。pGEM-EXPをNcoI, XbaI切断して得られた目的遺伝子断片を、同様の制限酵素で切断したpPA-TA(R)に挿入し、pPA-EXPを得た。さらに、pPA-EXPをPstIおよびSalIで切断することで得られる発現カセットPpsbA-EXP-TpsbAを、同じ組み合わせの制限酵素で処理したp16S-23S-aadAとライゲーションすることで、葉緑体形質転換用ベクターpKAT10を作出した。
<Expansin derived from Bacillus subtilis (polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9)>
Using the genomic DNA of Bacillus subtilis as a template, PCR was performed using primer sets (BsEXP-Fd1: CCATGGCTTATGACGACCTGCATGAAGG (SEQ ID NO: 46), BsEXP-Rv1: TCTAGAATTATTCAGGAAACTGAACATGGCCCGG (SEQ ID NO: 47)), and the resulting DNA fragment was pGEM-T (PGEM-EXP) The target gene fragment obtained by cleaving pGEM-EXP with NcoI and XbaI was inserted into pPA-TA (R) cleaved with the same restriction enzymes to obtain pPA-EXP. Furthermore, ligation of the expression cassette PpsbA-EXP-TpsbA obtained by cleaving pPA-EXP with PstI and SalI and p16S-23S-aadA treated with the same combination of restriction enzymes results in chloroplast transformation. The vector pKAT10 was created.
＜カルディセルロシルブター・サッカロリティカス由来のセロビオヒドロラーゼI CelA (GeneBank L32742.1)（配列番号１のアミノ酸配列のポリペプチド）＞
由来生物およびORF: Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 CelA(GeneBank L32742.1)
Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM8903のゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット(CsCBH-Fd1: CCATGGAATATGGGCAGAGGTTTATGTGGTTGTG（配列番号４８）、CsCBH-Rv1: TCTAGAATTATTGATTACCGAACAGAATTTCATATGTT（配列番号４９）)を用いてPCRを行い、得られたDNA断片を、pGEM-Tにクローニングした(pGEM-CBHI)。pGEM-CBHIをNcoI, XbaI切断して得られた目的遺伝子断片を、同様の制限酵素で切断したpPA-TA(R)に挿入し、pPA-CBHIを得た。さらに、pPA-CBHIをPstIおよびSalIで切断することで得られる発現カセットPpsbA-CBHI-TpsbAを、同じ組み合わせの制限酵素で処理したp16S-23S-aadAとライゲーションすることで、葉緑体形質転換用ベクターpKAT11を作出した。Caldicellulosiruptor saccharolyticus CelA中のCBHIドメイン（ＣＤ２）を大腸菌で発現させても酵素活性が検出されなかったことは、Appl Microbiol Biotechnol (1995) 43: 291-296に記載されている。
<Cellobiohydrolase I CelA (GeneBank L32742.1) derived from Cardicellulosyl butter saccharolyticus (polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1)>
Origin and ORF: Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 CelA (GeneBank L32742.1)
Using the genomic DNA of Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM8903 as a template, PCR was performed using the primer set (CsCBH-Fd1: CCATGGAATATGGGCAGAGGTTTATGTGGTTGTG (SEQ ID NO: 48), CsCBH-Rv1: TCTAGAATTATTGATTACCGAACAGAATTTCATATGTT (SEQ ID NO: 49)). Cloned into -T (pGEM-CBHI). The target gene fragment obtained by cleaving pGEM-CBHI with NcoI and XbaI was inserted into pPA-TA (R) cleaved with the same restriction enzymes to obtain pPA-CBHI. Furthermore, ligation of the expression cassette PpsbA-CBHI-TpsbA obtained by cleaving pPA-CBHI with PstI and SalI with p16S-23S-aadA treated with the same restriction enzyme for chloroplast transformation The vector pKAT11 was created. It is described in Appl Microbiol Biotechnol (1995) 43: 291-296 that no enzyme activity was detected even when the CBHI domain (CD2) in Caldicellulosiruptor saccharolyticus CelA was expressed in E. coli.
２．葉緑体形質タバコの作製法
タバコの葉緑体形質転換は、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1993) 90, 913-917及びMethods in Molecular Biology vol.286: Transgenic Plants 111-137を参考にした。25℃、16時間明 (光照度：30 mmolm-2sec-1)/８時間暗の周期で、タバコ（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）を３％ショ糖含有RM寒天培地（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1990) 87, 8526-8530）にて無菌的に生育させた。
2. Preparation method of chloroplast trait tobacco For chloroplast transformation of tobacco, refer to Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 913-917 and Methods in Molecular Biology vol.286: Transgenic Plants 111-137 I made it. 25 ° C, 16 hours light (light illuminance: 30 mmolm -2 sec -1 ) / 8 hours dark period, tobacco (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) with RM agar containing 3% sucrose (Proc. Natl. Acad. Sci USA (1990) 87, 8526-8530).
播種後１ヶ月程度の植物体から若い緑葉（長径４〜５ｃｍ程度）を切除し、パーティクルガン（BIO-RAD: PDS1000He）による遺伝子導入に供した。形質転換用ベクターを導入する粒子には、金粒子（０．６μm）を用いた。 Young green leaves (about 4 to 5 cm in major axis) were excised from the plants about 1 month after sowing and subjected to gene transfer using a particle gun (BIO-RAD: PDS1000He). Gold particles (0.6 μm) were used as particles into which the transformation vector was introduced.
パーティクルガン処理後のタバコ葉を、25℃、暗所にて3日間インキュベーションした後、葉を切片化して、スペクチノマイシン（200mg/L）入りの３％ショ糖含有RMOP寒天培地に移した。その後、25℃、16時間明 (光照度：30 mmolm-2sec-1)/８時間暗の周期下で培養した。4〜6週でスペクチノマイシン耐性シュート（あるいはカルス）が得られた。 The tobacco leaves after the particle gun treatment were incubated at 25 ° C. in the dark for 3 days, and then the leaves were sectioned and transferred to a 3% sucrose-containing RMOP agar medium containing spectinomycin (200 mg / L). Thereafter, the cells were cultured at 25 ° C. for 16 hours in light (light intensity: 30 mmolm −2 sec −1 ) / 8 hours in a dark cycle. A spectinomycin resistant shoot (or callus) was obtained at 4-6 weeks.
スペクチノマイシン耐性シュート/カルスを、スペクチノマイシン（500mg/L）入りの３％ショ糖含有RMOP寒天培地に植え継ぎ、１ヶ月程度無菌培養した段階で一部組織を採取し、細胞内の全DNAを調整した。その全DNAを鋳型として特異的プライマーセットを用いてPCRを行うことによって、葉緑体DNAの所定の領域に目的遺伝子が導入されていることを確認した。 A spectinomycin-resistant shoot / callus was planted on a 3% sucrose-containing RMOP agar medium containing spectinomycin (500 mg / L), and a portion of the tissue was collected after aseptic culture for about 1 month. DNA was prepared. By performing PCR using the specific primer set using the total DNA as a template, it was confirmed that the target gene was introduced into a predetermined region of chloroplast DNA.
目的遺伝子の導入が確認された形質転換体系統のシュートを、スペクチノマイシン(500mg/L)入りの３％ショ糖含有RM培地に移植することによって、発根及び植物体の増殖を促した。再生した植物体の緑葉から全DNAを調整し、サザンブロティングにより、遺伝子導入型葉緑体DNAの量（ホモプラズミシティー）を調べた。 The shoots of the transformant lines in which the introduction of the target gene was confirmed were transplanted into RM medium containing 3% sucrose containing spectinomycin (500 mg / L) to promote rooting and plant growth. Total DNA was prepared from the green leaves of the regenerated plant, and the amount (homoplasmicity) of the transgenic chloroplast DNA was examined by Southern blotting.
サザンブロティングの具体的な方法としては、得られた形質転換体について、1μgの細胞内全DNAを制限酵素XmnIで処理し、1%アガロース電気泳動で分離した後、ナイロンメンブレンHybond-N (GE Healthcare)へと転写した。プローブは、プライマーセット（ADL-2F: CCCCTTTTTTACGTCCCCATGTTCC（配列番号５０）、ADL-2R: GCCTTTCCTCGTTTGAACCTCGCCC（配列番号５１））を用い、PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche)により合成した。ハイブリダーゼションにはDIG Easy Hyb(Roche)を、シグナルの検出にはDIG Luminescent Detection Kit(Roche)を使用した。その結果を図２に示す。野生型タバコ（WT）では、2.3 Kbpのバンドが検出されるのに対し、各種形質転換タバコ（KATs）では、導入遺伝子の鎖長に応じて検出されるバンドの大きさが変化している。なお、クロストリジウム・サーモセラム由来のセロビオヒドロラーゼIIを葉緑体内に組み込んだタバコ（KAT3-1）とサーモトガ・マリティマ由来のキシロシダーゼを葉緑体内に組み込んだタバコ（KAT9-6）については、導入した糖化酵素遺伝子中にXmnIサイトが存在するため、2本のバンドが検出された。また、各形質転換体には、野生型タバコのゲノムに由来する2.3 Kbpのバンドが認められないことから、これらの形質転換体がホモプラズミック系統であることがであることが確認された。 As a specific method of Southern blotting, 1 μg of intracellular total DNA was treated with the restriction enzyme XmnI and separated by 1% agarose electrophoresis, and then nylon membrane Hybond-N (GE Transcript to Healthcare). Probes were synthesized by PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche) using a primer set (ADL-2F: CCCCTTTTTTACGTCCCCATGTTCC (SEQ ID NO: 50), ADL-2R: GCCTTTCCTCGTTTGAACCTCGCCC (SEQ ID NO: 51)). DIG Easy Hyb (Roche) was used for hybridization, and DIG Luminescent Detection Kit (Roche) was used for signal detection. The result is shown in FIG. In wild-type tobacco (WT), a 2.3 Kbp band is detected, while in various transformed tobacco (KATs), the size of the detected band changes according to the length of the transgene. In addition, the saccharification was introduced for tobacco (KAT3-1) in which cellobiohydrolase II derived from Clostridium thermocellum was incorporated into the chloroplast and tobacco (KAT9-6) in which xylosidase derived from Thermotoga maritima was incorporated into the chloroplast. Two bands were detected due to the presence of the XmnI site in the enzyme gene. Moreover, since no 2.3 Kbp band derived from the genome of wild-type tobacco was observed in each transformant, it was confirmed that these transformants were homoplasmic strains.
３．葉緑体形質転換タバコの表現型
上記で作製された形質転換植物は、いずれの糖化酵素を導入したものでも、３％ショ糖含有RM寒天培地で無菌的に生育させると、形質転換当代における顕著な生育異常は認められなかった。
3. Phenotypes of chloroplast-transformed tobacco Any of the transformed plants prepared as described above, when any of the saccharifying enzymes are introduced, grows aseptically on a 3% sucrose-containing RM agar medium. No abnormal growth was observed.
４．各形質転換体での酵素発現量の確認
３％ショ糖含有RM寒天培地で無菌的に生育させた各種形質転換植物（タバコ）から、長径４〜５cm程度（新鮮重量200〜400mg程度）の緑葉を収穫し、新鮮重量200 mgあたり1 mlのタンパク質抽出バッファー(50 mM Sodium acetate(pH6.0), 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10% (V/V) glycerol, 2 mM PMSF)で粉砕した。粉砕には氷冷した乳鉢、乳棒を用いた。破砕液をサンプリングチューブに移し、20,000 g 、10分間、4℃にて遠心分離し、上清（TSP）を回収した。更に、上清（TSP）を60℃にて20分間インキュベ-ションした後、20,000g、5分間、4℃にて遠心分離した。得られた上清が目的酵素の簡易精製画分である（Heated）。これらのサンプルをSDS-PAGE（Mini-PROTEAN TGX Any-kD(Bio-RAD)に供し、CBB染色を行ったところ、各糖化酵素が検出された（図３参照）。
4). Confirmation of enzyme expression level in each transformant Green leaves of various lengths of about 4-5cm (fresh weight about 200-400mg) from various transformed plants (tobacco) grown aseptically on RM agar medium containing 3% sucrose Harvested and ground with 1 ml protein extraction buffer (50 mM Sodium acetate (pH 6.0), 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10% (V / V) glycerol, 2 mM PMSF) per 200 mg fresh weight . An ice-cooled mortar and pestle were used for grinding. The disrupted solution was transferred to a sampling tube and centrifuged at 20,000 g for 10 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant (TSP). Further, the supernatant (TSP) was incubated at 60 ° C. for 20 minutes, and then centrifuged at 20,000 g for 5 minutes at 4 ° C. The obtained supernatant is a simple purified fraction of the target enzyme (Heated). When these samples were subjected to SDS-PAGE (Mini-PROTEAN TGX Any-kD (Bio-RAD)) and CBB staining was performed, each saccharifying enzyme was detected (see FIG. 3).
５．植物の栽培
３％ショ糖含有RM寒天培地で無菌的に生育させ、高さ１０〜１５ｃｍに達した各種形質転換植物（タバコ）を、バーミッキュライト入りのポットに移植し、25℃、16時間明 (光照度：50-100mmolm-2sec-1)/８時間暗の環境下で、500倍希釈したHyponex（株式会社ハイポネックスジャパン）を施肥しつつ栽培した。１ヶ月程度経過して、植物が５０cm以上の高さに達したところで、緑葉をサンプリングした。
5. Cultivation of plants Various transformed plants (tobacco) grown aseptically on RM agar medium containing 3% sucrose and reaching a height of 10 to 15 cm were transplanted into pots containing vermiculite, 25 ° C., 16 Time light (light illuminance: 50-100 mmolm -2 sec -1 ) / 8 hours under dark environment, Hyponex (Hyponex Japan Co., Ltd.) diluted 500 times was cultivated and fertilized. About 1 month later, when the plant reached a height of 50 cm or more, the green leaves were sampled.
又は、無菌的に前培養した各種形質転換植物（タバコ）を、1/2濃度のMurashige & Skoog（ＭＳ）液体培地（Physiol. Plant (1962) 15, 493-497）に移植し、25℃、16時間明(光照度：50 mmolm-2sec-1)/８時間暗の環境下で、水耕栽培した。土壌栽培の場合と同様、３週間〜１ヶ月程度経過して、植物が５０cm以上の高さに生育したところで、緑葉をサンプリングした。 Alternatively, various transformed plants (tobacco) pre-cultured aseptically were transplanted into a 1/2 concentration Murashige & Skoog (MS) liquid medium (Physiol. Plant (1962) 15, 493-497), Hydroponic cultivation was performed in a dark environment for 16 hours (light intensity: 50 mmolm −2 sec −1 ) / 8 hours. As in the case of soil cultivation, green leaves were sampled when a plant grew to a height of 50 cm or more after about 3 weeks to 1 month.
斯くして得られた緑葉を後記する実施例２の実験に使用した。 The green leaves thus obtained were used in the experiment of Example 2 described later.
実施例２
上記実施例１で得られた形質転換植物（タバコ）の緑葉を使用して、当該緑葉中のセルロースの糖化実験を行った。
１．糖化酵素を含む液体画分とセルロースを含む不溶性画分の分離
形質転換植物（タバコ）の緑葉143.5g(β1,4-エンドグルカナーゼを導入したタバコ(KAT1B-3)の葉24.5g、セロビオヒドロラーゼIIを導入したタバコ（KAT3-1）の葉7.2g、βグルコシダーゼを導入したタバコ(KAT4-1)の葉33.2g、キシラナーゼを導入したタバコ(KAT5-4)の葉1.9g、キシロシダーゼを導入したタバコ(KAT9-6)の葉1.7g、セロビオヒドロラーゼIを導入したタバコ(KAT11-5)の葉75g)をドライアイスと共にブレンダーにより凍結・粉砕した。この粉砕物を290mlの50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.6）に懸濁し、氷上で20 分間緩やかに攪拌した後、遠心分離（25000 x g、20分）し、上清を粗抽出液、沈殿を不溶性画分として回収した。上清は60℃で20分間処理した後に、遠心分離(25000 x g、20分間)し、その上清は、酵素を含む液体画分として回収した。当該液体画分は0.22μmのメンブランフィルターでろ過し、4℃で保存した。当該液体画分中のタンパク質量をプロテインアッセイキット（BIO-RAD社）を用いて、BSAをスタンダードとして測定したところ、タンパク質量の総量は688mgであった。
Example 2
Using the green leaves of the transformed plant (tobacco) obtained in Example 1 above, a saccharification experiment of cellulose in the green leaves was performed.
1. Separation of liquid fraction containing saccharifying enzyme and insoluble fraction containing cellulose Green leaves of transformed plant (tobacco) 143.5 g (24.5 g of tobacco (KAT1B-3) introduced with β1,4-endoglucanase), cellobiohydrolase Tobacco (KAT3-1) leaves introduced with II II, β-glucosidase introduced tobacco (KAT4-1) leaves 33.2 g, xylanase introduced tobacco (KAT5-4) leaves 1.9 g, xylosidase introduced Tobacco (KAT9-6) leaves 1.7 g and cellobiohydrolase I-introduced tobacco (KAT11-5) leaves 75 g) were frozen and ground in a blender with dry ice. This ground product is suspended in 290 ml of 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.6), stirred gently on ice for 20 minutes and then centrifuged (25000 xg, 20 minutes). It was collected as an insoluble fraction. The supernatant was treated at 60 ° C. for 20 minutes and then centrifuged (25000 × g, 20 minutes), and the supernatant was recovered as a liquid fraction containing the enzyme. The liquid fraction was filtered through a 0.22 μm membrane filter and stored at 4 ° C. When the amount of protein in the liquid fraction was measured using a protein assay kit (BIO-RAD) using BSA as a standard, the total amount of protein was 688 mg.
２．不溶性画分の糖化前処理
上記分離処理で得た不溶性画分を、1重量%の水酸化ナトリウム水溶液を加えて600mlに定容し、撹拌することにより完全に懸濁した。懸濁液を121℃5分間のオートクレーブ処理した後、遠心分離（25000 x g、20分）した沈殿を回収した。沈殿に1重量%の水酸化ナトリウム水溶液を600ml加え、再度懸濁した。得られた懸濁液を再度121℃5分間のオートクレーブ処理した後、遠心分離（25000 x g、20分）した沈殿を回収した。得られた沈殿を蒸留水に懸濁し、遠心分離（25000 x g、20分）した（蒸留水による洗浄）。蒸留水による洗浄を更に2回繰り返し、得られた沈殿(34 g)を糖化対象試料とした。得られた沈殿の一部を、60℃の乾燥器中で乾燥させ、乾燥前後の重量から、水分含量を測定したところ、93.1 %であった。また、得られた乾燥物について、下記の硫酸加水分解法によりグルコース、キシロースの含有率を測定したところ、グルコース48.6重量％、キシロース3.4重量％であった。
2. Pre-saccharification pretreatment of insoluble fraction The insoluble fraction obtained by the above-described separation treatment was added to a 1% by weight aqueous sodium hydroxide solution to a volume of 600 ml, and completely suspended by stirring. The suspension was subjected to autoclaving at 121 ° C. for 5 minutes, and then the centrifuged precipitate (25000 × g, 20 minutes) was collected. 600 ml of a 1% by weight aqueous sodium hydroxide solution was added to the precipitate and suspended again. The obtained suspension was again subjected to autoclaving at 121 ° C. for 5 minutes, and then the centrifuged precipitate (25000 × g, 20 minutes) was collected. The obtained precipitate was suspended in distilled water and centrifuged (25000 × g, 20 minutes) (washing with distilled water). Washing with distilled water was further repeated twice, and the resulting precipitate (34 g) was used as a sample for saccharification. A part of the resulting precipitate was dried in a dryer at 60 ° C., and the water content was measured from the weight before and after drying. As a result, it was 93.1%. Further, when the content of glucose and xylose was measured by the following sulfuric acid hydrolysis method for the obtained dried product, glucose was 48.6% by weight and xylose was 3.4% by weight.
＜硫酸加水分解法＞
前処理後の乾燥物約0.2 gを怦量し、72%硫酸を3 ml加え適宜撹拌しながら30℃で60分間インキュベートし、これに蒸留水84 mlを混合した後、121℃で60分間処理した。室温に冷却後、蒸留水で100 mlとし、炭酸カルシウム（粉末）を加え中和した。この溶液を遠心分離（20000 x g、10分間）した上清をHPLCで解析し、グルコース量及びキシロース量を測定した。また、標品としてグルコース、キシロースをそれぞれ約0.2 g怦量したものを同様に処理、測定し、回収率を算出した。前処理後の乾燥物での測定結果と得られた回収率から、前処理後の乾燥物中のグルコース、キシロースの含有率を測定した。
<Sulfuric acid hydrolysis method>
Weigh approximately 0.2 g of the dried product after pretreatment, add 3 ml of 72% sulfuric acid and incubate for 60 minutes at 30 ° C with appropriate stirring. Mix this with 84 ml of distilled water, then treat at 121 ° C for 60 minutes. did. After cooling to room temperature, it was made up to 100 ml with distilled water and neutralized by adding calcium carbonate (powder). The supernatant obtained by centrifuging this solution (20000 × g, 10 minutes) was analyzed by HPLC, and the amounts of glucose and xylose were measured. Moreover, about 0.2 g each of glucose and xylose as preparations were treated and measured in the same manner, and the recovery rate was calculated. From the measurement result in the dried product after the pretreatment and the obtained recovery rate, the contents of glucose and xylose in the dried product after the pretreatment were measured.
回収率（％）＝
｛標品グルコース(又はキシロース)でのHPLCによる測定結果（mg/ml）
× 100｝/グルコース（キシロース）の怦量値（mg）
グルコース含有率(%)＝
HPLCでのグルコース濃度（mg/ml）/グルコースの回収率（％）
キシロース含有率(%)＝
HPLCでのキシロース濃度（mg/ml）/キシロースの回収率（％）
Recovery rate (%) =
{Measurement result by HPLC with standard glucose (or xylose) (mg / ml)
× 100} / glucose (xylose)
Glucose content (%) =
HPLC glucose concentration (mg / ml) / glucose recovery rate (%)
Xylose content (%) =
HPLC xylose concentration (mg / ml) / xylose recovery (%)
３．糖化
上記糖化前処理で得た沈殿を終濃度50mg/mlになるように、上記分離処理で得た液体画分と1 mMアジ化ナトリウムとを含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.6）に懸濁し、反応液（総量1ml）を調製した。液体画分は、反応液中のタンパク質量が0.02〜1mgになるように含有量を調整した。当該反応液を50℃で2日間反応を行い、上清中のグルコース、セロビオース、セロトリオース量、及びキシロース、キシロビオース、キシロトリオース量をHPLCで測定した。HPLCは、日立製D-2000 Elite糖分析システム（リン酸-フェニルヒドラジンポストカラム誘導体化法）を用い、カラムはSHODEX NH2P-50 4Eを用いた。
3. Saccharification Precipitate obtained in the above saccharification pretreatment was added to a 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.6) containing the liquid fraction obtained in the above separation treatment and 1 mM sodium azide so as to have a final concentration of 50 mg / ml. Suspended to prepare a reaction solution (total amount: 1 ml). The content of the liquid fraction was adjusted so that the amount of protein in the reaction solution was 0.02 to 1 mg. The reaction solution was reacted at 50 ° C. for 2 days, and glucose, cellobiose, cellotriose content, and xylose, xylobiose, xylotriose content in the supernatant were measured by HPLC. For HPLC, Hitachi D-2000 Elite sugar analysis system (phosphate-phenylhydrazine post-column derivatization method) was used, and SHODEX NH2P-50 4E was used as the column.
下記の算出式に従って、基質（上記糖化前処理で得た沈殿）50 mg中に含まれるグルコース量及びキシロース量から、酵素反応によって遊離したグルコース、セロビオース、セロトリオース、キシロース、キシロビオース、キシロトリオースの回収率を算出し、糖化率とした。 Recovery of glucose, cellobiose, cellotriose, xylose, xylobiose, and xylotriose released by the enzymatic reaction from the amount of glucose and xylose contained in 50 mg of the substrate (precipitation obtained in the above saccharification pretreatment) according to the following calculation formula The rate was calculated and used as the saccharification rate.
糖化率（グルコース：％）＝糖化液上清のグルコース[1〜3量体量（mg/ml）]/
糖化試料量（50mg/ml）×固形分率（6.9%）×グルコース含有率（48.6%）
×100
糖化率（キシロース：％）＝糖化液上清のキシロース[1〜3量体量（mg/ml）]/
糖化試料量（50mg/ml）×固形分率（6.9%）xキシロース含有率（3.4%）
×100
総糖化率（％）＝糖化液上清のグルコース[1〜3量体量（mg/ml）]＋キシロース
[1〜3量体量（mg/ml）]/50mg中に含まれるグルコース、キシロ
ースの総量（mg）×100
Saccharification rate (glucose:%) = glucose of saccharified solution supernatant [1-3 trimer mass (mg / ml)] /
Amount of saccharified sample (50 mg / ml) x solid content (6.9%) x glucose content (48.6%)
× 100
Saccharification rate (xylose:%) = xylose of saccharified solution supernatant [1-3 trimer mass (mg / ml)] /
Saccharified sample amount (50 mg / ml) x solid content (6.9%) x xylose content (3.4%)
× 100
Total saccharification rate (%) = glucose of saccharified solution supernatant [1-3 trimer mass (mg / ml)] + xylose
[1-3 trimer weight (mg / ml)] / 50mg glucose contained in xylo
Total amount (mg) x 100
また、陽性コントロールとして、上記分離処理で得た液体画分の代わりに0.2 mg（タンパク質量）の糖化酵素製剤GC220(genencor社製)を加えた以外は上記と同条件で、反応・測定を行った。 In addition, as a positive control, the reaction and measurement were performed under the same conditions as above except that 0.2 mg (protein amount) saccharifying enzyme preparation GC220 (manufactured by genencor) was added instead of the liquid fraction obtained in the separation process. It was.
４．結果
得られた結果を図４に示す。この結果から、上記分離処理で得た液体画分の添加量に依存して、タバコ葉に含まれるセルロースの糖化率が向上しており、特にタンパク質量1
mgに相当する量の液体画分を使用した場合には、総糖化率が５０％を超えており、より一層効率的な還元糖の生成が可能になることが明らかとなった。
4). Results The results obtained are shown in FIG. From this result, the saccharification rate of cellulose contained in tobacco leaves is improved depending on the addition amount of the liquid fraction obtained by the separation treatment, and in particular, the amount of protein
When the liquid fraction corresponding to mg was used, the total saccharification rate exceeded 50%, and it became clear that it was possible to produce reducing sugar more efficiently.
Claims (11)
糖化酵素をコードする遺伝子が植物の葉緑体DNAに組み込まれている形質転換植物の少なくとも１種を抽出溶媒で抽出処理し、糖化酵素を含む液体画分と、セルロースを含む不溶性画分に分離する分離工程、及び
前記液体画分と前記不溶性画分を混合し、セルロースを糖化させて還元糖を生成させる糖化工程。 A method for saccharification of plant cellulose, comprising the following steps:
At least one transformed plant in which the gene encoding saccharifying enzyme is incorporated into the chloroplast DNA of the plant is extracted with an extraction solvent and separated into a liquid fraction containing saccharifying enzyme and an insoluble fraction containing cellulose. And a saccharification step of mixing the liquid fraction and the insoluble fraction and saccharifying cellulose to produce reducing sugar.
The saccharification method according to any one of claims 1 to 6, wherein the transformed plant is tobacco.
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